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CN120456919A - 乙型肝炎组合物 - Google Patents

乙型肝炎组合物

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CN120456919A
CN120456919A CN202380086687.2A CN202380086687A CN120456919A CN 120456919 A CN120456919 A CN 120456919A CN 202380086687 A CN202380086687 A CN 202380086687A CN 120456919 A CN120456919 A CN 120456919A
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CN
China
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methyl
hydrocarbon chain
hepatitis
saturated
hbs
Prior art date
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Application number
CN202380086687.2A
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B·巴亚特
K·穆萨维
V·瓦希莱弗
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Glaxosmithkline Biology Co ltd
Original Assignee
Glaxosmithkline Biology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

提供了一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码乙型肝炎病毒抗原的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。

Description

乙型肝炎组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎的组合物，其中这些组合物包含编码一种或多种乙型肝炎抗原的mRNA，并且涉及相关方面。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个重大公共卫生问题。WHO估计，在全球范围内，2019年有2.96亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年有150万新感染病例(WHO，2021年)。HBV感染的临床病程和结果在很大程度上由获得感染的年龄以及病毒和个体免疫应答之间的复杂相互作用驱动。因此，暴露于HBV可导致会自发消退的急性肝炎，或其可进展为多种形式的慢性感染，包括非活性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带状态、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。据认为，15％-40％的慢性感染者(定义为检测到血清HBsAg超过6个月)将发生肝脏后遗症，其中肝硬化(LC)、肝功能代偿不全和肝细胞癌(HCC)是主要并发症。
尽管在许多流行国家，在婴幼儿中实施普遍预防性乙型肝炎免疫接种在降低乙型肝炎的发病率和患病率方面非常有效，但它尚未产生青少年和成人慢性乙型肝炎(CHB)患病率的大幅下降，并且预计在引入后几十年才会对HBV相关死亡产生影响。世界卫生组织估计2019年有82万人死于HBV相关原因，主要死于肝硬化和肝细胞癌(原发性肝癌)(WHO，2021)。
慢性乙型肝炎的临床管理旨在通过预防疾病进展，进而预防HCC发展，来提高生存率和生活质量。目前的治疗策略主要基于长期抑制HBV DNA复制，以实现HBV诱导的肝病的稳定并防止进展。血清HBV DNA水平是所有当前治疗方式的基础终点。但乙型肝炎e抗原(HBeAg)的消失(可检测到)是一个有价值的生物标志物，无论是否伴有抗HBs血清转化，HBsAg消失通常被认为是代表“功能性治愈”的最佳终点，因为它表明HBV复制和病毒蛋白表达的显著抑制(Revill，2019；Block，2017；Cornberg，2017)。目前，CHB患者有两种主要的治疗选择：用聚乙二醇化干扰素α(PegIFNα)治疗，或用核苷(酸)类似物(NA)治疗(EASL，2017)。旨在通过有限疗程治疗诱导长期免疫控制的PegIFNα可实现持续的关闭治疗(off-treatment)控制，但持久的病毒学应答和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)消失仅限于一小部分患者。此外，由于耐受性差和长期安全性问题，大量患者不适合接受此类治疗。
NA通过抑制HBV聚合酶逆转录酶活性来抑制DNA复制。欧洲批准用于HBV治疗的NA包括恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)和替诺福韦艾拉酚胺(TAF)(它们与对HBV耐药性的高屏障相关)，以及拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)和替比夫定(TBV)(它们与对HBV耐药性的低屏障相关)。用具有高耐药性屏障的强效NA治疗的主要优点是其可预测的长期高抗病毒功效，导致绝大多数依从性患者中的HBV DNA抑制，以及其有利的安全性谱。NA治疗的缺点是它是一种长期治疗方案，因为NA通常不能实现HBV根除，并且NA停用可能导致HBV复发。
由于HBsAg血清清除率低和非NA病毒复发的高风险，大多数患者维持长期甚至无限期的NA治疗，这可能与患者对疗法的依从性降低、财务成本增加以及长期暴露后药物毒性和耐药性突变的风险增加有关。因此，需要新的策略来用有限疗程方案实现“功能性治愈”。
信使RNA(mRNA)是一种单链RNA分子，其对应于基因的遗传序列并在产生蛋白质的过程中由核糖体读取。基于mRNA的疫苗为涉及减毒活/灭活病原体或亚单位疫苗的传统策略提供了替代疫苗接种方法(Zhang，2019)。mRNA疫苗可以利用非复制mRNA(mRNA)或自复制RNA(也称为自扩增mRNA或SAM)。基于非复制mRNA的疫苗通常编码目的抗原，并包含5’和3’非翻译区(UTR)、5’帽和聚(A)尾，而自扩增RNA还编码病毒复制机制，从而实现细胞内RNA扩增(Pardi,2018)。
本发明旨在帮助解决对可以清除HBsAg的HBV治疗的需求，以允许患者安全地停止NA疗法而没有病毒或临床复发。
发明内容
本披露提供一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA，其中该mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)。在实施方案中，HBc与人恒定链(invariant chain，hli)融合。
在一方面，本披露提供了用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少一种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。在实施方案中，HBsAg是乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。在实施方案中，HBsAg与人恒定链(hli)融合。
在进一步的方面，mRNA是非复制的。在其他方面，mRNA是自复制mRNA(SAM)。
在其他方面，包含mRNA的组合物与一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时施用。在实施方案中，重组乙型肝炎多肽包括重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)、重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。在进一步的实施方案中，一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。佐剂可以是AS01。
本文还描述了治疗慢性乙型肝炎感染的方法。该方法可以包括初免-加强方案。编码乙型肝炎病毒抗原的mRNA可以作为初免剂量施用，并且一种或多种重组乙型肝炎多肽可以作为加强剂量施用。在实施方案中，一种或多种重组乙型肝炎多肽可以作为加强剂量与佐剂一起施用。佐剂可以是AS01。
本文还描述了一种治疗人慢性乙型肝炎感染的方法，其包括以下步骤：(a)向人施用包含编码乙型肝炎多肽的多核苷酸的腺病毒载体；(b)向人施用编码乙型肝炎病毒抗原的mRNA；和(c)向人施用至少一种重组乙型肝炎多肽。这种方法可以是异源初免-加强方案，其包括(a)施用腺病毒载体作为初免剂量；(b)施用mRNA作为加强剂量；和(c)施用至少一种重组乙型肝炎多肽作为一个或多个加强剂量。在一个实施方案中，腺病毒载体是复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体。
本发明还提供了包含与一种或多种多肽顺序或同时施用的mRNA的组合物。在进一步的实施方案中，一种或多种多肽与佐剂一起施用。佐剂可以是AS01。
在一个方面，存在一种方法，其包括向人施用mRNA与至少一种多肽的组合。组分(即mRNA和多肽)可以在异源初免-加强方案中顺序施用。如果使用异源初免-加强方案，mRNA可以作为初免剂量施用，并且至少一种多肽作为加强剂量施用。在另一个方面，至少一种多肽作为初免剂量施用，并且mRNA作为加强剂量施用。至少一种多肽可以与或不与佐剂一起施用。在特定实施方案中，多肽与佐剂一起施用。在一个实施方案中，mRNA与佐剂化多肽顺序施用。在另一个实施方案中，mRNA与佐剂化多肽伴随(例如，于不同部位同时)施用。佐剂优选为AS01。
序列说明
SEQ ID NO:1：HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：HBc截短体的氨基酸序列
SEQ ID NO:3：并入了口蹄疫病毒2A切割区的间隔区的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：编码并入了口蹄疫病毒2A切割区的间隔区的核苷酸序列
SEQ ID NO:5：HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：编码HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:7：hIi的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：编码hIi的核苷酸序列
SEQ ID NO:9：hIi-HBc-2A-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：编码hIi-HBc-2A-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:11：HBc的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：hIi替代变体的氨基酸序列
SEQ ID NO:13：编码hIi替代变体的核苷酸序列
SEQ ID NO:14：hIi-HBc-2A-HBs的替代核酸序列
SEQ ID NO:15：hIi-HBc-2A-HBs的替代氨基酸序列
SEQ ID NO:16：空SAM载体的核酸序列
SEQ ID NO:17：编码hIi_HBc_2A_HBs SAM转基因的人密码子优化(Genewiz)的核酸序列
SEQ ID NO:18：hli_HBc_2A_HBs SAM质粒序列
SEQ ID NO:19：编码HBc_2A_HBs SAM转基因的人密码子优化(Genewiz)的核酸序列
SEQ ID NO:20：SAM质粒序列中的HBc_2A_HBs
SEQ ID NO:21：hli-HBc的氨基酸序列
SEQ ID NO:22：编码hli-HBc的核苷酸序列
SEQ ID NO:23：hli-HBc mRNA质粒序列(UTR4)
SEQ ID NO:24：编码HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:25：HBs mRNA质粒序列(UTR4)
SEQ ID NO:26：hli-HBs的氨基酸序列
SEQ ID NO:27：编码hli-HBs的核苷酸序列
SEQ ID NO:28：hli-HBs mRNA质粒序列(UTR4)
SEQ ID NO:29：IRES核苷酸序列
SEQ ID NO:30：编码hIi_HBc mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
SEQ ID NO:31：编码HBs mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
SEQ ID NO:32：编码hIi_HBs mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
附图说明
图1A：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后脾脏中的HBV核心抗原(HBc)特异性CD4+T细胞应答。在第二次免疫后12/13天(12/13dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由条形表示。
图1B：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后脾脏中的HBV表面(HBs)特异性CD4+ T细胞应答。在第二次免疫后12/13天(12/13dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由条形表示。
图2A：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后脾脏中的HBV核心抗原(HBc)特异性CD8+T细胞应答。在第二次免疫后12/13天(12/13dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由条形表示。
图2B：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后脾脏中的HBV表面(HBs)特异性CD8+ T细胞应答。在第二次免疫后12/13天(12/13dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由条形表示。
图3A：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后的HBV核心抗原(HBc)特异性抗体应答。在第二次免疫后12/13天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBcIgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBc IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图3B：显示了用ChAd155-hli-HBV引发和用SAM-HBV(±hli)加强后的HBV表面抗原(HBs)特异性抗体应答。在第二次免疫后12/13天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBsIgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBs IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图4A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在14dpII(即第二次给药后14天)脾脏中的HBV核心抗原(HBc)特异性CD8+ T细胞应答。在第二次免疫后14天(14dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图4B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)脾脏中的HBV核心(HBc)特异性CD8+ T细胞应答。在第四次免疫后22天(22dpIV)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图5A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在14dpII(即第二次给药后14天)脾脏中的HBV表面(HBs)特异性CD8+ T细胞应答。在第二次免疫后14天(14dpIV)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图5B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)脾脏中的HBV表面抗原(HBs)特异性CD8+ T细胞应答。在第四次免疫后22天(22dpIV)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD8+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图6A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在14dpII(即第二次给药后14天)脾脏中的HBV核心抗原(HBc)特异性CD4+ T细胞应答。在第二次免疫后14天(14dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图6B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)脾脏中的HBV核心抗原(HBc)特异性CD4+ T细胞应答。在第四次免疫后22天(22dpIV)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB核心(HBc)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图7A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在14dpII(即第二次给药后14天)脾脏中的HBV表面抗原(HBs)特异性CD4+ T细胞应答。在第二次免疫后14天(14dpII)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图7B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)脾脏中的HBV表面抗原(HBs)特异性CD4+ T细胞应答。在第四次免疫后22天(22dpIV)，收集脾脏以通过细胞内细胞染色评估HB表面(HBs)特异性CD4+ T细胞。每个点代表单个动物，几何平均值(GM)由柱形表示。
图8A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在13dpII/14dpII(即第二次给药后13/14天)测量的抗HBc结合抗体滴度。在第二次免疫后13/14天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBc IgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBc IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图8B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)测量的抗HBc结合抗体滴度。在第四次免疫后22天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBc IgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBc IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图9A：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在13dpII/14dpII(即第二次给药后13/14天)测量的抗HBs结合抗体滴度。在第二次免疫后13/14天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBs IgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBs IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图9B：显示了表2中详述的所有组(其中C＝ChAd155-hIi-HBV，M＝MVA-HBV，S＝SAM-hIi-HBV，P＝HBc-HBs/AS01)在22dpIV(即第四次给药后22天)测量的抗HBs结合抗体滴度。在第四次免疫后22天，收集血清样品以通过ELISA评估抗HBs IgG抗体滴度。对于每个组，每个点代表单个动物的抗HBs IgG抗体滴度和几何平均值(GM)由柱形表示，置信区间(Cl)为95％。
图10：显示了在不同组中检测到的循环HBs抗原滴度的动力学。循环HBs抗原滴度的几何平均值(GMs)由正方形表示，置信区间为95％。
图11：显示了不同组中第二次和第四次免疫后与免疫前滴度相比的循环HBs抗原滴度。几何平均值比率由正方形表示，置信区间为90％。
图12：显示了在不同组中检测到的AST和ALT水平的动力学。AST和ALT滴度与免疫前滴度相比的几何平均值比率(GMR)由三角形表示，置信区间为95％。
图13A：显示了HBc特异性CD8+ T细胞的细胞因子共表达谱。表达至少一种、两种或三种细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的HBc特异性CD8+T细胞的频率已经在第二次免疫后14天通过细胞内染色进行评估。标绘了每组的中值。
图13B：显示了HBs-特异性T细胞的细胞因子共表达谱。表达至少一种、两种或三种细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的HBs特异性CD8+ T细胞的频率已经在第二次免疫后14天通过细胞内染色进行评估。标绘了每组的中值。
图14：显示了实施例中使用的SAM-HBV构建体。SAM构建体含有RNA扩增所必需的VEEV TC-83的遗传元件(非结构蛋白序列，nsP1-4)。编码结构蛋白的序列已经被编码HBV多肽的转基因所替代，所述转基因处于亚基因组启动子的控制之下。空SAM质粒如SEQ ID NO:16所示。插入物在SEQ ID NO:16的核苷酸7561之后开始。显示了两种不同的HBV构建体。在两种构建体中，HBc和HBs蛋白被2A序列分隔。在一个构建体中，人恒定链(hli)与HBc融合。
图15：显示了SEQ ID NO:18的SAM质粒序列的hli_HBc_2A_HBs SAM质粒图谱。
图16：显示了SEQ ID NO:20的SAM质粒序列的HBc_2A_HBs SAM质粒图谱。
图17：显示了共同施用3种不同mRNA后HBV特异性CD8+和CD4+ T细胞应答。
图18：显示了在实施例3中观察到的HBc特异性和HBs特异性CD8+ T细胞应答。
图19：显示了图18的(hIi-HBc+hIi-HBs)mRNA构建体的组合与单独的hIi-HBc和hIi-HBs的CD8+Tell应答的几何平均值比率(GMR)的比较。
图20：显示了在实施例3中观察到的HBc特异性和HBs特异性CD4+ T细胞应答。
图21：显示了在实施例3中观察到的HBc特异性IgG应答。
具体实施方式
HBV抗原
已经鉴定了至少十种HBV基因型(A至J)(Liu，2021)。在给定的HBV基因型中，还鉴定了多个亚基因型。例如，基因型A、B、C、D和F已被进一步分成亚基因型。选择用于所披露的组合物和方法中的抗原以提供跨越所有HBV基因型的免疫学覆盖。HBV基因组包含四个重叠的开放阅读框(ORF)，其编码(i)病毒聚合酶(Pol)，(ii)病毒表面蛋白(L-HBs、M-HBs和HBs)，(iii)前核心/核心蛋白(HBe和HBc)，和(iiii)X蛋白(HBx)。
乙型肝炎病毒表面蛋白(HBsAg)由三种相关但不同的蛋白组成——大(L)表面蛋白、中(M)表面蛋白和小(S)表面蛋白。HBV表面蛋白(L、M和S)来自相同ORF的交替翻译。大表面蛋白由三个结构域构成：preS1(具有108/118/119个氨基酸，取决于基因型；基因型ApreS1结构域为119个氨基酸)、preS2(具有55个氨基酸)和小表面蛋白(HBs，具有226个氨基酸)。中表面蛋白由两个结构域构成：preS2和小表面蛋白(HBs)。小表面蛋白(HBs)不含preS1或preS2，长226个氨基酸。
乙型肝炎核心蛋白抗原(HBc)跨基因型和基因亚型高度保守，并且选择乙型肝炎小表面蛋白抗原(HBs)序列以包括关键的跨基因型保守的B细胞表位，其允许诱导广泛的中和应答。合适地，用于所披露的方法和组合物中的HBc和HBs的序列基于来自基因型/亚型A2的那些。
合适地，用于所披露的方法和组合物中的HBV表面蛋白抗原衍生自小(S)表面抗原蛋白。特别地，用于本文的HBV表面抗原可以衍生自HBs。
特别地，合适的HBV表面蛋白抗原包含HBV adw2株基因型A的小(S)蛋白(HBs)。例如，合适的HBs抗原与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％的同一性。在优选的实施方案中，合适的HBs抗原具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的226个氨基酸。在一方面，HBs抗原可以与hli融合。在实施方案中，hli-HBs抗原与SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性。在优选的实施方案中，hli-HBs具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
乙型肝炎核心蛋白(HBc)是包装病毒基因组的核衣壳的主要成分。该蛋白(长183-185aa)在被感染细胞的细胞质中表达。HBc在C末端包含149个残基的组装结构域和34-36个残基的RNA结合结构域。用于所披露的方法和组合物中的HBc抗原可以是全长的或可以包含C末端截短的蛋白(缺乏RNA结合C末端)，例如包括野生型核心抗原蛋白的氨基酸1-145，例如野生型乙型肝炎核心抗原蛋白的氨基酸1-145、1-146、1-147、1-148或氨基酸1-149。截短的蛋白质保留组装成核衣壳颗粒的能力。用于所披露的方法和组合物的合适的HBc抗原具有来自HBV adw2株基因型A的氨基酸序列。当用作重组多肽时，重组HBc蛋白适当地从野生型在C末端截短。特别地，重组HBc蛋白与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％的同一性。在优选的实施方案中，重组HBc蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。当在mRNA中表达或从病毒载体表达时，HBc抗原合适地是全长HBc抗原。特别地，HBc抗原与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％的同一性。在实施方案中，HBc抗原具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一方面，HBc抗原可以与hli融合。在实施方案中，hli-HBc与SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性。在优选的实施方案中，hli-HBc具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
恒定链
抗原是在体内诱导免疫应答，尤其是抗体产生的物质。抗原可以是外来的，即致病的，起源或源于生物体本身，后者被称为自身抗原或自体抗原。抗原可以通过MHC分子呈递在抗原呈递细胞的表面上。有两类MHC分子，MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。MHC-II分子是在内质网中合成并离开内质网进入MHC II类区室中的膜结合受体。为了防止内源性肽(即自身抗原)与MHC-II分子结合并被呈递以产生免疫应答，新生MHC-II分子与另一种蛋白质(恒定链)相互作用，所述恒定链阻断MHC-II分子的肽结合槽。
人恒定链(hIi，当在质膜表达时也称为CD74)是一种进化上保守的II型膜蛋白，其在细胞内和整个免疫系统中具有多种作用(Borghese，2011)。当MHC II类区室与含有被吞噬和降解的外源蛋白的晚期内体融合时，恒定链被切割，仅留下与MHC-II分子结合的CLIP区。在第二步中，通过HLA-DM分子去除CLIP，使MHC-II分子自由结合外源蛋白的片段。一旦MHC II类区室与质膜融合，所述片段就呈递在抗原呈递细胞的表面上，从而将外源抗原呈递给其他细胞，主要是T辅助细胞。
已知当编码恒定链和所述抗原的融合物的腺病毒表达系统用于疫苗接种时，针对抗原的免疫应答增加(参见WO2007/062656，其也公开为US2011/0293704并且出于公开恒定链序列的目的通过引用并入)，即恒定链增强了抗原的免疫原性。此外，所述腺病毒构建体已被证明可用于在初免-加强疫苗接种方案的背景下引发免疫应答(参见WO2014/141176，其也公开为US2016/0000904；和WO2010/057501，其也公开为US2010/0278904，并且出于公开恒定链序列和编码恒定链序列的腺病毒载体的目的通过引用并入)。
在本发明中，编码乙型肝炎病毒抗原的mRNA包括编码恒定链(Ii)、优选人恒定链(hIi)的核苷酸序列。hIi的两个氨基酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12所示。在优选的实施方案中，恒定链具有SEQ ID NO:12。合适地，编码hIi的核苷酸序列与编码HBc抗原和/或HBs抗原的核苷酸序列N末端融合。
在本发明中，提供了用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中，其中编码HBc的核苷酸序列的N末端与人恒定链(hli)融合。
在本发明中，还提供了用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的第一mRNA和编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)的第二mRNA，其中所述第一和第二mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中，并且其中编码HBc和HBs的核苷酸序列的N末端与人恒定链(hli)融合。
在一个实施方案中，mRNA编码SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:15(优选SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。SEQ ID NO:15是SEQ ID NO:12中所示的hli、SEQ ID NO:11中所示的HBc、SEQ ID NO:3中所示的2A和SEQ ID NO:1中所示的HBs的融合体。
在某些实施方案中，用于本文披露的方法和组合物中的腺病毒载体(Ad)，例如黑猩猩腺病毒载体(ChAd)可以包括编码hIi的核苷酸序列。包含在所披露的腺病毒载体中的hIi的两个氨基酸序列示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12中，并且编码这些氨基酸序列的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13中。在优选的实施方案中，恒定链具有SEQID NO:12。合适地，编码hIi的核苷酸序列与编码HBc抗原的核苷酸序列N末端融合。
信使RNA(mRNA)
非复制mRNA
本披露提供了包含重组信使RNA(mRNA)的组合物，所述重组信使RNA(mRNA)具有编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的开放阅读框。如本文所用，术语“重组信使RNA”(mRNA)是指编码至少一种目的多肽并且能够在体外、体内、原位或离体翻译以产生编码的目的多肽的任何重组产生的多核苷酸。mRNA通常含有编码目的多肽的区段(即，编码异源多肽(例如乙型肝炎病毒抗原)的区段)、5'非翻译区(5'UTR)、任选的3'非翻译区(3'UTR)、3'聚(单磷酸腺苷)(3'聚(A))尾和5'帽。5'UTR在目的多肽的上游(即5')；然而，3'UTR在目的多肽的下游(即3')。5'UTR起始于转录起始位点，结束于目的多肽的编码区的翻译起始序列(即5'-腺苷、尿苷、鸟苷-3'(5'-AUG-3')序列)之前的一个核苷酸。3'UTR在目的多肽编码区的翻译终止密码子之后。
在实施方案中，本披露的mRNA可以是结构修饰的或化学修饰的。如本文所用，“结构”修饰是其中在多核苷酸中插入、缺失、复制、反转或随机化两个或更多个连接的核苷而对核苷酸本身没有显著化学修饰的修饰。因为化学键必须断裂和重整以实现结构修饰，所以结构修饰具有化学性质，因此是化学修饰。然而，结构修饰将导致不同的核苷酸序列。例如，可以将多核苷酸“ATCG”化学修饰为“AT-5meC-G”。同一多核苷酸可以在结构上从“ATCG”修饰为“ATCCCG”。在此，插入了二核苷酸“CC”，导致对多核苷酸的结构修饰。在一个实施方案中，本披露的mRNA可以具有所有或任何相同核苷类型的一致化学修饰，或具有所有或任何相同核苷类型但随机掺入的化学修饰的测量百分比，例如其中所有尿苷被尿苷类似物(例如假尿苷)替代。在另一个实施方案中，mRNA可以在整个多核苷酸中具有两个、三个或四个相同核苷类型的一致修饰(例如所有尿苷和所有半胱氨酸等以相同方式修饰)。当本发明披露的mRNA的多核苷酸被化学修饰或结构修饰时，所述多核苷酸可被称为“修饰的多核苷酸”。
在实施方案中，mRNA具有以下构型：5'帽/5'UTR/hli/HBc/3'UTR/聚A。
在实施方案中，mRNA具有以下构型：5'帽/5'UTR/HBc/3'UTR/聚A。
在实施方案中，mRNA具有以下构型：5'帽/5'UTR/hli/HBs/3'UTR/聚A。
在实施方案中，mRNA具有以下构型：5'帽/5'UTR/HBs/3'UTR/聚A。
在一些实施方案中，mRNA包含5'帽。在一些实施方案中，mRNA还包括7-甲基鸟苷、5'第一核糖核苷、任选的5'第二核糖核苷和任选的三磷酸桥。在一些实施方案中，7-甲基鸟苷直接或间接地5'至5'连接至5'第一核糖核苷。在一些实施方案中，7-甲基鸟苷通过三磷酸桥5'至5'连接至5'第一核糖核苷。在一些实施方案中，5’第一核糖核苷包含2’-甲基化的核糖(2’-O-Me)(即，帽-1或帽-2)。在一些实施方案中，5’第二核糖核苷与5’第一核糖核苷的3’末端结合。在一些实施方案中，5'第二核糖核苷包含2'-甲基化的核糖(2'-O-Me)(即，帽-2)。在一些实施方案中，5'第一核糖核苷包含2'-甲基化的核糖(2'-O-Me)并且该5'第二核糖核苷包含2'-甲基化的核糖(2'-O-Me)(即，帽-2)。5'帽包含通过mRNA鸟苷酸转移酶经由5'至5'三磷酸连接与RNA连接的鸟苷，并且其中所述鸟苷的鸟嘌呤在其7位置被甲基化。在此上下文中并且在一些实施方案中，当所述鸟苷的核糖的5'末端通过mRNA鸟苷酸转移酶经由三磷酸基团与mRNA的核糖的5'末端连接时，出现5'至5'三磷酸连接。在一些实施方案中，此后，所述鸟苷的鸟嘌呤在其7位置被(鸟嘌呤-N7-)-甲基转移酶甲基化。在一些实施方案中，在没有添加7-鸟苷及其进一步甲基化以获得7-甲基鸟苷的情况下，将7-甲基鸟苷通过5’至5’添加至5’第一核糖核苷立即发生(即，)。在一些实施方案中，将7-甲基鸟苷通过5'至5'添加至5'第一核糖核苷并且包含2'-甲基化的核糖的5'第一核糖核苷或包含2'-甲基化的核糖的5'第二核糖核苷的添加立即发生(即，)。在一些实施方案中，预形成帽结构(即，作为帽-1、帽-2或帽-0，在5'鸟苷/7-甲基鸟苷上添加或不添加7-甲基基团)并添加至重组RNA分子(即，通过连接)。在一些实施方案中，该预形成的帽结构添加有5’-AG-3’起始序列，该起始序列如AG产品插页(Trilink公司目录号N-7113)中所述，将该插页通过引用并入)。
在没有进一步甲基化的情况下，通过5'至5'与5'第一核糖核苷结合的7-甲基鸟苷称为帽-0，并表示为5’(m7Gp)(ppN)[pN]N，其中前一个“N”表示mRNA的第一(5’)碱基，“pN”表示RNA中的另一个核苷酸，并且“[pN]N”中“[..]N”的添加表示RNA的重复聚合结构，从而共同表示RNA中每个循序相邻的核苷酸。
通过2'-O-甲基转移酶对紧邻所述7-甲基鸟苷(即，5'第一核糖核苷)的mRNA的核苷的核糖的2'碳进行另外的氧连接的甲基化，产生帽-1结构，该帽-1结构表示为5’(m7Gp)(ppm2N)[pN]N，其中“m2”的添加表示紧邻(经由三磷酸连接)所述7-甲基鸟苷的核苷的核糖的2'碳的氧连接的甲基化。并且更进一步，对5'第二核糖核苷(即，紧邻帽-1中甲基化的5'第一核苷的下一个(3’)核苷)进行另外的甲基化，产生帽-2结构，该帽-2结构表示为5’(m7Gp)(ppm2N)(m2pN)[pN]n，其中后面的“m2”的添加表示紧邻帽-1中甲基化的核苷酸的核苷酸的甲基化。这种帽-2甲基化也针对紧邻核苷酸的核糖的2'碳(即，2'-O-Me)。在一些实施方案中，5'帽是帽-0、帽-1或帽-2。在一些实施方案中，5'帽是帽-0。在一些实施方案中，5'帽是帽-1。在一些实施方案中，5'帽是帽-2。
在一些实施方案中，5'第一核糖核苷或5'第二核糖核苷被外源地添加至mRNA。在一些实施方案中，5'第一核糖核苷或5'第二核糖核苷对于mRNA来说是天然的(即，如果该天然序列是5'-UUAAT-3'，则当存在三磷酸桥时，m7Gp的添加将产生5’-m7Gp(ppUUAAT-3’；如果天然序列相同，则帽-1结构将产生5’-(m7Gp)(ppm2U)UAAT-3’，且该帽-2结构将产生5’-(m7Gp)(ppm2U)(m2U)AAT-3’)。
可以使用提供5'帽所有材料的试剂盒，无论是帽-1还是帽-2，以及在帽-0试剂盒中添加帽-1和帽-2能力的补充试剂盒。5'加帽的方法可以根据制造商的说明进行。
在一些实施方案中，mRNA包含3’聚(一磷酸腺苷)(聚(A))尾。在一些实施方案中，3’聚(A)尾是来自3’UTR的3’。在一些实施方案中，3'聚(A)尾位于mRNA的3'末端。
本文披露的mRNA可以被修饰。如本文所用，术语“经修饰的mRNA”或“RNA修饰”可以指化学修饰，包括主链修饰以及糖修饰或碱基修饰。在这种情况下，如本文所定义的修饰的RNA分子可以含有核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相关的主链修饰是这样的修饰，其中包含在本文定义的RNA分子中的核苷酸的主链的磷酸是化学修饰的。与本发明相关的糖修饰是如本文所定义的RNA分子的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明相关的碱基修饰是RNA分子的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在本文中，核苷酸类似物或修饰优选选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
在一方面，可掺入如本文所述的经修饰的RNA分子中的经修饰的核苷和核苷酸可在糖部分中被修饰。例如，2'羟基基团(OH)可以被许多不同的“氧基”或“脱氧基”取代基修饰或替代。“氧基”-2'羟基基团修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；其中2'羟基例如通过亚甲基桥连接至相同核糖的4'碳的“锁”核酸(LNA)；和氨基基团(-O-氨基，其中氨基基团例如NRR可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或者氨基基团可以通过接头连接至糖，其中接头包含原子C、N和O中的一个或多个。糖基团还可以含有一个或多个具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，经修饰的RNA分子可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
在另一个方面，磷酸主链可以在经修饰的核苷和核苷酸中进一步修饰，所述经修饰的核苷和核苷酸可以掺入如本文所述的经修饰的RNA分子中。主链的磷酸基团可以通过用不同的取代基替换一个或多个氧原子来修饰。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的经修饰的磷酸完全替换未修饰的磷酸部分。经修饰的磷酸基团的非限制性实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。
可以在本发明中使用的经修饰的核苷和核苷酸可以在核碱基部分中进一步修饰。RNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述的核苷和核苷酸可以在主沟(major groove)面上进行化学修饰。在一些实施方案中，主沟化学修饰可以包括氨基、硫醇基、烷基或卤代基团。
经修饰的mRNA可以包含一个或多个经修饰的核苷和核苷酸。核苷和核苷酸以及经修饰的核苷酸和核苷的制备是本领域熟知的，参见以下参考文献：美国专利号4373071、4458066、4500707、4668777、4973679、5047524、5132418、5153319、5262530、5700642。许多经修饰的核苷和经修饰的核苷酸是可商购的。
可掺入经修饰的核苷和核苷酸并存在于mRNA分子中的经修饰的核碱基包括：假尿苷；N1-甲基假尿苷；N1-乙基假尿苷；2-甲基硫代-N6-(cis-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲基硫代-N6-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1,2'-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6异戊烯基腺苷；2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(cis-羟基异戊烯基)腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,N6,2'-O-三甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰腺苷；2-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷；7-去氮杂-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6(二甲基)腺嘌呤；N6-cis-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫代腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲基硫代)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-ATP；2'-叠氮基-2'-脱氧-ATP；2'-脱氧-2'-α-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮杂)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(硫代烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤代)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫代烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；去氮杂腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮杂腺苷TP；2'氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-OMe-2-氨基-ATP；2'O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-α-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2'-α-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2'-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基腺嘌呤；2-甲基硫代-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮杂-3-溴腺苷TP；3-去氮杂-3-氯腺苷TP；3-去氮杂-3-氟腺苷TP；3-去氮杂-3-碘腺苷TP；3-去氮杂腺苷TP；4'-叠氮基腺苷TP；4'-碳环腺苷TP；4'-乙炔基腺苷TP；5'-同-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮杂腺苷TP；2-氨基嘌呤；7-去氮杂-2,6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤；7-去氮杂-2-氨基嘌呤；2-硫代胞苷；3-甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙酰基胞苷；2'-O-甲基胞苷；2'-O-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷；赖胞苷；N4,2'-O-二甲基胞苷；N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4,N4-二甲基-2'-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异-胞苷；吡咯并胞苷；α-硫代胞苷；2-(硫代)胞嘧啶；2'-氨基-2'-脱氧-CTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-CTP；2'-脱氧-2'-α-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基胞苷TP；3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4,2'-O-二甲基胞苷；5(卤代)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤代)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶：5-溴-胞苷；5-碘代-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；去氮杂胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷：2-甲氧基胞苷；2-硫代-5-甲基胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-假异胞苷；4-硫代-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉林；5-甲基-泽布拉林；吡咯并假异胞苷；泽布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2,2'-脱水-胞苷TP盐酸盐；2'氟-N4-Bz-胞苷TP；2'氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2'-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2'O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2'-a-乙炔基胞苷TP；2'-a-三氟甲基胞苷TP；2'-b-乙炔基胞苷TP；2'-b-三氟甲基胞苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基胞苷TP；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3'-乙炔基胞苷TP；4'-叠氮基胞苷TP；4'-碳环胞苷TP；4'-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5'-同-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苯甲酰基-胞苷TP；假异胞苷；7-甲基鸟苷；N2,2'-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；怀俄苷；1,2'-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；7-氨基甲基-7-去氮杂鸟苷；7-氰基-7-去氮杂鸟苷；古嘌苷；甲基怀俄苷；N2,7-二甲基鸟苷；N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷；N2,N2,7-三甲基鸟苷；N2,N2-二甲基鸟苷；N2,7,2'-O-三甲基鸟苷；6-硫代-鸟苷；7-去氮杂-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫代-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-GTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-GTP；2'-脱氧-2'-α-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(去氮杂)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(去氮杂)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤代)鸟嘌呤；8(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤代)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；去氮杂鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫代-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂鸟苷；6-硫代-7-去氮杂鸟苷；6-硫代-7-甲基鸟苷；7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷；N2-甲基-6-硫代-鸟苷；1-Me-GTP；2'氟-N2-异丁基鸟苷TP；2'O-甲基-N2-异丁基鸟苷TP；2'-a-乙炔基鸟苷TP；2'-a-三氟甲基鸟苷TP；2'-b-乙炔基鸟苷TP；2'-b-三氟甲基鸟苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-α-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基鸟苷TP；4'-叠氮基鸟苷TP；4'-碳环鸟苷TP；4'-乙炔基鸟苷TP；5'-同-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-去氮杂鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；环氧辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；辫苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；去氮杂胸苷；脱氧-胸苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；3-甲基尿苷；5-羧基甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氢尿苷；(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-甲基-假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代-2'-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-甲基-假尿苷TP；4-硫代尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲基酯；5,2'-O-二甲基尿苷；5,6-二氢-尿苷；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷甲基酯；5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧基肉桂基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲基酯-尿苷TP；N1-甲基-假尿苷；N1-乙基-假尿苷；尿苷5-氧乙酸；尿苷5-羟乙酸甲基酯；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫代尿苷；1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-假尿苷；1取代的2(硫代)-假尿苷；1取代的2,4-(二硫代)假尿苷；1取代的4(硫代)假尿苷；1取代的假尿苷；1-(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；2(硫代)假尿苷；2'-脱氧尿苷；2'-氟尿苷；2-(硫代)尿嘧啶；2,4-(二硫代)假尿嘧啶；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-鸟苷；2'-氨基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-脱氧尿苷TP；2'-O-甲基假尿苷；2'-脱氧尿苷；2'-氟尿苷；2'-脱氧-2'-α-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；4(硫代)假尿苷；4-(硫代)假尿苷；4-(硫代)尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5(胍烷基)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(卤代)尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫代)假尿苷；5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿苷；5-(甲基)-4(硫代)假尿苷；5-(甲基)假尿苷；5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶；5-(炔丙基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘代-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮)尿嘧啶；6-(偶氮)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；去氮杂尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿苷；4-硫代-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺基甲基-4-硫代-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫代-假尿苷；2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；2-硫代-1-甲基-假尿苷；2-硫代-5-氮杂-尿苷；2-硫代-二氢假尿苷；2-硫代-二氢尿苷；2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫代-1-甲基-假尿苷；4-硫代-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(.+-.)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)ara-假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)假尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)ara-假尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)假尿苷TP；1-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-双三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3,4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-炔-2-基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苄基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫代甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1,6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；I-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苯甲酰基假尿苷TP；1-苄基氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟基甲基假尿苷TP；1-异丙基-假-UTP；1-Me-2-硫代-假-UTP；1-Me-4-硫代-假-UTP；1-Me-α-硫代-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2,2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-乙基羧酸-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-叔丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉代甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-新戊酰基-假尿苷TP；1-炔丙基-假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-炔丙基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-叔丁基-假-UTP；1-硫代甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫代吗啉甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2'-脱水-尿苷TP；2'-溴-脱氧尿苷TP；2'-F-5-甲基-2'-脱氧-UTP；2'-OMe-5-Me-UTP；2'-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2'-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫代尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-炔丙基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-叠氮基尿苷TP；4'-碳环尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5'-同-尿苷TP；5-碘-2'-氟-脱氧尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基尿苷TP；6-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉代)-假-UTP；6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；6-(取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯代-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-乙基羧酸-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-叔丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫代-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2-(2-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙基酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对苯甲酸；怀丁苷；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧怀丁苷；修饰不足的羟基怀丁苷；4-脱甲基怀俄苷；2,6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基:1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-胞苷；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-腺嘌呤；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-尿苷；2'-氨基-2'-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2'-叠氮基-2'-脱氧核糖；2'氟-2'-脱氧核糖；2'-氟-修饰碱基；2'-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；3-(甲基)异羧基苯乙烯基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5取代的嘧啶；5-(甲基)异羧基苯乙烯基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异羧基苯乙烯基；异鸟苷；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素(Nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；稠五苯基(Pentacenyl)；菲基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；茋苄基；取代的1,2,4-三唑；并四烯基(Tetracenyl)；结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤-5'-TP；2-硫代-泽布拉林；5-氮杂-2-硫代-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基核糖苷-TP；间型霉素(Formycin)ATP；间型霉素B TP；吡咯赖氨酸(Pyrrolosine)TP；2'-OH-阿糖腺苷TP；2'-OH-阿糖胞苷TP；2'-OH-阿糖尿苷TP；2'-OH-阿糖鸟苷TP；5-(2-羰甲氧基乙烯基)尿苷TP；或N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，腺苷可取代的经修饰核苷酸包括：2-甲基硫代-N6-(cis-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲基硫代-N6-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1,2'-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6异戊烯基腺苷；2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(cis-羟基异戊烯基)腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,N6,2'-O-三甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰腺苷；2-甲基腺苷；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷；7-去氮杂-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6(二甲基)腺嘌呤；N6-cis-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫代腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲基硫代)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-ATP；2'-叠氮基-2'-脱氧-ATP；2'-脱氧-2'-α-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮杂)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(硫代烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤代)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫代烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；去氮杂腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮杂腺苷TP；2'氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-OMe-2-氨基-ATP；2'O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-α-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2'-α-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2'-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基腺嘌呤；2-甲基硫代-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮杂-3-溴腺苷TP；3-去氮杂-3-氯腺苷TP；3-去氮杂-3-氟腺苷TP；3-去氮杂-3-碘腺苷TP；3-去氮杂腺苷TP；4'-叠氮基腺苷TP；4'-碳环腺苷TP；4'-乙炔基腺苷TP；5'-同-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮杂腺苷TP；怀丁苷；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧怀丁苷；修饰不足的羟基怀丁苷；4-脱甲基怀俄苷；2,6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基:1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-胞苷；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-腺嘌呤；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-尿苷；2'-氨基-2'-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2'-叠氮基-2'-脱氧核糖；2'氟-2'-脱氧核糖；2'-氟-修饰碱基；2'-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；3-(甲基)异羧基苯乙烯基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5取代的嘧啶；5-(甲基)异羧基苯乙烯基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异羧基苯乙烯基；异鸟苷；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素(Nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；稠五苯基(Pentacenyl)；菲基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；茋苄基；取代的1,2,4-三唑；并四烯基(Tetracenyl)；结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤-5'-TP；2-硫代-泽布拉林；5-氮杂-2-硫代-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基核糖苷-TP；间型霉素(Formycin)A TP；间型霉素B TP；吡咯赖氨酸(Pyrrolosine)TP；2'-OH-阿糖腺苷TP；2'-OH-阿糖胞苷TP；2'-OH-阿糖尿苷TP；2'-OH-阿糖鸟苷TP；5-(2-羰甲氧基乙烯基)尿苷TP；或N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，尿苷可取代的经修饰核苷酸或胸苷可取代的经修饰核苷酸包括：假尿苷；N1-甲基假尿苷；N1-乙基假尿苷；肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；环氧辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；辫苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；去氮杂胸苷；脱氧-胸苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；3-甲基尿苷；5-羧基甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氢尿苷；(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-甲基-假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代-2'-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-甲基-假尿苷TP；4-硫代尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲基酯；5,2'-O-二甲基尿苷；5,6-二氢-尿苷；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷；5-羧基羟基甲基尿苷甲基酯；5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧基肉桂基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲基酯-尿苷TP；N1-甲基-假尿苷；N1-乙基-假尿苷；尿苷5-氧乙酸；尿苷5-羟乙酸甲基酯；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫代尿苷；1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿苷；1(氨基羰基乙烯基)-假尿苷；1取代的2(硫代)-假尿苷；1取代的2,4-(二硫代)假尿苷；1取代的4(硫代)假尿苷；1取代的假尿苷；1-(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；2(硫代)假尿苷；2'-脱氧尿苷；2'-氟尿苷；2-(硫代)尿嘧啶；2,4-(二硫代)假尿嘧啶；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-鸟苷；2'-氨基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-UTP；2'-叠氮基-脱氧尿苷TP；2'-O-甲基假尿苷；2'-脱氧尿苷；2'-氟尿苷；2'-脱氧-2'-α-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；4(硫代)假尿苷；4-(硫代)假尿苷；4-(硫代)尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5(胍烷基)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(卤代)尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫代)假尿苷；5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿苷；5-(甲基)-4(硫代)假尿苷；5-(甲基)假尿苷；5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶；5-(炔丙基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘代-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮)尿嘧啶；6-(偶氮)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；去氮杂尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿苷；4-硫代-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺基甲基-4-硫代-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫代-假尿苷；2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；2-硫代-1-甲基-假尿苷；2-硫代-5-氮杂-尿苷；2-硫代-二氢假尿苷；2-硫代-二氢尿苷；2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫代-1-甲基-假尿苷；4-硫代-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(.+-.)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)ara-假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)假尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)ara-假尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)假尿苷TP；1-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-双三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3,4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-炔-2-基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苄基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫代甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1,6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；I-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苯甲酰基假尿苷TP；1-苄基氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟基甲基假尿苷TP；1-异丙基-假-UTP；1-Me-2-硫代-假-UTP；1-Me-4-硫代-假-UTP；1-Me-α-硫代-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2,2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-乙基羧酸-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-叔丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉代甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-新戊酰基-假尿苷TP；1-炔丙基-假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-炔丙基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-叔丁基-假-UTP；1-硫代甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫代吗啉甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2'-脱水-尿苷TP；2'-溴-脱氧尿苷TP；2'-F-5-甲基-2'-脱氧-UTP；2'-OMe-5-Me-UTP；2'-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2'-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫代尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-炔丙基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-叠氮基尿苷TP；4'-碳环尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5'-同-尿苷TP；5-碘-2'-氟-脱氧尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基尿苷TP；6-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉代)-假-UTP；6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；6-(取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯代-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-乙基羧酸-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-叔丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫代-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2-(2-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙基酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对苯甲酸；怀丁苷；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧怀丁苷；修饰不足的羟基怀丁苷；4-脱甲基怀俄苷；2,6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基:1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-胞苷；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-腺嘌呤；2'甲基；2'氨基；2'叠氮基；2'氟-尿苷；2'-氨基-2'-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2'-叠氮基-2'-脱氧核糖；2'氟-2'-脱氧核糖；2'-氟-修饰碱基；2'-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；3-(甲基)异羧基苯乙烯基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5取代的嘧啶；5-(甲基)异羧基苯乙烯基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异羧基苯乙烯基；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素(Nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；稠五苯基(Pentacenyl)；菲基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；茋苄基；取代的1,2,4-三唑；并四烯基(Tetracenyl)；结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤-5'-TP；2-硫代-泽布拉林；5-氮杂-2-硫代-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基核糖苷-TP；间型霉素(Formycin)A TP；间型霉素B TP；吡咯赖氨酸(Pyrrolosine)TP；2'-OH-阿糖胞苷TP；2'-OH-阿糖尿苷TP TP；或5-(2-羰甲氧基乙烯基)尿苷TP。
在一些实施方案中，胞嘧啶可取代的经修饰的核苷酸包含2-硫代胞苷；3-甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙酰基胞苷；2'-O-甲基胞苷；2'-O-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷；赖胞苷；N4,2'-O-二甲基胞苷；N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4,N4-二甲基-2'-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异-胞苷；吡咯并胞苷；α-硫代胞苷；2-(硫代)胞嘧啶；2'-氨基-2'-脱氧-CTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-CTP；2'-脱氧-2'-α-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基胞苷TP；3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4,2'-O-二甲基胞苷；5(卤代)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤代)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶：5-溴-胞苷；5-碘代-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；去氮杂胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷：2-甲氧基胞苷；2-硫代-5-甲基胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-假异胞苷；4-硫代-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉林；5-甲基-泽布拉林；吡咯并假异胞苷；泽布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2,2'-脱水-胞苷TP盐酸盐；2'氟-N4-Bz-胞苷TP；2'氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2'-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2'O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2'-a-乙炔基胞苷TP；2'-a-三氟甲基胞苷TP；2'-b-乙炔基胞苷TP；2'-b-三氟甲基胞苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基胞苷TP；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3'-乙炔基胞苷TP；4'-叠氮基胞苷TP；4'-碳环胞苷TP；4'-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5'-同-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苯甲酰基-胞苷TP；假异胞苷；2'氟-胞苷；或2'-OH-阿糖胞苷TP。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括：7-甲基鸟苷；N2,2'-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；怀俄苷；1,2'-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；7-氨基甲基-7-去氮杂鸟苷；7-氰基-7-去氮杂鸟苷；古嘌苷；甲基怀俄苷；N2,7-二甲基鸟苷；N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷；N2,N2,7-三甲基鸟苷；N2,N2-二甲基鸟苷；N2,7,2'-O-三甲基鸟苷；6-硫代-鸟苷；7-去氮杂-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫代-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2'-氨基-2'-脱氧-GTP；2'-叠氮基-2'-脱氧-GTP；2'-脱氧-2'-α-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-α-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(去氮杂)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(去氮杂)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤代)鸟嘌呤；8(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤代)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；去氮杂鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫代-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂鸟苷；6-硫代-7-去氮杂鸟苷；6-硫代-7-甲基鸟苷；7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷；N2-甲基-6-硫代-鸟苷；1-Me-GTP；2'氟-N2-异丁基鸟苷TP；2'O-甲基-N2-异丁基鸟苷TP；2'-a-乙炔基鸟苷TP；2'-a-三氟甲基鸟苷TP；2'-b-乙炔基鸟苷TP；2'-b-三氟甲基鸟苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-α-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基鸟苷TP；4'-叠氮基鸟苷TP；4'-碳环鸟苷TP；4'-乙炔基鸟苷TP；5'-同-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-去氮杂鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；环氧辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；7-(胍鎓烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；7-(丙炔基)异羧基苯乙烯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异羧基苯乙烯基；异鸟苷；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素(Nubularine)；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；稠五苯基(Pentacenyl)；菲基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；茋苄基；取代的1,2,4-三唑；并四烯基(Tetracenyl)；结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤-5'-TP；2-硫代-泽布拉林；5-氮杂-2-硫代-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基核糖苷-TP；间型霉素(Formycin)ATP；间型霉素B TP；吡咯赖氨酸(Pyrrolosine)TP；或2'-OH-阿糖鸟苷TP。
许多这些经修饰的核碱基及其相应的核糖核苷可从商业供应商处获得。
自扩增mRNA(SAM)
本文披露的mRNA可以是复制型的，也称为自扩增。自扩增mRNA分子可以是甲病毒衍生的mRNA复制子。mRNA扩增还可以通过提供编码抗原的非复制mRNA与单独的编码复制机器的mRNA来实现。
自复制RNA分子在本领域是众所周知的，并且可以通过使用来源于例如甲病毒的复制元件，并用编码目的蛋白质的核苷酸序列置换结构病毒蛋白质来产生。自复制RNA分子通常是+链分子，其在递送至细胞后可以直接翻译，并且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，然后该酶从递送的RNA产生反义和有义转录物。因此，递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子RNA以及共线亚基因组转录物可以自身翻译以提供编码抗原的原位表达，或者可以被转录以提供与递送的RNA具有相同有义的进一步转录物，所述转录物被翻译以提供抗原的原位表达。这一转录序列的总体结果是引入的复制子RNA数量的巨大扩增，因此编码的抗原成为细胞的主要多肽产物。
合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可以使用突变体或野生型病毒序列，例如VEEV的减毒TC83突变体已用于复制子中，参见以下参考文献：WO2005/113782。
在某些实施方案中，本文所述的自复制RNA分子编码(i)可以从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)抗原。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如包含一种或多种甲病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4(其中nsP代表非结构蛋白)。
天然甲病毒基因组除了非结构复制酶多蛋白之外还编码结构病毒粒子蛋白，而自复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，自复制RNA可以导致细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不会产生含有RNA的病毒粒子。无法产生这些病毒粒子意味着，与野生型甲病毒不同，自复制RNA分子无法以传染性形式永存。在野生型病毒中永久存在所必需的甲病毒结构蛋白不存在于本发明的自复制RNA中，它们的位置被编码目的免疫原的一个或多个基因所取代，使得亚基因组转录物编码免疫原，而不是甲病毒结构病毒粒子蛋白。
可用于本发明的自复制RNA分子可以具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码一种或多种HBV抗原。
在某些实施方案中，本文披露的自复制RNA分子具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。在一些实施方案中，必须选择自复制RNA分子的5'序列以确保与编码的复制酶的相容性。
自复制RNA分子可具有3'聚A尾。它还可以在其3'末端附近包括聚A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。
自复制RNA分子可以有不同的长度，但它们通常为5000-25000个核苷酸长。自复制RNA分子通常是单链的。单链RNA通常可以通过结合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR来启动佐剂作用。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可以与TLR3结合，并且该受体也可以由dsRNA触发，该dsRNA在单链RNA复制过程中或在单链RNA的二级结构中形成。
在另一个实施方案中，自复制RNA可以包含两个单独的RNA分子，每个分子包含衍生自甲病毒的核苷酸序列：一个RNA分子包含用于表达甲病毒复制酶的RNA构建体，并且一个RNA分子包含可被复制酶反式复制的RNA复制子。用于表达甲病毒复制酶的RNA构建体包含5'-帽。参见WO2017/162265。
自复制RNA可以通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT可以使用在细菌中以质粒形式产生和繁殖的或合成产生的(cDNA)模板(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程改造方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶)可用于从DNA模板转录自复制RNA。可以根据需要使用适当的加帽和聚A添加反应(尽管复制子的聚A通常编码在DNA模板内)。这些RNA聚合酶对转录的5’核苷酸有严格的要求，在一些实施方案中，这些要求必须与编码的复制酶的要求相匹配，以确保IVT转录的RNA能有效地作为其自身编码的复制酶的底物。
自复制RNA可以包括(除了任何5'帽结构之外)一个或多个具有经修饰的核碱基的核苷酸。本发明所使用的RNA理想地仅包括核苷之间的磷酸二酯键，但在一些实施方案中，它可以含有氨基磷酸酯键和/或甲基膦酸酯键。
自复制RNA分子可以编码单个异源多肽抗原(即抗原)，或者任选地，两个或更多个异源多肽抗原以这样的方式连接在一起，使得当表达为氨基酸序列时，每个序列保持其身份(例如，串联)。从自复制RNA产生的异源多肽然后可以作为融合多肽产生，或者以产生单独的多肽或肽序列的方式进行工程改造。
本文所述的自复制RNA分子可以被工程化以表达多个核苷酸序列，从而允许蛋白质如一种、两种或更多种HBV抗原(例如表面和核心抗原)的共表达。RNA分子可以与细胞因子或其他免疫调节剂(这可以增强免疫应答的产生)一起表达这些蛋白质。
如果需要，可以使用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法来筛选或分析自复制RNA分子以确认它们的治疗和预防性质。例如，可以测试包含自复制RNA分子的疫苗对特定目的淋巴细胞类型(例如B细胞、T细胞、T细胞系和T细胞克隆)的增殖诱导或效应子功能的影响。例如，可以分离来自经免疫小鼠的脾细胞，并且细胞毒性T淋巴细胞具有裂解自体靶细胞的能力，所述自体靶细胞包含编码抗原的自复制RNA分子。此外，辅助性T细胞分化可以通过ELISA测量TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)细胞因子的增殖或产生来分析，或者直接在CD4+ T细胞中通过细胞质细胞因子染色和流式细胞术来分析。
也可以测试编码抗原的自复制RNA分子诱导体液免疫应答的能力，例如通过诱导B细胞产生对目的抗原特异的抗体来证明。这些测定可以使用例如来自经免疫个体的外周B淋巴细胞进行。此类测定方法是本领域技术人员已知的。可用于表征自复制RNA分子的其他测定可涉及检测靶细胞编码抗原的表达。例如，FACS可用于检测细胞表面或细胞内的抗原表达。FACS选择的另一个优点是可以对不同水平的表达进行分类；有时可能需要较低的表达。用于鉴定表达特定抗原的细胞的其他合适方法包括在平板上使用单克隆抗体进行淘选或使用包被有单克隆抗体的磁珠进行捕获。
在一个实施方案中，本披露的自复制RNA可以包括编码自切割肽的序列。自切割肽可以是但不限于口蹄疫病毒(FMDV)的2A切割区(本文称为“2A”)。2A肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一方面，2A肽在最后一个甘氨酸和最后一个脯氨酸之间切割。2A肽使核糖体跳过2A肽C末端的肽键的合成，导致2A序列末端与下游的下一肽之间的分离(“切割”)。在实施方案中，2A肽可用于分离两个或更多个目的多肽的编码区。作为非限制性实例，编码2A肽的核苷酸序列可以在第一编码区A(例如，编码hli-HBc)和第二编码区B(例如，编码HBs)之间。
在另一个实施方案中，本披露的自复制RNA可以包括编码内部核糖体进入位点(IRES)的序列。IRES元件的作用类似于另外的核糖体募集位点，允许翻译发生在mRNA的内部区域，从而导致下游ORF与上游ORF分开翻译。在实施方案中，IRES可用于分离两个或更多个目的多肽的编码区。作为非限制性实例，编码IRES的核苷酸序列可以在第一编码区A(例如，编码hli-HBc)和第二编码区B(例如，编码HBs)之间。
在实施方案中，自复制RNA具有以下构型：5'帽/5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4/亚基因组启动子/hli/HBc/2A/HBs/3'UTR/聚A。
在实施方案中，自复制RNA具有以下构型：5'帽/5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4/亚基因组启动子/hli/HBc/IRES/HBs/3'UTR/聚A。
在实施方案中，自复制RNA具有以下构型：5'帽/5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4/亚基因组启动子/hli/HBc/3'UTR/聚A。
在实施方案中，自复制RNA具有以下构型：5'帽/5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4/亚基因组启动子/HBs/3'UTR/聚A。
在实施方案中，自复制RNA具有以下构型：5'帽/5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4/亚基因组启动子/hli/HBs/3'UTR/聚A。
在一个实施方案中，mRNA是非复制mRNA。在第二实施方案中，mRNA是复制mRNA。
脂质纳米颗粒(LNP)
脂质纳米颗粒(LNP)是其中可以包封mRNA的非病毒粒子脂质体颗粒。未经保护的RNA本身可能会被受试者的RNA酶降解。LNP通过在整体组合物中包封一定量的mRNA来提供保护mRNA的手段。LNP递送系统及其制备方法是本领域已知的。LNP可以包括一些外部mRNA(例如在LNP的表面上)，但期望至少一半的mRNA(并且合适地至少85％，尤其是至少95％，例如全部)被包封。
第一脂质
在一些实施方案中，LNP包含脂质，所述脂质包含：第一脂质(即阳离子可电离的脂质)、任选的甾醇(例如胆固醇)、任选的聚合物缀合的脂质和任选的第二脂质(即任选的阴离子脂质或任选的中性脂质，包括两性离子脂质)。在一些实施方案中，任选的中性脂质包括中性脂质两性离子脂质。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质包含聚乙二醇缀合的脂质。在一些实施方案中，LNP包含来自以下的脂质：WO2012/006376、WO2012/030901、WO2012/031046、WO2012/031043、WO2012/006378、WO2011/076807、WO2013/033563、WO2013/006825、WO2014/136086、WO2015/095340、WO2015/095346、WO2016/037053、WO2017/075531、WO2018/081480、WO2015/074085、WO2018/1703322、美国专利申请号：20220081392、20220072155、20220040285、20210395188、20210251898、20210128488、20210122703、20210122702、20210107861、20200283372、20200172472、20200163878、20200121809、20200046838、20190359556、20190314524、20190274968、20190270697、20190022247、20180185516、20170283367、20170157268、20170119904、20160376224、20160317676、或20150376115、美国专利申请号61/905,724或15/614,499、或美国专利号8,802,863、9,458,090、9,593,077、9,567,296、9,604,908、9,643,916、9,669,097、9,670,487、9,737,619、9,738,593、9,725,720、9,796,977,10,106,490、10,166,298、10,221,127、10,723,692、11,040,112、11,168,051或11,285,222(包括其中提及的可电离脂质和PEG-脂质)。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含胺，该胺可以是叔胺，其当与阳离子可电离脂质的pKa相比时，视阳离子可电离脂质所在的溶液的pH而变得带电荷。在一些实施方案中，当阳离子可电离脂质所在的溶剂的pH高于pKa时，至少一半阳离子可电离脂质是电中性的并且胺是叔胺；当阳离子可电离脂质所在的溶剂的pH低于pKa时，至少一半阳离子可电离脂质带正电。在这方面，在一些实施方案中，但不限于特定理论，认为可电离脂质的正电荷分布在胺上，并且由此当阳离子可电离脂质所在的溶剂的pH低于pKa时，所述胺带正电。因为胺可以根据溶液的pH相对于阳离子可电离脂质的pKa在中性和带正电荷之间变化，并且因为不受特定理论的束缚，胺是可电离的胺。
当胺是叔胺和当阳离子可电离脂质电中性时，将进一步描述阳离子可电离脂质，但此类描述不应将阳离子可电离脂质限制为缺乏转变为带正电荷的能力。也就是说，在此描述了处于叔胺状态并且电中性的脂质，而不必需描述叔胺带电时的阳离子可电离脂质。在一些实施方案中，除了上述可电离胺之外，阳离子可电离脂质还包含头基(RH)和脂肪酸尾(RFA1或RFA2)。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质还包含(除了上述可电离胺之外)头基和至少两个脂肪酸尾(RFA1和RFA2)，例如在式I中。
式I：
在一些实施方案中，胺提供头基和脂肪酸尾之间的分支点。在一些实施方案中，脂肪酸尾(RFA)或至少两个脂肪酸尾(即，RFA1、RFA2…)紧挨着可电离胺。在一些实施方案中，脂肪酸尾包含或至少两个脂肪酸尾包含生物可降解基团(即，RBD1或RBD2)，并且至少两个脂肪酸尾相同或彼此独立。在一些实施方案中，至少两个脂肪酸尾各自包含生物可降解基团，例如式II中的，并且生物可降解基团相同或彼此独立。在一些实施方案中，生物可降解基团按从可电离胺的顺序包括-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，其中X为0、1或2，且其中Ra为氢或C1-C12烷基。在一些实施方案中，脂肪酸包含或所述至少两种脂肪酸在胺分支点和生物可降解基团之间包含C1-C12烷基、C1-C12亚烷基、或C1-C12亚烯基(即，RFC1和RFC2))，例如式II中。在一些实施方案中，所述脂肪酸包含或所述两个或更多个脂肪酸包含可电离胺和可生物降解基团远端的C6-C24烷基、C6-C24亚烷基、C7-C23烷基、C7-C23亚烷基、C8-C22烷基、C8-C22亚烷基、C9-C21烷基、C9-C21亚烷基、C10-C20烷基、C10-C20亚烷基、C11-C19烷基、C11-C19亚烷基、C12-C18烷基、C12-C18亚烷基、C13-C17烷基或C13-C17亚烷基(即RFC3和RFC4)、例如在式II中。
式II：
其中：RFC1和RFC2各自独立地为C1-C12烷基、C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
RFC3和RFC4各自独立地为：C6-C24烷基、C6-C24亚烷基、C7-C23烷基、C7-C23亚烷基、C8-C22烷基、C8-C22亚烷基、C9-C21烷基、C9-C21亚烷基、C10-C20烷基、C10-C20亚烷基、C11-C19烷基、C11-C19亚烷基、C12-C18烷基、C12-C18亚烷基、C13-C17烷基、C13-C17亚烷基；
RBD1和RBD2各自独立地为：-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、或-NRaC(＝O)O-，其中X为0、1或2，且其中Ra为氢或C1-C12烷基。
在一些实施方案中，C6-C24烷基或C6-C24亚烷基在以下位置连接至生物可降解基团：其C6-C12、C7-C11、C8-C10或C9。在一些实施方案中，至少两个脂肪酸尾中的每一个的C6-C24烷基或C6-C24亚烷基独立地包含：
在一些实施方案中，头基包含以下，由以下组成，是以下或具有以下：第一基团(即RH1)和第二基团(即RH2)，其中第一基团是C1-C24烷基、C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基，并且第二基团是H、-OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)OR4、-NR5C(＝O)OR4或OR5；其中R4是C1-C12烷基且R5是H或C1-C6烷基。在一些实施方案中，头基包含直链或支链形式的-(CH2)6OH、-(CH2)5OH、-(CH2)4OH、-(CH2)3OH、-(CH2)2OH或-CH2OH。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成或是以下：[(4-羟基丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)或9-十七烷基8-{(2-羟基乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸酯。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质是：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV28：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV31：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV33：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV37：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：RV39，即2,5-双((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基)苄基4-(二甲基氨基)丁酸酯)：
RV39
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV42：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV44：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV73：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV75：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV81：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV84：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV85：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV86：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV88：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV91：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV92：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV93：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：2-(5-((4-((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1,3-二基二辛酸酯(RV94)，具有以下结构：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV95：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV96：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV97：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV99：
在实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有以下结构的RV101：
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含以下，由以下组成，基本上由以下组成或是以下：具有式III的结构的脂质：
其中n＝1至3的整数并且
(i)R1是CH3，R2和R3都是H，并且Y是C；或
(ii)R1和R2共同为CH2–CH2并与氮一起形成五、六或七元杂环烷基，R3为CH3，且Y为C；或
(iii)R1是CH3，R2及R3均不存在，且Y为O；
其中o是0或1；
其中X是：
(i)其中R4和R5独立地是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的C10-20烃链；或
(ii)–CH(–R6)–R7，其中
(1)R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8或–Cp–R8；
(2)R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'或–Cp'–R8',
(3)p和p'独立地是0、1、2、3或4；和
(4)R8和R8’独立地是
(A)在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；
(B)–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；
(C)–C6-16饱和烃链；
(D)–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；
(E)–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；以及
(F)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，R1是CH3，R2和R3都是H，并且Y是C。在一些实施方案中，R1和R2共同为CH2–CH2并且与氮一起形成五-、六-或七元杂环烷基，R3是CH3，且Y是C。在一些实施方案中，R1是CH3、R2和R3均不存在，且Y为O。
在实施方案中，X是其中R4和R5独立地是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的C10-20烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8'是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是-C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8'是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是-C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8'是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是-C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是-C(-C6-16)-C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8'是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是-C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是-C6-16饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是-CH(-R6)-R7，R6是-(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p'–O–C(O)–R8'，p和p'独立地为0、1、2、3或4；R8是-C6-16饱和烃链；并且R8'是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–(CH2)p–O–C(O)–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
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在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
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在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–(CH2)p’–O–C(O)–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cpx–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；R8是–C6-16饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cpx–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是在ω6和ω9位置之一或两者上具有一个或两个顺式烯基团的–C8-20烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C1-3–C(–O–C6-12)–O–C6-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C(–C6-16)–C6-16饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8”，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C[–C–O–C(O)–C4-12]–C–O–C(O)–C4-12饱和或不饱和烃链。
在实施方案中，X是–CH(–R6)–R7，R6是–Cp–R8，R7是–Cp’–R8’，p和p’独立地是0、1、2、3或4；并且R8是–C6-16饱和或不饱和烃链；并且R8’是–C6-16饱和或不饱和烃链。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含来自以下的阳离子脂质：WO2012/006376、WO2012/030901、WO2012/031046、WO2012/031043、WO2012/006378、WO2011/076807、WO2013/033563、WO2013/006825、WO2014/136086、WO2015/095340、WO2015/095346、WO2016/037053、WO2017/075531、WO2018/081480、WO2015/074085、WO2018/1703322、美国专利申请公开号：20220081392、20220072155、20220040285、20210395188、20210251898、20210128488、20210122703、20210122702、20210107861、20200283372、20200172472、20200163878、20200121809、20200046838、20190359556、20190314524、20190274968、20190270697、20190022247、20180185516、20170283367、20170157268、20170119904、20160376224、20160317676、或20150376115、美国专利号61/905,724或15/614,499、或美国专利号8,802,863、9,458,090、9,593,077、9,567,296、9,604,908、9,643,916、9,669,097、9,670,487、9,737,619、9,738,593、9,725,720、9,796,977,10,106,490、10,166,298、10,221,127、10,723,692、11,040,112、11,168,051、11,246,933或11,285,222(其中称为可电离脂质)。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含第一基团和两个可生物降解的疏水尾。在一些实施方案中，第一基团包含中心部分和头基，其中第一基团能够带正电。在一些实施方案中，中心部分直接键合至两个可生物降解基团中的每一个。在一些实施方案中，中心部分直接键合至头基。在一些实施方案中，中心部分选自中心碳原子、中心氮原子、中心杂芳基和中心杂环基。在一些实施方案中，两个可生物降解的疏水尾之一或两个可生物降解的疏水尾中的每一个具有下式：-(C1-C12烷基、C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基)-(可生物降解基团)-(C6-C24烷基、C6-C24亚烷基、C7-C23烷基、C7-C23亚烷基、C8-C22烷基、C8-C22亚烷基、C9-C21烷基、C9-C21亚烷基、C10-C20烷基、C10-C20亚烷基、C11-C19烷基、C11-C19亚烷基、C12-C18烷基、C12-C18亚烷基、C13-C17烷基、C13-C17亚烷基)。在一些实施方案中，两个可生物降解的疏水尾中的每一个可生物降解基团独立地选自：-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、或-NRaC(＝O)O-，其中X为0、1或2，且其中Ra为氢或C1-C12烷基。在一些实施方案中，在两个可生物降解尾之一或两个可生物降解尾中的每一个：1)具有末端疏水链，其为支化烷基和末端，2)支化烷基的支链相对于可生物降解基团具有α位，3)可生物降解疏水尾的6至12个碳原子将末端与可生物降解基团分开。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含双(2-甲基丙烯酰基)氧乙基二硫化物(DSDMA，CAS号36837-97-5)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基-N、N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(y-DLenDMA)、98N12-5、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(基于咪唑基)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)HGT4003、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二酸(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊基[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺))、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)N1,N 16-双十一-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、(市售阳离子脂质体，包含DOTMA和1,2-二油酰-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL、Grand Island、N.Y.)、(市售阳离子脂质体，包含N-(1-(2,3二油酰基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基-三氟乙酸铵(DOSPA)、(DOPE)，来自GIBCO/BRL)、或(市售的阳离子脂质，其包含乙醇中的双十八烷基酰胺甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.，Madison，Wis.)或上述任何物质的任何组合。其他合适的阳离子包括国际专利公开WO2010/053572(特别是在第[00225]段描述的CI 2-200)和WO2012/170930中描述的那些(这两篇文献均通过引用并入本文)、HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见美国专利申请公开号20150140070A1)。
代表性的阳离子可电离脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、MC3(美国专利公开号20100324120)。
各种两亲性脂质可以在水性环境中形成双层，以将含有RNA的水性核心包封为LNP。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头基。一些磷脂是阴离子的，而另一些是两性离子的，另一些是阳离子的。合适的磷脂类别包括但不限于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，表1中列出了一些有用的磷脂。有用的阳离子脂质包括但不限于二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质包括但不限于酰基两性离子脂质和醚两性离子脂质。有用的两性离子脂质的实例是1-2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和十二烷基磷酸胆碱。脂质可以是饱和的或不饱和的。优选使用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。如果不饱和脂质有两个尾部，则两个尾部都可以是不饱和的，或者它可以具有一个饱和尾部和一个不饱和尾部。
其他有用的LNP描述于以下参考文献中：WO2012/006376；WO2012/030901；WO2012/031046；WO2012/031043；WO2012/006378；WO2011/076807；WO2013/033563；WO2013/006825；WO2014/136086；WO2015/095340；WO2015/095346；WO2016/037053。在一些实施方案中，LNP是RV01脂质体，参见以下参考文献：WO2012/006376和Geall等人.(2012)PNAS USA.9月4日；109(36):14604-9。
聚乙二醇缀合的脂质
在一些实施方案中，LNP包含聚乙二醇缀合的(PEG缀合的)脂质。在一些实施方案中，PEG缀合的脂质包含具有各种长度和分子量的聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，PEG缀合的脂质中的PEG具有以下中值分子量：0.5kDa、0.6kDa、0.7kDa、0.8kDa、0.9kDa、1.0kDa、1.1kDa、1.2kDa、1.3kDa、1.4kDa、1.5kDa、1.6kDa、1.7kDa、1.8kDa、1.9kDa、2.0kDa、2.1kDa、2.2kDa、2.3kDa、2.4kDa、2.5kDa、2.6kDa、2.7kDa、2.8kDa、2.9kDa、3.0kDa、3.1kDa、3.2kDa、3.3kDa、3.4kDa、3.5kDa、3.6kDa、3.7kDa、3.8kDa、3.9kDa、4.0kDa、4.1kDa、4.2kDa、4.3kDa、4.4kDa、4.5kDa、4.6kDa、4.7kDa、4.8kDa、4.9kDa、5.0kDa、5.1kDa、5.2kDa、5.3kDa、5.4kDa、5.5kDa、5.6kDa、5.7kDa、5.8kDa、5.9kDa或6.0kDa。
在一些实施方案中，PEG缀合的脂质包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000中，“2000”表示PEG的中值分子量(以道尔顿为单位)。在一些实施方案中，PEG缀合的脂质包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]。在一些实施方案中，PEG缀合的脂质包含1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇。
第二脂质
在一些实施方案中，LNP还包含第二脂质，其包含阴离子脂质、中性脂质或两性离子脂质。在一些实施方案中，中性脂质包括中性两性离子脂质。在一些实施方案中，阴离子脂质、中性脂质或两性离子脂质包含磷酸基团(即，是磷脂)、胆碱或鞘脂。
在一些实施方案中，第二脂质包括1,2-双十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(17:0PE)、1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(06:0PE)、1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(08:0PE)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(10:0PE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(12:0PE)、1,2-双十五酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(15:0PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0PE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(14:0PE)、1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:1PE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-Trans)PE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:2PE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:3PE)、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(22:6PE)、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(20:4PE)、1-十五酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(15:0-18:1PE)、1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2PE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1PE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1PE)、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4PE)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6PE)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2PE)、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4PE)、1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6PE)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1Lyso PE)、1-羟基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(2-18:1Lyso PE)、1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0Lyso PE)、1-十三酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(13:0Lyso PE)、1-(10Z-十七碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(17:1Lyso PE)、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0Lyso PE)、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(14:0Lyso PE)、L-α-磷脂酰乙醇胺、1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(04:0PC)、1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)、1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(7:0PC)、1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(8:0PC)、1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(9:0PC)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(10:0PC)、1,2-双十一酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(11:0PC)、1,3-二棕榈酰基-rac-甘油-2-磷酸胆碱(16:02-PC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-双十三烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(13:0PC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-双十五烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(15:0PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-双十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(17:0PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(19:0PC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:0PC)、1,2-双二十一酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(21:0PC)、1,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:0PC)、1,2-双二十三酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(23:0PC)、1,2-双二十四酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(24:0PC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(11-cis)PC)、1,2-二[(8Z)十八烯酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(8-cis)PC)、1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-cis)PC)、1,2-二石油硒酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-cis)PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-Trans)PC)、1,2-双十七酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-双十五烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]、1,2-双二十碳六烯酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:3(cis)PC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:1(cis)PC)、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:4(cis)PC)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:1(cis)PC)、1,2-二神经酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(24:1(cis)PC)、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:6(cis)PC)、1-十五烷酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(15:0-18:1)PC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-16:0PC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-18:0PC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-14:0PC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:0PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:2PC)、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-20:4PC)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-22:6PC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-14:0PC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-16:0PC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:1PC)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-20:4PC)、1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-22:6PC)、1-油酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-14:0PC)、1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-16:0PC)、1-油酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-18:0PC)、1-(8Z-十八烯酰基)-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(n10)-16:0PC)、1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-02:0PC)、1-棕榈酰基-2-[12’-(棕榈酰基氧基)十八烷酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-(12-PAHSA)PC)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-己酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-庚酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-辛酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-壬酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-癸酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十一烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-月桂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十三烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十五烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-羟基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十七酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-(10Z-十七碳烯酰基)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-羟基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十九烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-花生酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-山嵛酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-二十四烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-二十六烷酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆固醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、N-二十四烷酰基-D-赤型鞘氨醇磷酸乙醇胺、或鞘磷脂。
甾醇
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含甾醇。在一些实施方案中，甾醇包括胆固醇、胆固醇硫酸盐、去氨甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、7-脱氢胆固醇、二氢羊毛甾醇、对称甾醇、拉斯特甾醇(lathosteriol)、14-去甲基-羊毛甾醇、8(9)-脱氢胆固醇、8(14)-脱氢胆固醇、14-去甲基-14-脱氢羊毛甾醇(FF-MAS)、薯蓣皂苷元、硫酸脱氢表雄酮(DHEA硫酸盐)、脱氢表雄酮、谷甾醇、羊毛甾醇95、4,4-二甲基(d6)-胆甾-8(9)、14-二烯-3β-醇(二氢-FF-MAS-d6)、4,4-二甲基(d6)-胆甾-8(9)-烯-3β-醇(二氢T-MAS-d6)、酵母烯醇、谷甾烷醇、菜油甾烷醇、菜油甾醇(camperstanol)、7-脱氢去氨链甾醇、孕烯醇酮、4,4-二甲基-胆甾-8(9)-烯-3β-醇(二氢T-MAS)、Δ5-燕麦甾醇、菜子甾醇、二氢FF-MAS、24-亚甲基胆固醇、氧甾醇、氘代甾醇、氟化甾醇、磺化甾醇、磷酸化甾醇、A环取代的甾醇、胆甾-5-烯-3β,4β-二醇、5α-胆固醇-3β-醇、4-胆甾烯-3-酮、胆甾-8(9),24-二烯-3-酮、胆甾-8(9),24-二烯-3-酮、2,2,3,4,4-五氘-5a-胆甾-3β-醇、胆甾醇基磷酸胆碱、胆甾醇基-d7十五烷酸酯、胆甾醇基-d7棕榈酸酯、B环取代的甾醇、胆甾烷醇、5β,6β-环氧-d7,3β-羟基-5-胆甾烯-7-酮、6α-羟基-5α-胆甾烷、胆甾烷醇、5α,6α-环氧,胆甾-5-稀-3β,7α-二醇、胆甾-5-稀-3β,7β-二醇、胆甾烷醇、5α,6α-环氧-d7,Δ5,7-胆固醇、胆甾-5,8(9)-二烯-3β-醇、胆甾-5,8(14)-二烯-3β-醇、7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮、酵母烯醇-d7、酵母烯醇、7-脱氢去氨链甾醇、3b,5a-二羟基胆甾-6-酮、D环取代的甾醇、3β-羟基-5α-胆甾-8(14)-烯-15-酮、3β-羟基-5α-胆甾烷-15-酮、5α-胆甾-8(14)-烯-3β,15α-二醇、5α-胆甾-8(14)-烯-3β,15β,-二醇、羊毛甾醇95、5α-7,24-胆甾二烯、14-脱氢酵母烯醇、麦角甾-5,7,9(11),22-四烯-3β-醇、胆甾-5-烯-3β、25-二醇、胆甾-(25R)-5-烯-3β,27-二醇、24(R/S),25-环氧胆固醇、24(S),25-环氧胆固醇、24(R/S),25-环氧胆固醇-d6、胆甾-5-烯-3β,22(S)-二醇、胆甾-5-烯-3β,22(R)-二醇、胆甾-5-烯-3β,24(S)-二醇、胆甾-5-烯-3β,24(R)-二醇、27-羟基-4-胆甾烯-3-酮、菜油甾烷醇、N,N-二甲基-3β-羟基胆酰胺、25,27-二羟基胆固醇、N,N-二甲基-3β-羟基胆酰胺、25,27-二羟基胆固醇、5-胆甾烯-3β,20α-二醇,24S,25-环氧-5α-胆甾-8(9)-烯-3β-醇、24(S/R),25-环氧羊毛甾-8(9)-烯-3β-醇、7-酮-27-羟基胆固醇、7α,27-二羟基-4-胆甾烯-3-酮、7α,27-二羟基胆固醇、7β,27-二羟基胆固醇、5α,6β-二羟基胆甾烷醇、7α,25-二羟基胆固醇、7β,25-二羟基胆固醇、7α,24(S)-二羟基胆固醇、7α,24(S)-二羟基-4-胆甾烯-3-酮、7-酮-25-羟基胆固醇、7α,24S,27-三羟基胆固醇,二氢睾酮、睾酮、雌酮、雌激素、雌二醇、皮质酮、皮质醇、或24S,27-二羟基胆固醇。
制备包封mRNA的LNP
如上所述，在一些实施方案中，mRNA分子被包封在LNP内。在一些实施方案中，可将mRNA和LNP的脂质混合和/或纯化，从而提供所述包含或包封在其中。在一些实施方案中，mRNA和LNP的脂质可以混合和/或纯化，从而提供包含或包封在LNP内的上述比例的mRNA。
在一些方面，提供了一种获得组合物的方法，该组合物包含mRNA和LNP，其中mRNA以上述比例包封在LNP内，其中LNP包含上述脂质；该方法包括混合包含重组RNA分子的第一溶液和包含上述脂质的第二溶液。在一些实施方案中，混合至少通过T型混合器、微流体或冲击喷射混合器进行。在一些实施方案中，第一溶液还包含柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸钠)或乙酸盐缓冲液(例如，乙酸钠)。
在一些实施方案中，第二溶液还包含有机溶剂。在一些实施方案中，有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷、二乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇、苯甲醇和脂族醇(例如，C1至C8醇)。在一些实施方案中，脂族醇包括乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇、苯甲醇和己醇。在一些实施方案中，有机溶剂包括醇溶液。在一些实施方案中，有机醇溶液包含70体积％至100体积％的乙醇。
在一些实施方案中，该方法包括将包含重组RNA分子和LNP的上述脂质的第一溶液与为水溶液的第二溶液混合。在一些实施方案中，LNP的RNA和脂质在有机溶剂中混合。在一些实施方案中，有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷、二乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇、苯甲醇和脂族醇(例如，C1至C8醇)。在一些实施方案中，脂族醇包括乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇、苯甲醇和己醇。在一些实施方案中，有机溶剂包括醇溶液。在一些实施方案中，有机醇溶液包含70体积％至100体积％的乙醇。在一些实施方案中，有机醇溶液包含70体积％至100体积％的乙醇和30体积％至0体积％的苯甲醇。在一些实施方案中，水溶液包含柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸钠)或乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸钠)。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液以1:1至5:1、2:1至4:1、2.5:1至3.5:1或3:1的比例混合。
在一些实施方案中，第一和第二溶液(即，上述两种方法中的任一种)的混合是在4.5至第一脂质(例如，阳离子可电离脂质)的pKa的pH下进行，从而获得第一混合物。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液的混合在4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0至第一脂质(例如，阳离子可电离脂质)的pKa的pH下进行，从而获得第一混合物。在一些实施方案中，该方法还包括第一增加，其是将第一混合物的pH增加至等于或高于第一脂质的pKa，从而获得pH调节的第一混合物。在一些实施方案中，第一增加获得pH调节的第一混合物，其pH从第一脂质(例如，阳离子可电离脂质)的pKa至：9.0、8.9、8.8、8.7、8.6、8.5、8.4、8.3、8.2、8.1、8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2、7.1或7.0。
在一些实施方案中，第一增加或纯化包括错流过滤或切向流过滤。在一些实施方案中，第一增加或纯化还包括将包含LNP和重组RNA分子的组合物转移至不同于第一溶液的第三溶液中。在一些实施方案中，第三溶液包含磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，转移包括透析。在一些实施方案中，切向流过滤包括使用中空纤维过滤器。在一些实施方案中，中空纤维包括聚醚砜中空纤维过滤器或聚砜中空纤维过滤器。
在一些实施方案中，第一增加或纯化包括在上述过滤之前使LNP/RNA混合物通过离子交换固态支持物。在一些实施方案中，离子交换固态支持物包括阴离子交换柱或阳离子交换柱。
在一些实施方案中，在将mRNA与LNP的脂质混合之前，将LNP的脂质与有机溶剂混合以获得浓缩原液(例如，原液脂质/有机溶剂混合物)。在一些实施方案中，混合(例如，将原液脂质/有机溶剂混合物在25℃至37℃下搅拌、摇动、涡旋、超声处理或搅动)至少5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟或40分钟以形成均质原液脂质/有机溶剂混合物。在一些实施方案中，混合(例如，将原液脂质/有机溶剂混合物在25℃至37℃下搅拌、摇动、涡旋、超声处理或搅动)不超过10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.1小时、1.2小时、1.3小时、1.4小时或1.5小时以形成均质原液脂质/有机溶剂混合物。考虑到上述实施方案，考虑并支持任何上述“至少”的时间量和“不超过”的时间量可以组合以提供封闭范围(即，将原液脂质/有机溶剂混合物在25℃至37℃下搅拌、摇动、涡旋、超声处理或搅动5分钟至19分钟)。
方案
本发明涉及一种治疗慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，该方法通过向人施用编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA，以及编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA。在一个实施例中，共同施用第一和第二mRNA。在共同施用的第一实施例中，第一和第二mRNA在单独的LNP制剂中，其在施用前混合到单一组合物中。这可以在施用前立即在床边进行。在共同施用的第二实施例中，将第一和第二mRNA共同配制到单个LNP中。在共同施用的第三实施例中，将第一和第二mRNA共同填充到单个小瓶中。
因此，本发明涵盖包含编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA和编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA的免疫原性组合，其中第一和第二mRNA在单独的LNP制剂中。本发明还包括通过混合单独的LNP制剂形成的所得组合物。
本发明还涵盖包含编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA和编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA的免疫原性组合物。在此类组合物中，第一和第二mRNA可以由单独的LNP包封，或者第一和第二mRNA可以配制在相同的LNP中。
本发明涵盖通过向人施用编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA与至少一种重组乙型肝炎多肽的组合来治疗慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法。组分(例如，mRNA和重组乙型肝炎多肽)可以在异源初免-加强方案中顺序施用。如果使用异源初免-加强方案，mRNA优选作为初免剂量施用，并且至少一种重组乙型肝炎多肽作为加强剂量施用。在该方案中，该方法包括首先施用mRNA，然后施用重组乙型肝炎多肽。在另一个方面，至少一种重组乙型肝炎多肽作为初免剂量施用，并且mRNA作为加强剂量施用。在该方案中，该方法包括施用重组乙型肝炎多肽，然后施用mRNA。在进一步的方面，至少一种重组乙型肝炎多肽作为初免剂量施用，并且mRNA与佐剂化重组蛋白一起作为加强剂量施用。在该方案中，该方法包括施用重组乙型肝炎多肽，然后施用mRNA与重组蛋白。
在一些实施方案中，至少一种乙型肝炎病毒多肽是重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)或其组合中的至少一种。至少一种重组乙型肝炎多肽可以与或不与佐剂一起施用。在优选的实施方案中，mRNA与佐剂化重组乙型肝炎多肽一起顺序施用，其中重组乙型肝炎多肽包括乙型肝炎小表面(HBs)和乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原两者。在该实施方案中，佐剂优选为AS01。
在这样的方案中，可以存在多个初免和/或加强剂量。在一个实施方案中，存在mRNA的单次初免和至少一种重组乙型肝炎多肽的多个后续剂量。例如，两个剂量的重组乙型肝炎多肽。在另一个实施方案中，存在多个初免剂量的mRNA和多个后续剂量的重组乙型肝炎多肽。例如，两个剂量的mRNA，然后是两个剂量的重组乙型肝炎多肽。在另一个实施方案中，存在至少一种重组乙型肝炎多肽的单次初免和所述mRNA的多个后续剂量。在又一个实施方案中，存在多个初免剂量的重组乙型肝炎多肽和多个后续剂量的mRNA。
在其他实施方案中，mRNA与至少一种重组乙型肝炎多肽同时施用。这些组分的进一步剂量可随后在稍后时间施用。在一些实施方案中，mRNA与至少一种重组乙型肝炎多肽同时施用。至少一种重组乙型肝炎多肽是重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)或其组合中的至少一种。重组HBc可以是全长的或截短的，优选截短的。至少一种重组乙型肝炎多肽可以与或不与佐剂一起施用。在一个实施方案中，mRNA与佐剂化重组乙型肝炎多肽同时施用，其中重组乙型肝炎多肽包括乙型肝炎小表面(HBs)和乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原两者。在这种情况下，佐剂优选为AS01。
在这些上述实施方案中，重组乙型肝炎表面抗原(HBs)可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在此类上述实施方案中，重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)可具有SEQ ID NO:2或11的氨基酸序列。优选地，HBc具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在所有这些方案中，至少一种重组乙型肝炎多肽可以与合适的佐剂一起施用。合适的佐剂是那些可以增强患有慢性疾病和免疫能力被破坏的受试者的免疫应答的佐剂。CHB患者的特征在于他们不能对病毒产生有效的先天和适应性免疫应答，这使得有效的疫苗开发具有挑战性。在这些患者中，佐剂疫苗制剂的一个关键功能应旨在将细胞介导的免疫应答导向被认为对去除细胞内病原体至关重要的辅助性T细胞1(Th1)谱。
合适的佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如无机金属盐如磷酸铝或氢氧化铝)、有机非肽佐剂(例如皂苷，如QS21或角鲨烯)、油基佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒佐剂(例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒粒子、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL)(例如3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)或胞壁酰肽)、合成佐剂(例如非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物或合成脂质A)、合成多核苷酸佐剂(例如聚精氨酸或聚赖氨酸)和含有未甲基化CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。特别地，佐剂可以是有机非肽佐剂(例如皂苷，如QS21或角鲨烯)和/或细菌佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL)(例如3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)))。
一种合适的佐剂是单磷酰基脂质A(MPL)，特别是3-O-脱酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)。化学上，它通常作为具有4、5或6条酰化链的3-O-脱酰化单磷酰基脂质A的混合物提供。它可以通过GB 2122204B中教导的方法纯化和制备，该参考文献还披露了二磷酰基脂质A及其3-O-脱酰基变体的制备。已经描述了其他纯化和合成的脂多糖[美国专利号6,005,099和EP0729473B1；Hilgers，1986；Hilgers，1987；和EP0549074B1]。
皂苷也是合适的佐剂[Lacaille-Dubois，1996]。例如，皂苷Quil A(来源于南美的皂皮树)及其级分描述于美国专利号5,057,540和Kensil，1996；和EP 0 362 279B1。Quil A的纯化级分也被称为免疫刺激剂，例如QS21和QS17；它们的制备方法公开于美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1中。在Kensil，1991中进一步描述了QS21的使用。QS21和聚山梨酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含QuilA级分如QS21和QS7的颗粒佐剂系统。
佐剂如上述那些可以与载体如脂质体、水包油乳液和/或金属盐(包括铝盐如氢氧化铝)一起配制。例如，3D-MPL可以用氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳液(WO 95/17210)配制；QS21可以用含胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)配制。
佐剂的组合可用于所披露的组合物中，特别是单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合(参见例如WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)，更特别是如WO 94/00153中所披露的QS21和3D-MPL的组合，或如WO 96/33739中所披露的其中QS21在含胆固醇脂质体(DQ)中被淬灭的组合物。在WO 95/17210中描述了在水包油乳液中涉及QS21、3D-MPL和生育酚的强效佐剂制剂，并且其是可用于所披露的组合物中的另一种制剂。因此，合适的佐剂系统包括例如单磷酰基脂质A(优选3D-MPL)与铝盐的组合(例如如WO00/23105中所述)。另一示例性佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。如WO 96/33739中所披露的，QS21可以在含胆固醇的脂质体中被淬灭。
因此，与至少一种重组乙型肝炎多肽一起使用的合适佐剂是AS01(有时称为“AS-01”)，其是含有MPL和QS-21的基于脂质体的佐剂。作为MPL和QS-21免疫增强剂的媒剂的脂质体由磷酸盐缓冲盐水溶液中的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇构成。AS01B-4是AS01佐剂的一种特别优选的变体，由免疫增强剂QS-21(从皂皮树的树皮中纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂质A)以及DOPC/胆固醇脂质体(作为这些免疫增强剂的媒剂)和PBS溶液中的山梨糖醇构成。特别地，单次人剂量的AS01B-4(0.5mL)含有50μg QS-21和50μg MPL。AS01E-4相当于AS01B-4的两倍稀释，即它含有25μg QS-21和25μg MPL/人剂量。
在所有这些方案中，在优选的实施方案中，mRNA编码与或不与hli融合的乙型肝炎核心(HBc)多肽。由mRNA编码的HBc可以是全长的或截短的，优选全长的。在优选的实施方案中，由mRNA编码的HBc是全长的并且与hli融合。在另一个优选的实施方案中，mRNA编码与或不与hli融合的全长乙型肝炎核心(HBc)抗原，和与或不与hli融合的乙型肝炎表面蛋白(HBsAg)。优选地，HBsAg是与或不与hli融合的乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。在另一个优选的实施方案中，乙型肝炎小表面蛋白(HBs)与hli融合。
由mRNA编码的HBc和/或由mRNA编码的HBs优选与hIi融合。
本发明还包括通过向人施用腺病毒载体来治疗慢性乙型肝炎感染(CHB)，所述腺病毒载体包含编码乙型肝炎多肽的多核苷酸与编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA的组合。组分可以异源初免-加强方案施用。如果使用初免-加强方案，腺病毒载体优选作为初免剂量施用，mRNA作为第一加强剂量施用。在这样的方案中，可以存在多个初免和/或加强剂量。在一个实施方案中，存在腺病毒载体(如复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体)的单次初免，以及包含mRNA和/或重组HBV多肽的多个后续加强剂量。
在异源初免-加强方案的替代实施方案中，mRNA用作第一初免剂量，腺病毒载体(如复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体)用作第一加强剂量。
本发明还包括通过向人施用(i)包含编码乙型肝炎多肽的多核苷酸的腺病毒载体，和(ii)包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)、重组乙型肝炎核心抗原(HBc)和佐剂的组合物，与编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA组合来治疗慢性乙型肝炎感染(CHB)。
本发明还可以包括施用多个后续剂量的mRNA。在这样的实施方案中，用于初免和加强剂量的mRNA优选是相同的。
受试者
本发明旨在用于人受试者。待使用本发明的方法治疗的受试者可以是任何年龄。
本发明的方法适合用于治疗HBV，即用于向感染乙型肝炎病毒的受试者施用。受试者可以仅感染乙型肝炎病毒，或同时感染乙型肝炎和丁型肝炎病毒。
制剂和施用
mRNA可以通过各种合适的途径施用，包括肠胃外施用，例如肌内或皮下施用。合适地，mRNA肌内施用。
mRNA可以以液体或干燥(例如冻干)形式提供。优选的形式将取决于多种因素，例如mRNA的精确性质，例如mRNA是否易于干燥，或者可能存在的其他组分。
优选地，mRNA以液体形式提供。
用于在施用前与其他组合物组合的包含mRNA的组合物本身不需要具有生理上可接受的pH或生理上可接受的张力；用于施用的制剂应该具有生理上可接受的pH值和生理上可接受的渗透压。
液体制剂的pH根据组合物的组分和对人类受试者施用的必要适宜性来调节。
对于肠胃外施用，溶液应该具有生理上可接受的渗透压，以避免过度的细胞变形或溶解。生理上可接受的渗透压通常是指溶液的渗透压接近等渗或轻度高渗。重量克分子渗透压浓度(osmolality)可以根据本领域已知的技术来测量，例如通过使用可商购的渗透压计，例如可从Instruments Inc.(USA)获得的Advanced Model 2020。
用于重构的液体基本上是水性的，例如注射用水、磷酸盐缓冲盐水等。如上所述，对缓冲液和/或张力调节剂的需求将取决于被重构的容器的内容物和重构内容物的后续用途。缓冲液可选自醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和TRIS。缓冲液可以是磷酸盐缓冲液，例如Na/Na2PO4，Na/K2PO4或K/K2PO4。
mRNA可以在各种物理容器中提供，例如小瓶或预填充的注射器。
在一些实施方案中，mRNA以单剂量的形式提供。在其他实施方案中，mRNA以多剂量形式提供，例如包含2、5或10个剂量。
通常，液体在容器之间转移，例如从小瓶转移到注射器，以提供“超额”，确保所需的全部体积可以方便地转移。所需的超额水平将视情况而定，但应避免超额以减少浪费，超额不足可能会造成实际困难。超额可以是20至100ul/剂量，例如30ul或50ul。
可以存在稳定剂。当提供多剂量容器时，稳定剂可能特别重要，因为最终制剂的剂量可以经一段时间施用给受试者。
制剂优选是无菌的。
建立强而持久的免疫的方法通常包括重复免疫，即通过施用一次或多次进一步的剂量来增强免疫应答。这种进一步的施用可以用相同的免疫原性组合物(同源加强)或不同的免疫原性组合物(异源加强)进行。本发明可以作为同源或异源的初始/加强方案的一部分，作为初免或加强免疫应用。
因此，mRNA的施用可以是多剂量施用方案的一部分。例如，mRNA可以在多剂量方案中作为初免剂量提供，例如两剂量、三剂量、四剂量、五剂量、六剂量、七剂量、八剂量、九剂量、十剂量、十一剂量、十二剂量或更多剂量的方案，特别是在六个月内施用的六剂量方案。mRNA可以在多剂量方案中作为加强剂量提供，特别是两剂量、三剂量、四剂量、五剂量、六剂量、七剂量、八剂量、九剂量、十剂量、十一剂量、十二剂量或更多剂量方案，例如在六个月内施用的六剂量方案。在一个特定实施例中，mRNA作为四剂量方案施用。
初免和加强剂量可以是同源或异源的。因此，mRNA可以在同源多剂量方案中作为初免剂量和加强剂量提供，特别是两剂量、三剂量、四剂量、五剂量、六剂量、七剂量、八剂量、九剂量、十剂量、十一剂量、十二剂量或更多剂量的方案，特别是在六个月内施用的六剂量方案。在一个实施例中，mRNA作为四剂量方案施用。可替代地，mRNA可以在异源多剂量方案中作为初免剂量或加强剂量提供，特别是两剂量、三剂量、四剂量、五剂量、六剂量、七剂量、八剂量、九剂量、十剂量、十一剂量、十二剂量或更多剂量的方案，特别是在六个月内施用的六剂量方案，并且一个或多个加强剂量可以是不同的(例如mRNA；或替代抗原呈递如蛋白质或病毒载体抗原-有或没有佐剂，如AS01或角鲨烯乳剂佐剂)。在一个实施例中，mRNA作为四剂量方案施用。
剂量之间的时间可以是两周到六个月，例如三周到三个月。优选地，每月同时施用两个剂量——一个初免剂量和一个加强剂量——持续六个月。也可以提供定期的长期加强剂量，例如每2至10年一次。
本发明涵盖包含编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA和编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA的免疫原性组合或组合物。在一个实施例中，免疫原性组合包含编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA和编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA，其中第一和第二mRNA在单独的LNP制剂中。
在另一个实施例中，免疫原性组合物包含编码第一乙型肝炎病毒抗原的第一mRNA和编码第二乙型肝炎病毒抗原的第二mRNA。第一和第二mRNA可以由单独的LNP包封，或者第一和第二mRNA可以共同配制在相同的LNP中。
在一些实例中，组合或组合物包含按重量计相等量的第一和第二mRNA。然而，在其他实例中，组合或组合物可包含按重量计不等量的第一和第二mRNA。在一些实施方案中，第一乙型肝炎病毒抗原是HBc，并且第二乙型肝炎病毒抗原是HBs。在此类实施方案中，所述组合或组合物按重量计含有比第二mRNA更多的第一mRNA。
在含有HBc和HBs mRNA两者的制剂的实施例中，组合物含有等量(按重量计)的HBc和HBs mRNA。然而，在一个实施例中，组合物包含按重量计比编码HBs的mRNA(HBs-mRNA)更多的编码HBc的mRNA(“HBc-mRNA”)。在一个实施例中，当与HBs-mRNA相比时，组合物含有1.25至2倍量的HBc-mRNA，例如1.5至2倍量的mRNA。在一个特定实施例中，组合物含有HBs-mRNA的1.5倍重量的HBc-mRNA。
在另一个实施例中，提供了免疫原性组合，其包含：
·第一组合物，其包含包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA和包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的mRNA；和
·第二组合物，其包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)和AS01。
该组合可用于通过顺序施用或伴随施用第一和第二组合物来治疗慢性乙型肝炎(CHB)的方法中。第一组合物可包含共同配制在单一LNP中的编码HBc和HBs的mRNA。可替代地，可以将编码HBc和HBs的mRNA配制成单独的LNP，并将这些LNP共填充到单个小瓶中。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本领域普通技术人员所理解的相同的含义。
贯穿说明书，包括权利要求书，其中在上下文允许的情况下，术语“包含”及其变体如“包括”应被解释为包括所陈述的一个或多个要素(例如整数)，而不必然排除任何其他要素(例如整数)。因此,“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括一些另外的，例如X+Y。
表述“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
关于数值x的术语“约”或“近似”是任选的，表示例如给定数值的x±10％，如给定数值的x±5％。
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非所述内容另有清楚地指示。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，组分可以以任何顺序混合。如果有三个组分，那么两个组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，等等。
术语“蛋白质”、“多肽”、“抗原”和“肽”在本文中可互换使用，并且是指任何肽连接的氨基酸链，无论长度、共翻译或翻译后修饰如何。融合蛋白(或“嵌合蛋白”)是包含两个或更多个肽连接蛋白的重组蛋白。融合蛋白通过连接两个或更多个最初编码单独蛋白质的基因而产生。该融合基因的翻译产生单个融合蛋白。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指由核苷酸单体制备的聚合大分子。合适地，本发明的多核苷酸是重组的。重组是指多核苷酸是克隆、限制性消化或连接步骤或产生不同于自然界中发现的多核苷酸的其他程序中的至少一种的产物。
异源核酸序列是指不是从以下分离、衍生或基于以下的任何核酸序列：宿主生物体中发现的天然存在的核酸序列。“天然存在的”意指在自然界中发现的、非合成制备或修饰的序列。当序列从来源分离但被修饰(例如，通过缺失、取代(突变)、插入或其他修饰)时，该序列是“衍生自”该来源的，合适地不破坏来源基因的正常功能。
合适地，本发明中使用的多核苷酸是分离的。“分离的”多核苷酸是从其原始环境中取出的多核苷酸。例如，如果天然存在的多核苷酸与天然系统中的一些或全部共存物质分离，则该多核苷酸是分离的。如果例如将多核苷酸克隆到不是其天然环境的一部分的载体中或如果其包含在cDNA中，则认为多核苷酸是分离的。
如本文所用，“伴随”施用是指在同一个正在进行的免疫应答期间施用。优选地，两种组分同时施用(例如伴随施用包含载体的组合物和包含蛋白质的组合物)，然而，一种组分可以在几分钟内(例如，在同一医疗预约或医生就诊时)或在几小时内施用。这种施用也称为共同施用。在一些实施方案中，伴随施用可以指腺病毒载体和蛋白质组分的施用。在其他实施方案中，共同施用是指施用腺病毒载体和另一种病毒载体，例如痘病毒如MVA。在其他实施方案中，共同施用是指施用腺病毒载体和蛋白质组分，其中所述蛋白质组分是佐剂化的。
“顺序”施用是指施用第一组合物，随后在显著长的时间之后施用第二组合物，例如不在由第一施用产生的正在进行的免疫应答期间。因此，顺序施用涵盖初免-加强情况中的第一次和后续施用。两次连续施用之间的时间段为例如1周、2周、4周、6周、8周或12周。更具体地，其是4周或8周。
术语“佐剂”是指在细胞或体液水平上增强、刺激、激活、强化或调节对组合物的抗原的免疫应答的试剂，例如免疫佐剂刺激免疫系统对抗原的应答，但其本身不具有免疫作用。本文披露的免疫原性组合物可以包括佐剂作为制剂中的单独成分，无论组合物中包含的载体(或其另一组分)是否也编码“遗传佐剂”，如hIi。
实施例
已经在小鼠中产生了比较具有或不具有人恒定链的SAM-HBV的免疫原性的临床前数据(下面的实施例1)。此外，还产生了临床前数据，其比较了使用MVA-HBV和ChAd155-hIi-HBV中的一种或多种的疫苗接种方案与使用至少一种SAM-hIi-HBV构建体的疫苗接种方案的免疫原性(下面的实施例2)。还产生了观察HLA-A2/DRB1初试小鼠中共同施用的LNP-mRNA的免疫原性的临床前数据(下面的实施例3)。
这些实验表明，与没有人恒定链的构建体相比，含有与乙型肝炎核心抗原(HBc)融合的人恒定链(hIi)的经LNP配制的SAM-HBV诱导了更高频率的HBc特异性CD8+ T细胞应答(即，发现更高百分比的HBc特异性CD8+细胞显示应答)(下面的实施例1)。此外，已经显示使用SAM-hIi-HBV可以在HBV慢性感染小鼠模型中诱导更高频率的HBc和HBs特异性CD8+ T细胞应答(下面的实施例2)。此外，实验显示了共同施用LNP配制的hli-HBc和hli-Hbs mRNA的优选比率(下面的实施例3)。
在所有这些实验中，使用HLA.A2/DRB1小鼠(对于人HLA-A2和HLA-DRB1分子是转基因的)来评估HBV mRNA疫苗诱导HBc特异性CD8+T细胞应答的能力。在相同的HLA.A2/DRB1小鼠中评估HBV特异性CD4+T细胞和抗体。
ChAd155-hIi-HBV药物物质的产生：
ChAd155-hIi-HBV药物物质的制造涉及将Procell-92.S细胞培养至确定的细胞密度。然后以确定的感染复数用ChAd155-hIi-HBV主病毒种子(MVS)感染细胞。通过基于阴离子交换色谱的多步骤方法纯化ChAd155-hIi-HBV病毒收获物。
ChAd155-hIi-HBV的疫苗配制和灌装：
纯化的ChAd155-hIi-HBV原料药物物质(bulk Drug Substance)随后如下处理：
·在配制缓冲液中稀释纯化的ChAd155-hIi-HBV药物物质。
·无菌过滤。
·灌装最终容器。
ChAd155-hIi-HBV疫苗是容纳在小瓶中的液体制剂。
MVA-HBV药物物质的产生：
在鸡胚成纤维细胞(CEF)的原代细胞培养物中生产MVA-HBV药物物质至规定的细胞密度，然后以规定的感染复数用MVA-HBV主病毒种子(MVS)感染。通过基于分级梯度离心的多步骤方法纯化MVA-HBV病毒收获物。
MVA-HBV的疫苗配制和灌装：
纯化的MVA-HBV原料药物物质随后进行如下处理：
·在配制缓冲液中稀释纯化的MVA-HBV DS。
·灌装最终容器。
MVA-HBV疫苗是一种液体制剂，装在可抽取体积为0.5mL的小瓶中。
HBc药物物质的产生：
HBc DS生产工艺由以下组成：使用重组大肠杆菌工作种子接种预培养瓶，随后进行发酵工艺和多步纯化工艺，包括收获、提取、澄清以及多个色谱和过滤步骤。
HBs药物物质的产生：
HBs DS生产工艺由以下组成：使用重组酿酒酵母工作种子接种预培养瓶，随后进行发酵工艺和多步纯化工艺，包括收获、提取、澄清以及多个色谱和过滤步骤。
HBc和HBs的疫苗配制和灌装：
将纯化的HBs和HBc DS稀释在包括蔗糖作为冷冻保护剂和泊洛沙姆作为表面活性剂的配制缓冲液中，装入4mL透明玻璃小瓶中并冻干。
AS01佐剂系统的剂量：
AS01B-4佐剂系统由以下构成：免疫增强剂QS-21(一种从皂皮树的皮中纯化的三萜糖苷)和MPL(3-D单磷酰脂质A)(使用脂质体作为这些免疫增强剂的媒剂)和山梨醇。具体而言，AS01B-4的单个临床剂量容器(0.5mL)含有50μg QS-21和50μg MPL。人剂量的1/10，即50μl是小鼠中注射的体积(对应于5μg QS-21和MPL)。
mRNA构建体的产生：
质粒用BspQI限制性内切酶线性化以产生用于体外转录的DNA模板。mRNA是使用封端类似物TRILINK CLEANCAP A/G和100％ N1-甲基伪尿苷通过体外转录产生的，然后进行DNA酶I、磷酸酶处理和硅胶柱纯化。新合成的mRNA通过毛细管凝胶电泳和变性琼脂糖凝胶进行验证。
SAM-HBV和SAM-hIi-HBV构建体的产生：
将HBV和hli-HBV序列进行密码子优化以用于人蛋白表达，合成并通过GENEWIZ克隆到SAM质粒中。RNA通过体外转录合成。简而言之，编码SAM复制子的DNA质粒通过用BspQI在聚A尾的3'末端进行限制性消化而线性化，并通过苯酚-氯仿提取纯化。线性化的DNA用作模板，用于使用T7 RNA聚合酶的体外转录反应。体外转录之后使用痘苗加帽试剂盒进行RNA的加帽，并通过LiCl沉淀纯化RNA并重悬于无核酸酶的水中。
LNP与SAM的制备遵循通过微流体混合制备LNP的既定方法，其中脂质(阳离子脂质、两性离子脂质、胆固醇和PEG-脂质缀合物)溶解在乙醇溶液中，并且SAM溶解在水性缓冲溶液中。使用微流体混合室将乙醇溶液和水溶液快速混合在一起。包封SAM的脂质纳米颗粒通过混合物中过饱和脂质的成核自发形成。脂质的缩合和沉淀捕获SAM并形成脂质纳米颗粒。在LNP短暂成熟后，然后将SAM-LNP的缓冲液交换到储存缓冲液中。对SAM-LNP溶液的大小、脂质含量、RNA截留和体外效力进行表征。
SAM载体VEE TC-83在实施例中用作克隆的背景构建体。背景空构建体具有核酸序列SEQ ID NO:16。
图14的HBV-SAM构建体的设计包括克隆在SAM载体的亚基因组启动子下的序列，该序列编码HBV抗原。对SAM HBV构建体进行修饰，包括抗原编码序列的密码子优化。
评估SAM构建体的稳健抗原产生和抗原性，并使用体内模型进一步测试其免疫原性和功效。
设计并获得具有SEQ ID NO:17和19的序列的SAM构建体，用于在以下实施例中进一步表征和测试。
SAM-HBV和SAM-hIi-HBV构建体的表征：
RNA模式同质性评估
为了研究RNA模式的同质性，在1％琼脂糖凝胶中分析RNA样品。如下制备RNA样品：将100-250ng RNA与3uL上样缓冲液(50mM EDTA pH8，30％w/v蔗糖，0.05％溴酚蓝)和水混合至10uL的最终体积。样品在50℃变性20分钟。琼脂糖凝胶在NorthernMax-Gly凝胶运行缓冲液(InvitrogenTM)中在130V下运行45分钟。没有观察到主要的RNA降解，并且在两种构建体之间获得了相似的模式。
通过蛋白质印迹评估蛋白质表达
根据以下方法评估细胞从不同HBV SAM构建体表达给定抗原的能力。
在第0天，将幼年仓鼠肾(BHK)细胞以1×107接种在T225烧瓶中的生长培养基(DMEM高葡萄糖(GibcoTM)、1％ L-谷氨酰胺、1％Pen-Strep5％FBS(GibcoTM))中。对于胰蛋白酶消化，除去培养基并用5mL PBS洗涤细胞。除去PBS洗涤液，加入5mL预热的胰蛋白酶并将其完全铺展在板上。除去胰蛋白酶并将板在37℃下保持1-2分钟。然后将细胞重悬于10mL生长培养基中。将细胞计数并以所需浓度接种到新烧瓶中。然后将细胞在37℃、5％ CO2下孵育约20小时。
在第1天，通过向6孔板(一个孔/电穿孔)的每个孔中添加2mL生长培养基(DMEM高葡萄糖、1％ L-谷氨酰胺、1％Pen-Strep、1％FBS)来准备板。将板在37℃培养箱中保温。制备电穿孔器以递送120V、25ms脉冲、0.0脉冲间隔、1个脉冲(用于2mm比色皿)。比色皿贴上标签并保存在冰上。将处于生长期的细胞收获到BHK生长培养基中，并使用细胞计数器计数。按照与上述相同的胰蛋白酶消化方案对细胞进行胰蛋白酶消化。然后将细胞以462x g离心3分钟。吸出培养基，用20mL冷Opti-MEM培养基(GibcoTM)洗涤细胞一次。将细胞再次以462xg离心5分钟。吸出培养基并将细胞重悬于Opti-MEM培养基中至0.25mL/1x106个细胞/电穿孔。还制备了标准品和阴性对照品。
对于每个样品，将2ug RNA与250μL细胞混合，并将混合物轻轻移液4-5次。将细胞和RNA混合物转移到2mm比色皿中，并使用上述参数进行一个电穿孔脉冲。使细胞在室温下静置10分钟。将来自一个比色皿的细胞添加到预热的6孔板的一个孔中，并将板前后倾斜，然后以45°角左右倾斜以均匀分布细胞。在第2天(电穿孔后17h)，收集细胞培养上清液并以不同浓度通过蛋白质印迹进行分析。将细胞单层分离并重悬于1mL补充有cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche，目录号11697498001)的20mM HEPES、150mM NaCl、5％甘油pH 7.6缓冲液中，然后通过超声处理进行细胞裂解。细胞裂解后，通过蛋白质印迹分析细胞内级分。使用的一抗是小鼠抗HBc单克隆抗体和兔抗HBs多克隆血清(内部产生)。
LNP配制后SAM的体外效力
在LNP配制后也进行体外效力测定。
细胞免疫应答-细胞内细胞因子染色(ICS)：
将在不同时间点收集的外周血白细胞(PBL)、脾细胞或肝浸润淋巴细胞的新鲜池用15-mer重叠11aa(覆盖HBc或HBs序列)的池离体刺激6小时。通过ICS测量表达IFN-γ和/或IL-2和/或肿瘤坏死因子(TNF)-α的CD4+或CD8+T细胞的量来评估HBc和HBs特异性细胞应答。考虑ICS结果的技术可接受标准包括获得的CD8+ T或CD4+ T细胞的最小数量>3000个事件。
体液免疫应答-酶联免疫吸附测定(ELISA)：
通过ELISA在不同时间点对来自免疫小鼠的血清测量HBc-和HBs-特异性抗体应答。简而言之，用纯化的乙型肝炎核心抗原(HBc)或用纯化的乙型肝炎表面抗原(HBs)包被96孔Elisa板。将来自疫苗接种的小鼠的血清连续稀释并孵育。标准品和对照材料的系列稀释液用于计算测试的血清的抗HBc或抗HBs抗体标准品滴度，并确保测试的有效性。在每个孵育步骤后，用PBS 0.1％tween20缓冲液洗涤板。然后添加辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体，通过与四甲基联苯胺液体底物(TMB)孵育显示抗体复合物。在450-620nm处记录光密度(OD)。使用回归模型由ELISA的标准曲线测定每个个体小鼠血清的抗HBc或HBs抗体滴度。然后计算各组小鼠的几何平均滴度(GMT)。对于每个时间点和每个抗原(HBc、HBs)，在log10滴度上拟合方差分析(ANOVA)模型，包括作为固定效应的组、研究和相互作用，并使用异质性方差模型(不假设组间方差相同)。该模型用于估计几何平均值(及其95％ CI)以及几何平均值比率及其95％ CI。由于没有设定预定义的标准，因此分析是描述性的，在没有调整多重性情况下计算组间比率的95％ CI。
ALT/AST测量：
使用以下市售试剂盒定量小鼠血清中ALT和AST的水平：
·丙氨酸氨基转移酶活性测定试剂盒Sigma Aldrich目录号MAK052
·天冬氨酸氨基转移酶活性测定试剂盒Sigma Aldrich目录号MAK055
血清HBs抗原定量
使用来自BIO-RAD的Monolisa Anti-HBs PLUS商业试剂盒(目录号72566)和国际标准(Abbott Diagnostics)定量小鼠血清中的循环HBs抗原。
实施例1：具有或不具有人恒定链的SAM-HBV
在该实验中，雄性和雌性HLA.A2/DR1初试小鼠在第0天和第28天接受肌内注射。在第0天和第28天施用给不同组的组合物详述于下表1中。
表1：
(注：SAM-hIi-HBV是SEQ ID NO:17的构建体，SAM-HBV是SEQ ID NO:19的构建体)
除对照组7外，所有组均使用14只小鼠(N＝14)。在第一次注射后14天(14dpI)，处死来自每组的2只小鼠，以便可以采集脾脏样品和血清样品并在该时间点测量T细胞应答，并且从所有小鼠采集血清样品。在第二次注射(12/13dpII)后12和13天，将剩余的动物全部处死，并采集脾脏、肝脏和血清样品。
对于组1至6，所有小鼠均用ChAd155-hIi-HBV初免并用SAM-HBV(±hIi)加强。施用相同剂量的ChAd155-hIi-HBV：108vp/小鼠。然而，SAM-HBV(±hIi)使用了三种不同的剂量：2.5μg、1μg和0.1μg。各组中使用的具体剂量在上表1中指定。
实施例1产生的HBc-和HBs-特异性CD4+和CD8+ T细胞应答以及HBc-和HBs-特异性抗体应答如图1、2和3所示。图1显示CD4+应答，图2显示CD8+应答，图3显示抗体应答。在所有这些图中，图“A”表示乙型肝炎核心抗原应答，图“B”表示乙型肝炎表面抗原应答。
如图2A和2B所示，与没有恒定链的构建体(SAM-HBV)相比，显示包含恒定链的SAM构建体(SAM-hIi-HBV)诱导显著更高频率的针对HBc的HBc特异性CD8+ T细胞应答(几何平均值比率，GMR＝4.1，95％CI[1.96-8.40])。首先计算用SAM-hIi-HBV免疫的小鼠组的HBc特异性CD8+T细胞应答的几何平均值，然后计算用SAM-HBV免疫的小鼠组的几何平均值。然后计算这2个几何平均值的比率。在这种情况下，我们观察到SAM-hIi-HBV诱导了4倍更高的HBc特异性CD8+ T细胞应答。
HBV感染的有效控制与特异性靶向HBV核心和表面抗原的CD4+和CD8+ T细胞的诱导和持续相关，其在HBV感染的控制和消退中起主要作用。
几项已发表的研究比较了受HBV影响的患者(急性感染后、从慢性感染中恢复的患者、活动性慢性感染和非活动性携带者)的不同区段中的HBV抗原特异性T细胞，强调了诱导针对HBV抗原特别是HBc抗原的强多特异性T细胞应答以促进HBV感染清除的必要性。与此一致，比较来自慢性HBV感染消退患者相比于慢性HBV感染未消退患者的T细胞，显示在感染消退患者中对HBc抗原具有特异性的更高的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞[Boni,2012；Li,2011；Liang,2011]。
此外，功能性CD8+ T细胞的作用似乎是关键的。在急性HBV感染期间，黑猩猩中CD8+ T细胞的耗竭导致病毒血症的持续[Thimme，2003]。在人中，急性乙型肝炎期间HBV的清除与对病毒核衣壳、包膜和聚合酶蛋白的强、多克隆、多特异性CD8+ T细胞应答相关，该应答在临床恢复后持续数十年。相反，CHB患者通常不能对病毒产生强烈的CD8+ T细胞应答。经历自发或干扰素诱导缓解的CHB患者对HBV产生CD8+ T细胞应答，其强度和特异性与从急性肝炎中恢复的患者的应答相似[Rehermann，1996]。
由于包含恒定链(SAM-hIi-HBV)的SAM构建体显示诱导针对HBc和HBs抗原的更大CD8+ T细胞应答，因此选择这些构建体用于实施例2。
实施例2：在HLA.A2/DR1转导的小鼠中用SAM-hIi-HBV替代MVA-HBV或ChAd155- hIi-HBV和MVA-HBV两者的评估
由于每个实验动物的最大容量，计划了两个独立的实验。两个实验各组中均包含表2中详述的动物。
在该实验中，使用雄性和雌性HLA.A2/DR1转导的小鼠。AAV2/8-HBV转导的HLA.A2/DR1鼠模型再现了慢性HBV感染的病毒学和免疫学特征。选择其以评估不同疫苗方案的免疫原性，肝脏浸润HBc特异性CD8+ T细胞的影响(其潜在靶向表达HBcAg的肝细胞)，并通过测量血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性来评估潜在的疫苗相关肝脏炎症。
因此，在这些实验中，雄性和雌性HLA.A2/DR1小鼠(组1-6和组8)在第0天静脉注射携带有复制能力的HBV DNA基因组的腺相关病毒血清型2/8(AAV2/8HBV)载体的1010个病毒基因组(vg)。
基于在第21/22天在血清中检测到的HBs循环抗原水平、年龄和性别比例，将HLA.A2/DR1小鼠在免疫前随机分为7个不同组(组1-6和组8)。
来自组7的小鼠没有用AAV2/8-HBV病毒载体转导，而是用共同施用疫苗方案肌内(IM)免疫。该组用作免疫学读出的阳性对照。
HLA.A2/DR1转导的小鼠在第31或33天(第一次免疫)、第59或61天(第二次免疫)、第73或75天(第三次免疫)和第86或88天(第四次免疫)接受含有HBc和HBs抗原的各种制剂(列于表2中)的肌内(腓肠肌)注射。将两个单独实验的结果组合在一起，用于图表的呈现和结果的统计分析。
在所有情况下，使用相同剂量的每种组合物：
·将ChAd155-hIi-HBV以108vp/小鼠的剂量施用给小鼠，
·用MVA-HBV接种的小鼠接受剂量为107pfu/小鼠，
·以1μg/小鼠的剂量向小鼠施用SAM-hIi-HBV，和
·接受佐剂化蛋白的组接受剂量为4μg HBc、1μg HBs和包含5μg MPL和5μg QS21的AS01/小鼠。
该实验的目的是通过与MVA-HBV的疫苗方案相比诱导至少相同水平的HBc特异性CD8+ T细胞应答，评估SAM-hIi-HBV是否可以在顺序或共同施用疫苗方案中替代MVA-HBV或ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV两者。
表2：
(注：SAM-hIi-HBV是SEQ ID NO:17的构建体，SAM-HBV是SEQ ID NO:19的构建体)
在第一次注射前31或33天，用AAV2/8-HBV转导组1至组6和组8的小鼠。如上所述，出于与运行实验相关的实际原因，将每组分成两组并运行两个单独的实验。显示的所有结果都是来自两个实验的组合输出。
在第二次注射后13天和14天(13/14dpII)，处死来自组1至组6(来自每个实验)中每组的15只小鼠、来自实验20200719的组7和组8的6只和4只小鼠以及来自实验20200720的组7和组8的4只和5只小鼠，以便可以从所有小鼠采集脾脏样品并采集血清样品。在第四次注射后22天(22dPIV)，将剩余的动物全部处死，并采集脾脏、肝脏和血清样品。
由实施例2的各个组产生的CD8+ T细胞和抗体应答如图4A和4B所示。图4的结果显示，在第二次免疫后14天，用ChAd155-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强产生比用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强高7.36倍的HBc特异性CD8+ T细胞应答(GMR＝7.36，90％ CI[3.96-13.70])。类似地，结果还显示，与用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强相比，用SAM-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强诱导高9倍的HBc特异性CD8+ T细胞应答(GMR＝9.07，90％ CI[4.87-16.87])。
类似的CD8+ T细胞结果显示在图5A和5B中。在此，在第二次免疫后14天，用ChAd155-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强诱导了比用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强高3.6倍的HBs特异性CD8+ T细胞应答(GMR＝3.64，90％ CI[2.34-5.67])。结果还显示，与用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强相比，用SAM-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强诱导高7.78倍的HBs特异性CD8+ T细胞应答(GMR＝7.78，90％ CI[5-12.12])。
有趣的是，用SAM-hIi-HBV疫苗替代MVA-HBV或ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV两者诱导了更多的多功能HBV特异性CD8+ T细胞，如细胞因子共表达谱所证明的(图13A、13B)。大多数HBV特异性CD8+ T细胞主要表达IFN-g与TNFα的组合，并且当使用SAM-hIi-HBV的同源初免加强时，该群体进一步增加。
图6和7显示了在脾脏中测量的CD4+应答。在第二次免疫后14天，所有疫苗方案在AAV2/8-HBV转导的HLA-A2/DR1小鼠中引起非常低至检测不到的HBc特异性CD4+ T细胞(≤0.1％)并且稍高的HBc特异性CD4+ T细胞仅在单独或与两种载体组合施用HBc-HBs/AS01后被诱导。
关于第二次免疫后14天抗HBs特异性CD4+ T细胞应答，与用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强相比，用ChAd155-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强诱导了高7.12倍的HBs特异性CD4+ T细胞应答(几何平均值比率(GMR)＝7.12，90％ CI[4.61-11])。要注意的是，用SAM-hIi-HBV替代ChAd和MVA两者并没有诱导更高的应答，然而，结果显示，与用ChAd155-hIi-HBV初免和用MVA-HBV加强相比，用SAM-hIi-HBV初免和用SAM-hIi-HBV加强诱导高2.56倍的HBs特异性CD4+ T细胞应答(GMR＝2.56，90％ CI[1.66-3.95])。如先前对HBc特异性CD4+ T细胞应答所观察到的，仅在单独施用HBc-HBs/AS01或与两种载体组合施用后诱导强HBs特异性CD4+ T细胞。
关于体液免疫应答，用SAM-hIi-HBV替代MVA-HBV或ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV两者不影响抗HBc和抗HBs抗体应答的水平。
有趣的是，无论使用何种方案(顺序或共同施用)，用Th HBV疫苗免疫均显示血清HBs抗原在所有组中降低±1.5倍，没有组间差异(图10和11)。最后，作为肝脏相关炎症参数，在第二次和第四次免疫后在小鼠血清中测量AST和ALT的血清活性。对于每个组，ALT水平在所有研究期间都是稳定的，并且不受用SAM-hIi-HBV替代MVA-HBV或ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV两者的显著影响。在所有组中测得的AST水平略高，无组间差异(图12)。
总体结论：
用SAM-hIi-HBV替代MVA-HBV或ChAd155-hIi-HBV和MVA-HBV两者诱导显著更高的HBc-和-HBs特异性CD8+ T细胞应答：SAM/SAM>ChAd/SAM>ChAd/MVA，对HBs特异性CD4+ T细胞应答有轻微的正面影响。未观察到对抗HBc和-HBs IgG抗体应答水平的显著影响。
关于循环HBs抗原，在所有组中存在循环HBs抗原降低±1.5倍的趋势，没有组间差异。
此外，当通过测量天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清活性来评估潜在的疫苗相关肝脏炎症时，与未接种疫苗的组相比，在疫苗组中没有检测到肝酶的增加。
实施例3：HLA-A2/DRB1初试小鼠中共同施用的LNP-mRNA的免疫原性评估
该实验的细节在表3中给出。LNP-mRNA构建体含有UTR4主链和RV39LNP。制剂还包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、聚乙二醇缀合(PEG-缀合)脂质、和胆固醇。
在该实验中使用8-12周龄的初试HLA-A2/DRB1小鼠(54只雄性，47只雌性)。时间表包括在第0、21、42和63天通过肌内免疫途径进行注射。使用的剂量为：
·mRNA：如表中所示，
·ChAd155-hIi-HBV：108vp/小鼠，
·MVA-HBV：107pfu/小鼠，
·HBc-HBs：4-1μg/AS01，即4μg HBc和1μg HBs(对于与表3的组7中的mRNA同时给药的佐剂化蛋白)。
ChAd155-hIi-HBV载体编码SEQ ID NO:15的hIi-HBc-2A-HBs氨基酸序列，并且MVA-HBV载体编码SEQ ID NO:5的HBc-2A-HBs氨基酸序列。
该实验的主要目的是研究共同施用的hli-HBc和hLI-HBs mRNA(即“hIi-HBc+hIi-HBs”)之间的免疫干扰。将3种共同施用的mRNA(包括hIi-HBc和hIi-HBs)与仅含有单一mRNA类型的制剂进行比较，进行了实验。在该早期实验中，观察到共同施用对HBc和HBs特异性CD8+ T细胞应答产生负面影响(参见图17)。特别地，当这些mRNA共同施用时，HBc特异性应答低6.7倍，HBs特异性应答低2倍。
进行的第一个改变是仅共同施用HBc和HBs mRNA(即不使用第三mRNA)。此外，由于对HBc特异性CD8+应答的影响最大，HBs mRNA的量相对于HBc mRNA减少。这产生了在表3的组2至组5中观察到的HBc mRNA与HBs mRNA的不同比率：
·向组2小鼠施用含有7μg HBc mRNA和7μg HBs mRNA的组合物，
·对于组3，对HBs mRNA进行1.5倍稀释，导致向小鼠施用4.6μg(四舍五入至小数点后1位)HBs mRNA。
o因此，该组合物中使用的mRNA的比率为1.5HBc mRNA:1HBs mRNA。
·对于组4，对4.6μg HBs mRNA组合物进行1.5倍稀释，得到向小鼠施用3.1μg(四舍五入到小数点后1位)的组合物。
o因此，该组合物中使用的mRNA的比率为2.3HBc mRNA:1HBs mRNA。
·对于组5，对3.1μg HBs mRNA组合物进行进一步1.5稀释，得到向小鼠施用2.0μg(四舍五入到小数点后1位)的组合物。
o因此，该组合物中使用的mRNA的比率为3.5HBc mRNA:1HBs mRNA。
为了选择与单独的LNP-mRNA(即组8、9、10、11和12)相比含有与最低水平的免疫干扰相关的LNP-mRNA的比率的共同施用(来自组2、3、4和5)，因此，我们：
·评估了对HBc特异性CD8+ T细胞应答的潜在负面影响。
·评估了对HBs特异性CD8+ T细胞应答的潜在负面影响。
为了评估免疫干扰，在第75天和第77天测量脾脏中的HBc和HBs特异性CD8+ T细胞应答(参见图18、19和20)。
成功标准定义为：“评估不同LNP-mRNA比率的共同施用相比于单一LNP-mRNA制剂的非劣效性。如果几何平均值比率的90％置信区间下限高于0.33，则显示非劣效性。如果统计学上显示非劣效性，科学家将评估生物学相关性。”
在样品量为8只小鼠的SD低于0.36的情况下，在5％水平α下至少80％可显示3倍非劣效性。每组分配8只小鼠，NaCl组分配5只小鼠，总共101只小鼠。
结果显示，与对照组(仅用7μg hIi-HBc mRNA免疫的小鼠)相比，相对于hIi-HBcmRNA减少hIi-HBs mRNA的量改善了HBc特异性CD8+应答(参见图19)。当使用4.6μg hIi-HBsmRNA时，观察到最高的HBc特异性CD8+应答。
有趣的是，还发现具有7μg hIi-HBc和4.6μg hIi-HBs的组合物产生与具有7μghIi-HBc和7μg hIi-HBs的组合物相似水平的HBs特异性CD8+ T细胞应答，并且该应答类似于在仅用4.6μg HBs hIi-HBs mRNA免疫的小鼠组中检测到的应答。尽管7μg-3.1μg和7μg-2μg组合物导致比7μg-7μg更高的HBc特异性T细胞应答，但观察到这两种组合物的HBs特异性CD8+ T细胞应答显著降低。
因此，发现含有7μg hIi-HBc-mRNA和4.6μg hIi-HBs-mRNA(即比率为1.5hIi-HBc-mRNA:1hIi-HBs-mRNA)的共同施用是优选的组合物，因为由共同施用的mRNA诱导的免疫应答类似于由每种mRNA单独诱导的免疫应答。
该实验的结果还显示：
·共同施用对HBc特异性CD4+T细胞应答无负面影响，以及
·共同施用(hIi-HBc+hIi-HBs)对HBc特异性IgG应答无负面干扰。
该实验还被设计为：
(i)直接比较使用共同施用mRNA(hIi-HBc+hIi-HBs)相比于ChAd/MVA的初免-加强免疫(表3中组1与组2、3、4和5之间的比较)。
(ii)评估4个剂量相比于2个剂量共同施用mRNA
(hIi-HBc+hIi-HBs)的免疫原性(表3中组4和组6之间的比较)。
(iii)研究共同施用的mRNA(hIi-HBc+hIi-HBs)和AS01佐剂化蛋白之间的任何免疫干扰(表3的组6和组7的比较)。在组7中，将“hIi-HBc+hIi-HBs”和“HBc-HBs/AS01”组合物同时但作为两次不同的注射施用到小鼠的两个不同肢体中。
这些次要目的的终点是在第75/77天通过ICS测量的脾脏中的HBc和HBs特异性CD4+和CD8+ T细胞应答，以及在第75天和77天通过ELISA测量的HBc和HBs特异性抗体应答(参见图18、20和21)。
各结果如下：
(i)对于2个剂量的mRNA相比于ChAd/MVA初免加强：
·发现两个剂量mRNA比ChAd/MVA初免加强诱导更高的CD8+ T细胞应答。特别地，发现针对HBc的CD8+ T细胞应答增加3倍，针对HBs的CD8+ T细胞应答增加2倍(参见图18)。
·还发现两个剂量mRNA诱导8倍更高的HBc特异性CD4+ T细胞应答。mRNA或ChAd/MVA均未诱导HBs-CD4+ T细胞应答(参见图19)。
·还发现两个剂量mRNA诱导8倍更高的HBc特异性IgG应答(参见图21)。mRNA或ChAd/MVA均未诱导HBs特异性IgG应答。
(ii)对于4个剂量相比于2个剂量mRNA：
·发现用共同施用的mRNA进行的另外两次免疫诱导CD8+ T细胞应答。特别地，发现针对HBc的CD8+ T细胞应答增加2倍，针对HBs的CD8+ T细胞应答增加3倍(参见图18)。
·还发现四个剂量mRNA诱导3.5倍更高的HBc特异性CD4+ T细胞应答。在4个剂量或2个剂量后，没有诱导HBs特异性CD4+ T细胞应答(参见图19)。
·还发现四个剂量mRNA诱导2倍更高的HBc特异性IgG应答(参见图21)。4个剂量或2个剂量均未诱导HBs特异性IgG应答。
(iii)对于mRNA和佐剂化蛋白的共同施用：
·发现共同施用佐剂化蛋白和共同施用mRNA(hIi-HBc+hIi-HBs)对HBc特异性CD8+ T细胞应答具有负面影响。然而，未发现该共同施用方案对HBs特异性CD8+ T细胞应答产生负面影响(参见图18)。
·发现该共同施用方案对HBc特异性CD4+ T细胞应答产生负面影响。然而，在制剂中包含佐剂化蛋白也导致诱导HBs特异性CD4+ T细胞应答(参见图19)。
·还发现共同施用方案对HBc特异性IgG应答具有正面影响(参见图21)。此外，在制剂中包含佐剂化蛋白导致诱导HBs特异性IgG应答。
表3：
本发明的实施方案
下面在三组实施方案中描述本发明的实施方案。在适当的情况下，来自三个组的特征可以组合以形成单独的实施方案。
实施方案的组1描述了：
实施方案A.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案B.如实施方案A所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案C.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)与人恒定链(hIi)融合。
实施方案D.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物还包括编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的mRNA。
实施方案E.如实施方案D所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面蛋白(HBs)包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案F.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面抗原(HBs)与人恒定链(hIi)融合。
实施方案G.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒表面蛋白(HBsAg)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案H.如实施方案G所述的组合物，其中所述HBsAg是乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案I.如实施方案H所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案J.如实施方案G至I中任一项所述的组合物，其中所述HBsAg与人恒定链(hli)融合。
实施方案K.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案L.如实施方案K所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ IDNO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案M.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物与一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时施用。
实施方案N.如实施方案M所述的组合物，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案O.如实施方案M或N所述的组合物，其中所述HBc包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案P.如实施方案M或N所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案Q.如实施方案M至P中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
实施方案R.如实施方案Q所述的组合物，其中所述佐剂是AS01。
实施方案S.一种治疗慢性乙型肝炎感染的方法，其包括向人施用初免-加强方案，其中编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA作为初免剂量施用，并且一种或多种重组乙型肝炎多肽作为加强剂量施用。
实施方案T.如实施方案S所述的方法，其中所述mRNA编码选自乙型肝炎核心抗原(HBc)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的至少一种乙型肝炎病毒抗原。
实施方案U.如实施方案T所述的方法，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案V.如实施方案S至U中任一项所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗原与hli融合。
实施方案W.如实施方案S至U中任一项所述的方法，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案X.如实施方案S至W中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
实施方案Y.如实施方案X所述的方法，其中所述佐剂是AS01。
实施方案的组2描述了：
实施方案i.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的第一mRNA，其中所述第一mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案ii.如实施方案ii所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案iii.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)与人恒定链(hIi)融合。
实施方案iv.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物还包括编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的第二mRNA。
实施方案v.如实施方案iv所述的组合物，其中所述编码HBc的第一mRNA(“HBcmRNA”)与所述编码HBs的第二mRNA(“HBs mRNA”)包封在不同的LNP中。
实施方案vi.如实施方案iv所述的组合物，其中所述编码HBc的第一mRNA(“HBcmRNA”)与所述编码HBs的第二mRNA(“HBs mRNA”)包封在相同的LNP中。
实施方案vii.如实施方案iv至vi中任一项所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面蛋白(HBs)包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案viii.如实施方案iv至vii中任一项所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面抗原(HBs)与人恒定链(hIi)融合。
实施方案ix.如实施方案iv至viii中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的第一mRNA按重量计多于第二mRNA。
实施方案x.如实施方案iv至ix中任一项所述的组合物，其中所述第一mRNA和所述第二mRNA各自按重量计以1.5:1的比率存在。
实施方案xi.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的第一mRNA，其中所述第一mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案xii.如实施方案xi所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xiii.如实施方案xi或xxii所述的组合物，其中所述HBs与人恒定链(hli)融合。
实施方案xiv.如实施方案xi至xiii中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包括编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的第二mRNA。
实施方案xv.如实施方案xii所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xvi.如实施方案xiv或xv所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)与人恒定链(hIi)融合。
实施方案xvii.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xviii.如实施方案xvii所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xix.如任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物与一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时施用。
实施方案xx.如实施方案xix所述的组合物，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案xxi.如实施方案xix或xx所述的组合物，其中所述HBc包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xxii.如实施方案xix或xx所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案xxiii.如实施方案xix至xxii中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
实施方案xxiv.如实施方案xxiii所述的组合物，其中所述佐剂是AS01。
实施方案的组3描述了：
实施方案1.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案2.如任一前述实施方案中所述的mRNA，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)包含与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案3.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)与人恒定链(hli)融合。
实施方案4.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述mRNA还编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案5.如任一前述实施方案中所述的mRNA，其中所述乙型肝炎小表面蛋白(HBs)包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案6.如实施方案4或5中任一项所述的mRNA，其中编码HBc的mRNA(HBcmRNA)按重量计多于编码HBs的mRNA(HBs mRNA)。
实施方案7.如实施方案4至6中任一项所述的mRNA，其中所述HBc mRNA和所述HBsmRNA各自按重量计以1.5:1的比率存在。
实施方案8.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒表面蛋白(HBsAg)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
实施方案9.如实施方案8所述的mRNA，其中所述HBsAg是乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案10.如实施方案9所述的mRNA，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案11.如实施方案8至10所述的mRNA，其中所述HBsAg与人恒定链(hli)融合。
实施方案12.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案13.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案14.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述组合物与一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时施用。
实施方案15.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案16.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述HBc包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案17.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案18.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
实施方案19.如实施方案18所述的mRNA，其中所述佐剂是AS01。
实施方案20.一种治疗慢性乙型肝炎感染的方法，其包括向人施用初免-加强方案，其中编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA作为初免剂量施用，并且编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA作为加强剂量施用。
实施方案21.如实施方案20所述的方法，其包括向所述人施用四个连续剂量的mRNA。
实施方案22.如实施方案20或21所述的方法，其中包含一种或多种佐剂化重组乙型肝炎多肽的单独组合物与所述mRNA同时施用，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案23.一种治疗慢性乙型肝炎感染的方法，其包括向人施用初免-加强方案，其中编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA作为初免剂量施用，并且一种或多种重组乙型肝炎多肽作为加强剂量施用。
实施方案24.如实施方案23所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗原选自乙型肝炎核心抗原(HBc)或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。
实施方案25.如实施方案23所述的方法，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案26.如实施方案23-25所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗原与hli融合。
实施方案27.如实施方案23-26所述的方法，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
实施方案28.如实施方案23-27所述方法，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
实施方案29.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述LNP包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、甾醇和不可电离阳离子脂质。
实施方案30.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述LNP包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、甾醇和可电离阳离子脂质。
实施方案31.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述非阳离子脂质是中性脂质，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或鞘磷脂(SM)。
实施方案32.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述甾醇是胆固醇。
实施方案33.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述LNP包含约0.5至15摩尔％的PEG修饰的脂质、约5至25摩尔％的非阳离子脂质、约25至55摩尔％的甾醇和约20摩尔％至60摩尔％的可电离阳离子脂质。
实施方案34.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述LNP的直径是50至200μm。
实施方案35.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述LNP具有0.4或更小，诸如0.3或更小的多分散性。
实施方案36.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中核苷酸(N)与磷脂(P)的比率在1N:1P至20N:1P、1N:1P至10N:1P、2N:1P至8N:1P、2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P的范围内。
实施方案37.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中至少一半的所述mRNA被包封在所述LNP中，合适地至少85％，尤其是至少95％，例如100％。
实施方案38.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述mRNA是非复制或自复制mRNA(SAM)。
实施方案39.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述自复制RNA分子编码(i)可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)所述乙型肝炎多肽。
实施方案40.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述mRNA具有构型5'帽-5'UTR-非结构蛋白(NSP)1-4-亚基因组启动子-乙型肝炎多肽-3'UTR-聚A。
实施方案41.如任一前述实施方案所述的mRNA，用于向患有慢性乙型肝炎感染的人受试者施用。
实施方案42.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述mRNA是非复制mRNA。
实施方案43.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与AS01佐剂一起施用。
实施方案44.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述方法包括首先施用所述mRNA，然后施用所述一种或多种重组乙型肝炎多肽。
实施方案45.如任一前述实施方案所述的mRNA，其中所述方法包括初免-加强方案，其中所述mRNA作为初免剂量施用，并且所述一种或多种重组乙型肝炎多肽作为加强剂量施用。
实施方案46.如实施方案45所述的mRNA，其中所述方法包括所述mRNA的单次初免和所述重组乙型肝炎多肽的多个后续加强剂量。
实施方案47.如实施方案46所述的mRNA，其中所述方法包括所述一种或多种重组乙型肝炎多肽的两个或三个后续加强剂量。
实施方案48.如实施方案45所述的mRNA，其中所述方法包括所述mRNA的多个初免剂量和所述重组乙型肝炎多肽的多个后续加强剂量。
实施方案49.如实施方案48所述的mRNA，其中所述方法包括所述mRNA的两个初免剂量和所述重组乙型肝炎多肽的两个后续加强剂量。
实施方案50.一种免疫原性组合物，其包含如任一前述实施方案所述的mRNA。
实施方案51.如实施方案50所述的免疫原性组合物，其还包含所述一种或多种重组乙型肝炎多肽。
实施方案52.一种免疫原性组合，其包含：
(a)如实施方案1至49中任一项所述的mRNA；和
(b)与所述mRNA一起施用的一种或多种重组乙型肝炎多肽。
实施方案53.如实施方案52所述的免疫原性组合，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽包含乙型肝炎表面抗原(HBs)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)和佐剂。
实施方案54.如实施方案53所述的免疫原性组合，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与AS01佐剂组合。
实施方案55.如实施方案52至54中任一项所述的免疫原性组合，其还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体可以是编码乙型肝炎多肽的复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体。
实施方案56.如实施方案55所述的免疫原性组合，其中所述腺病毒载体编码与人恒定链(hIi)融合的乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)。
实施方案57.如实施方案56所述的免疫原性组合，其中所述腺病毒载体另外编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)。
实施方案58.如实施方案55至57中任一项所述的免疫原性组合，其中腺病毒载体编码包含与SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。
实施方案59.如实施方案55至58中任一项所述的免疫原性组合，其中腺病毒载体编码由与SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成的多肽。
实施方案60.如实施方案55至59中任一项所述的免疫原性组合，其中腺病毒载体编码包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的多肽。
实施方案61.如实施方案55至60中任一项所述的免疫原性组合，其中腺病毒载体编码由SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列组成的多肽。
实施方案62.一种免疫原性组合，其包含：
·第一组合物，其包含包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA和包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的mRNA；和
·第二组合物，其包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)和佐剂。
实施方案63.如实施方案62所述的免疫原性组合，其中第二组合物包含AS01佐剂。
实施方案64.如实施方案62或63所述的组合，用于在通过顺序或伴随施用所述组合物来治疗慢性乙型肝炎(CHB)的方法中使用。
实施方案65.一种治疗人的慢性乙型肝炎(CHB)感染的方法，其中所述方法包括与所述一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时地向所述人施用如实施方案1至49中任一项所述的mRNA。
实施方案66.如实施方案62所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽是重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)。
实施方案67.如实施方案63所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述组合物还包含重组乙型肝炎表面抗原(HBs)和佐剂。
实施方案68.如实施方案62或63所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
实施方案69.如实施方案65所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述佐剂含有MPL和QS-21。
实施方案70.如实施方案63所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述重组乙型肝炎表面抗原(HBs)是C末端截短的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)。
实施方案71.如实施方案62至67中任一项所述的治疗人的慢性乙型肝炎(CHB)感染的方法，其中所述方法还包括向所述人施用包含编码乙型肝炎多肽的多核苷酸的腺病毒载体。
实施方案72.如实施方案68所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAd)载体。
实施方案73.如实施方案68或69所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述腺病毒载体编码与人恒定链(hIi)融合的乙型肝炎多肽。
实施方案74.如实施方案68至70中任一项所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述腺病毒载体编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)。
实施方案75.如实施方案71所述的治疗人的慢性乙型肝炎感染(CHB)的方法，其中所述腺病毒载体另外编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBs)。
实施方案76.如实施方案1至49中任一项所述的mRNA或如实施方案50至61中任一项的免疫原性组合在治疗HBV中的用途。
实施方案77.如实施方案1至49中任一项所述的mRNA或如实施方案50至61中任一项所述的免疫原性组合在降低感染HBV的患者中的循环乙型肝炎表面抗原(HBs)水平中的用途。
实施方案78.如实施方案1至49中任一项所述的mRNA或如实施方案50至61中任一项所述的免疫原性组合在制备药物中的用途。
实施方案79.如实施方案1至5449中任一项所述的mRNA或如实施方案50至61中任一项所述的免疫原性组合在制备用于治疗HBV的药物中的用途。
实施方案80.一种试剂盒，其包含以下组分：
(a)如实施方案1至49中任一项所述的mRNA；和
(b)与所述mRNA一起施用的一种或多种重组乙型肝炎多肽。
参考文献
World Health Organization(WHO).Global Hepatitis report,2017.http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/255016/1/9789241565455-eng.pdf？ua＝1.Accessed November 2017.
Block TM,Locarnini S,McMahon BJ,Rehermann B,Peters MG.Use of Currentand New Endpoints in the Evaluation of Experimental Hepatitis BTherapeutics.Clin Infect Dis.2017；64(9):1283-1288.
Cornberg M,Wong VW,Locarnini S,Brunetto M,Janssen HL,Chan HL.The roleof quantitative hepatitis B surface antigen revisited.J Hepatol.2017；66(2):398-411.
EASL 2017.Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitisB virus infection.J Hepatol 2017；67(2),370-398.
Borghese F,Clanchy FI.CD74:an emerging opportunity as a therapeutictarget in cancer and autoimmune disease.Expert Opin Ther Targets.2011；15(3):237-51.
Jiang S,et al.,Lipidoid-Coated Iron Oxide Nanoparticles for EfficientDNA and siRNA delivery Nano Lett.,13:1059-1064(2013).
Zhang,C et al.Advances in mRNA vaccines for infectious diseases,Front.Immunol.2019,10:594.
Boni C,Laccabue D,Lampertico P,et al.Restored function of HBV-specific T cells afterlong-term effective therapy with nucleos(t)ideanalogues.Gastroenterology.2012；143(4):963-73.e9.
Rehermann B,Ferrari C,Pasquinelli C,Chisari FV.The hepatitis B viruspersists for decades after patients'recovery from acute viral hepatitisdespite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response.Nat Med.1996；2(10):1104-8.
Thimme R,Wieland S,Steiger C,et al.CD8+ T Cells Mediate ViralClearance and Disease Pathogenesis during Acute Hepatitis B VirusInfection.Journal of Virology 2003；77(1):68-76.
WO2005/113782
WO2011/076807
WO2012/006376
WO2012/006378
WO2012/006380
WO2012/030901
WO2012/031043
WO2012/031046
WO2013/006825
WO2013/006834
WO2013/006837
WO2013/033563
WO2014/136086
WO2015/095340
WO2015/095346
WO2016/037053
WO2017/070620
WO2017/162265
序列表
SEQ ID NO:1：HBs的氨基酸序列
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:2：HBc截短体的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
SEQ ID NO:3：并入口蹄疫病毒2A切割区的间隔区的氨基酸序列
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:4：编码并入了口蹄疫病病毒2A切割区的间隔区的核苷酸序列
GCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCT
SEQ ID NO:5：HBc-2A-HBs的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:6：编码HBc-2A-HBs的核苷酸序列
ATGGACATCGATCCCTACAAGGAATTTGGCGCCACCGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCGTGAGGGACCTCCTGGACACCGCCAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAATCTCCCGAGCACTGCAGCCCACACCACACCGCACTGAGGCAGGCCATCCTGTGCTGGGGAGAGCTGATGACCCTCGCCACCTGGGTGGGCAACAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTGAACTACGTCAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTCGGCAGGGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAGGACACCTCCCGCCTACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACAGTGGTGAGGAGGAGGGACAGGGGCAGGTCACCCAGGAGGAGGACTCCAAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGAAGGAGGAGCCAGAGCAGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCAGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCCTCGGCGGGAGCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAACAGCCAGTCTCCCACCAGCAATCACAGCCCCACCAGCTGCCCCCCAATCTGTCCTGGCTACCGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTCCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCAGTGTGTCCCCTGATCCCCGGCTCAACCACCACTAACACCGGCCCCTGCAAAACCTGCACCACCCCCGCTCAGGGCAACAGCATGTTCCCAAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACCTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGCTGGCTCAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTCCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACTCCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATTTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
SEQ ID NO:7：hIi的氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVPM
SEQ ID NO:8：编码hIi的核苷酸序列
ATGCACAGGAGGAGGAGCAGGAGCTGCAGGGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAACGAGCAGCTGCCAATGCTGGGCAGGAGGCCCGGAGCACCCGAAAGCAAGTGCAGCAGGGGCGCCCTGTACACCGGCTTCAGCATCCTGGTGACCCTCCTGCTGGCCGGCCAGGCCACCACCGCCTATTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCAGGCTCGATAAGCTGACCGTGACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGAGGATGAAGCTGCCCAAGCCCCCCAAGCCCGTGAGCAAGATGAGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCTCTGCCCATGGGGGCCCTGCCCCAGGGCCCCATGCAGAACGCCACCAAATACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGATCCTCTGAAGGTGTACCCACCCCTGAAAGGCAGCTTCCCCGAGAACCTCAGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCCGGCACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCCAAGGAGAGCCTCGAGCTCGAGGACCCAAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATG
SEQ ID NO:9：hIi-HBc-2A-HBs的氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVPMMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:10：编码hIi-HBc-2A-HBs的核苷酸序列
ATGCACAGGAGGAGGAGCAGGAGCTGCAGGGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAACGAGCAGCTGCCAATGCTGGGCAGGAGGCCCGGAGCACCCGAAAGCAAGTGCAGCAGGGGCGCCCTGTACACCGGCTTCAGCATCCTGGTGACCCTCCTGCTGGCCGGCCAGGCCACCACCGCCTATTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCAGGCTCGATAAGCTGACCGTGACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGAGGATGAAGCTGCCCAAGCCCCCCAAGCCCGTGAGCAAGATGAGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCTCTGCCCATGGGGGCCCTGCCCCAGGGCCCCATGCAGAACGCCACCAAATACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGATCCTCTGAAGGTGTACCCACCCCTGAAAGGCAGCTTCCCCGAGAACCTCAGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCCGGCACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCCAAGGAGAGCCTCGAGCTCGAGGACCCAAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATGGACATTGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACCGTCGAACTGCTGAGCTTCCTCCCCAGCGACTTCTTCCCCTCCGTGAGGGATCTGCTGGACACAGCTAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACAGCCCTGAGGCAGGCCATCCTCTGTTGGGGCGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAATAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTTGGCAGGGAGACCGTCCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAGGACTCCCCCAGCCTACAGGCCCCCTAACGCCCCCATCCTGTCTACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGGAGGAGGGACAGGGGCAGAAGCCCCAGGAGAAGGACCCCTAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAAAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATTCCCCAGTCACTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCCTCGGCGGGAGCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAATAGCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCTCCCACTTCCTGCCCCCCTATCTGCCCCGGCTACAGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCCGTGTGTCCCCTGATCCCCGGAAGCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACTCTATGTTCCCCAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACTTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAATATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTTAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCTCCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTCCTGCCCATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
SEQ ID NO:11：HBc的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
SEQ ID NO:12：hIi替代变体的氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVP
SEQ ID NO:13：编码hIi替代变体的核苷酸序列
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCC
SEQ ID NO:14：hIi-HBc-2A-HBs的替代核酸序列
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCAACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCGGCGCCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACACAGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGCCGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATT
SEQ ID NO:15：hIi-HBc-2A-HBs的替代氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:16：空SAM载体的核酸序列
ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTAT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
1插入物在核苷酸7561之后开始
SEQ ID NO:17：编码hIi_HBc_2A_HBs SAM转基因的人密码子优化(Genewiz)的核酸序列
ATGCATAGAAGAAGGTCCAGAAGCTGCAGAGAAGACCAGAAACCCGTGATGGACGACCAGAGAGACCTCATCTCCAACAACGAGCAGCTGCCTATGCTGGGCAGAAGGCCCGGCGCTCCCGAATCCAAGTGTTCCAGAGGAGCCCTCTACACCGGCTTCAGCATCCTCGTCACACTGCTGCTCGCTGGACAAGCCACCACCGCTTACTTTCTGTACCAGCAGCAAGGAAGACTGGATAAGCTGACCGTCACCTCCCAGAATCTCCAACTGGAGAATCTGAGGATGAAACTCCCCAAACCTCCTAAGCCCGTGTCCAAGATGAGGATGGCTACACCTCTGCTCATGCAAGCCCTCCCCATGGGAGCTCTGCCCCAAGGACCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAACATGACAGAGGACCACGTGATGCATCTGCTCCAGAACGCCGATCCTCTCAAGGTCTATCCCCCTCTGAAGGGCTCCTTCCCCGAGAATCTGAGGCATCTCAAAAACACCATGGAGACCATCGATTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCATCACTGGCTGCTGTTCGAGATGTCTAGGCACTCCCTCGAGCAGAAGCCCACAGATGCCCCTCCCAAGGAGAGCCTCGAGCTGGAAGATCCCTCCAGCGGACTGGGAGTCACAAAGCAAGACCTCGGCCCCGTCCCCATGGACATCGATCCCTACAAAGAGTTCGGCGCTACCGTGGAGCTGCTGTCCTTTCTGCCTTCCGACTTTTTCCCCTCCGTCAGAGATCTGCTGGACACCGCCTCCGCTCTGTATAGGGAGGCCCTCGAGTCCCCCGAGCACTGTTCCCCTCATCACACAGCTCTGAGACAAGCCATTCTGTGCTGGGGCGAGCTGATGACACTGGCCACATGGGTCGGCAACAACCTCGAAGATCCCGCCTCTAGGGATCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGACTGAAGATTAGACAGCTGCTGTGGTTCCACATTAGCTGTCTCACCTTTGGCAGAGAAACCGTGCTGGAGTATCTGGTGAGCTTCGGAGTGTGGATCAGAACCCCCCCCGCCTATAGACCTCCCAATGCCCCCATTCTGTCCACACTGCCCGAGACAACCGTCGTCAGAAGGAGGGACAGAGGAAGATCCCCTAGAAGGAGAACCCCCAGCCCTAGAAGAAGGAGGTCCCAGTCCCCCAGAAGAAGGAGAAGCCAGAGCAGAGAATCCCAGTGCGCTCCCGTCAAACAGACCCTCAACTTCGATCTGCTCAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCCAACCCCGGCCCTATGGAGAATATCACCAGCGGCTTTCTCGGCCCTCTGCTGGTCCTCCAAGCTGGCTTCTTTCTGCTGACAAGGATTCTGACAATCCCCCAATCTCTGGACAGCTGGTGGACATCCCTCAACTTTCTGGGCGGAAGCCCCGTGTGCCTCGGCCAAAACTCCCAGAGCCCCACATCCAATCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCTATTTGCCCCGGCTACAGATGGATGTGTCTGAGAAGGTTCATCATCTTCCTCTTCATTCTCCTCCTCTGCCTCATCTTTCTGCTGGTGCTCCTCGACTACCAAGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGATCCCCGGCAGCACCACCACAAATACCGGCCCTTGTAAGACATGCACCACACCCGCCCAAGGCAACAGCATGTTTCCTAGCTGCTGCTGCACAAAGCCTACAGACGGCAACTGCACATGCATTCCTATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCTAAGTATCTGTGGGAATGGGCTTCCGTGAGGTTCAGCTGGCTCTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAATGGTTTGTGGGCCTCAGCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCTATTTGGATGATGTGGTATTGGGGACCCTCTCTGTACAGCATCGTGTCCCCCTTCATCCCTCTGCTGCCCATTTTTTTCTGTCTGTGGGTGTATATTTGATGA
SEQ ID NO:18：AA098中的hli_HBc_2A_HBs，SAM质粒序列
ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTAT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GCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACACGCGTAATACGACTCACTATAG
SEQ ID NO:19：编码HBc_2A_HBs SAM转基因的人密码子优化(Genewiz)的核酸序列
ATGGACATCGATCCCTACAAAGAGTTCGGCGCTACCGTGGAGCTGCTGTCCTTTCTGCCTTCCGACTTTTTCCCCTCCGTCAGAGATCTGCTGGACACCGCCTCCGCTCTGTATAGGGAGGCCCTCGAGTCCCCCGAGCACTGTTCCCCTCATCACACAGCTCTGAGACAAGCCATTCTGTGCTGGGGCGAGCTGATGACACTGGCCACATGGGTCGGCAACAACCTCGAAGATCCCGCCTCTAGGGATCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGACTGAAGATTAGACAGCTGCTGTGGTTCCACATTAGCTGTCTCACCTTTGGCAGAGAAACCGTGCTGGAGTATCTGGTGAGCTTCGGAGTGTGGATCAGAACCCCCCCCGCCTATAGACCTCCCAATGCCCCCATTCTGTCCACACTGCCCGAGACAACCGTCGTCAGAAGGAGGGACAGAGGAAGATCCCCTAGAAGGAGAACCCCCAGCCCTAGAAGAAGGAGGTCCCAGTCCCCCAGAAGAAGGAGAAGCCAGAGCAGAGAATCCCAGTGCGCTCCCGTCAAACAGACCCTCAACTTCGATCTGCTCAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCCAACCCCGGCCCTATGGAGAATATCACCAGCGGCTTTCTCGGCCCTCTGCTGGTCCTCCAAGCTGGCTTCTTTCTGCTGACAAGGATTCTGACAATCCCCCAATCTCTGGACAGCTGGTGGACATCCCTCAACTTTCTGGGCGGAAGCCCCGTGTGCCTCGGCCAAAACTCCCAGAGCCCCACATCCAATCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCTATTTGCCCCGGCTACAGATGGATGTGTCTGAGAAGGTTCATCATCTTCCTCTTCATTCTCCTCCTCTGCCTCATCTTTCTGCTGGTGCTCCTCGACTACCAAGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGATCCCCGGCAGCACCACCACAAATACCGGCCCTTGTAAGACATGCACCACACCCGCCCAAGGCAACAGCATGTTTCCTAGCTGCTGCTGCACAAAGCCTACAGACGGCAACTGCACATGCATTCCTATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCTAAGTATCTGTGGGAATGGGCTTCCGTGAGGTTCAGCTGGCTCTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAATGGTTTGTGGGCCTCAGCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCTATTTGGATGATGTGGTATTGGGGACCCTCTCTGTACAGCATCGTGTCCCCCTTCATCCCTCTGCTGCCCATTTTTTTCTGTCTGTGGGTGTATATTTGATGA
SEQ ID NO:20：AA098中的HBc_2A_HBs，SAM质粒序列
ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagATGGACATCGATCCCTACAAAGAGTTCGGCGCTACCGTGGAGCTGCTGTCCTTTCTGCCTTCCGACTTTTTCCCCTCCGTCAGAGATCTGCTGGACACCGCCTCCGCTCTGTATAGGGAGGCCCTCGAGTCCCCCGAGCACTGTTCCCCTCATCACACAGCTCTGAGACAAGCCATTCTGTGCTGGGGCGAGCTGATGACACTGGCCACATGGGTCGGCAACAACCTCGAAGATCCCGCCTCTAGGGATCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGACTGAAGATTAGACAGCTGCTGTGGTTCCACATTAGCTGTCTCACCTTTGGCAGAGAAACCGTGCTGGAGTATCTGGTGAGCTTCGGAGTGTGGATCAGAACCCCCCCCGCCTATAGACCTCCCAATGCCCCCATTCTGTCCACACTGCCCGAGACAACCGTCGTCAGAAGGAGGGACAGAGGAAGATCCCCTAGAAGGAGAACCCCCAGCCCTAGAAGAAGGAGGTCCCAGTCCCCCAGAAGAAGGAGAAGCCAGAGCAGAGAATCCCAGTGCGCTCCCGTCAAACAGACCCTCAACTTCGATCTGCTCAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCCAACCCCGGCCCTATGGAGAATATCACCAGCGGCTTTCTCGGCCCTCTGCTGGTCCTCCAAGCTGGCTTCTTTCTGCTGACAAGGATTCTGACAATCCCCCAATCTCTGGACAGCTGGTGGACATCCCTCAACTTTCTGGGCGGAAGCCCCGTGTGCCTCGGCCAAAACTCCCAGAGCCCCACATCCAATCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCTATTTGCCCCGGCTACAGATGGATGTGTCTGAGAAGGTTCATCATCTTCCTCTTCATTCTCCTCCTCTGCCTCATCTTTCTGCTGGTGCTCCTCGACTACCAAGGCATGCTGCCCGTGTGCCCTCTGATCCCCGGCAGCACCACCACAAATACCGGCCCTTGTAAGACATGCACCACACCCGCCCAAGGCAACAGCATGTTTCCTAGCTGCTGCTGCACAAAGCCTACAGACGGCAACTGCACATGCATTCCTATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCTAAGTATCTGTGGGAATGGGCTTCCGTGAGGTTCAGCTGGCTCTCTCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAATGGTTTGTGGGCCTCAGCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCTATTTGGATGATGTGGTATTGGGGACCCTCTCTGTACAGCATCGTGTCCCCCTTCATCCCTCTGCTGCCCATTTTTTTCTGTCTGTGGGTGTATATTTGATGAggcgcgcccacccaGCGGCCGCATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCGTTTAAACACGTGATATCTGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACACGCGTAATACGACTCACTATAG
SEQ ID NO:21：hli-HBc的氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
SEQ ID NO:22：编码hli-HBc的核苷酸序列
ATGCACAGAAGAAGAAGCAGATCATGCAGGGAGGATCAGAAACCAGTGATGGACGACCAGAGGGACCTGATCAGCAACAATGAGCAACTGCCAATGCTGGGCCGAAGACCCGGCGCCCCCGAGTCAAAGTGCAGCCGAGGCGCCTTATACACCGGCTTCAGCATCCTGGTTACGCTGCTCCTGGCAGGCCAGGCCACCACCGCATATTTCCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTGGACAAGCTAACCGTGACCTCACAGAACCTACAGCTGGAAAATCTGAGGATGAAGCTCCCAAAGCCCCCTAAGCCCGTGAGCAAGATGAGAATGGCCACACCCCTGCTGATGCAGGCCCTCCCCATGGGAGCCCTGCCACAGGGACCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGACCCCCTGAAGGTGTACCCCCCCCTGAAGGGCAGCTTCCCCGAGAACCTGAGACACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCAGACACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCCCCCAAGGAGTCCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATGGACATCGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACAGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCGTGAGAGACCTGCTGGACACCGCCTCCGCCCTGTACAGAGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACCGCCCTGAGACAGGCCATCCTGTGCTGGGGGGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAACAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGAGACCTGGTGGTGAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCTTGACCTTCGGCAGAGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCCGCACCCCTCCCGCATACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGACGCAGAGACAGAGGCCGGAGCCCCCGCAGAAGAACCCCCAGCCCCAGGAGAAGACGGAGCCAGAGCCCCAGAAGACGGCGCAGCCAGAGCAGAGAGAGCCAGTGC
SEQ ID NO:23：hli-HBc质粒序列(UTR4)
ACGCGTGCCTAAATTAATACGACTCACTATAAGGAGAAGCTGTCTATCGGGCTCCAGCGGTCATGCACAGAAGAAGAAGCAGATCATGCAGGGAGGATCAGAAACCAGTGATGGACGACCAGAGGGACCTGATCAGCAACAATGAGCAACTGCCAATGCTGGGCCGAAGACCCGGCGCCCCCGAGTCAAAGTGCAGCCGAGGCGCCTTATACACCGGCTTCAGCATCCTGGTTACGCTGCTCCTGGCAGGCCAGGCCACCACCGCATATTTCCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTGGACAAGCTAACCGTGACCTCACAGAACCTACAGCTGGAAAATCTGAGGATGAAGCTCCCAAAGCCCCCTAAGCCCGTGAGCAAGATGAGAATGGCCACACCCCTGCTGATGCAGGCCCTCCCCATGGGAGCCCTGCCACAGGGACCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGACCCCCTGAAGGTGTACCCCCCCCTGAAGGGCAGCTTCCCCGAGAACCTGAGACACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCAGACACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCCCCCAAGGAGTCCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATGGACATCGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACAGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCGTGAGAGACCTGCTGGACACCGCCTCCGCCCTGTACAGAGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACCGCCCTGAGACAGGCCATCCTGTGCTGGGGGGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAACAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGAGACCTGGTGGTGAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCTTGACCTTCGGCAGAGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCCGCACCCCTCCCGCATACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGACGCAGAGACAGAGGCCGGAGCCCCCGCAGAAGAACCCCCAGCCCCAGGAGAAGACGGAGCCAGAGCCCCAGAAGACGGCGCAGCCAGAGCAGAGAGAGCCAGTGCTGATAAGCCGCCGCTCCAGCTTTGCACGTTTCGATCCCAAAGGCCCTTTTTAGGGCCGACCATTCATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCGTTTAAACACGTGATATCTGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC
SEQ ID NO:24：编码HBs的核苷酸序列
ATGGAGAATATCACCAGCGGCTTCCTCGGCCCCCTCTTAGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTCCTGACACGGATCCTGACCATCCCGCAGTCCCTGGACTCATGGTGGACCTCCCTGAACTTCCTGGGCGGCTCCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAACTCCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACAGGTGGATGTGCCTGCGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCTCCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGGAACAGCATGTTCCCCTCCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCCTCCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCTCCGTGCGGTTCAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCCACCGTGTGGCTGTCCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
SEQ ID NO:25：HBs质粒序列(UTR4)
ACGCGTGCCTAAATTAATACGACTCACTATAAGGAGAAGCTGTCTATCGGGCTCCAGCGGTCATGGAGAATATCACCAGCGGCTTCCTCGGCCCCCTCTTAGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTCCTGACACGGATCCTGACCATCCCGCAGTCCCTGGACTCATGGTGGACCTCCCTGAACTTCCTGGGCGGCTCCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAACTCCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACAGGTGGATGTGCCTGCGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCTCCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGGAACAGCATGTTCCCCTCCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCCTCCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCTCCGTGCGGTTCAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCCACCGTGTGGCTGTCCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATCTGATAAGCCGCCGCTCCAGCTTTGCACGTTTCGATCCCAAAGGCCCTTTTTAGGGCCGACCATTCATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCGTTTAAACACGTGATATCTGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC
SEQ ID NO:26：hli-HBs的氨基酸序列
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:27：编码hli-HBs的核苷酸序列
ATGCACAGAAGACGCTCCAGGAGCTGCCGAGAGGATCAGAAACCTGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAATGAGCAGTTGCCCATGCTGGGACGCCGCCCCGGCGCACCGGAGAGCAAGTGCTCCCGCGGCGCCTTATACACCGGATTCAGCATCCTCGTTACCCTGTTACTGGCCGGGCAGGCCACCACGGCCTACTTCCTCTACCAACAACAGGGCAGGTTAGACAAGCTGACCGTGACCTCACAGAATCTCCAGTTAGAGAACCTGAGAATGAAGCTGCCAAAGCCACCTAAGCCTGTGAGCAAGATGCGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCCCTGCCTATGGGCGCCCTGCCACAGGGCCCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAATATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAATGCCGACCCTCTGAAGGTGTACCCTCCTCTGAAGGGCTCCTTCCCAGAGAATCTGCGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGTCCAGGCACTCTCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCAAAGGAGAGCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCAGTGCCAATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCTCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAATTTCCTGGGCGGCAGCCCAGTGTGCCTGGGCCAGAACAGCCAGTCCCCAACCAGCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCTCCCATCTGCCCAGGCTACAGGTGGATGTGCCTGAGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCAGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCAGCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACAGCATGTTCCCCTCGTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAATTGCACCTGCATCCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGCGGTTCAGCTGGCTCAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCAATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCATCCCTCTACAGCATCGTGAGCCCATTCATCCCACTGCTGCCTATCTTCTTCTGCTTGTGGGTGTACATC
SEQ ID NO:28：hli-HBs质粒序列(UTR4)
ACGCGTGCCTAAATTAATACGACTCACTATAAGGAGAAGCTGTCTATCGGGCTCCAGCGGTCATGCACAGAAGACGCTCCAGGAGCTGCCGAGAGGATCAGAAACCTGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAATGAGCAGTTGCCCATGCTGGGACGCCGCCCCGGCGCACCGGAGAGCAAGTGCTCCCGCGGCGCCTTATACACCGGATTCAGCATCCTCGTTACCCTGTTACTGGCCGGGCAGGCCACCACGGCCTACTTCCTCTACCAACAACAGGGCAGGTTAGACAAGCTGACCGTGACCTCACAGAATCTCCAGTTAGAGAACCTGAGAATGAAGCTGCCAAAGCCACCTAAGCCTGTGAGCAAGATGCGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCCCTGCCTATGGGCGCCCTGCCACAGGGCCCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAATATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAATGCCGACCCTCTGAAGGTGTACCCTCCTCTGAAGGGCTCCTTCCCAGAGAATCTGCGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGTCCAGGCACTCTCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCAAAGGAGAGCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCAGTGCCAATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCTCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAATTTCCTGGGCGGCAGCCCAGTGTGCCTGGGCCAGAACAGCCAGTCCCCAACCAGCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCTCCCATCTGCCCAGGCTACAGGTGGATGTGCCTGAGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCAGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCAGCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACAGCATGTTCCCCTCGTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAATTGCACCTGCATCCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGCGGTTCAGCTGGCTCAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCAATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCATCCCTCTACAGCATCGTGAGCCCATTCATCCCACTGCTGCCTATCTTCTTCTGCTTGTGGGTGTACATCTGATAAGCCGCCGCTCCAGCTTTGCACGTTTCGATCCCAAAGGCCCTTTTTAGGGCCGACCATTCATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCGTTTAAACACGTGATATCTGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC
SEQ ID NO:29：IRES核苷酸序列
TGATTAAAACAGCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACTCTGATTTTACGAAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCTTCCCTAATTCGAAACGTAGAAGCAATGCGCACCACTGATCAATAGTAGGCGTAACGCGCCAGTTACGTCATGATCAAGCATATCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTTACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAGCCCAGTAACACCATGGAAGCTGCAGGGTGTTTCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGCCACTGCAATCCCCACAGGTGACTGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCTATGGGGAGACCCATAGGACGCTCTAATGTGGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCCTTCAACCCAGAGGGTAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCTTTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTACAGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTGTAATAGAGCTGTTATATACCTATTTGTTGGCTTTGTACCACTAACTTTAAAATCTATAACTACCCTCAACTTTATATTAACCCTCAATACAGTTGACC
SEQ ID NO:30：编码hIi_HBc mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
ATGCACAGAAGAAGAAGCAGATCATGCAGGGAGGATCAGAAACCAGTGATGGACGACCAGAGGGACCTGATCAGCAACAATGAGCAACTGCCAATGCTGGGCCGAAGACCCGGCGCCCCCGAGTCAAAGTGCAGCCGAGGCGCCTTATACACCGGCTTCAGCATCCTGGTTACGCTGCTCCTGGCAGGCCAGGCCACCACCGCATATTTCCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTGGACAAGCTAACCGTGACCTCACAGAACCTACAGCTGGAAAATCTGAGGATGAAGCTCCCAAAGCCCCCTAAGCCCGTGAGCAAGATGAGAATGGCCACACCCCTGCTGATGCAGGCCCTCCCCATGGGAGCCCTGCCACAGGGACCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGACCCCCTGAAGGTGTACCCCCCCCTGAAGGGCAGCTTCCCCGAGAACCTGAGACACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCAGACACAGCCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCCCCCAAGGAGTCCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCCGTGCCCATGGACATCGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACAGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCGTGAGAGACCTGCTGGACACCGCCTCCGCCCTGTACAGAGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACCGCCCTGAGACAGGCCATCCTGTGCTGGGGGGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAACAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGAGACCTGGTGGTGAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCTTGACCTTCGGCAGAGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCCGCACCCCTCCCGCATACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGACGCAGAGACAGAGGCCGGAGCCCCCGCAGAAGAACCCCCAGCCCCAGGAGAAGACGGAGCCAGAGCCCCAGAAGACGGCGCAGCCAGAGCAGAGAGAGCCAGTGC
SEQ ID NO:31：编码HBs mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
ATGGAGAATATCACCAGCGGCTTCCTCGGCCCCCTCTTAGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTCCTGACACGGATCCTGACCATCCCGCAGTCCCTGGACTCATGGTGGACCTCCCTGAACTTCCTGGGCGGCTCCCCCGTGTGCCTGGGCCAGAACTCCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCCCCCACCAGCTGCCCCCCCATCTGCCCCGGCTACAGGTGGATGTGCCTGCGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCCGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCTCCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGGAACAGCATGTTCCCCTCCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAACTGCACCTGCATCCCCATCCCCTCCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCTCCGTGCGGTTCAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCCACCGTGTGGCTGTCCGCCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATCTTCTTCTGCCTGTGGGTGTACATC
SEQ ID NO:32：编码hIi_HBs mRNA转基因的人密码子优化(CodeRNA2)的核酸序列
ATGCACAGAAGACGCTCCAGGAGCTGCCGAGAGGATCAGAAACCTGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCAACAATGAGCAGTTGCCCATGCTGGGACGCCGCCCCGGCGCACCGGAGAGCAAGTGCTCCCGCGGCGCCTTATACACCGGATTCAGCATCCTCGTTACCCTGTTACTGGCCGGGCAGGCCACCACGGCCTACTTCCTCTACCAACAACAGGGCAGGTTAGACAAGCTGACCGTGACCTCACAGAATCTCCAGTTAGAGAACCTGAGAATGAAGCTGCCAAAGCCACCTAAGCCTGTGAGCAAGATGCGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCCCTGCCTATGGGCGCCCTGCCACAGGGCCCCATGCAGAATGCCACCAAGTACGGCAATATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAATGCCGACCCTCTGAAGGTGTACCCTCCTCTGAAGGGCTCCTTCCCAGAGAATCTGCGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACTGGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGTCCAGGCACTCTCTGGAGCAGAAGCCCACCGACGCCCCTCCAAAGGAGAGCCTGGAGCTGGAGGACCCCAGCAGCGGCCTGGGCGTGACCAAGCAGGACCTGGGCCCAGTGCCAATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCTCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAATTTCCTGGGCGGCAGCCCAGTGTGCCTGGGCCAGAACAGCCAGTCCCCAACCAGCAACCACAGCCCTACCAGCTGCCCTCCCATCTGCCCAGGCTACAGGTGGATGTGCCTGAGGCGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATCTTCCTGCTGGTGCTGCTGGACTACCAGGGCATGCTGCCAGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCAGCACCACCACCAACACCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACAGCATGTTCCCCTCGTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAATTGCACCTGCATCCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTACCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGCGGTTCAGCTGGCTCAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTCGTGGGCCTGTCCCCTACCGTGTGGCTGTCCGCAATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCATCCCTCTACAGCATCGTGAGCCCATTCATCCCACTGCTGCCTATCTTCTTCTGCTTGTGGGTGTACATC。

Claims (25)

1.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码至少乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)包含与SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
3.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)与人恒定链(hIi)融合。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的mRNA。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面蛋白(HBs)包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述乙型肝炎小表面抗原(HBs)与人恒定链(hIi)融合。
7.如权利要求4至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含按重量计比编码HBs的mRNA(HBs-mRNA)更多的编码HBc的mRNA(HBc-mRNA)。
8.如权利要求4至7中任一项所述的组合物，其中所述编码HBc的mRNA和所述编码HBsmRNA的mRNA各自按重量计以1.5:1的比率存在。
9.一种用于治疗慢性乙型肝炎感染的组合物，其包含编码乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的mRNA，其中所述mRNA被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求9或10所述的组合物，其中所述HBs与人恒定链(hli)融合。
12.如权利要求3、6或11所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述人恒定链(hIi)包含与SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物与一种或多种重组乙型肝炎多肽顺序或同时施用。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述HBc包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其中所述HBs包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求14至17中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述佐剂是AS-01。
20.一种治疗慢性乙型肝炎感染的方法，其包括向人施用初免-加强方案，其中编码至少一种乙型肝炎病毒抗原的mRNA作为初免剂量施用，并且一种或多种重组乙型肝炎多肽作为加强剂量施用。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述mRNA编码至少一种选自乙型肝炎核心抗原(HBc)或乙型肝炎小表面蛋白(HBs)的乙型肝炎病毒抗原。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗原与hli融合。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述重组乙型肝炎多肽包含重组乙型肝炎核心蛋白(HBc)和重组乙型肝炎小表面蛋白(HBs)。
24.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组乙型肝炎多肽与佐剂一起施用。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述佐剂是AS01。
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Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
CA2085827C (en) 1991-12-23 2003-10-14 Lucas A. T. Hilgers Adjuvant composition containing synthetic hydrophobic lipopolysaccharide
DE69327599T2 (de) 1992-06-25 2000-08-10 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende Impfstoffzusammensetzung
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
RU2154068C2 (ru) 1993-11-17 2000-08-10 Лаборатуар Ом С.А. Глюкозаминовые дисахариды, способ их получения, фармацевтическая композиция
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2654522C (en) 1997-08-29 2014-01-28 Antigenics Inc. Compositions comprising the adjuvant qs-21 and polysorbate or cyclodextrin as exipient
EP1279401B1 (en) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CZ301212B6 (cs) 1998-10-16 2009-12-09 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Vakcinacní prostredek
PT1751289E (pt) 2004-05-18 2009-03-31 Alphavax Inc Vectores de alfavirais derivados da tc-83, partículas e métodos
PL1957528T3 (pl) 2005-11-30 2013-03-29 Univ Copenhagen Szczepionka nukleotydowa
CA3006395C (en) 2008-11-07 2022-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
WO2010057501A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Københavns Universitet (University Of Copenhagen) Priming of an immune response
SMT201800499T1 (it) 2009-06-10 2018-11-09 Arbutus Biopharma Corp Formulazione lipidica migliorata
WO2011075656A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
CA3009891C (en) 2009-12-23 2020-09-15 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
EP2526113B1 (en) 2010-01-22 2016-08-10 Sirna Therapeutics, Inc. Post-synthetic chemical modification of rna at the 2'-position of the ribose ring via "click" chemistry
JP2013531634A (ja) 2010-05-24 2013-08-08 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチド送達のための新規なアミノアルコールカチオン性脂質
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
RS63817B1 (sr) 2010-07-06 2023-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk
SI2590626T1 (sl) 2010-07-06 2016-01-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomi z lipidi, ki imajo koristno pKa vrednost, za dostavo RNA
HUE061068T2 (hu) 2010-08-31 2023-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilált liposzómák immunogént kódoló RNS szállítására
ES2727583T3 (es) 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
US9254265B2 (en) 2010-08-31 2016-02-09 Novartis Ag Small liposomes for delivery of immunogen encoding RNA
CN103167866B (zh) 2010-09-20 2015-09-23 瑟纳治疗公司 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
EP2621480B1 (en) 2010-09-30 2018-08-15 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU2011318289A1 (en) 2010-10-21 2013-03-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
DK2635265T3 (en) 2010-11-05 2018-07-16 Sirna Therapeutics Inc New low molecular weight cyclic amine-containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
ME03491B (me) 2011-06-08 2020-01-20 Translate Bio Inc Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk
EP4014966A1 (en) 2011-07-06 2022-06-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
EP3508220A1 (en) 2011-08-31 2019-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP3988537A1 (en) 2011-12-07 2022-04-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
DK2830594T3 (en) 2012-03-27 2018-08-13 Sirna Therapeutics Inc DIETHER-BASED BIOLOGICALLY DEGRADABLE CATIONIC LIPIDS FOR siRNA RELEASE
KR102255108B1 (ko) 2013-03-08 2021-05-24 노파르티스 아게 활성제의 전달을 위한 지질 및 지질 조성물
WO2014139587A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
MX2016005238A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Formulaciones de lipidos para la administracion de acido ribonucleico mensajero.
CA2930602C (en) 2013-11-18 2019-05-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for rna delivery
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
ES2908827T3 (es) 2013-12-19 2022-05-04 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
CA3179824A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
ES2969956T3 (es) 2014-09-05 2024-05-23 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
AU2016253972B2 (en) 2015-04-27 2020-01-02 Acuitas Therapeutics Inc. Nucleoside-modified RNA for inducing an adaptive immune response
DK3313829T3 (da) 2015-06-29 2024-06-17 Acuitas Therapeutics Inc Lipider og lipide nanopartikelformuleringer til levering af nukleinsyrer
MA46023A (fr) 2015-10-22 2019-07-03 Modernatx Inc Vaccin contre le virus de la grippe à large spectre
ES2938557T3 (es) 2015-10-28 2023-04-12 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2017099823A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
WO2017117528A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2018078053A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Curevac Ag Lipid nanoparticle mrna vaccines
US20190274968A1 (en) 2016-10-27 2019-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
US20180185516A1 (en) 2016-12-09 2018-07-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
ES2981244T3 (es) 2017-04-28 2024-10-07 Acuitas Therapeutics Inc Novedosas formulaciones de nanopartículas de lípidos de carbonilo y lípidos para la administración de ácidos nucleicos
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
US12065396B2 (en) 2017-08-17 2024-08-20 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
GB201721069D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
JP7543259B2 (ja) 2018-10-18 2024-09-02 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 活性剤の脂質ナノ粒子送達のための脂質
EP4450487A3 (en) 2019-01-11 2024-12-25 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3143631A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
CN116367854A (zh) * 2020-07-08 2023-06-30 杨森科学爱尔兰无限公司 针对hbv的rna复制子疫苗

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