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CN120303303A - 用于治疗补体旁路相关疾病的aav载体 - Google Patents

用于治疗补体旁路相关疾病的aav载体 Download PDF

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CN120303303A
CN120303303A CN202480002120.7A CN202480002120A CN120303303A CN 120303303 A CN120303303 A CN 120303303A CN 202480002120 A CN202480002120 A CN 202480002120A CN 120303303 A CN120303303 A CN 120303303A
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才源
朱莹
马珍
张绘云
周倩倩
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Hefei Xingmou Biotechnology Co ltd
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Abstract

本公开提供了一种CR2‑FH融合蛋白、编码其的多核苷酸、载体、药物组合物及其用途，可用于治疗补体旁路相关疾病例如干性AMD等。

Description

[根据细则26改正 20.06.2024]用于治疗补体旁路相关疾病的AAV载体
优先权
本申请要求2023年5月19日提交的申请号为2023105884953的中国申请的权益和优先权。出于所有目的，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及治疗补体旁路相关疾病的融合蛋白、构建体及其用途。具体地，本申请涉及治疗补体旁路相关疾病的CR2-FH分子、编码该CR2-FH分子的构建体及其用途。
 背景技术
补体系统是一种重要的宿主防御系统，在调节体液免疫和细胞免疫、分解代谢免疫复合物和清除凋亡细胞等免疫调节机制中发挥重要作用。补体系统由多种可溶性蛋白分子组成，其组成成分包含补体固有成分、多种调节因子和补体受体等分子。补体级联反应有三条激活途径：经典途径/替代途径/凝集素途径，三条途径在下游汇合于C3，并通过C5最终活化产生攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，发挥溶解细胞效应，参与免疫，是人体重要的天然免疫屏障。然而，不适当的补体激活及其在宿主细胞上的沉积可导致补体介导的靶细胞裂解，以及由于产生强大的炎症介质而导致组织破坏。异常的补体激活与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)的发病机制有关。全基因组研究表明，补体级联中多种成分的遗传变异与AMD风险增加有关，C3、C5、过敏毒素C3a和C5a以及其他急性期反应物蛋白已被证明存在于患者眼部玻璃膜疣沉积物中。在AMD患者中，血浆中C3a、C3d、Bb和C5a等水平较高，这些都表明补体激活在AMD发病机制中起作用。另外，补体旁路相关疾病还包括类风湿性关节炎、C3肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)、因子H相关的溶血性尿毒综合症(HUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、中风、心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、败血症、烧伤、与心肺转流和血液透析相关的炎症、血浆去除术、血小板分离、白细胞分离法、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)和放射造影剂诱导的过敏反应。
AMD是影响视网膜黄斑或中央区的致衰、致盲疾病，并且是老年中不可逆视觉丧失的主导原因。在发达国家，AMD是65岁以上人群高发的致盲性疾病，在全球范围内影响着约9％的人口。AMD主要分为干性和湿性两种，其中干性AMD占80％以上，晚期可发展为地图样萎缩(geographic atrophy，GA)。干性AMD的典型特征是与视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium，RPE)细胞退行性改变有关的玻璃膜疣的形成，黄斑中央出现一个可见的色素沉着区，且出现感光细胞——视杆(Rod)和视锥(Cone)细胞的丧失。干性AMD后期，RPE大面积的萎缩，脉络膜血管萎缩，导致永久性中心视力丧失。
因子H(factor H，FH)为1231个氨基酸组成的单链糖蛋白，分子量155kDa，由20个短共有重复序列(short consensus repeat，SCR)组成，是替代途径的关键抑制剂，FH功能缺陷或水平不足可能会促进补体激活，从而增加局部组织损伤的风险。在正常生理情况下，C3与因子B(factor B，FB)、因子D(factor D，FD)等相互作用，可产生极少量的C3b和C3bBb(C3转化酶)，C3转化酶迅速受FH作用，不能再激活C3和后续的补体成分。病理情况下，FH对C3转化酶的控制不足，C3转化酶将C3蛋白水解成C3b分子，同时产生过敏毒素C3a，补体级联转移到其末端裂解途径，这会产生过敏毒素C5a和MAC，C5a和MAC都会导致强烈的炎症信号。已有研究证明，在干性AMD中，由于RPE细胞的功能障碍，视网膜动态平衡受到损害，FH的减少导致C3在RNA和蛋白质水平上积累，RPE细胞更易因氧化应激产生损伤。内源性的FH有助于调节转录和代谢稳态，并保护RPE细胞免受氧化应激损伤。此外，FH具有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是第一个发现与干性AMD相关的补体SNPs。由于补体在宿主防御和免疫复合物分解代谢中起重要作用，将补体抑制剂FH靶向补体活化和疾病部位可能会提高其疗效，同时减少补体抑制带来的副作用。补体受体2(CR2)是一种补体受体，是C3结合蛋白家族的成员，由15或16个SCR结构域组成，CR2的天然配体是iC3b，C3dg和C3d，它们是C3的分解片段。C3的裂解最初导致C3b在活化细胞表面的产生和沉积，C3b片段参与扩增补体级联反应的酶复合物的产生。在细胞表面，C3b迅速转化为无活性的iC3b，特别是当沉积在含有补体激活调节剂的宿主表面时。即使没有膜结合的补体调节因子，由于FH的作用，也会形成大量水平的iC3b。随后，iC3b被因子I(factor I，FI)和其他蛋白酶消化为膜结合片段C3dg和C3d，但这个过程相对缓慢。因此，CR2的C3配体一旦产生后就相对长寿，并且以高浓度存在于补体激活位点。CR2因此能充当将分子带到补体激活位点的有效靶向载体。尽管在AMD治疗方面，特别是在使用VEGF抑制剂的情况下，湿性AMD抗体药物及基因治疗产品已取得良好进展，但是截止目前国内还没有批准用于干性AMD的基因治疗药物。因此，迫切需要新的治疗药物来解决这一问题。基于基因治疗产品具有持续作用的优势，因此我们希望开发干性AMD的高效治疗药物。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)最早于在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(adenovirus，AdV)制剂中发现，随后很快就在人体组织中被发现。由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，能高效长期表达外源基因等特点，使其成为基因递送的重要工具。目前，前沿的AAV基因组设计能够将衣壳中携带的单链DNA设计成自我互补的序列。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录，与传统的单链AAV基因组相比，它的基因表达更为迅速，而且表达量更高。至今为止，全球已有六款以重组AAV为载体的基因治疗药物获批上市，除了诺华公司的Zolgensma(AAV9型)以外，还有UniQure公司开发的Glybera(AAV1型)和Spark Therapeutics公司开发的Luxturna(AAV2型)等。由此我们可以看出，AAV基因疗法的潜力巨大，基因治疗成为解决药物持续作用且时间有限这一困境的核心技术。
发明内容
本公开一方面提供了补体受体2(CR2)-因子H(FH)融合蛋白(以下简称为CR2-FH融合蛋白)，其包括：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；所述FH部分包含FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域(例如FH(SCR1-SCR4))。在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分以融合蛋白的形式直接或间接地相互融合。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过共价连接的。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分可选择地由连接体序列连接。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过氨基酸连接体序列连接的。所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
“分离的”的物质是指已经经人工获得的"被分离"的物质或成分，其以足够纯的状态存在。在某些实施方式中，融合蛋白的纯度为至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；所述FH部分包含两个或更多个FH片段，所述FH片段包含FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))，优选地，所述两个或更多个FH片段之间由连接体序列连接，更优选地，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))、FH的N-末端第八个SCR结构域(例如FH(SCR8))和FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域(例如FH(SCR19-SCR20))。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))和FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域(例如FH(SCR18-SCR20))。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))、FH的N-末端第十八个SCR结构域(例如FH(SCR18))和FH的N-末端第二十个SCR结构域(例如FH(SCR20))。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；其中所述FH部分包含两个FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))以及FH的N-末端第七个SCR结构域(例如FH(SCR7))。
在一些实施方式中，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，所述结构域之间由连接体序列连接，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述FH的N-末端第七个SCR结构域包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述CR2部分或其变体包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过连接体序列连接的，优选地，所述连接体序列如(G4S)n所示，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含信号肽序列，优选地，所述信号肽序列位于N-末端，更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供多核苷酸，其编码本公开中所述的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，编码所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：19、28或29所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第八个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：20所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：21所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：24所示的序列。在一些实施方式中，编码所述CR2部分的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：18所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：57所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：58所示的序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第七个SCR结构域包含如SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：74所示的序列。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列包含编码信号肽序列的多核苷酸序列，优选地，所述编码信号肽的多核苷酸序列位于编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列的5’端，更优选地，编码所述信号肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO：37或38所示。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75所示的序列。
在另一方面，本公开提供载体，其编码本公开中所述的多核苷酸。在一些实施方式中，所述载体选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。
在另一方面，本公开提供宿主细胞，其包含如本公开中所述的多核苷酸或如本公开中所述的载体。
在另一方面，本公开提供AAV颗粒，其包含如本公开中所述的AAV载体。
在另一方面，本公开提供药物组合物，其包含本公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒中的至少一种，
以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述组合物适于眼内、静脉内、动脉内、皮下、气管内或吸入给药。
在另一方面，本公开提供本公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒、或本公开中所述的药物组合物在制备用于治疗在受试者中补体旁路相关疾病的药物中的用途。
本公开提供一种在所需受试者中治疗补体旁路相关疾病的方法，其中施用有效量的公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒、或本公开中所述的药物组合物。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是炎性疾病或自身免疫疾病。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是年龄相关性黄斑变性，优选为干性年龄相关性黄斑变性。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是微血管病性溶血性贫血、血小板减少症或急性肾衰竭的症状。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病选自黄斑变性、缺血再灌注、器官移植排斥、玻璃疣相关疾病、妊娠相关性疾病、药物不良反应、和心肺转流后并发症。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎、C3肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)、因子H相关的溶血性尿毒综合症(HUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、中风、心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、败血症、烧伤、与心肺转流和血液透析相关的炎症、血浆去除术、血小板分离、白细胞分离法、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)和放射造影剂诱导的过敏反应。
 附图说明
图1示出了XMDC025、XMDC026、XMDC029、CR2-FH(1-4)和CR2-FH(1-5)的结构示意图。
图2A-E示出了ssAAV-XMDC025、ssAAV-XMDC026、ssAAV-XMDC029、ssAAV-CR2-FH(1-4)和ssAAV-CR2-FH(1-5)的载体信息。
图3A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层厚度的影响。
图4A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层核密度的影响。
图5A-B示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)的视网膜HE染色图像。
图6A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视锥细胞数量的影响。
图7A-B示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)的视锥细胞免疫荧光染色图像。
图8A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视杆细胞外节段厚度的影响。
图9A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视杆细胞免疫荧光染色图像。
图10A-B示出了AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠RPE细胞的影响。
图11A-B示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)的RPE细胞F-肌动蛋白染色图像。
图12示出了XMDC061、XMDC062、XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC061-(CR2-R36AK41A K67A)和XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)的结构示意图。
图13A-G示出了ssAAV-XMDC061、ssAAV-XMDC062、ssAAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)和ss-AAVXMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)的载体信息。
图14A-B示出了CR2-FH(SCR1-5+1-5)结构示意图和ssAAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)载体信息图。
图15示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层厚度的影响。
图16示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层核密度的影响。
图17示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)的视网膜HE染色图像。
图18示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视锥细胞数量的影响。
图19示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)的视锥细胞免疫荧光染色图像。
图20示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视杆细胞外节段厚度的影响。
图21示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜视杆细胞免疫荧光染色图像。
图22示出了AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠RPE细胞的影响。
图23示出了PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)的RPE细胞F-肌动蛋白染色图像。
发明详述
下面关于本公开的描述仅仅旨在说明本公开的各种不同的实施方式。因此，所讨论的特定修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本公开范围的情况下做出各种不同的等效、改变和修改方案，并且应当理解这些等效实施方式将被包含在本文中。本文引用的包含出版物、专利和专利申请在内的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
本公开一方面提供了补体受体2(CR2)-因子H(FH)融合蛋白(以下简称为CR2-FH融合蛋白)，其包括：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体；所述FH部分包含FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域。在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分以融合蛋白的形式直接或间接地相互融合。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过共价连接的。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过氨基酸连接体序列连接的。在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过连接体序列连接的，优选地，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
本文所用的“融合蛋白”是指可操作地相互连接的两个或多个肽、多肽或蛋白质。在一些实施方式中，CR2-FH融合蛋白中所述CR2部分和所述FH部分被直接相互融合。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过氨基酸连接体序列连接的。连接体序列的实例在本领域是已知的，并且包含例如(Gly4Ser)、(Gly4Ser)2、(Gly4Ser)3、(Gly3Ser)4、(SerGly4)、(SerGly4)2、(SerGly4)3和(SerGly4)4。连接序列还可包含在补体因子的不同结构域之间发现的“天然”连接序列，也被称为内源性链接序列。融合蛋白中CR2部分和FH部分的次序可以变化。例如，在一些实施方式中，所述CR2部分的C-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的FH部分的N-末端。在一些实施方式中，CR2部分的N-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的FH部分的C-末端。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域；所述FH部分包含两个或更多个FH片段，所述FH片段包含FH的前四个N-末端SCR结构域，优选地，所述两个或更多个FH片段之间由连接体序列连接，更优选地，所述连接体序列包含如(G4S)n所示的序列和/或内源性序列，其中n为大于0的整数。在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域；所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域、FH的N-末端第八个SCR结构域和FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过连接体序列连接的，优选地，所述连接体序列包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域；其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域和FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过连接体序列连接的，优选地，所述连接体序列包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))、FH的N-末端第十八个SCR结构域(例如FH(SCR18))和FH的N-末端第二十个SCR结构域(例如FH(SCR20))。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第十八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过连接体序列连接的，优选地，所述连接体序列包含如(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，提供的CR2-FH融合蛋白包含：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体(例如CR2(SCR1-SCR4)或其变体，诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列)；其中所述FH部分包含两个FH的前四个N-末端SCR结构域(例如FH(SCR1-SCR4))以及FH的N-末端第七个SCR结构域(例如FH(SCR7))。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第七个SCR结构域包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或FH内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，所述结构域之间由连接体序列连接，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或FH内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：10具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，其中所述CR2-FH融合蛋白具有结合于CR2配体和抑制旁路途径的补体激活的双重功能。所述CR2-FH融合蛋白可以以一定的结合亲合性结合于CR2配体，所述结合亲合性为所述CR2蛋白质的大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中任何一个。结合亲合性可以通过本领域已知的任何方法进行测定，包含例如表面等离子体共振、量热法滴定、ELISA和流式细胞术。CR2-FH融合蛋白也能抑制旁路途径的补体激活，具有的补体抑制活性为所述FH蛋白质的补体抑制活性的大约50％、60％、70％、80％、90％或100％中任何一个或更高。
在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，CR2-FH融合蛋白形成二聚体或多聚体。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含信号肽序列，优选地，所述信号肽序列位于N-末端，更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在一些实施方式中，所述CR2-FH融合蛋白包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
CR2部分
本文所述的CR2部分包含CR2或其片段。CR2是主要在成熟B细胞和滤泡树突样细胞(follicular dendritic cells)上表达的跨膜蛋白质。CR2是C3结合蛋白家族的成员。CR2的天然配体是iC3b，C3dg和C3d，它们是C3的分解片段。C3的裂解最初导致C3b在活化细胞表面的产生和沉积，C3b片段参与扩增补体级联反应的酶复合物的产生。在细胞表面，C3b迅速转化为无活性的iC3b，特别是当沉积在含有补体激活调节剂的宿主表面时。即使没有膜结合的补体调节因子，由于FH的作用，也会形成大量水平的iC3b。随后，iC3b被因子I(factor I，FI)和其他蛋白酶消化为膜结合片段C3dg和C3d，但这个过程相对缓慢。因此，CR2的C3配体一旦产生后就相对长寿，并且以高浓度存在于补体激活位点。CR2因此能充当将分子带到补体激活位点的有效靶向载体。CR2含有具有15个或16个被称为短同源重复序列(SCR结构域)的重复单元的胞外部分。SCR结构域具有高度保守残基的典型框架，所述高度保守残基包含四个半胱氨酸、两个脯氨酸、一个色氨酸以及几个其它部分保守的甘氨酸和疏水性残基。SCR1-4结构域位于人类CR2蛋白质序列位置第23-271个氨基酸。在本公开的一些实施方式中，所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述CR2部分包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。CR2部分的变体还可以包含一些突变位点，CR2部分的变体包含如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
H因子部分(FH部分)
本文所述的CR2-FH融合蛋白的FH部分包含FH或其片段。补体因子H(FH)是单多肽链血浆糖蛋白。该蛋白质是由以一串20个珠子样连续的方式排列的大约60个氨基酸的20个重复SCR结构域组成的。H因子结合于C3b，加速了旁路途径C3转化酶(C3Bb)的衰变，并且充当C3b蛋白水解失活的辅因子。在H因子的存在下，C3b蛋白水解导致C3b的切割。SCR1-4结构域位于人类补体因子H蛋白质序列位置第21-262个氨基酸。在本公开的一些实施方式中，所述FH部分包含两个或更多个FH片段，所述FH片段包含FH的前四个N-末端SCR结构域，优选地，所述两个或更多个FH片段之间由连接体序列连接，更优选地，所述连接体序列如(G4S)n所示，其中n为大于0的整数。在一些实施方式中，所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在本公开的一些实施方式中，所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域、FH的N-末端第八个SCR结构域和FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域。在本公开的一些实施方式中，所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域和FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域。在一些实施方式中，FH是野生型FH。在一些实施方式中，FH部分是野生型FH的片段或者若干片段直接或间接连接而成。
在另一方面，本公开提供多核苷酸，其编码本公开中所述的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，编码所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：19、28或29所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第八个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：20所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：21所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：24所示的序列。在一些实施方式中，编码所述CR2部分的多核苷酸序列包含如SEQ ID NO：18所示的序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第十八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：57所示的多核苷酸序列。在一些实施方式中，编码所述FH的N-末端第二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：58所示的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述FH的N-末端第七个SCR结构域包含如SEQ ID NO：61所示的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：74所示的序列，或者与SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：74具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。
在一些实施方式中，多核苷酸序列为DNA或者RNA，例如mRNA序列。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列包含编码信号肽序列的多核苷酸序列，优选地，所述编码信号肽的多核苷酸序列位于编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列的5’端，更优选地，编码所述信号肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO：37或38所示。
在一些实施方式中，编码所述CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75所示的序列，或者与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：75具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。
在另一方面，本公开提供载体，其编码本公开中所述的多核苷酸。在一些实施方式中，所述载体选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。
在另一方面，本公开提供宿主细胞，其包含如本公开中所述的多核苷酸或如本公开中所述的载体。
在另一方面，本公开提供AAV颗粒，其包含如本公开中所述的AAV载体。在一些实施方式中，所述AAV颗粒通过包含一个或多个编码AAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸和编码AAV辅助病毒功能的核酸的生产细胞系产生。
在一些实施方式中，所述AAV的血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在一些实施方案中，所述AAV载体包含侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述异源核酸侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10血清型的ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR为AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述AAV颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述ITR和所述衣壳源自AAV2。在其他实施方案中，所述AAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。
在一些实施方式中，所述AAV载体包含一个或多个启动子、增强子、或多聚腺苷酸化信号。
在另一方面，本公开提供药物组合物，其包含本公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒中的至少一种，
以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述组合物适于眼内、静脉内、动脉内、皮下、气管内或吸入给药。
在另一方面，本公开提供本公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒、或本公开中所述的药物组合物在制备用于治疗在受试者中补体旁路相关疾病的药物中的用途。
本公开提供一种在所需受试者中治疗补体旁路相关疾病的方法，其中施用有效量的公开中所述的CR2-FH融合蛋白、本公开中所述的多核苷酸、本公开中所述的载体、本公开中所述的宿主细胞、本公开中所述的AAV颗粒、或本公开中所述的药物组合物。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是炎性疾病或自身免疫疾病。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是年龄相关性黄斑变性，优选为干性年龄相关性黄斑变性。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病是微血管病性溶血性贫血、血小板减少症或急性肾衰竭的症状。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病选自黄斑变性、缺血再灌注、器官移植排斥、玻璃疣相关疾病、妊娠相关性疾病、药物不良反应、和心肺转流后并发症。
在一些实施方式中，所述补体旁路相关疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎、C3肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)、因子H相关的溶血性尿毒综合症(HUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、中风、心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、败血症、烧伤、与心肺转流和血液透析相关的炎症、血浆去除术、血小板分离、白细胞分离法、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)和放射造影剂诱导的过敏反应。
在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选为人。
下面将进一步详细说明本公开。然而，实施本公开的方式不限于下述实施例。
实施例1：表达CR2和FH片段基因的AAV质粒载体的构建
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR8氨基酸序列(SEQ ID NO：3)、SCR19-SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR8)+linker+FH(SCR19-SCR20)-+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC025(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图1。
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR18-SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR18-SCR20)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC026(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图1。
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC029(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图1。
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker-的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为CR2-FH(1-4)(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图1。
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR5氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR5)+linker-的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为CR2-FH(1-5)(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图1。
用BamH I/EcoR V双酶切XMDC025、XMDC026、XMDC029、CR2-FH(1-4)、CR2-FH(1-5)和ssAAV质粒，通过连接、转化及克隆筛选鉴定等常规分子生物学操作构建了ssAAV-XMDC025、ssAAV-XMDC026、ssAAV-XMDC029、ssAAV-CR2-FH(1-4)、ssAAV-CR2-FH(1-5)载体，其载体信息见图2。用无内毒素的质粒提取试剂盒(MN)获得高质量的质粒DNA备用。
上述结构中内源性的linker为CR2或FH结构中的内源性的连接序列。因此本领域技术人员应理解，结构中linker序列是根据其C端或N端连接的CR2或FH结构序列的不同所确定的。
表1.序列信息
实施例2：重组AAV病毒的制备和鉴定
使用三质粒包装系统制备重组AAV病毒，辅助质粒(phelper)、AAV的Cap和Rep蛋白表达质粒、表达载体目的质粒(ssAAV-XMDC025、ssAAV-XMDC026、ssAAV-XMDC029、ssAAV-CR2-FH(1-4)、ssAAV-CR2-FH(1-5))按照2:1:1的质量比，和PEI促转剂形成转染复合物，转染HEK293T细胞，进行AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)病毒包装。分别于转染后第3天和第7天，进行两次上清的收集，即获得含有目的基因的AAV病毒颗粒。采用不同梯度的碘克沙醇(15％、25％、40％和60％)进行密度梯度离心(Beckman的超速离心机)，获得纯化的AAV病毒。对获得的纯化的AAV病毒，通过透射电子显微电镜进行AAV质量的鉴定和qPCR进行AAV病毒滴度的定量。
实施例3：PEG-400诱导干性AMD小鼠模型及AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)注射给药
使用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)诱导干性AMD小鼠模型，PEG处理的小鼠会出现与干性AMD临床病理特征相似的视网膜病理改变，如视网膜结构破坏，RPE细胞损伤和光感受器丧失。具体方法如下：
SPF级4周雄性C57BL/6J小鼠70只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重14g左右，按照小鼠节律在12小时光照与黑暗交替环境下饲养。
由于AAV注射后需要一定时间目的基因的表达才能达到稳定水平，于第1天进行双眼玻璃体腔注射给药，于第22天进行双眼视网膜下腔注射PEG-400造模，于第27天摘取眼球进行冷冻切片，并染色观察视网膜、RPE结构。处理见表2：
表2.第1天对小鼠进行双眼玻璃体腔注射给药
具体操作步骤如下：
玻璃体腔注射给药：小鼠双眼各滴5％扩瞳液进行扩瞳，腹腔注射5％水合氯醛10mL/kg(生工)麻醉，将麻醉后的动物侧卧于操作台上，选择眼睛颞上或鼻上角巩膜缘后1-2mm为注射进针处(注射器：Hamilton针，7632-01)，注意避免损伤晶体后囊和其它视网膜部位。针头进入玻璃体腔，推注注射液，结束后停顿10秒缓慢拔针，涂红霉素眼膏，放回笼中。
实施例4：苏木素伊红(HE)染色评估AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层厚度及核密度的影响
将实施例3中的小鼠摘除眼球，取单侧眼于4％多聚甲醛(biosharp)4℃固定过夜，PBS(biosharp)清洗4次后将角膜与晶状体剥离，保留视网膜、脉络膜、巩膜等眼杯进行30％蔗糖(生工)脱水，直至沉底后进行10μm厚度冷冻切片，进行HE染色，染色完成后拍照并用Image J对视网膜切片进行外核层(outer nuclear layer，ONL)厚度及核密度测量并分析差异。
结果见图3、图4、图5，与对照组相比，造模组小鼠视网膜外核层厚度及核密度显著减少，视网膜结构明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)能显著增加外核层的厚度及核密度，改善了视网膜的结构损伤，注射AAV-CR2-FH(1-5)仅能显著增加外核层的厚度；AAV-XMDC029对视网膜厚度的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-4)，对视网膜核密度的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)。
实施例5：免疫荧光染色评估AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜感光细胞的影响
将实施例4中冷冻切片于载片盒内室温晾干，用免疫组化笔(Vectorlabs)将载玻片上的组织圈起；将多聚赖氨酸载玻片(世泰)放入湿盒内，用PBS清洗载玻片上的组织，室温孵育5分钟，倒掉玻片上的PBS，如此洗涤5次，每次10分钟；加封闭液(5％山羊血清(碧云天)+0.5％Triton 100(生工))500μL/张，于湿盒内室温孵育45分钟；倒掉载玻片上的封闭液，滴加一抗混合液：视锥细胞感光物质Cone Arresting-1(EMD Millipore Corp)、视杆细胞感光物质Rodopsin-1(Santa Cruz)，200μL/张，放置于湿盒内4℃过夜孵育；次日，室温下以PBS冲洗5次，每次5分钟；加二抗混合液：Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 555(Cell Signaling)和Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 488(Invitrogen)1:500稀释进行复染，于湿盒内避光室温孵育2.5小时；此步后均需避光；去除二抗，室温下PBS冲洗5次，每次5分钟；加DAPI染色液(Sigma)，50μL/张，室温孵育10分钟后，PBS冲洗3次，每次5分钟；封片，在荧光显微镜下观察拍照。
结果见图6、图7、图8和图9，与对照组相比，造模组视网膜视锥细胞数量减少，视杆细胞外节段厚度变窄，感光细胞明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)均能显著改善视锥细胞与视杆细胞损伤；AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)对视锥细胞损伤的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-5)。
实施例6：F-肌动蛋白染色评估AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠RPE细胞的影响
将实施例3中小鼠摘除的另一侧眼于4％多聚甲醛中4℃固定过夜；摘除角膜、晶状体、肌肉和视网膜，将巩膜、脉络膜、RPE复合物在室温下用4％多聚甲醛固定2小时，用PBS清洗3次，每次5分钟；将巩膜、脉络膜、RPE复合物在封闭液(5％山羊血清+0.5％TritonX-100)中室温封闭1小时，用594鬼笔环肽(Jackson ImmunoResearch)(1:40甲醇储存原液)在室温下置于振荡器上染色40分钟，然后于振荡器上用PBS清洗6次，每次5分钟，在室温下用DAPI染色30分钟，然后用PBS清洗3次，每次5分钟，将巩膜、脉络膜、RPE复合物转移到载玻片上，剪为8瓣左右，封片，在荧光显微镜下观察拍照。
结果见图10和图11，与对照组相比，造模组RPE细胞显著增大，RPE细胞明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC025、AAV-XMDC026、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(1-4)能显著减小RPE细胞面积，RPE细胞损伤得到改善，注射AAV-CR2-FH(1-5)对RPE细胞损伤无改善作用；AAV-XMDC029对RPE细胞损伤的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-4)和AAV-CR2-FH(1-5)。
结合HE染色、免疫荧光染色及F-肌动蛋白染色结果，注射AAV-XMDC029对PEG-400诱导的干性AMD小鼠模型视网膜外核层核密度、RPE细胞损伤的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-4)、AAV-CR2-FH(1-5)，对外核层厚度的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-4)，对视锥细胞的改善作用优于AAV-CR2-FH(1-5)。
实施例7：其他质粒载体的构建
方案1
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR18氨基酸序列(SEQ ID NO：39)、SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：40)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR18)+linker+FH(SCR20)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC061(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案2
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR7氨基酸序列(SEQ ID NO：43)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR7)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC062(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案3
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4的R36A K41A K67A突变体氨基酸序列(SEQ ID NO：46)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR8氨基酸序列(SEQ ID NO：3)、SCR19-SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR8)+linker+FH(SCR19-SCR20)-+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案4
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4的R36A K41A K67A突变体氨基酸序列(SEQ ID NO：46)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR18-SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR18-SCR20)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)(由生工生物工程上海股份有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案5
根据CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4的R36A K41A K67A突变体氨基酸序列(SEQ ID NO：46)与FH(Gene ID:3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案6
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4的R36A K41A K67A突变体氨基酸序列(SEQ ID NO：46)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR18氨基酸序列(SEQ ID NO：39)、SCR20氨基酸序列(SEQ ID NO：40)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+FH(SCR18)+linker+FH(SCR20)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
方案7
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4的R36A K41A K67A突变体氨基酸序列(SEQ ID NO：46)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、SCR7氨基酸序列(SEQ ID NO：43)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR4)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR7)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图12。
上述结构中内源性的linker为CR2或FH结构中的内源性的连接序列。因此本领域技术人员应理解，结构中linker序列是根据其C端或N端连接的CR2或FH结构序列的不同所确定的。
用BamH I/EcoR V双酶切XMDC061、XMDC062、XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)和ssAAV质粒，通过连接、转化及克隆筛选鉴定等常规分子生物学操作构建了ssAAV-XMDC061、ssAAV-XMDC062、ssAAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC026-(CR2-R36AK41A K67A)、ssAAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC061-(CR2-R36AK41A K67A)、ssAAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A))载体，其载体信息见图13。用无内毒素的质粒提取试剂盒(MN)获得高质量的质粒DNA备用。
方案8
根据NCBI上公布的CR2(Gene ID：1380)的SCR1-SCR4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与FH(Gene ID：3075)的SCR1-SCR5氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，在组合物的N端加上分泌信号肽CD5-sp氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，用(G4S)2和内源性的linker接头连接，组成了结构为CD5-sp+linker+CR2(SCR1-SCR4)+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR5)+linker+(G4S)2+linker+FH(SCR1-SCR5)+linker的开放阅读框，根据人密码子偏好设计核苷酸序列，并在5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入EcoR V酶切位点，命名为CR2-FH(SCR1-5+1-5)(由苏州金唯智生物科技有限公司合成全基因)，其结构示意图见图14。
上述结构中内源性的linker为CR2或FH结构中的内源性的连接序列。因此本领域技术人员应理解，结构中linker序列是根据其C端或N端连接的CR2或FH结构序列的不同所确定的。
用BamH I/EcoR V双酶切CR2-FH(SCR1-5+1-5)和ssAAV质粒，通过连接、转化及克隆筛选鉴定等常规分子生物学操作构建了ssAAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)载体，其载体信息见图14。用无内毒素的质粒提取试剂盒(MN)获得高质量的质粒DNA备用。
表3.序列信息
实施例8：其他重组AAV病毒的制备和鉴定
使用三质粒包装系统制备重组AAV病毒，辅助质粒(phelper)、AAV的Cap和Rep蛋白表达质粒、表达载体目的质粒(ssAAV-XMDC061、ssAAV-XMDC062、ssAAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、ssAAV-XMDC062-(CR2-R36AK41A K67A)、ssAAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5))按照2:1:1的质量比，和PEI促转剂形成转染复合物，转染HEK293T细胞，进行AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)病毒包装。分别于转染后第3天和第7天，进行两次上清的收集，即获得含有目的基因的AAV病毒颗粒。采用不同梯度的碘克沙醇(15％、25％、40％和60％)进行密度梯度离心(Beckman的超速离心机)，获得纯化的AAV病毒。对获得的纯化的AAV病毒，通过透射电子显微电镜进行AAV质量的鉴定和qPCR进行AAV病毒滴度的定量。
实施例9：PEG-400诱导干性AMD小鼠模型及AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)注射给药
具体方法如下：
SPF级4-5周雄性C57BL/6J小鼠88只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重14 -18g左右，按照小鼠节律在12小时光照与黑暗交替环境下饲养。
由于AAV注射后需要一定时间目的基因的表达才能达到稳定水平，于第1天进行双眼玻璃体腔注射给药，于第22天进行双眼视网膜下腔注射PEG-400造模，于第27天摘取眼球进行冷冻切片，并染色观察视网膜、RPE结构。处理见表4：
表4.给药方案
具体注射给药的操作步骤同实施例3。
实施例10：苏木素伊红(HE)染色评估AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜外核层厚度及核密度的影响
将实施例9中的小鼠摘除眼球，取单侧眼进行冷冻切片和HE染色，染色完成后拍照并用Image J对视网膜切片进行外核层(outer nuclear layer，ONL)厚度及核密度测量并分析差异，具体操作步骤同实施例4。
结果见图15、图16、图17，与对照组相比，造模组小鼠视网膜外核层厚度及核密度显著减少，视网膜结构明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)均能显著增加外核层厚度及核密度，改善视网膜结构损伤。
实施例11：免疫荧光染色评估AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠视网膜感光细胞的影响
将实施例9中冷冻切片进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察拍照，具体操作步骤同实施例5。
结果见图18、图19、图20和图21，与对照组相比，造模组视网膜视锥细胞数量减少，视杆细胞外节段厚度变窄，视锥与视杆细胞明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC029可显著改善造模引起的损伤，有效保护视锥细胞与视杆细胞外节段厚度。
实施例12：F-肌动蛋白染色评估AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD模型小鼠RPE细胞的影响
将实施例9中小鼠摘除的另一侧眼进行F-肌动蛋白染色，在荧光显微镜下观察拍照，具体操作步骤同实施例6。
结果见图22和图23，与对照组相比，造模组RPE细胞显著增大，RPE细胞明显损伤；与造模组相比，注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36AK41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36AK41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36AK41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)均能显著减小RPE细胞面积，RPE细胞损伤得到明显改善。
结合HE染色、免疫荧光染色及F-肌动蛋白染色结果，注射AAV-XMDC061、AAV-XMDC062、AAV-XMDC025-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC026-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC029-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC061-(CR2-R36A K41AK67A)、AAV-XMDC062-(CR2-R36A K41A K67A)、AAV-XMDC029、AAV-CR2-FH(SCR1-5+1-5)对PEG-400诱导的干性AMD小鼠模型视网膜外核层结构损伤与RPE细胞损伤均具有显著改善作用，其中AAV-XMDC029还可有效改善视锥细胞与视杆细胞外节段厚度的损伤。
统计分析
采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理和统计分析。统计学水平设在5％或p≤0.05，计算各项分析指标的平均数和标准误(Mean±SEM)，p≤0.05即为差异具有统计学意义。
本公开不限于上述实施方式。在不违背本公开的精神和原则的情况下做出的任何改动、修改、替换、组合、简化均属于本公开的等同技术方案，并且均包含在本公开的保护范围之内。

Claims (33)

  1. 一种补体受体2(CR2)-因子H(FH)融合蛋白，其包括：a)包含CR2片段的CR2部分，和b)包含FH片段的FH部分，所述CR2部分和所述FH部分可选择地由连接体序列连接，其中所述CR2部分包含CR2的前四个N-末端SCR结构域或其变体，所述FH部分包含FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域。
  2. 如权利要求1所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH部分包含两个或更多个FH片段，所述FH片段包含FH的前四个N-末端SCR结构域，所述两个或更多个FH片段之间可选择地由连接体序列连接。
  3. 如权利要求1所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域、FH的N-末端第八个SCR结构域和FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域。
  4. 如权利要求1所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域和FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域。
  5. 如权利要求1所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH部分包含FH的前四个N-末端SCR结构域、FH的N-末端第十八个SCR结构域和FH的N-末端第二十个SCR结构域。
  6. 如权利要求1所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH部分包含两个FH的前四个N-末端SCR结构域以及FH的N-末端第七个SCR结构域。
  7. 如权利要求1至6中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
  8. 如权利要求1至6中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述结构域之间由连接体序列连接，所述连接体序列包含(G4S)n所示序列和/或内源性连接序列，其中n为大于0的整数。
  9. 如权利要求1至8中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
  10. 如权利要求3所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
  11. 如权利要求3所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第十九至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
  12. 如权利要求4所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第十八至二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
  13. 如权利要求5所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第十八个SCR结构域包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
  14. 如权利要求5所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第二十个SCR结构域包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。
  15. 如权利要求6所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述FH的N-末端第七个SCR结构域包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
  16. 如权利要求1至15中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述CR2部分或其变体包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
  17. 如权利要求1至16中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述CR2-FH融合蛋白包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
  18. 如权利要求1至17中任一项所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述CR2-FH融合蛋白包含信号肽序列，优选地，所述信号肽序列位于N-末端，更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
  19. 如权利要求18所述的CR2-FH融合蛋白，其中所述CR2-FH融合蛋白包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
  20. 多核苷酸，其编码如权利要求1至19中任一项所述的CR2-FH融合蛋白。
  21. 如权利要求所述的多核苷酸，所述编码CR2-FH融合蛋白的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：22、23、25、26、30、31、59、60、62、63、65、66、67、68、70、71、72、73、74或75所示的核苷酸序列。
  22. 载体，其编码如权利要求20或21所述的多核苷酸。
  23. 如权利要求22所述的载体，其中所述载体选自选自腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、RNA病毒载体、慢病毒载体和牛痘病毒载体中的至少一种。
  24. 宿主细胞，其包含如权利要求20或21所述的多核苷酸或如权利要求23所述的载体。
  25. AAV颗粒，其包含如权利要求23所述的AAV载体。
  26. 药物组合物，其包含如权利要求1至19中任一项所述的CR2-FH融合蛋白、如权利要求20或21所述的多核苷酸、如权利要求22或23所述的载体、如权利要求24所述的宿主细胞、如权利要求25所述的AAV颗粒中的至少一种，
    以及药学上可接受的载体。
  27. 如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物适于眼内、静脉内、动脉内、皮下、气管内或吸入给药。
  28. 如权利要求1至19中任一项所述的CR2-FH融合蛋白、如权利要求20或21所述的多核苷酸、如权利要求22或23所述的载体、如权利要求24所述的宿主细胞、如权利要求25所述的AAV颗粒、或如权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗在受试者中补体旁路相关疾病的药物中的用途。
  29. 如权利要求28所述的用途，其中所述补体旁路相关疾病是炎性疾病或自身免疫疾病。
  30. 如权利要求28所述的用途，其中所述补体旁路相关疾病是年龄相关性黄斑变性，优选为干性年龄相关性黄斑变性。
  31. 如权利要求28所述的用途，其中所述补体旁路相关疾病是微血管病性溶血性贫血、血小板减少症或急性肾衰竭的症状。
  32. 如权利要求28所述的用途，其中所述补体旁路相关疾病选自黄斑变性、缺血再灌注、器官移植排斥、玻璃疣相关疾病、妊娠相关性疾病、药物不良反应、和心肺转流后并发症。
  33. 如权利要求28所述的用途，其中所述补体旁路相关疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎、C3肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)、因子H相关的溶血性尿毒综合症(HUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、中风、心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、败血症、烧伤、与心肺转流和血液透析相关的炎症、血浆去除术、血小板分离、白细胞分离法、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)和放射造影剂诱导的过敏反应。
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