JP2021500071A - ヒト翻訳後修飾ｖｅｇｆ−ｔｒａｐによる眼疾患および転移性大腸がんの処置 - Google Patents
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Abstract
眼疾患、例えば加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）または新血管形成に関連した状態もしくはがん、例えば転移大腸がんと診断され、治療的ｍＡｂによる処置が適応となったヒト対象への、完全ヒト翻訳後修飾（ＨｕＰＴＭ）治療的ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）の送達のための組成物および方法が記載される。送達は、遺伝子療法を通して、例えば、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ、すなわち、ヒトグリコシル化導入遺伝子生成物を連続的に供給する恒久的なデポーを患者の組織または臓器に形成するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするウイルスベクター、好ましくはＡＡＶ８または変異体ＡＡＶ．７ｍ８、または他のＤＮＡ発現構築物を、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐによる処置に適応された眼の状態またはがんと診断された患者（ヒト対象）に投与することによって、有利に達成することができる。あるいは、眼疾患またはがんの処置のために、例えば、培養されたヒト細胞培養、例えば不死化された網膜または肝臓細胞において生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを患者に投与することができる。【選択図】図５−１
Description
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる配列表を含む。２０１８年１０月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２６１１５＿１０５００２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１９７，４３８バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる配列表を含む。２０１８年１０月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２６１１５＿１０５００２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１９７，４３８バイトである。
本発明は、例えば滲出型加齢性黄斑変性症（「ＷＡＭＤ」）、加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮水腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視およびポリープ様脈絡膜脈管障害を含む、増加した血管化によって引き起こされる眼疾患と診断されたヒト対象の目の網膜／硝子体液への、完全ヒト翻訳後修飾（ＨｕＰＴＭ）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）の送達のための組成物および方法を含む。がん、特に転移性大腸がんの処置のための腫瘍へのＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの送達のための組成物および方法も提供される。
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心視覚の進行性の不可逆的で重度の喪失を引き起こす変性網膜眼病である。該疾患は、最高視力（ＶＡ）の領域である黄斑を害し、６０才以上のアメリカ人の失明の主因である（Kolb et al., eds. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Salt Lake City (UT): University of Utah Health Sciences Centerの中のHageman et al. Age-Related Macular Degeneration (AMD) 2008; 1995-（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27323/から入手可能））。
新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）としても知られる、ＡＭＤの「進出型」新生血管の形態（ＷＡＭＤ）は、ＡＭＤ症例の１５〜２０％を占め、様々な刺激に応答した神経網膜におけるおよびその下の異常な新血管形成によって特徴付けられる。この異常な血管増殖は、漏出性の血管の形成、およびしばしば大出血、ならびに正常な網膜アーキテクチャの歪みおよび破壊につながる。ＷＡＭＤでは視覚機能が激しく損なわれ、最終的に、炎症および瘢痕化が罹患網膜において視覚機能の恒久的な喪失を引き起こす。究極的には、光受容体の死および瘢痕形成が中心視覚の重度の喪失、ならびに読む、書くおよび顔を認識するまたは運転する能力の喪失をもたらす。多くの患者は、もはや有給の仕事を維持すること、毎日の活動を実行することができず、その結果として生活の質の低下を報告する（Mitchell and Bradley, 2006, Health Qual Life Outcomes 4: 97）。
予防的療法は効果をほとんど示しておらず、治療的な戦略は主に新生血管病変および関連する液貯留を処置することに重点を置いている。ＷＡＭＤのための処置には、レーザー光凝固およびベルテポルフィンによる光力学的療法が含まれてきたが、現在、ＷＡＭＤのための医療標準処置には、血管新生の刺激と結びつけられ、介入のための標的にされているサイトカインである、血管内皮細胞増殖因子（「ＶＥＧＦ」）に結合して中和することを目的とする薬剤による硝子体内（「ＩＶＴ」）注射が含まれる。使用されるＶＥＧＦ阻害剤（「抗ＶＥＧＦ」剤）には、例えば、ラニビズマブ（親和性が改善された、原核生物の大腸菌（E. coli）で作製された小さい抗ＶＥＧＦ Ｆａｂタンパク質）；適応外ベバシズマブ（ＣＨＯ細胞で生成されるＶＥＧＦに対するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ））；またはアフリベルセプト（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させたヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインのＶＥＧＦ結合領域からなる組換え融合タンパク質；「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」として一般的に知られる分子のクラスに属する）が含まれる。これらの療法の各々は、ナイーブなＷＡＭＤ患者において平均して最良に補正された視力を向上させた；しかし、それらの効果は持続期間が制限されるようであり、患者は平均して４〜６週毎に高頻度の投与を通常受ける。
頻繁なＩＶＴ注射は、患者および彼らの介護者にかなりの処置負担をもたらす。長期療法は失明の進行を鈍化させ、短期的に平均して視覚を向上させるが、これらの処置のいずれも新血管形成の再発を阻止しない（Brown, 2006, N Engl J Med 355: 1432-1444；Rosenfeld, 2006 N Engl J Med 355: 1419-1431；Schmidt-Erfurth, 2014, Ophthalmology 121(1): 193-201）。疾患の悪化を阻止するために、各々を再投与しなければならない。反復処置の必要性は、患者にさらなるリスクを招く可能性があり、患者と治療にあたる医師の両者にとって不都合である。
関連するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ、ビズ−アフリベルセプト（目への投与に適切でない製剤にアフリベルセプトのアミノ酸配列を有する）は転移性大腸がんの処置のために使用され、１時間の静脈内注入によって２週毎に投与される。半減期は４〜７日の範囲内であり、反復投与が要求される。大出血、胃腸穿孔および損なわれた創傷治癒などの用量制限副作用が、治療効果を制限し得る。Bender et al., 2012, Clin. Cancer Res. 18:5081を参照されたい。
増加した血管化によって引き起こされる眼疾患、例えば「滲出型」ＡＭＤとしても知られるｎＡＭＤと診断された患者（ヒト対象）の目の網膜／硝子体液への、ヒト翻訳後修飾ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）の送達のための組成物および方法が提供される。これは、遺伝子療法を通して、例えば、完全ヒト翻訳後修飾導入遺伝子生成物を連続的に供給する恒久的なデポーを目の中に形成するために、ｎＡＭＤまたは血管化によって引き起こされる他の眼疾患と診断された患者（ヒト対象）の目に（導入遺伝子として）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成することができる。そのようなＤＮＡベクターは、患者に対して網膜下空間に、または脈絡膜上空間に、または硝子体内に投与することができる。ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、（非ヒトＣＨＯ細胞と比較して）ヒト細胞における発現のために、完全ヒト翻訳後修飾を有することができる。本方法は、ＶＥＧＦ阻害に応答する任意の眼の適応症、特にアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））に応答するもの：例えば、少し例を挙げると、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、例えばＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）およびＲＶＯの後の黄斑浮腫、病的近視、特に近視の脈絡膜新血管形成によって引き起こされるもの、ならびにポリープ様脈絡膜脈管障害を処置するために使用することができる。
他の実施形態では、がん、例えば転移性大腸がんと診断された患者における、がん細胞および周囲組織、特に血管化の増加を示している組織へのＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの送達のための組成物および方法が提供される。これは、遺伝子療法を通して、例えば、完全ヒト翻訳後修飾導入遺伝子生成物を連続的に供給する恒久的なデポーを肝臓の中に形成するために、がん、特に転移性大腸がんと診断された患者（ヒト対象）の肝臓に、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質を導入遺伝子としてコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成することができる。そのようなＤＮＡベクターは、患者に対して静脈内に、または肝臓血流を通して、例えば肝上静脈を通してもしくは肝臓動脈を通して肝臓に直接的に投与することができる。
導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、（アミノからカルボキシ末端にかけて）：（ｉ）Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（ヒト；ＶＥＧＦＲ１とも呼ばれる）、（ｉｉ）ＫＤＲのＩｇ様ドメイン３（ヒト；ＶＥＧＦＲ２とも呼ばれる）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である。具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有する（図１のアミノ酸位置の番号付けを提供する配列番号１および図１が本明細書で使用される；アフリベルセプトのアミノ酸配列およびアフリベルセプトをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列については下の表１も参照）。図１は、アフリベルセプト配列のＮ末端のＦｌｔ−１リーダー配列も提供し、下に開示されるように、導入遺伝子は図１のリーダー配列または他の代替リーダー配列をコードする配列を含むことができる。あるいは、導入遺伝子は、目における安定性および滞留を増加させるが、全身循環に侵入の後の導入遺伝子生成物の全身半減期を低減するように設計されたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの変異体；トランケーションされたかまたは「Ｆｃなし」のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ構築物、改変されたＦｃを有するＶＥＧＦ Ｔｒａｐ導入遺伝子をコードすることができ、ここで、改変はＦｃＲｎ結合部位を使用不能にし、および／または、別のＦｃ領域もしくはＩｇ様ドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換している。
ある特定の態様では、ヒト網膜細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現のための構築物が本明細書で提供される。本構築物は、導入遺伝子および網膜細胞における発現のために適切な発現制御エレメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができる。網膜細胞に導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、網膜細胞へのトロピズムを有するべきである。他の態様では、ヒト肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現のための構築物が提供され、これらの構築物は、導入遺伝子およびヒト肝臓細胞における発現のために適切な発現制御エレメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができる。肝臓に導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、肝臓細胞へのトロピズムを有するべきである。これらのベクターには、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）、特にＡＡＶ８カプシドを有するものが含まれ得、または、ＡＡＶ８カプシドの変異体が好ましい。しかし、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたは「裸のＤＮＡ」構築物と呼ばれる非ウイルス性の発現ベクターを非限定的に含む、他のウイルスベクターを使用することができる。好ましくは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子は、適切な発現制御エレメント、例えば、遍在性ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー）、または組織特異的プロモーター、例えばＲＰＥ特異的プロモーター、例えばＲＰＥ６５プロモーター、または錐体特異的プロモーター、例えばオプシンプロモーター、または肝臓特異的プロモーター、例えばＴＢＧ（チロキシン結合性グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーターもしくはＭＩＲ１２２プロモーターによって制御されるべきである。ある特定の実施形態では、特にがん適応症のために、治療効能のために所望により導入遺伝子発現をオンオフすることができるように、誘導可能なプロモーターが好ましい可能性がある。そのようなプロモーターには、例えば、低酸素誘導プロモーターおよび薬物誘導性プロモーター、例えばラパマイシンおよび関連薬剤によって誘導されるプロモーターが含まれる。低酸素誘導性プロモーターには、ＨＩＦ結合部位を有するプロモーターが含まれる、例えば、低酸素誘導性プロモーターの教示のために、その各々は、参照により組み込まれている、Schodel, et al., Blood, 2011, 117(23):e207-e217およびKenneth and Rocha, Biochem J., 2008, 414: 19-29を参照されたい。さらに、構築物において使用することができる低酸素誘導性プロモーターには、エリスロポイエチンプロモーターおよびＮ−ＷＡＳＰプロモーターが含まれる（エリスロポイエチンプロモーターの開示のためにはTsuchiya, 1993, J. Biochem. 113 :395を、およびＮ−ＷＡＳＰプロモーターの開示のためにはSalvi, 2017, Biochemistry and Biophysics Reports 9: 13-21を参照、その両方は低酸素誘導プロモーターの教示のために参照により組み込まれている）。あるいは、構築物は、薬物誘導性プロモーター、例えば、ラパマイシンおよび関連した類似体の投与によって誘導可能であるプロモーターを含有することができる（例えば、薬物誘導性プロモーターのそれらの開示のために本明細書に参照により組み込まれている、国際公開第９４／１８３１７号パンフレット、国際公開第９６／２０９５１号パンフレット、国際公開第９６／４１８６５号パンフレット、国際公開第９９／１０５０８号パンフレット、国際公開第９９／１０５１０号パンフレット、国際公開第９９／３６５５３号パンフレットおよび国際公開第９９／４１２５８号パンフレット、ならびに米国特許第７，０６７，５２６号明細書（ラパマイシン類似体を開示する）を参照されたい）。
本構築物は、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を強化する他の発現制御エレメントを含むことができる（例えば、ニワトリβ−アクチンイントロン、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸがトランケーションされたイントロン１）、β−グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン、および雑種アデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプターイントロンなどのイントロン、ならびにポリＡシグナル、例えば、ウサギβ−グロビンポリＡシグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、合成ポリＡ（ＳＰＡ）シグナルおよびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル）。例えば、Powell and Rivera- Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸（例えば、ポリヌクレオチド）および核酸配列は、例えば当業者に公知である任意のコドン最適化技術を通してコドン最適化することができる（例えば、Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161によるレビューを参照されたい）。配列番号２として提供されているのは、配列番号１の導入遺伝子生成物に加えて図１に提供されるリーダー配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。配列番号３は、配列番号１の導入遺伝子生成物に加えて図１のリーダー配列をコードするコンセンサスコドン最適化ヌクレオチド配列である（配列番号２および３については下の表１を参照されたい）。
具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象において黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害を含む眼の障害を処置するための遺伝子療法投与のための構築物であって、ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターを含み、発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、構築物が提供される。具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象においてがん、特に転移性大腸がんを処置するための遺伝子療法投与のための構築物であって、ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターを含み、発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、構築物が提供される。ある特定の実施形態では、コードされるＡＡＶ８カプシドは、配列番号１１の配列を有し、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換、特に、アミノ酸残基が、例えば、様々なＡＡＶのカプシド配列のアミノ酸配列の比較を提供し、「ＳＵＢＳ」とラベルされた行のカプシド配列の中の異なる位置での置換に適切なアミノ酸を強調している図６に示すような他のＡＡＶカプシドの対応する位置で見出される置換を有する。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、アフリベルセプトのアミノ酸配列（配列番号１）を有する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、目の中での安定性を維持しつつ、全身循環の中のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの半減期を低減してもよい、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおける改変を有する配列番号１の変異体である。ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含まないＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ（ＦｃなしのまたはＦｃ（−）変異体）、例えば図４に示すものが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、カルボキシペプチダーゼ活性によってＫＤＫ配列の末端リジン（すなわち、図４のアミノ酸２０５）を含有してもよいかまたは含有しなくてもよい。あるいは、図４で示すように、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはタンパク質のＣ末端のＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ領域の全部または一部を有することができ、Ｃ末端配列は、ＫＤＫＴＨＴ（配列番号３１）もしくはＫＤＫＴＨＬ（配列番号３２）、ＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号３３）、ＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号３４）またはＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号３５）であってもよい。ヒンジ領域のシステイン残基は鎖間ジスルフィド結合の形成を促進してもよいが、ヒンジ領域の全てまたはシステイン含有部分を含有しない融合タンパク質は、鎖間の結合を形成しなくてもよい鎖内部の結合のみを形成してもよい。
あるいは、他の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＦｃＲｎ結合を、およびそれによってタンパク質の全身半減期を低減する、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの突然変異を有する（Andersen, 2012, J Biol Chem 287: 22927-22937）。これらの突然変異には、ＩｇＧ１重鎖における位置の通常の番号付けを使用して、Ｉ２５３、Ｈ３１０および／またはＨ４３５の突然変異が含まれ、より具体的にはＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａおよび／またはＨ４３５ＱもしくはＨ４３５Ａが含まれる。これらの位置は、配列番号１の（および、位置がピンク色で強調されている図１の）ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのＩ２３８、Ｈ２９５およびＨ４２０に対応する。したがって、突然変異Ｉ２３８Ａ、Ｈ２９５ＡおよびＨ４２０ＱまたはＨ４２０Ａの１つ、２つまたは３つを有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが提供される。４２０位のヒスチジンのアラニンまたはグルタミン置換を有するアフリベルセプトのアミノ酸配列を有する融合タンパク質の例示的なＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭアミノ酸配列が、図３に提供される。
代替的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、それが全身循環に侵入するとＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの半減期を低減しつつ目におけるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの安定性を向上または維持することができ、有害効果の可能性を低減する、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換するＦｃドメインまたは他のドメイン配列を有する。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＩｇＧ１ドメインを図７ＡおよびＢにそれぞれ示すＩｇＧ２ ＦｃまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む代替のＦｃドメインが置換しており、図で、ヒンジ配列はイタリック体で示されている。変異体は、ヒンジ領域の全部もしくは一部を含むか、またはヒンジ領域を全く含まない。ヒンジ領域を有するこれらの変異体では、鎖間ジスルフィド結合が形成されないように、ヒンジ領域配列はヒンジ領域のシステインの、セリンによる１つまたは２つの置換を有することもできる。例示的な導入遺伝子生成物のアミノ酸配列は、図７Ｃ〜Ｈに提供する。
他の代替的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを、Ｆｌｔ−１もしくはＫＤＲのＩｇ様ドメインの１つもしくは複数、またはその組合せが置換している。ヒトＦｌｔ１およびヒトＫＤＲの細胞外ドメインのアミノ酸配列は図８Ａおよび８Ｂにそれぞれ示し、Ｉｇ様ドメインはカラーテキストで示されている。Ｃ末端ドメインが、Ｆｌｔ１のＩｇ様ドメインの１つ、２つ、３つもしくは４つ、特に少なくともＩｇ様ドメイン２および３；または、ＫＤＲのＩｇ様ドメインの１つ、２つ、３つもしくは４つ、特に少なくともドメイン３、４および／もしくは５からなるかそれを含む導入遺伝子生成物が提供される。具体的な実施形態では、導入遺伝子生成物は、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３、４および５ならびにＦｌｔ１ Ｉｇ様ドメイン２によるＣ末端ドメインを有する。例示的な導入遺伝子生成物のアミノ酸配列は、図８ＣおよびＤに提供する。
ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのための構築物は、形質導入された網膜細胞または肝臓細胞による適切な同時および翻訳後プロセシング（グリコシル化およびタンパク質硫酸化）を確実にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むべきである。一部の実施形態では、シグナル配列は、Ｆｌｔ−１のもの、すなわちＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）である（図１を参照されたい）。代替的な実施形態では、シグナル配列はＫＤＲシグナル配列、すなわちＭＱＳＫＶＬＬＡＶＡＬＷＬＣＶＥＴＲＡ（配列番号３７）、あるいは、好ましい実施形態では、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）（図２）またはＭＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３９）である。ヒト網膜細胞における発現のために使用される他のシグナル配列には、限定されずに、下の表３のそれらを含めることができ、ヒト肝臓細胞における発現のために使用されるシグナル配列には、限定されずに、下の表４のそれらを含めることができる。
具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃおよび８Ｄに示すアミノ酸配列を有する。
具体的な実施形態では、リンカーとして、（ＧＰ）ｎ（配列番号４０）もしくは（ＡＰ）ｎ（配列番号４１）もしくは（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号４２）などの強固なリンカー、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４３）などのフレキシブルリンカーを含む、フレキシブルまたは強固な短いペプチドによって配列の同一のコピーを連結することによって、Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２およびＫＤＲのＩｇ様ドメイン３のアミノ酸配列（すなわち、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインなしの（しかし、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域の全部または一部を含むことができる）アフリベルセプトのアミノ酸配列）を有する融合タンパク質の２つのコピーをコードする構築物が提供され（図４を参照されたい）、ここで、これらのうちのいずれに関しても、ｎ＝１、２、３または４である（Chen, 2013, "Fusion protein linkers: property, design and functionality", Adv. Drug. Deliv. 65(10): 1357-1369、表３）。構築物は、以下のように配置することができる：リーダー−Ｆｌｔ１ Ｉｇ様ドメイン２−ＫＤＲ−Ｉｇ様ドメイン３＋リンカー＋Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２−ＫＤＲ（Ｉｇ様ドメイン３）。あるいは、構築物は、ＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質の第２のコピーの別個の発現を促進するために、２つの間にＩＲＥＳ配列を有するＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の２つのコピーにより二シストロン性である。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される構築物は、以下の構成成分を含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復配列；（２）ａ）ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターを含むＣＢ７プロモーター、ｂ）ニワトリβ−アクチンイントロンおよびｃ）ウサギβ−グロビンポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）上記のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするヌクレオチド配列。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される構築物は、以下の構成成分を含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復配列；（２）ａ）低酸素誘導性プロモーター、ｂ）ニワトリβ−アクチンイントロンおよびｃ）ウサギβ−グロビンポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）上記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするヌクレオチド配列。
ある特定の態様では、新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト網膜細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、以下の網膜細胞型の１つまたは複数によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法が本明細書に記載される：ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞。
ある特定の態様では、がん、特に転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞または周囲組織（例えば、がん細胞を囲んでいる血管化の増加を示している組織）にヒト肝臓細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法が本明細書に記載される。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈ、図８Ｃまたは図８Ｄのアミノ酸配列を含むタンパク質である（提示されるＮ末端のリーダー配列を含むかまたは除く）。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはα２，６−シアリル化グリカンを含有する、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目にグリコシル化ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐはＮｅｕＧｃ（すなわち、下記の標準アッセイによって検出可能なレベル）を含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目にグリコシル化ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐはα−Ｇａｌエピトープの検出可能なレベル（すなわち、下記の標準アッセイによって検出可能なレベル）を含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目にグリコシル化ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐはＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の中の網膜下空間に、または硝子体内もしくは脈絡膜上に、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする発現ベクターを投与することを含み、ここで、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ヒトの不死化された網膜由来の細胞において前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化される、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の中の網膜下空間に、または硝子体内もしくは脈絡膜上に、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする発現ベクターを投与することを含み、ここで、前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、ヒトの不死化された網膜由来の細胞において前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化されるが、ＮｅｕＧｃおよび／またはα−Ｇａｌを含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、グリコシル化されるがＮｅｕＧｃおよび／またはα−Ｇａｌを含有しないＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞および／または前記がん細胞の周囲組織にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはα２，６−シアリル化グリカンを含有する、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞および／または前記がん細胞の周囲組織にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはＮｅｕＧｃを含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞および／または前記がん細胞の周囲組織にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはα−Ｇａｌを含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞および／または前記がん細胞の周囲組織にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の肝臓にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする発現ベクターを投与することを含み、ここで、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ヒトの不死化された肝臓由来の細胞において前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化される、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の肝臓にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする発現ベクターを投与することを含み、ここで、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ヒトの不死化された肝臓由来の細胞において前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化されるが、検出可能なＮｅｕＧｃおよび／またはα−Ｇａｌを含有しない、方法が本明細書に記載される。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈ、図８Ｃまたは図８Ｄのアミノ酸配列を含む（図に提示されるリーダー配列もしくは代替リーダー配列を含むかまたはリーダー配列を含まない）。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、チロシン硫酸化をさらに含む。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、α２，６−シアリル化グリカンを含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、細胞培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株に前記組換えヌクレオチド発現ベクターを形質導入し、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを発現させることによって確認される。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、細胞培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株に前記組換えヌクレオチド発現ベクターを形質導入することによって確認される。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子は、リーダーペプチドをコードする。リーダーペプチドは、本明細書でシグナルペプチドまたはリーダー配列と呼ぶこともできる。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の中の網膜下空間に、または硝子体内もしくは脈絡膜上に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含み、前記組換えベクターは、培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞に形質導入するために使用される場合、前記細胞培養においてα２，６−シアリル化グリカンを含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成をもたらす、方法が本明細書に記載される。
ある特定の態様では、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の中の網膜下空間に、または硝子体内もしくは脈絡膜上に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含み、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはグリコシル化されるがＮｅｕＧｃを含有せず；前記組換えベクターは、培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞を形質導入するために使用される場合、前記細胞培養においてグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃおよび／またはα−Ｇａｌを含有しない前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成をもたらす、方法が本明細書に記載される。
本明細書に記載される方法のある特定の態様では、目に送達することは、目の網膜、脈絡膜および／または硝子体液に送達することを含む。
そのような遺伝子療法を投与する対象は、抗ＶＥＧＦ療法に応答性の者であるべきである。特定の実施形態では、本方法は、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断され、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質または他の抗ＶＥＧＦ剤による処置に応答性であると同定された患者を処置することを包含する。より具体的な実施形態では、患者は、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質による処置に応答性である。ある特定の実施形態では、患者は、遺伝子療法による処置の前に、硝子体内に注射されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐによる処置に応答性であることが示されている。具体的な実施形態では、患者は、アフリベルセプトによって以前に処置されており、アフリベルセプトに応答性であることが見出されている。代替的な実施形態では、患者は、ラニビズマブによって以前に処置されており、ラニビズマブに応答性であることが見出されている。代替的な実施形態では、患者は、ベバシズマブによって以前に処置されており、ベバシズマブに応答性であることが見出されている。
そのようなウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を送達される対象は、ウイルスベクターまたは発現構築物の中の導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭに応答性であるべきである。応答性を判定するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子生成物（例えば、細胞培養、バイオリアクターなどにおいて生成される）を対象に直接的に、例えば硝子体内注射によって投与することができる。
特定の実施形態では、本方法は、転移性大腸がんと診断され、抗ＶＥＧＦ剤、特にＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質による処置に応答性であると同定された患者を処置することを包含する。より具体的な実施形態では、患者は、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質による処置に応答性である。ある特定の実施形態では、患者は、遺伝子療法による処置の前に、静脈内投与されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐによる処置に応答性であることが示されている。具体的な実施形態では、患者は、ジブ−アフリベルセプトによって以前に処置されており、ジブ−アフリベルセプトに応答性であることが見出されている。代替的な実施形態では、患者は、ベバシズマブによって以前に処置されており、ベバシズマブに応答性であることが見出されている。代替的な実施形態では、患者は、ラニビズマブによって以前に処置されており、ラニビズマブに応答性であることが見出されている。代替的な実施形態では、患者は、レゴラフェニブによって以前に処置されており、レゴラフェニブに応答性であることが見出されている。
そのようなウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を送達される対象は、ウイルスベクターまたは発現構築物の中の導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭに応答性であるべきである。応答性を判定するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子生成物（例えば、細胞培養、バイオリアクターなどにおいて生成される）を対象に直接的に、例えば静脈内注入によって投与することができる。
ある特定の態様では、ヒト翻訳後修飾を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンのヒト翻訳後修飾を含有する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、ヒト翻訳後修飾のみを含有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、Ｎｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌの免疫原性非ヒト翻訳後修飾の検出可能なレベルを含有しない。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有する。一実施形態では、チロシン部位は、アフリベルセプトのＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３および／またはＦｃドメインで硫酸化される（硫酸化部位については図１を参照されたい、赤色で強調されている）。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカン、および少なくとも１つの硫酸化チロシン部位を含有する。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、完全ヒト翻訳後修飾を含有する（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）。ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの翻訳後修飾は、培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞を導入遺伝子によって形質導入することによって評価することができ、それは、前記細胞培養においてグリコシル化されるがＮｅｕＧｃを含有しない前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成をもたらすことができる。あるいは、またはさらに、チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成は、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認することができる。
組換えベクターの治療有効用量は、目に、例えば網膜下空間に、または脈絡膜上の空間に、または硝子体内に、≧０．１ｍＬ〜≦０．５ｍＬ、好ましくは０．１〜０．２５ｍＬ（１００〜２５０μｌ）の範囲内の注射容量で投与するべきである。硝子体液において少なくとも約０．３３μｇ／ｍＬ〜約１．３２μｇ／ｍＬ、または眼房水（前眼房）において約０．１１μｇ／ｍＬ〜約０．４４μｇ／ｍＬのＣｍｉｎで検出可能である導入遺伝子生成物の濃度を維持する用量が望ましく；その後、約１．７０〜約６．６０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高約２６．４０μｇ／ｍＬの導入遺伝子生成物の硝子体Ｃｍｉｎ濃度、ならびに／または約０．５６７〜約２．２０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高８．８０μｇ／ｍＬの眼房水Ｃｍｉｎ濃度を維持するべきである。硝子体液濃度は、導入遺伝子生成物の患者の眼房水または血清の濃度を測定することによって推定および／またはモニタリングすることができる。あるいは、遊離ＶＥＧＦ血漿濃度の約１０ｐｇ／ｍＬへの低減を達成するのに十分な用量を使用することができる。（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Avery et al., 2017, Retina, the Journal of Retinal and Vitreous Diseases 0: 1-12；およびAvery et al., 2014, Br J Ophthalmol 98: 1636-1641を参照）。
がん、特に転移性大腸がんの処置のために、２週毎に４ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合に、２週または４週後に、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子生成物の血漿濃度がジブ−アフリベルセプトの少なくともＣｍｉｎ血漿濃度のレベルで維持されるように、治療有効用量を患者に、好ましくは静脈内に投与するべきである。
本発明は、経時的に消散してピークおよびトラフのレベルをもたらすＶＥＧＦ阻害剤の高用量ボーラスの反復眼内注射を含む医療標準処置に対していくつかの利点を有する。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ生成物の反復注射と対比して、導入遺伝子生成物ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの持続的発現はより一貫したレベルの治療薬が作用部位に存在することを可能にし、より少ない注射しか必要でなく、より少ない医師診察で済むので、患者にとってより危険でなく、より便利である。さらに、導入遺伝子から発現されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、翻訳の間および後に存在する異なる微小環境のために、直接的に注射されるものと異なる様式で翻訳後に改変される。いかなる特定の理論によっても束縛されることなく、これは、異なる拡散、生物活性、分布、親和性、薬物動態および免疫原性特徴を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ分子をもたらし、そのため、作用部位に送達される抗体は、直接的に注射されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐと比較して「生物学的により優れたもの」である。
さらに、導入遺伝子からｉｎ ｖｉｖｏで発現されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、タンパク質凝集およびタンパク質酸化などの組換え技術によって生成されるタンパク質に関連した分解産物を含有する可能性が低い。凝集は、高タンパク質濃度、製造装置および容器との表面相互作用ならびにある特定の緩衝系による精製に起因する、タンパク質の生成および貯蔵に関連した問題である。凝集を促進するこれらの条件は、遺伝子療法における導入遺伝子発現に存在しない。メチオニン、トリプトファンおよびヒスチジン酸化などの酸化もタンパク質の生成および貯蔵と関連し、ストレス下にある細胞培養条件、金属および空気との接触ならびに緩衝液および賦形剤の中の不純物によって引き起こされる。導入遺伝子からｉｎ ｖｉｖｏで発現されるタンパク質も、ストレス下の条件で酸化することがある。しかし、ヒトおよび多くの他の生物体は抗酸化防御システムを備えており、それは酸化ストレスを低減するだけでなく、時には酸化を修復および／または元通りにする。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで生成されるタンパク質は、酸化型になる可能性が低い。凝集および酸化の両方は、効力、薬物動態（クリアランス）および免疫原性に影響を及ぼす可能性がある。
本発明は、以下の原理に一部基づく：
（ｉ）ヒト網膜細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化、網膜細胞における頑強なプロセスを含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。（例えば、網膜細胞による糖タンパク質の生成を報告している、Wang et al., 2013, Analytical Biochem. 427: 20-28およびAdamis et al., 1993, BBRC 193 : 631-638；および、網膜細胞によって分泌されるチロシン硫酸化糖タンパク質の生成を報告している、Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567およびKanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131を参照、これらの各々は、ヒト網膜細胞によって行われる翻訳後修飾について、参照によりその全体が組み込まれる）。
（ｉｉ）ヒト肝細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化を含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。（例えば、ヒト肝臓によって分泌される血漿タンパク質のプロテオーム同定についてはhttps://www.proteinatlas.org/humanproteome/liver；それらの分泌タンパク質上のグリカンのスペクトルについては、Clerc et al., 2016, Glycoconj 33 :309-343およびPompach et al. 2014 J Proteome Res. 13 :5561-5569；ならびに、ＴＰＳＴ−２（チロシン−Ｏ硫酸化を触媒する）は他の組織におけるより強く肝臓において発現されるが、ＴＰＳＴ−１は他の組織と同等の平均レベルで発現されることを報告している、E Mishiro, 2006, J Biochem 140:731-737を参照、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、アフリベルセプトは、９６．９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質分子量を有するＣＨＯ細胞において作製される二量体糖タンパク質である。それは概ね１５％のグリコシル化を含有し、１１５ｋＤａの総分子量を与える。一次配列によって予測される各ポリペプチド鎖の上の全ての５つの推定上のＮ−グリコシル化部位は、炭水化物で占有することができ、末端シアル酸残基における不均一性を含む、ある程度の鎖不均一性を示す。Ｆｃドメインは、比較的低いレベルで、例えば、細胞状態によって分子の５〜２０％がシアリル化される部位を含有する。これらのＮ−グリコシル化部位は、配列番号１のアミノ酸配列の３６、６８、１２３、１９６および２８２位に見出される（図１も参照、残基は黄色で強調されている）。ＶＥＧＦＡのみに結合するラニビズマブおよびベバシズマブと対照的に、アフリベルセプトはＶＥＧＦの全てのアイソフォームならびに胎盤増殖因子（「ＰＬＧＦ」）に結合する。
（ｉｖ）アフリベルセプトなどのＣＨＯ細胞生成物と異なり、ヒト網膜またはヒト肝臓細胞によるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのグリコシル化は、安定性、半減期を向上させることができ、導入遺伝子生成物の望ましくない凝集を低減するグリカンの付加をもたらす。（例えば、抗体およびＦａｂにおけるグリコシル化の明らかとなってきた重要性のレビューについては、Bovenkamp et al., 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441を参照）。注目すべきことに、本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭに加えられるグリカンは、２，６−シアル酸を含有する高度にプロセシングされた複合型のＮ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うために要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有しないＣＨＯ細胞において作製されるアフリベルセプトに存在せず、ＣＨＯ細胞は二分岐のＧｌｃＮＡｃも生成しないが、それらは免疫原性であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）は生成する。例えば、Dumont et al., 2015, Critical Rev in Biotech, 36(6): 1110-1122を参照されたい。さらに、ＣＨＯ細胞は、高濃度でアナフィラキシーを誘発することができる、ほとんどの個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応する免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原を生成することもできる。例えば、Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子生成物の免疫原性を低減し、安全性および効能を向上させるはずである。
（ｖ）グリコシル化部位に加えて、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有することができる；アフリベルセプトのＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３およびＦｃドメインのチロシン−Ｏ硫酸化部位を赤で強調している、図１を参照されたい。（タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を囲んでいるアミノ酸の分析について、例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照）。「規則」は、以下の通りに要約することができる：Ｙの＋５〜−５の位置にＥまたはＤを有するＹ残基、Ｙの−１の位置は中性または酸性の荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効にする塩基性アミノ酸、例えばＲ、ＫまたはＨでない）。硫酸化部位は、配列番号１のＶＥＧＦ ｔｒａｐ配列の１１、１４０、２６３および２８１位に見出すことができる。
（ｖｉ）ヒト網膜細胞における頑強な翻訳後プロセスであるチロシン硫酸化は、ＶＥＧＦへの増加した結合力を有する導入遺伝子生成物をもたらすことができる。例えば、治療抗体のＦａｂのチロシン硫酸化は、抗原結合力および活性を劇的に増加させることが示されている。（例えば、Loos et al., 2015, PNAS 112: 12675- 12680およびChoe et al., 2003, Cell 114: 161-170を参照）。そのような翻訳後修飾は、ＣＨＯ細胞生成物であるアフリベルセプトにおいて、良くても存在量が少ない。ヒト網膜細胞と異なり、ＣＨＯ細胞は分泌細胞でなく、翻訳後チロシン硫酸化の能力が限られている。（例えば、Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537、特にp. 1537の考察を参照されたい）。
（ｖｉｉ）Ｏ−グリコシル化は、酵素によるセリンまたはトレオニン残基へのＮ−アセチルガラクトサミンの付加を含む。抗体のヒンジ領域に存在するアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化することができることが実証されている。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐはＩｇＧ Ｆｃヒンジ領域の全部または一部を含み、したがって、ヒト網膜細胞または肝臓細胞で発現される場合にＯグリコシル化することが可能である。Ｏ−グリコシル化の可能性は、大腸菌（E. coli）はヒトＯ−グリコシル化において使用されるものと同等の機構をやはり天然に含有しないので（代わりに、細菌が特異的Ｏ−グリコシル化機構を含有するように改変される場合のみ、大腸菌（E. coli）におけるＯ−グリコシル化が実証された。例えば、Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098を参照されたい）、大腸菌（E. coli）において生成されるタンパク質と比較して、本明細書で提供されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質に別の利点を付与する。
（ｖｉｉｉ）ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを網膜／硝子体液に送達するために、前述の翻訳後修飾に加えて、向上したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ構築物を工学的に操作し、使用することができる。例えば、アフリベルセプトはインタクトなＦｃ領域を有するので、それはタンパク分解性異化作用からサルベージされ、内皮細胞におけるＦｃＲｎへの結合を通して再循環される可能性があり；したがって、目から全身循環への侵入の後にその全身半減期を延長する（例えば、アフリベルセプトは静脈内投与の後、概ね４〜７日の血清半減期を有する）。３回の毎月の硝子体内注射を受けたヒト対象における比較研究は、アフリベルセプトおよびベバシズマブ（完全長抗体）が３回目の投与の後に全身貯留を示したが、ラニビズマブ（Ｆａｂ）は示さなかったことを実証した。（レビューについては、Avery et al., 2017, Retina, the Journal of Retinal and Vitreous Diseases 0: 1-12；およびAvery et al., 2014, Br J Ophthalmol 98: 1636-1641を参照されたい）。抗ＶＥＧＦ剤の延長された滞留は出血および血栓塞栓性合併症と関連し、アフリベルセプトはＶＥＧＦの全てのアイソフォームならびにＰＬＧＦに結合するので、ＦｃＲＮ結合部位を無効にするようにＦｃを改変することによって、または、全身循環に侵入後の導入遺伝子生成物の半減期を低減するが、目における安定性および滞留をなお維持するためにＦｃを排除することによって、向上したより安全なアフリベルセプトを工学的に操作することができる。Ｆｃ機能を排除するが目における安定性をなお維持し、滞留を向上させるように設計された例示的な構築物が本明細書に記載され、図３および４に例示される。
（ｉ）ヒト網膜細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化、網膜細胞における頑強なプロセスを含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。（例えば、網膜細胞による糖タンパク質の生成を報告している、Wang et al., 2013, Analytical Biochem. 427: 20-28およびAdamis et al., 1993, BBRC 193 : 631-638；および、網膜細胞によって分泌されるチロシン硫酸化糖タンパク質の生成を報告している、Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567およびKanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131を参照、これらの各々は、ヒト網膜細胞によって行われる翻訳後修飾について、参照によりその全体が組み込まれる）。
（ｉｉ）ヒト肝細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化を含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。（例えば、ヒト肝臓によって分泌される血漿タンパク質のプロテオーム同定についてはhttps://www.proteinatlas.org/humanproteome/liver；それらの分泌タンパク質上のグリカンのスペクトルについては、Clerc et al., 2016, Glycoconj 33 :309-343およびPompach et al. 2014 J Proteome Res. 13 :5561-5569；ならびに、ＴＰＳＴ−２（チロシン−Ｏ硫酸化を触媒する）は他の組織におけるより強く肝臓において発現されるが、ＴＰＳＴ−１は他の組織と同等の平均レベルで発現されることを報告している、E Mishiro, 2006, J Biochem 140:731-737を参照、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、アフリベルセプトは、９６．９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質分子量を有するＣＨＯ細胞において作製される二量体糖タンパク質である。それは概ね１５％のグリコシル化を含有し、１１５ｋＤａの総分子量を与える。一次配列によって予測される各ポリペプチド鎖の上の全ての５つの推定上のＮ−グリコシル化部位は、炭水化物で占有することができ、末端シアル酸残基における不均一性を含む、ある程度の鎖不均一性を示す。Ｆｃドメインは、比較的低いレベルで、例えば、細胞状態によって分子の５〜２０％がシアリル化される部位を含有する。これらのＮ−グリコシル化部位は、配列番号１のアミノ酸配列の３６、６８、１２３、１９６および２８２位に見出される（図１も参照、残基は黄色で強調されている）。ＶＥＧＦＡのみに結合するラニビズマブおよびベバシズマブと対照的に、アフリベルセプトはＶＥＧＦの全てのアイソフォームならびに胎盤増殖因子（「ＰＬＧＦ」）に結合する。
（ｉｖ）アフリベルセプトなどのＣＨＯ細胞生成物と異なり、ヒト網膜またはヒト肝臓細胞によるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのグリコシル化は、安定性、半減期を向上させることができ、導入遺伝子生成物の望ましくない凝集を低減するグリカンの付加をもたらす。（例えば、抗体およびＦａｂにおけるグリコシル化の明らかとなってきた重要性のレビューについては、Bovenkamp et al., 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441を参照）。注目すべきことに、本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭに加えられるグリカンは、２，６−シアル酸を含有する高度にプロセシングされた複合型のＮ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うために要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有しないＣＨＯ細胞において作製されるアフリベルセプトに存在せず、ＣＨＯ細胞は二分岐のＧｌｃＮＡｃも生成しないが、それらは免疫原性であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）は生成する。例えば、Dumont et al., 2015, Critical Rev in Biotech, 36(6): 1110-1122を参照されたい。さらに、ＣＨＯ細胞は、高濃度でアナフィラキシーを誘発することができる、ほとんどの個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応する免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原を生成することもできる。例えば、Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子生成物の免疫原性を低減し、安全性および効能を向上させるはずである。
（ｖ）グリコシル化部位に加えて、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有することができる；アフリベルセプトのＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３およびＦｃドメインのチロシン−Ｏ硫酸化部位を赤で強調している、図１を参照されたい。（タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を囲んでいるアミノ酸の分析について、例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照）。「規則」は、以下の通りに要約することができる：Ｙの＋５〜−５の位置にＥまたはＤを有するＹ残基、Ｙの−１の位置は中性または酸性の荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効にする塩基性アミノ酸、例えばＲ、ＫまたはＨでない）。硫酸化部位は、配列番号１のＶＥＧＦ ｔｒａｐ配列の１１、１４０、２６３および２８１位に見出すことができる。
（ｖｉ）ヒト網膜細胞における頑強な翻訳後プロセスであるチロシン硫酸化は、ＶＥＧＦへの増加した結合力を有する導入遺伝子生成物をもたらすことができる。例えば、治療抗体のＦａｂのチロシン硫酸化は、抗原結合力および活性を劇的に増加させることが示されている。（例えば、Loos et al., 2015, PNAS 112: 12675- 12680およびChoe et al., 2003, Cell 114: 161-170を参照）。そのような翻訳後修飾は、ＣＨＯ細胞生成物であるアフリベルセプトにおいて、良くても存在量が少ない。ヒト網膜細胞と異なり、ＣＨＯ細胞は分泌細胞でなく、翻訳後チロシン硫酸化の能力が限られている。（例えば、Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537、特にp. 1537の考察を参照されたい）。
（ｖｉｉ）Ｏ−グリコシル化は、酵素によるセリンまたはトレオニン残基へのＮ−アセチルガラクトサミンの付加を含む。抗体のヒンジ領域に存在するアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化することができることが実証されている。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐはＩｇＧ Ｆｃヒンジ領域の全部または一部を含み、したがって、ヒト網膜細胞または肝臓細胞で発現される場合にＯグリコシル化することが可能である。Ｏ−グリコシル化の可能性は、大腸菌（E. coli）はヒトＯ−グリコシル化において使用されるものと同等の機構をやはり天然に含有しないので（代わりに、細菌が特異的Ｏ−グリコシル化機構を含有するように改変される場合のみ、大腸菌（E. coli）におけるＯ−グリコシル化が実証された。例えば、Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098を参照されたい）、大腸菌（E. coli）において生成されるタンパク質と比較して、本明細書で提供されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質に別の利点を付与する。
（ｖｉｉｉ）ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを網膜／硝子体液に送達するために、前述の翻訳後修飾に加えて、向上したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ構築物を工学的に操作し、使用することができる。例えば、アフリベルセプトはインタクトなＦｃ領域を有するので、それはタンパク分解性異化作用からサルベージされ、内皮細胞におけるＦｃＲｎへの結合を通して再循環される可能性があり；したがって、目から全身循環への侵入の後にその全身半減期を延長する（例えば、アフリベルセプトは静脈内投与の後、概ね４〜７日の血清半減期を有する）。３回の毎月の硝子体内注射を受けたヒト対象における比較研究は、アフリベルセプトおよびベバシズマブ（完全長抗体）が３回目の投与の後に全身貯留を示したが、ラニビズマブ（Ｆａｂ）は示さなかったことを実証した。（レビューについては、Avery et al., 2017, Retina, the Journal of Retinal and Vitreous Diseases 0: 1-12；およびAvery et al., 2014, Br J Ophthalmol 98: 1636-1641を参照されたい）。抗ＶＥＧＦ剤の延長された滞留は出血および血栓塞栓性合併症と関連し、アフリベルセプトはＶＥＧＦの全てのアイソフォームならびにＰＬＧＦに結合するので、ＦｃＲＮ結合部位を無効にするようにＦｃを改変することによって、または、全身循環に侵入後の導入遺伝子生成物の半減期を低減するが、目における安定性および滞留をなお維持するためにＦｃを排除することによって、向上したより安全なアフリベルセプトを工学的に操作することができる。Ｆｃ機能を排除するが目における安定性をなお維持し、滞留を向上させるように設計された例示的な構築物が本明細書に記載され、図３および４に例示される。
前述の理由で、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、遺伝子療法を通して、例えば、形質導入された網膜細胞によって生成される完全ヒト翻訳後修飾、例えばヒトのグリコシル化、硫酸化導入遺伝子生成物（検出可能なＮｅｕＧＣもα−Ｇａｌもない）を連続的に供給する恒久的なデポーを目の中に形成するために、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者（ヒト対象）の目における網膜下空間、脈絡膜上空間または硝子体内にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成される、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害の処置のための「生物学的により優れた」分子をもたらすはずである。形質導入することができる網膜細胞には、限定されずに、網膜ニューロン；ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞が含まれる。
さらに、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、遺伝子療法を通して、例えば、形質導入された肝臓細胞によって生成される完全ヒト翻訳後修飾、例えばヒトのグリコシル化、硫酸化導入遺伝子生成物（検出可能なＮｅｕＧＣもα−Ｇａｌもない）を連続的に供給する恒久的なデポーを肝臓の中に形成するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を、がん、特に転移性大腸がんと診断された患者（ヒト対象）の肝臓に、例えば静脈内投与によって、または肝臓の血流を通して、例えば肝上静脈または肝臓動脈によって投与することによって達成される、がん、特に転移性大腸がんの処置のための「生物学的により優れた」分子をもたらすべきである。
遺伝子療法への代替物として、またはさらなる処置として、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ糖タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株において生成することができ、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者に対して硝子体内投与によって、またはがん、特に転移性大腸がんと診断された患者に対して注入または他の非経口投与によって糖タンパク質を投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生成のために使用することができるヒト細胞株には、少し例を挙げれば、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ−７および網膜細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥが限定されずに含まれる（例えば、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ糖タンパク質の組換え生成のために使用することができるヒト細胞株のレビューについては、参照によりその全体が組み込まれる、Dumont et al., 2015, Critical Rev in Biotech, 36(6): 1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives"を参照）。完全なグリコシル化、特にシアリル化、およびチロシン硫酸化を確実にするために、生成のために使用する細胞株は、網膜細胞におけるチロシン−Ｏ硫酸化の役割を担うα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（または、α−２，３−およびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの両方）ならびに／またはＴＰＳＴ−１およびＴＰＳＴ−２酵素を同時発現するように宿主細胞を工学的に操作することによって強化することができる。
小分子薬と異なり、生物製剤は、異なる効力、薬物動態および安全性プロファイルを有する異なる改変または形態を有する多くの変異体の混合物を通常含む。遺伝子療法またはタンパク質療法アプローチで生成されるあらゆる分子が完全にグリコシル化および硫酸化されることは必須でない。むしろ、生成される糖タンパク質の集団は、効能を示すのに十分な、２，６−シアリル化および硫酸化を含むグリコシル化を有するべきである。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの集団の０．５％〜１％は、２，６−シアリル化および／または硫酸化を有する。他の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの集団の２％、２％〜５％、または２％〜１０％は、２，６−シアリル化および／または硫酸化を有する。ある特定の実施形態では、２，６−シアリル化および／または硫酸化のレベルは有意により高く、そのため、分子の最大５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％でさえも２，６−シアリル化および／または硫酸化を含有する。本明細書で提供される遺伝子療法処置の目標は、網膜の新血管形成を処置すること、および最小限の介入／侵襲的手順によって視力を維持もしくは向上させること、または転移性大腸がんを処置する、改善する、もしくはその進行を鈍化させることである。
網膜の新血管形成と関連した疾患の処置の効能は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）；目的の物体から反射される後方散乱光のエコー時間遅延および大きさを判定するために低コヒーレンス干渉計法を使用する三次元画像化技術であるＳＤ＿ＯＣＴ（ＳＤ−光学式干渉断層撮影）での網膜の厚さ（Schuman, 2008, Trans. Am. Opthalmol. Soc. 106:426-458）；フルオレセイン血管造影（ＦＡ）での新血管形成の領域；および、さらなる抗ＶＥＧＦ療法の必要性を測定することによってモニタリングすることができる。網膜の機能は、例えば、ＥＲＧによって判定することができる。ＥＲＧは、ヒトで使用するためにＦＤＡの承認を得た、網膜機能の非侵襲的電気生理学的試験であり、それは、目の光感受性細胞（桿体および錐体）およびそれらを接続する神経節細胞、特に閃光刺激へのそれらの応答を検査する。有害事象には、失明、眼の感染、炎症および網膜剥離を含む他の安全性事象を含めることができる。
がん、特に転移性大腸がんの処置の効能は、抗がん／抗転移剤の効能、例えば腫瘍サイズの低減、転移の数および／またはサイズの低減、全体生存率、無進行生存、奏効率、安定疾患の発生率等の増加を評価するための当技術分野で公知の任意の手段によってモニタリングすることができる。
他の利用可能な処置の送達を伴う目／網膜へのＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの送達の組合せが、本明細書に記載される。遺伝子療法処置の前、同時、または後に、さらなる処置を投与することができる。本発明の遺伝子療法と組み合わせることができる、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害のための利用可能な処置には、レーザー光凝固、ベルテポルフィンによる光力学療法、およびアフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはペガプタニブを限定されずに含む抗ＶＥＧＦ剤による硝子体内（ＩＶＴ）注射、ならびに炎症を低減する硝子体内ステロイドによる処置が限定されずに含まれる。本発明の遺伝子療法と組み合わせることができる転移性大腸がんのための利用可能な処置には、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）もしくはフォリン酸（ロイコボリン、ＦＡもしくはフォリン酸カルシウムとも呼ばれる）、フルオロウラシル（５ＦＵ）、および／またはオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）、ならびにジブ−アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブもしくはレゴラフェニブを限定されずに含む抗ＶＥＧＦ剤による静脈内投与が、限定されずに含まれる。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子およびＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質生成物を含有するＡＡＶ８ウイルスベクターを製造する方法も、提供される。具体的な実施形態では、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含む核酸ベクターで安定して形質転換された宿主細胞を培養すること、および宿主細胞によって生成されるＡＡＶ８ウイルスベクターを回収することによって、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含有するＡＡＶ８ウイルスベクターを作製するための方法であって、発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含み、ＡＡＶ８複製およびカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含む、方法が提供される。
本発明は、ヒト対象における網膜下注射または静脈内投与のためにＡＡＶ８カプシドにパッケージされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ構築物を記載する、下の実施例において例示される。
３．１．例示的な実施形態
１．ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含む発現構築物であって、発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、発現構築物。
２．導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、項１の発現構築物。
３．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項１または２の発現構築物。
４．導入遺伝子がＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項１〜３のいずれかの発現構築物。
５．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項１〜４のいずれかの発現構築物。
６．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項１〜５のいずれかの発現構築物。
７．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項１〜４のいずれかの発現構築物。
８．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項７の発現構築物。
９．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項１〜８のいずれかの発現構築物。
１０．図５Ａ〜５Ｅの１つの発現構築物である、項１〜６または９のいずれかの発現構築物。
１１．ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、アデノ随伴ウイルスベクター。
１２．導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、項１１のＡＡＶベクター。
１３．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項１１または１２のＡＡＶベクター。
１４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項１１〜１３のいずれかのＡＡＶベクター。
１５．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項１１〜１４のいずれかのＡＡＶベクター。
１６．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項１１〜１５のいずれかのＡＡＶベクター。
１７．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項１１〜１４のいずれかのＡＡＶベクター。
１８．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項１７のＡＡＶベクター。
１９．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項１１〜１８のいずれかのＡＡＶベクター。
２０．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むＡＡＶベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象の目に対する網膜下、硝子体内または脈絡膜上投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２１．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象への静脈内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２２．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ．７ｍ８カプシドのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象への静脈内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２３．ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐが図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有する、項２０〜２２の医薬組成物。
２４．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項２０〜２３のいずれかの医薬組成物。
２５．導入遺伝子がＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項２０〜２４のいずれかの医薬組成物。
２６．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項２０〜２５のいずれかの医薬組成物。
２７．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項２０〜２６のいずれかの医薬組成物。
２８．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項２０〜２５のいずれかの医薬組成物。
２９．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項２８の医薬組成物。
３０．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項２０〜２９のいずれかの医薬組成物。
３１．新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト網膜細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３２．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト網膜ニューロン、ヒト光受容体細胞、ヒト錐体細胞、ヒト桿体細胞、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ヒト網膜神経節細胞、ヒト小人細胞、ヒト日傘細胞、ヒト二層細胞、ヒト巨大網膜神経節細胞、ヒト光感受性神経節細胞、ヒトミュラーグリア、またはヒト網膜色素上皮細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３３．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、ヒト肝臓細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが配列番号１のアミノ酸配列を有する、項３１〜３３のいずれかの方法。
３５．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、無効化されたＦｃＲｎ結合部位を有する配列番号１のアミノ酸配列の変異体である、項３１〜３４のいずれかの方法。
３６．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが配列番号１の４２０位のヒスチジンの、アラニンまたはグルタミンによるアミノ酸置換を有する、項３５の方法。
３７．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはＩｇＧ１ Ｆｃドメインが配列番号１から欠失している、項３５の方法。
３８．配列番号１のＩｇＧ１ ＦｃドメインがＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、およびＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、ヒトＦｌｔ−１の１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメイン、またはヒトＫＤＲの１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメイン、またはヒトＦｌｔ−１の１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメインとヒトＫＤＲのＩｇＧ様ドメインとの組合せによって置換される、項３５の方法。
３９．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項３５の方法。
４０．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項３１〜３９のいずれかの方法。
４１．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４２．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４３．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４４．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４５．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４１〜４４のいずれかの方法。
４６．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭがα２，６−シアリル化グリカンおよびチロシン硫酸化を含有し、検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４１〜４５のいずれかの方法。
４７．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項４１〜４６のいずれかの方法。
４８．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
４９．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５０．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５１．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５２．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４８または５１のいずれかの方法。
５３．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭがα２，６−シアリル化グリカンおよびチロシン硫酸化を含有し、いかなる検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４８〜５２のいずれかの方法。
５４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項４８〜５３のいずれかの方法。
５５．組換えヌクレオチド発現ベクターがＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項４８〜５４のいずれかの方法。
５６．組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ８ウイルスベクターである、項４８〜５５のいずれかの方法。
５７．組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ．７ｍ８ウイルスベクターである、項４８〜５５のいずれかの方法。
５８．α２，６−シアリル化グリカンを含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成が、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認される、項４１、４３、４５〜４８、５０または５２〜５７のいずれかの方法。
５９．チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成が、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認される、項４２、４４〜４７、４９または５１〜５７のいずれかの方法。
６０．組換えＡＡＶを生成する方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、シス発現カセットは、網膜細胞または肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、人工ゲノム；
（ｉｉ）培養において宿主細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現を駆動する発現制御エレメントに作動可能に連結されているＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質をコードし、トランスにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を供給する、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いているトランス発現カセット；
（ｉｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質による人工ゲノムの複製およびパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
を含有する宿主細胞を培養することと、
（ｂ）人工ゲノムをカプシドに包んでいる組換えＡＡＶを細胞培養から回収することと
を含む方法。
６１．ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含むＡＡＶ８ウイルスベクターを製造する方法であって、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む核酸ベクターで安定して形質転換された宿主細胞を、ＡＡＶ８ウイルスベクターの生成に適切な条件下で培養することであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含み、ＡＡＶ８複製およびカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含む、こと；および宿主細胞によって生成されるＡＡＶ８ウイルスベクターを回収することを含む方法。
６２．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを製造する方法であって、ヒト網膜細胞においてＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された不死化ヒト網膜細胞を培養すること、およびヒト網膜細胞によって発現されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを単離することを含む方法。
１．ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含む発現構築物であって、発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、発現構築物。
２．導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、項１の発現構築物。
３．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項１または２の発現構築物。
４．導入遺伝子がＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項１〜３のいずれかの発現構築物。
５．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項１〜４のいずれかの発現構築物。
６．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項１〜５のいずれかの発現構築物。
７．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項１〜４のいずれかの発現構築物。
８．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項７の発現構築物。
９．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項１〜８のいずれかの発現構築物。
１０．図５Ａ〜５Ｅの１つの発現構築物である、項１〜６または９のいずれかの発現構築物。
１１．ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、アデノ随伴ウイルスベクター。
１２．導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、項１１のＡＡＶベクター。
１３．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項１１または１２のＡＡＶベクター。
１４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項１１〜１３のいずれかのＡＡＶベクター。
１５．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項１１〜１４のいずれかのＡＡＶベクター。
１６．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項１１〜１５のいずれかのＡＡＶベクター。
１７．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項１１〜１４のいずれかのＡＡＶベクター。
１８．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項１７のＡＡＶベクター。
１９．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項１１〜１８のいずれかのＡＡＶベクター。
２０．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むＡＡＶベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象の目に対する網膜下、硝子体内または脈絡膜上投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２１．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象への静脈内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２２．それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ．７ｍ８カプシドのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
ここで、前記ＡＡＶベクターは、前記対象への静脈内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
２３．ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐが図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有する、項２０〜２２の医薬組成物。
２４．導入遺伝子が表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項２０〜２３のいずれかの医薬組成物。
２５．導入遺伝子がＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項２０〜２４のいずれかの医薬組成物。
２６．調節配列の少なくとも１つが構成プロモーターである、項２０〜２５のいずれかの医薬組成物。
２７．１つまたは複数の調節配列がＣＢ７プロモーター、ニワトリβ−アクチンイントロンおよびウサギβ−グロビンポリＡシグナルである、項２０〜２６のいずれかの医薬組成物。
２８．調節配列の少なくとも１つが誘導可能なプロモーターである、項２０〜２５のいずれかの医薬組成物。
２９．誘導可能なプロモーターが低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーターである、項２８の医薬組成物。
３０．ＡＡＶ ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、項２０〜２９のいずれかの医薬組成物。
３１．新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト網膜細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３２．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト網膜ニューロン、ヒト光受容体細胞、ヒト錐体細胞、ヒト桿体細胞、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ヒト網膜神経節細胞、ヒト小人細胞、ヒト日傘細胞、ヒト二層細胞、ヒト巨大網膜神経節細胞、ヒト光感受性神経節細胞、ヒトミュラーグリア、またはヒト網膜色素上皮細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３３．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、ヒト肝臓細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
３４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが配列番号１のアミノ酸配列を有する、項３１〜３３のいずれかの方法。
３５．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、無効化されたＦｃＲｎ結合部位を有する配列番号１のアミノ酸配列の変異体である、項３１〜３４のいずれかの方法。
３６．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが配列番号１の４２０位のヒスチジンの、アラニンまたはグルタミンによるアミノ酸置換を有する、項３５の方法。
３７．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはＩｇＧ１ Ｆｃドメインが配列番号１から欠失している、項３５の方法。
３８．配列番号１のＩｇＧ１ ＦｃドメインがＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、およびＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、ヒトＦｌｔ−１の１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメイン、またはヒトＫＤＲの１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメイン、またはヒトＦｌｔ−１の１つもしくは複数のＩｇＧ様ドメインとヒトＫＤＲのＩｇＧ様ドメインとの組合せによって置換される、項３５の方法。
３９．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項３５の方法。
４０．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが表３または４のそのＮ末端にリーダー配列を含む、項３１〜３９のいずれかの方法。
４１．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４２．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４３．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４４．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の大腸がん細胞および／または前記大腸がん細胞の周囲組織に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
４５．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４１〜４４のいずれかの方法。
４６．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭがα２，６−シアリル化グリカンおよびチロシン硫酸化を含有し、検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４１〜４５のいずれかの方法。
４７．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項４１〜４６のいずれかの方法。
４８．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
４９．ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５０．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５１．転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
５２．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４８または５１のいずれかの方法。
５３．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭがα２，６−シアリル化グリカンおよびチロシン硫酸化を含有し、いかなる検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、項４８〜５２のいずれかの方法。
５４．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、項４８〜５３のいずれかの方法。
５５．組換えヌクレオチド発現ベクターがＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む、項４８〜５４のいずれかの方法。
５６．組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ８ウイルスベクターである、項４８〜５５のいずれかの方法。
５７．組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ．７ｍ８ウイルスベクターである、項４８〜５５のいずれかの方法。
５８．α２，６−シアリル化グリカンを含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成が、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認される、項４１、４３、４５〜４８、５０または５２〜５７のいずれかの方法。
５９．チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成が、ＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認される、項４２、４４〜４７、４９または５１〜５７のいずれかの方法。
６０．組換えＡＡＶを生成する方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、シス発現カセットは、網膜細胞または肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、人工ゲノム；
（ｉｉ）培養において宿主細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現を駆動する発現制御エレメントに作動可能に連結されているＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質をコードし、トランスにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を供給する、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いているトランス発現カセット；
（ｉｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質による人工ゲノムの複製およびパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
を含有する宿主細胞を培養することと、
（ｂ）人工ゲノムをカプシドに包んでいる組換えＡＡＶを細胞培養から回収することと
を含む方法。
６１．ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含むＡＡＶ８ウイルスベクターを製造する方法であって、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む核酸ベクターで安定して形質転換された宿主細胞を、ＡＡＶ８ウイルスベクターの生成に適切な条件下で培養することであって、発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含み、ＡＡＶ８複製およびカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含む、こと；および宿主細胞によって生成されるＡＡＶ８ウイルスベクターを回収することを含む方法。
６２．ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを製造する方法であって、ヒト網膜細胞においてＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された不死化ヒト網膜細胞を培養すること、およびヒト網膜細胞によって発現されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを単離することを含む方法。
特許または出願ファイルは、色刷りの少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を有するこの特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いによって特許庁から提供される。
増加した血管化によって引き起こされる眼疾患、例えば「滲出型」ＡＭＤとしても知られるｎＡＭＤと診断された患者（ヒト対象）の目の網膜／硝子体液への、ヒト翻訳後修飾ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）の送達のための組成物および方法が提供される。これは、遺伝子療法を通して、例えば、完全ヒト翻訳後修飾導入遺伝子生成物を連続的に供給する恒久的なデポーを目の中に形成するために、ｎＡＭＤまたは血管化によって引き起こされる他の眼疾患と診断された患者（ヒト対象）の目にＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質をコードする（導入遺伝子として）ウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成することができる。そのようなＤＮＡベクターは、患者に対して網膜下空間に、または脈絡膜上空間に、または硝子体内に投与することができる。ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、（非ヒトＣＨＯ細胞と比較して）ヒト細胞における発現のために、完全ヒト翻訳後修飾を有することができる。本方法は、ＶＥＧＦ阻害に応答する任意の眼の適応症、特にアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））に応答するもの：例えば、少し例を挙げると、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、例えばＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）およびＲＶＯの後の黄斑浮腫、病的近視、特に近視の脈絡膜新血管形成によって引き起こされるもの、ならびにポリープ様脈絡膜脈管障害を処置するために使用することができる。
他の実施形態では、がん、例えば転移性大腸がんと診断された患者における、がん細胞および周囲組織、特に血管化の増加を示している組織へのＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの送達のための組成物および方法が提供される。これは、遺伝子療法を通して、例えば、完全ヒト翻訳後修飾導入遺伝子生成物を連続的に供給する恒久的なデポーを肝臓の中に形成するために、がん、特に転移性大腸がんと診断された患者（ヒト対象）の肝臓に、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質を導入遺伝子としてコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成することができる。そのようなＤＮＡベクターは、患者に対して静脈内に、または肝臓血流を通して、例えば肝上静脈を通してもしくは肝臓動脈を通して肝臓に直接的に投与することができる。
導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、（アミノからカルボキシ末端にかけて）：（ｉ）Ｆｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（ヒト；ＶＥＧＦＲ１とも呼ばれる）、（ｉｉ）ＫＤＲのＩｇ様ドメイン３（ヒト；ＶＥＧＦＲ２とも呼ばれる）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である。具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有する（図１のアミノ酸位置の番号付けを提供する配列番号１および図１が本明細書で使用される；アフリベルセプトのアミノ酸配列およびアフリベルセプトをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列については下の表１も参照）。図１は、アフリベルセプト配列のＮ末端のＦｌｔ−１リーダー配列も提供し、下に開示されるように、導入遺伝子は図１のリーダー配列または他の代替リーダー配列をコードする配列を含むことができる。あるいは、導入遺伝子は、目における安定性および滞留を増加させるが、全身循環に侵入の後の導入遺伝子生成物の全身半減期をなお低減するように設計されたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの変異体；トランケーションされたかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ構築物、改変されたＦｃを有するＶＥＧＦ Ｔｒａｐ導入遺伝子をコードすることができ、ここで、改変はＦｃＲｎ結合部位を使用不能にし、および／または、別のＦｃ領域もしくはＩｇ様ドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換している。
ある特定の態様では、ヒト網膜または肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現のための構築物が本明細書で提供される。本構築物は、導入遺伝子および網膜または肝臓細胞における発現のために適切な発現制御エレメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができる。導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、網膜または肝臓細胞へのトロピズムを有するべきである。これらには、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）、特にＡＡＶ８カプシドを有するものを含めることができ、または、ＡＡＶ８カプシドの変異体が好ましい。しかし、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたは「裸のＤＮＡ」構築物と呼ばれる非ウイルス性の発現ベクターを非限定的に含む、他のウイルスベクターを使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸（例えば、ポリヌクレオチド）および核酸配列は、例えば当業者に公知である任意のコドン最適化技術を通してコドン最適化することができる（例えば、Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161によるレビューを参照）。配列番号２として提供されているのは、配列番号１の導入遺伝子生成物に加えて図１に提供されるリーダー配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列である。配列番号３は、配列番号１の導入遺伝子生成物に加えて図１のリーダー配列をコードするコンセンサスコドン最適化ヌクレオチド配列である（配列番号２および３については下の表１を参照されたい）。
具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象において、黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害を含む眼の障害を処置するための遺伝子療法投与のための構築物であって、ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、発現カセットが、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノムを含む、ＡＡＶベクターを含む構築物が提供される。
ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのための構築物は、形質導入された網膜細胞または肝臓細胞による適切な同時および翻訳後プロセシング（グリコシル化およびタンパク質硫酸化）を確実にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むべきである。好ましい実施形態では、シグナル配列は、Ｆｌｔ−１のもの、ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）である（図１を参照されたい）。代替的な実施形態では、シグナル配列はＫＤＲシグナル配列、ＭＱＳＫＶＬＬＡＶＡＬＷＬＣＶＥＴＲＡ（配列番号３７）、あるいは、好ましい実施形態では、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）またはＭＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３９）である（図２を参照）。ヒト網膜細胞における発現のために使用される他のシグナル配列には、限定されずに、下の表３のものを含めることができ、ヒト肝臓細胞における発現のために使用されるシグナル配列には、限定されずに、下の表４のものを含めることができる。
具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃおよび８Ｄに示すアミノ酸配列を有する。
ある特定の態様では、新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞を含むヒト網膜細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが網膜細胞の中に形成され、その後網膜に送達されるように、患者の目に前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することによって送達される。
ある特定の態様では、がん、特に転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞または周囲組織（例えば、がん細胞を囲んでいる血管化の増加を示している組織）にヒト肝臓細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが肝臓の中に形成され、その後がん細胞および／または周囲組織に送達されるように、がんと診断された患者に前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を好ましくは静脈内に投与することによって送達される。
そのような遺伝子療法を投与する対象は、抗ＶＥＧＦ療法に応答性の者であるべきである。特定の実施形態では、本方法は、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視もしくはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたかまたはがんと診断され、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質または他の抗ＶＥＧＦ剤による処置に応答性であると同定された患者を処置することを包含する。
ある特定の態様では、ヒト翻訳後修飾を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンのヒト翻訳後修飾を含有する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、ヒト翻訳後修飾のみを含有するだけである。一実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、Ｎｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌの免疫原性非ヒト翻訳後修飾を含有しない。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有する。一実施形態では、チロシン部位は、アフリベルセプトのＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３および／またはＦｃドメインで硫酸化される（硫酸化部位については図１を参照、赤色で強調されている）。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカン、および少なくとも１つの硫酸化チロシン部位を含有する。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、完全ヒト翻訳後修飾を含有する（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）。ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの翻訳後修飾は、培養において導入遺伝子によってＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞を形質導入することによって評価することができ、これは細胞培養において、２，６−シアリル化を有するが検出可能な（例えば下記の標準アッセイによって判定される）ＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成をもたらすことができる。あるいは、またはさらに、チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成は、細胞培養においてＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認することができる。
本発明は、経時的に消散してピークおよびトラフのレベルをもたらすＶＥＧＦ阻害剤の高用量ボーラスの反復眼内注射を含む医療標準処置に対していくつかの利点を有する。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ生成物の反復注射と対比して、導入遺伝子生成物ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの持続的発現はより一貫したレベルの治療薬が作用部位に存在することを可能にし、より少ない注射しか必要でなく、より少ない医師診察で済むので、患者にとってより危険でなく、より便利である。さらに、導入遺伝子から発現されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、翻訳の間および後に存在する異なる微小環境のために、直接的に注射されるものと異なる様式で翻訳後に改変される。いかなる特定の理論によっても束縛されることなく、これは、異なる拡散、生物活性、分布、親和性、薬物動態および免疫原性特徴を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ分子をもたらし、そのため、作用部位に送達される抗体は、直接的に注射されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐと比較して「生物学的により優れたもの」である。
ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、遺伝子療法を通して、例えば、形質導入された網膜細胞によって生成される完全ヒト翻訳後修飾、例えばヒト２，６−シアリル化、硫酸化導入遺伝子生成物（検出可能なＮｅｕＧＣもα−Ｇａｌもない）を連続的に供給する恒久的なデポーを目の中に形成するために、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者（ヒト対象）の目の網膜下空間、脈絡膜上空間または硝子体内にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を投与することによって達成される、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害の処置のための「生物学的により優れた」分子をもたらすべきである。さらに、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの生成は、遺伝子療法を通して、例えば、形質導入された肝臓細胞によって生成される完全ヒト翻訳後修飾、例えばヒト２，６−シアリル化、硫酸化導入遺伝子生成物（検出可能なＮｅｕＧＣもα−Ｇａｌもない）を連続的に供給する恒久的なデポーを肝臓の中に形成するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物を、がん、特に転移性大腸がんと診断された患者（ヒト対象）の肝臓に投与することによって達成される、がん、特に転移性大腸がんの処置のための「生物学的により優れた」分子をもたらすべきである。
遺伝子療法の代わりに、またはさらなる処置として、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ糖タンパク質を組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株において生成することができ、糖タンパク質は、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者に対して硝子体内投与によって、またはがん、特に転移性大腸がんと診断された患者に対して注入または他の非経口投与によって投与することができる。
小分子薬と異なり、生物製剤は、異なる効力、薬物動態および安全性プロファイルを有する異なる改変または形態を有する多くの変異体の混合物を通常含む。遺伝子療法またはタンパク質療法アプローチで生成されるあらゆる分子が完全にグリコシル化および硫酸化されることは必須でない。むしろ、生成される糖タンパク質の集団は、効能を示すのに十分な、２，６−シアリル化および硫酸化を含むグリコシル化を有するべきである。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの集団の０．５％〜１％は、２，６−シアリル化および／または硫酸化を有する。他の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの集団の２％、２％〜５％、または２％〜１０％は、２，６−シアリル化および／または硫酸化を有する。ある特定の実施形態では、２，６−シアリル化および／または硫酸化のレベルは有意により高く、そのため、分子の最大５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％でさえも２，６−シアリル化および／または硫酸化を含有する。本明細書で提供される遺伝子療法処置の目標は、網膜の新血管形成を処置すること、および最小限の介入／侵襲的手順によって視力を維持もしくは向上させること、または転移性大腸がんを処置する、改善する、もしくはその進行を鈍化させることである。
新血管形成に関連した目の疾患またはがんの処置のために有益である薬剤または処置と組み合わせたＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭによる処置方法も提供される。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子およびＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質生成物を含有するＡＡＶ８ウイルスベクターを製造する方法も、提供される。
５．１．ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子
ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子ならびに導入遺伝子をコードする構築物が提供される。導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐには、限定されずに、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭおよびＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ変異体を含めることができる。アフリベルセプトは、（アミノからカルボキシ末端にかけて）：（ｉ）ヒトＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（ＶＥＧＦＲ１としても知られる）、（ｉｉ）ヒトＫＤＲのＩｇ様ドメイン３（ＶＥＧＦＲ２としても知られる）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１のＦｃ、を含む融合タンパク質である。好ましくは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１のアミノ酸配列（配列番号１、リーダー配列を含まない）を有し、図１のリーダー配列または本明細書に記載される代替リーダー配列を含むことができる。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの変異体には、限定されずに、目における安定性および滞留を増加させるが、全身循環に侵入の後の導入遺伝子生成物の全身半減期をなお低減するように設計された変異体を含めることができる。一実施形態では、変異体はトランケーションされているかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐであってもよいか、１つまたは複数のアミノ酸置換を有することができるか、または異なるＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えばＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のＦｃ、またはＦｌｔ−１、ＫＤＲなどからのＩｇ様ドメインを有することができる。別の実施形態では、トランケーションされるかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、２つの「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を構築物に挿入することができる「二重用量」構築物を形成するように工学的に操作することができる。あるいは、変異体は、改変されたＦｃを有するアフリベルセプト導入遺伝子であってよく、ここで、改変はＦｃＲｎ結合部位を無効にする。そのような改変は、全身循環に侵入後の導入遺伝子生成物の全身半減期を低減するが、目における安定性および滞留をなお維持することができる。
ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子ならびに導入遺伝子をコードする構築物が提供される。導入遺伝子によってコードされるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐには、限定されずに、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭおよびＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ変異体を含めることができる。アフリベルセプトは、（アミノからカルボキシ末端にかけて）：（ｉ）ヒトＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（ＶＥＧＦＲ１としても知られる）、（ｉｉ）ヒトＫＤＲのＩｇ様ドメイン３（ＶＥＧＦＲ２としても知られる）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１のＦｃ、を含む融合タンパク質である。好ましくは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、図１のアミノ酸配列（配列番号１、リーダー配列を含まない）を有し、図１のリーダー配列または本明細書に記載される代替リーダー配列を含むことができる。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの変異体には、限定されずに、目における安定性および滞留を増加させるが、全身循環に侵入の後の導入遺伝子生成物の全身半減期をなお低減するように設計された変異体を含めることができる。一実施形態では、変異体はトランケーションされているかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐであってもよいか、１つまたは複数のアミノ酸置換を有することができるか、または異なるＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えばＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のＦｃ、またはＦｌｔ−１、ＫＤＲなどからのＩｇ様ドメインを有することができる。別の実施形態では、トランケーションされるかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、２つの「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を構築物に挿入することができる「二重用量」構築物を形成するように工学的に操作することができる。あるいは、変異体は、改変されたＦｃを有するアフリベルセプト導入遺伝子であってよく、ここで、改変はＦｃＲｎ結合部位を無効にする。そのような改変は、全身循環に侵入後の導入遺伝子生成物の全身半減期を低減するが、目における安定性および滞留をなお維持することができる。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ＶＥＧＦ受容体１および２の融合タンパク質をコードする導入遺伝子を指し、それらは血管新生に関連したいくつかの網膜疾患およびがんの処置のために開発された。一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させたヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインのＶＥＧＦ結合領域からなる組換え融合タンパク質をコードすることができる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、シグナル配列およびＶＥＧＦ受容体２のドメイン３に付着したＶＥＧＦ受容体１のドメイン２、ならびにヒトＩｇＧ Ｆｃ領域をコードすることができる（例えば、Holash et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(17): 11393を参照されたい）。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ジブ−アフリベルセプトのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードすることができる。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ（de Oliveira Dias et al., 2016, Int J Retin Vitr 2:3）をコードすることができる。
好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、アフリベルセプトの融合タンパク質をコードすることができる。アフリベルセプトは、（アミノからカルボキシ末端にかけて）：（ｉ）ヒトＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２（別名ＶＥＧＦＲ１）、（ｉｉ）ヒトＫＤＲのＩｇ様ドメイン３（別名ＶＥＧＦＲ２）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である。アフリベルセプトのアミノ酸配列（いかなるリーダー配列もない）は、表１に示す配列番号１である。
本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列が、提供される。好ましくは、コードヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される（例えば、Quax et al., 2015 Mol. Cell 59: 149-161を参照）。ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された配列を作成するために、アルゴリズム、例えば、ＥＭＢＯＳＳのウェブベースのトランスレータ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/）、または、http://www.geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html.が利用可能である。表１に示す通り、アフリベルセプトをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（リーダー配列を含む）は配列番号２であり（リーダーをコードする配列は図１における通りである、イタリック体で示される）、コンセンサス配列は配列番号３（リーダー配列をコードする配列は図１からである、イタリック体で示される）。配列番号３で、「ｒ」はプリン（ｇまたはａ）を示し；「ｙ」はピリミジン（ｔ／ｕまたはｃ）を示し；「ｍ」はａまたはｃであり；「ｋ」はｇまたはｔ／ｕであり；「ｓ」はｇまたはｃであり；「ｗ」はａまたはｔ／ｕであり；「ｂ」はｇ、ｃまたはｔ／ｕであり（すなわち、ａでない）；「ｄ」はａ、ｇまたはｔ／ｕであり（すなわち、ｃでない）；「ｈ」はａ、ｃまたはｔ／ｕであり（すなわち、ｇでない）；「ｖ」はａ、ｇまたはｃであり（すなわち、ｔでもｕでもない）；「ｎ」はａ、ｇ、ｃ、ｔ／ｕ、未知、または他である。
図１に示すように、アフリベルセプト配列中のヒトＦｌｔ−１配列は配列番号１のアミノ酸１〜１０２であり、ＫＤＲ配列はアミノ酸１０３〜２０５であり、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインはアミノ酸２０６〜４３１であり、ＩｇＧ１ Ｆｃヒンジ領域はアミノ酸２０６〜２２２である。図１は、Ｎ末端にＦｌｔ−１リーダー配列、ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）を有するアフリベルセプトの融合タンパク質のアミノ酸配列を提供する。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ヒトＫＤＲシグナル配列、ＭＱＳＫＶＬＬＡＶＡＬＷＬＣＶＥＴＲＡ（配列番号３７）、あるいはＭＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３９）、異種リーダー配列、またはＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）、代替の異種リーダー配列を伴うアフリベルセプトの融合タンパク質をコードすることができる（図２を参照されたい）。ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの発現ならびに適切な翻訳後プロセシングおよび改変のために有用であるリーダー配列も、下に開示される。それぞれ、表３および４を参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−ｔｒａｐ融合タンパク質の生物活性を有する、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの変異体には、限定されずに、目における安定性および滞留を増加させるが、全身循環に侵入の後の導入遺伝子生成物の全身半減期をなお低減するように設計された変異体を含めることができる。一実施形態では、変異体は、トランケーションされているかまたは「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｆｃドメインのヒンジ領域を含有しても含有していなくてもよい）であってもよい。別の実施形態では、トランケーションされるかまたは「Ｆｃなしの」またはＦｃ（−）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、２つの「Ｆｃなしの」ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を下記構築物に挿入してそこから発現させることができる、「二重用量」構築物を形成するように工学的に操作することができる。あるいは、変異体は、改変されたＦｃ、例えばＣ末端のリジン（−Ｋ）もしくはグリシン−リジン（−ＧＫ）欠失を有するトランケーションされたＦｃ、またはＦｃＲｎ結合部位を無効にする改変を有するアフリベルセプト導入遺伝子の融合タンパク質であってもよい。そのような改変は、全身循環に侵入後の導入遺伝子生成物の全身半減期を低減するが、目における安定性および滞留をなお維持することができる。全身循環における抗ＶＥＧＦ剤の長引く滞留は出血および血栓塞栓性合併症に関連するので、改変されたＦｃを有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子はタンパク質をより安全にするべきである。一実施形態では、改変されたＦｃを有するアフリベルセプト導入遺伝子を投与された患者は、より少ない出血および／または血栓塞栓性合併症を経験する。（例えば、Ding et al., 2017, MAbs 9:269-284；Kim, 1999, Eur J Immunol 29:2819；Andersen, 2012, J Biol Chem 287: 22927-22937；およびRegula, 2016, EMBO Mol Med 8: 1265-1288を参照されたい）。
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ変異体は、改変されたＩｇＧ Ｆｃとアフリベルセプトの融合タンパク質であってもよい。例えば、全てのヒトＩｇＧサブクラスの重鎖遺伝子において保存されるＣ末端のリジン（−Ｋ）は血清中のＩｇＧに一般的になく、Ｃ末端のリジンは循環の中で切断され、循環ＩｇＧの不均一な集団をもたらす。（van den Bremer et al., 2015, mAbs 7:672-680）。ｉｎ ｓｉｔｕでより均一な導入遺伝子生成物を生成するために、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐのＦｃのＣ末端のリジン（−Ｋ）またはグリシン−リジン（−ＧＫ）をコードするＤＮＡを欠失させることができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hu et al., 2017 Biotechnol. Prog. 33 : 786-794を参照）。別の実施形態では、Ｆｃ改変は、ＦｃＲｎ結合部位を無効にし、それによってタンパク質の全身半減期を低減する突然変異であってもよい。これらの突然変異には、ＩｇＧ１重鎖における位置の通常の番号付けを使用して、Ｉ２５３、Ｈ３１０および／またはＨ４３５の突然変異が含まれ、より具体的にはＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａおよび／またはＨ４３５ＱもしくはＨ４３５Ａが含まれる。これらの位置は、図１のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭにおけるＩ２３８、Ｈ２９５およびＨ４２０に対応する。したがって、配列番号１の２３８位のイソロイシンに対するアラニン置換、２９５位のヒスチジンに対するアラニン置換および／または４２０位のヒスチジンに対するグルタミンもしくはアラニン置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが提供される（または、ルーチンの配列アラインメントによって判定される異なるＶＥＧＦ ｔｒａｐタンパク質におけるそれに対応した位置）。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、突然変異Ｉ２３８Ａ、Ｈ２９５ＡおよびＨ４３５ＱまたはＨ４２０Ａの１つ、２つまたは３つを有する。４２０位のアラニンまたはグルタミン置換を有するアフリベルセプトのアミノ酸配列を有する融合タンパク質の例示的なＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭアミノ酸配列が、図３に提供される。
ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号１のアミノ酸２０６〜４３１）を含まず、配列番号１のアミノ酸１〜２０５の融合タンパク質をもたらす、アフリベルセプトのアミノ酸配列の変異体である。具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含まず、さらに、ＫＤＲ配列の末端リジン（すなわち、配列番号１のアミノ酸２０５）を有しても有さなくてもよく、配列番号１のアミノ酸１〜２０４の融合タンパク質をもたらす。あるいは、図４に示すように、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭはタンパク質のＣ末端のＩｇＧ１ Ｆｃのヒンジ領域の全部または一部を有する。具体的な実施形態では、Ｃ末端の配列は、ＤＫＴＨＴ（配列番号４４）もしくはＤＫＴＨＬ（配列番号４５）（２１０位のトレオニンを置換したロイシンを任意選択で有する、配列番号１のアミノ酸２０６〜２１０）であってもよく、配列番号１の１〜２１０位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐをもたらす；または、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号４６）（配列番号１のアミノ酸２０６〜２１６）であってもよく、配列番号１の１〜２１６位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをもたらす；または、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号４７）（配列番号１のアミノ酸２０６〜２２２）であってもよく、配列番号１の１〜２２２位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをもたらす；または、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号４８）（アミノ酸２０６〜２２７）であってもよく、配列番号１の１〜２２７位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをもたらす（およびＮ末端にリーダー配列を含むこともできる）。ヒンジ領域のシステイン残基は、鎖間ジスルフィド結合の形成を促進することができるが、ヒンジ領域の全てまたはシステイン含有部分を含有しない融合タンパク質は、鎖間の結合を形成することができないが鎖内部の結合のみを形成することができる。このＦｃなしのまたはＦｃ（−）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の２つのコピーを含み、それらを発現する発現構築物においてタンデムに並べて使用することができる。Ｆｃなしの導入遺伝子は、例えばＡＡＶ８ウイルスベクターに導入遺伝子の第２のコピーを加えることによってサイズ制限に対処する。
代替的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、それが全身循環に侵入するとＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの半減期を低減しつつ、目におけるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの安定性を向上または維持することができ、有害効果の可能性を低減する、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換するＦｃドメインまたは他のドメイン配列を有する。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、配列番号１のアミノ酸２０６〜４３１を、図７ＡおよびＢにそれぞれ示すＩｇＧ２ ＦｃまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む代替のＦｃドメインが置換しており、ここで、ヒンジ配列はイタリック体で示される。配列は、下の表２に提示される。変異体は、ヒンジ領域の全部もしくは一部を有するか、またはヒンジ領域を全く有しないＦｃドメインを含む。鎖間ジスルフィド結合が望ましくないある特定の実施形態では、ヒンジ領域の中のシステイン残基の１つまたは複数が、例えばＩｇＧ４ Ｆｃヒンジの２１０および２１３位でセリンによって置換されてもよい（図７ＦおよびＨを参照のこと、置換は下線付き）。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有する例示的導入遺伝子生成物のアミノ酸配列は、図７Ｃ〜Ｈに提示される。
他の代替的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを、ヒトＦｌｔ−１またはヒトＫＤＲのＩｇ様ドメインの、またはその組合せの１つもしくは複数が置換している。ヒトＦｌｔ １およびヒトＫＤＲの細胞外ドメイン（およびシグナル配列）のアミノ酸配列は図８Ａおよび８Ｂにそれぞれ提示し、Ｉｇ様ドメインはカラーテキストで示されている。Ｃ末端ドメインが、ヒトＦｌｔ１のＩｇ様ドメインの１つ、２つ、３つもしくは４つ、特に少なくともＩｇ様ドメイン２および３；または、ヒトＫＤＲのＩｇ様ドメインの１つ、２つ、３つもしくは４つ、特に少なくともドメイン３、４および／もしくは５からなるかまたはそれを含む導入遺伝子生成物が提供される。具体的な実施形態では、導入遺伝子生成物は、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３、４および５ならびにＦｌｔ１ Ｉｇ様ドメイン２を有するＣ末端ドメインを有する。
配列番号１のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換するのに使用することができる例示的な配列は、下の表２に提供される。配列番号１のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを置換したＦｌｔ−１および／またはＫＤＲ Ｉｇ様ドメインを有する例示的な導入遺伝子生成物のアミノ酸配列は、図８ＣおよびＤに提供される。
５．２ ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ構築物
ある特定の態様では、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現のための構築物が本明細書で提供される。本構築物は、導入遺伝子、および網膜細胞または肝臓細胞における発現のために適切な発現制御エレメントを含むことができる。一態様では、ベクターは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子および発現制御エレメントを含むウイルスベクターである。具体的な態様では、ウイルスベクターは、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含むＡＡＶベクターである。より具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子およびシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターが提供される。別の具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質をコードする導入遺伝子およびシグナル配列を含む、ＡＡＶ８ベクターが提供される。一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子およびシグナル配列を含む、ＡＡＶ８ベクターが提供される。具体的な実施形態では、ＡＡＶ８ベクターは、網膜細胞または肝臓細胞における発現を可能にする、導入遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターなどの調節配列をさらに含む。プロモーターは、構成的プロモーター、例えばＣＢ７プロモーターであってよい。あるいは、および、特に、がんが処置されたかまたは副作用が生じる場合、導入遺伝子発現をオフにすることが望ましい場合の、がんの処置で使用するために、誘導可能なプロモーター、例えば、本明細書に記載される低酸素誘導性またはラパマイシン誘導性プロモーターを使用することができる。
ある特定の態様では、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現のための構築物が本明細書で提供される。本構築物は、導入遺伝子、および網膜細胞または肝臓細胞における発現のために適切な発現制御エレメントを含むことができる。一態様では、ベクターは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子および発現制御エレメントを含むウイルスベクターである。具体的な態様では、ウイルスベクターは、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含むＡＡＶベクターである。より具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子およびシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターが提供される。別の具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質をコードする導入遺伝子およびシグナル配列を含む、ＡＡＶ８ベクターが提供される。一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子およびシグナル配列を含む、ＡＡＶ８ベクターが提供される。具体的な実施形態では、ＡＡＶ８ベクターは、網膜細胞または肝臓細胞における発現を可能にする、導入遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターなどの調節配列をさらに含む。プロモーターは、構成的プロモーター、例えばＣＢ７プロモーターであってよい。あるいは、および、特に、がんが処置されたかまたは副作用が生じる場合、導入遺伝子発現をオフにすることが望ましい場合の、がんの処置で使用するために、誘導可能なプロモーター、例えば、本明細書に記載される低酸素誘導性またはラパマイシン誘導性プロモーターを使用することができる。
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、網膜細胞または肝臓細胞へのトロピズムを有するべきである。これらには、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）、特にＡＡＶ８カプシドを有するものを含めることができる、またはＡＡＶ８カプシドの変異体が好ましい。しかし、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または「裸のＤＮＡ」構築物と呼ばれる非ウイルス性の発現ベクターを非限定的に含む他のウイルスベクターを使用することができる。好ましくは、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ導入遺伝子は、適切な発現制御エレメント、例えば、少し例を挙げると、遍在性ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー）、または組織特異的プロモーター、例えばＲＰＥ特異的プロモーター、例えばＲＰＥ６５プロモーター、または錐体特異的プロモーター、例えばオプシンプロモーター、または肝臓特異的プロモーター、例えばＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、またはｍＩＲ１２２プロモーター、または誘導可能なプロモーター、例えば低酸素誘導性プロモーターもしくはラパマイシン誘導性プロモーターによって制御するべきである。本構築物は、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を強化する他の発現制御エレメントを含むことができる（例えば、ニワトリβ−アクチンイントロン、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸがトランケーションされたイントロン１）、β−グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン、および雑種アデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプターイントロンなどのイントロン、ならびにポリＡシグナル、例えば、ウサギβ−グロビンポリＡシグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、合成ポリＡ（ＳＰＡ）シグナルおよびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル）。例えば、Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57を参照されたい。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現構築物が、本明細書で提供される方法で使用するためのものである。本明細書で提供されるウイルスベクターおよび他のＤＮＡ発現構築物は、標的細胞、例えば、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）を含む、ヒト網膜細胞；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；網膜色素上皮細胞；およびヒト肝臓細胞への導入遺伝子の送達のための任意の好適な方法を含む。導入遺伝子の送達手段には、ウイルスベクター、リポソーム、他の脂質含有複合体、他の巨大分子複合体、合成改変ｍＲＮＡ、未改変のｍＲＮＡ、小分子、非生物学的活性分子（例えば、金粒子）、重合分子（例えば、デンドリマー）、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはエピソームが含まれる。一部の実施形態では、ベクターは標的化ベクター、例えば、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；網膜色素上皮細胞；およびヒト肝臓細胞を例えば標的にしたベクターである。
一部の態様では、本開示は使用のための核酸を提供し、ここで、核酸は、以下からなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されているＶＥＧＦ−ＴｒａｐまたはＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする：ＣＢ７プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、オプシンプロモーター、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、低酸素誘導性プロモーターまたはラパマイシン誘導性プロモーター。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸（例えばポリヌクレオチド）を含む組換えベクターが本明細書で提供される。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡは、プロモーター配列、目的の遺伝子（導入遺伝子、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子）の配列、非翻訳領域および終止配列からなる群から選択される配列の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸（例えば、ポリヌクレオチド）および核酸配列は、例えば当業者に公知である任意のコドン最適化技術を通してコドン最適化してもよい（例えば、Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161によるレビューを参照されたい）。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される構築物は、以下の構成成分を含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復配列；（２）ａ）ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターを含むＣＢ７プロモーター、ｂ）ニワトリβ−アクチンイントロン、およびｃ）ウサギβ−グロビンポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする核酸配列。具体的な実施形態では、本明細書に記載される構築物は、以下の構成成分を含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復配列；（２）ａ）低酸素誘導性プロモーター、ｂ）ニワトリβ−アクチンイントロン、およびｃ）ウサギβ−グロビンポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする核酸配列。
５．２．１ ｍＲＮＡベクター
ある特定の実施形態では、ＤＮＡベクターに代わるものとして、本明細書で提供されるベクターは、目的の遺伝子（例えば、導入遺伝子、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）をコードする改変されたｍＲＮＡである。網膜または肝臓細胞への導入遺伝子の送達のための改変されたおよび未改変のｍＲＮＡの合成は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHansson et al., J. Biol. Chem., 2015, 290(9):5661-5672に教示されている。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする改変されたｍＲＮＡが本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡベクターに代わるものとして、本明細書で提供されるベクターは、目的の遺伝子（例えば、導入遺伝子、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）をコードする改変されたｍＲＮＡである。網膜または肝臓細胞への導入遺伝子の送達のための改変されたおよび未改変のｍＲＮＡの合成は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHansson et al., J. Biol. Chem., 2015, 290(9):5661-5672に教示されている。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする改変されたｍＲＮＡが本明細書で提供される。
５．２．２ ウイルスベクター
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えばＡＡＶ８）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、日本の血球凝集素ウイルス（ＨＶＪ）、アルファウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベースのおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損であるように改変される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、雑種ベクター、例えば、「ヘルプレス」アデノウイルスベクターに入れられるＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態では、第１のウイルスからのウイルスカプシドおよび第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より具体的な実施形態では、エンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えばＡＡＶ８）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、日本の血球凝集素ウイルス（ＨＶＪ）、アルファウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベースのおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損であるように改変される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、雑種ベクター、例えば、「ヘルプレス」アデノウイルスベクターに入れられるＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態では、第１のウイルスからのウイルスカプシドおよび第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より具体的な実施形態では、エンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＨＩＶベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＨＩＶベースのベクターは少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、ここで、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルスに由来する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される単純ヘルペスウイルスベースのベクターは、それらが１つまたは複数の最初期（ＩＥ）遺伝子を含まないように改変され、それらを非細胞傷害性にする。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＭＬＶベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＭＬＶベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最高８ｋｂの異種ＤＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレンチウイルスベクターは、非ヒトレンチウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスカプシドにパッケージングされる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントの１つまたは複数を含む：長い末端反復配列、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、att部位およびカプシド形成部位。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アルファウイルスベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるアルファウイルスベクターは、組換えの複製欠陥アルファウイルスである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるアルファウイルスベクターにおけるアルファウイルスレプリコンは、それらのビリオン表面で機能的異種リガンドを提示することによって、特異的細胞型に標的化される。
導入遺伝子を送達するために使用する組換えベクターには、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）が含まれる。以下のいくつかの理由のためにｒＡＡＶは特に魅力的なベクターである。それらは非複製細胞を形質導入することができ、したがって、細胞分裂が低レベルで起こる組織に導入遺伝子を送達するために使用することができる；それらは選択される特異的臓器を優先的に標的にするように改変することができる；ならびに、所望の組織特異性を得るために、および／または一部のＡＡＶに対する既存の患者抗体による中和を回避するために選択する、数百のカプシド血清型がある。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。好ましい実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ８ベースのウイルスベクターは、網膜細胞へのトロピズムを保持する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ８ベースのウイルスベクターは、肝臓細胞へのトロピズムを保持する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（複製のために必要とされる）および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（カプシドタンパク質の合成のために必要とされる）をコードする。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは非複製性であり、ｒｅｐまたはｃａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない（これらはｒＡＡＶベクターの製造においてパッケージング細胞によって供給される）。複数のＡＡＶ血清型が同定されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つまたは複数の血清型からの構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ２０またはＡＡＶｒｈ１０の１つまたは複数からのカプシド構成成分を含む。好ましい実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ２０またはＡＡＶｒｈ１０血清型の１つまたは複数からの構成成分を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法で使用するＡＡＶは、参照によりその全体が組み込まれる、Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068に記載される、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法で使用するＡＡＶは、その各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１９３，９５６号明細書；同第９４５８５１７号明細書；および同第９，５８７，２８２号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号明細書に記載される、以下のアミノ酸挿入の１つを含む：ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号５７）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号５８）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するＡＡＶは、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１９３，９５６号明細書；同第９，４５８，５１７号明細書；および同第９，５８７，２８２号明細書；米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号明細書、および国際出願公開第２０１８／０７５７９８号パンフレットに記載される、ＡＡＶ．７ｍ８（その変異体を含む）である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法で使用するＡＡＶは、米国特許第９，５８５，９７１号明細書に開示される任意のＡＡＶ、例えばＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法で使用するＡＡＶは、ＡＡＶ２／Ｒｅｃ２またはＡＡＶ２／Ｒｅｃ３ベクターであり、それらは、これらのベクターについて、参照により本明細書に組み込まれる、Charbel Issa et al., 2013, PLoS One 8(4): e60361に記載される、ＡＡＶ８カプシドおよび血清型ｃｙ５、ｒｈ２０またはｒｈ３９のカプシドに由来する雑種カプシド配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するＡＡＶは、その各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる以下の特許および特許出願のいずれかに開示されるＡＡＶである：米国特許第７，９０６，１１１号明細書；同第８，５２４，４４６号明細書；同第８，９９９，６７８号明細書；同第８，６２８，９６６号明細書；同第８，９２７，５１４号明細書；同第８，７３４，８０９号明細書；米国特許第９，２８４，３５７号明細書；同第９，４０９，９５３号明細書；同第９，１６９，２９９号明細書；同第９，１９３，９５６号明細書；同第９４５８５１７号明細書；および同第第９，５８７，２８２号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号明細書；同第２０１５／０１２６５８８号明細書；同第２０１７／００６７９０８号明細書；同第２０１３／０２２４８３６号明細書；同第２０１６／０２１５０２４号明細書；同第２０１７／００５１２５７号明細書；および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９；ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５。
ＡＡＶ８ベースのウイルスベクターは、本明細書に記載される組成物および方法のいくつかで使用される。ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列ならびに組換えＡＡＶおよびＡＡＶカプシドを作製する方法が、例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、米国特許第８，３１８，４８０号明細書、米国特許第８，９６２，３３２号明細書および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６に教示される。一態様では、導入遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）をコードするＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８）ベースのウイルスベクターが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐをコードするＡＡＶ８ベースのウイルスベクターが本明細書で提供される。より具体的な実施形態では、アフリベルセプトの融合タンパク質をコードするＡＡＶ８ベースのウイルスベクターが本明細書で提供される。
調節エレメントの制御下の、およびＩＴＲに隣接している、導入遺伝子の発現のための発現カセットを含むウイルスゲノム、ならびに、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、または、ＡＡＶ８カプシドタンパク質（配列番号１１）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一であり、ＡＡＶ８カプシドの生物学的機能を保持しているウイルスカプシドを含むＡＡＶ８ベクターが特定の実施形態で提供される。ある特定の実施形態では、コードされるＡＡＶ８カプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有し、ＡＡＶ８カプシドの生物学的機能を保持している配列番号１１の配列を有する。図６は、ＳＵＢＳとラベルされた行における比較に基づく、整列させた配列のある特定の位置で置換することができる潜在的アミノ酸を有する異なるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較アラインメントを提供する。したがって、具体的な実施形態では、ＡＡＶ８ベクターは、天然のＡＡＶ８配列のその位置に存在しない、図６のＳＵＢＳ行において同定された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有するＡＡＶ８カプシド変異体を含む。
ある特定の実施形態では、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を上で使用することができる。ある特定の実施形態では、自己相補的ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2): 171-82；McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254；および米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；および同第７，４５６，６８３号明細書を参照）。
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列ならびに組換えＡＡＶおよびＡＡＶカプシドを作製する方法が、例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、米国特許第８，３１８，４８０号明細書、米国特許第８，９６２，３３２号明細書および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６に教示される。
本発明は、それに限定されることを意味しないが例示的な実施形態によって例示され、これらの実施形態はｒＡＡＶベクターに関するが、異なる導入遺伝子送達系、例えばアデノウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスおよび／または非ウイルス性の発現ベクター、例えば「裸の」ＤＮＡ構築物を使用することもできる。導入遺伝子の発現は、構成的または組織特異的発現制御エレメントによって制御することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するウイルスベクターは、アデノウイルスベースのウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐを移入するために使用することができる。組換えアデノウイルスは、Ｅ１欠失のある、Ｅ３欠失があるかない、およびいずれかの欠失領域に挿入される発現カセットを有する、第一世代ベクターであってもよい。組換えアデノウイルスは、Ｅ２およびＥ４領域の完全なまたは部分的な欠失を含有する、第二世代ベクターであってもよい。ヘルパー依存性アデノウイルスは、アデノウイルス逆方向末端反復配列およびパッケージングシグナル（ファイ）のみを保持する。導入遺伝子は、ゲノムを概ね３６ｋｂの野生型サイズの近くに保つために、スタッファー配列ありまたはなしでパッケージングシグナルと３’ＩＴＲとの間に挿入される。アデノウイルスベクターの生成のための例示的なプロトコールは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27に見出すことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。組換えレンチウイルスベクターは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐを移入するために使用することができる。構築物を作製するために４つのプラスミドが使用される：Ｇａｇ／ｐｏｌ配列含有プラスミド、Ｒｅｖ配列含有プラスミド、エンベロープタンパク質含有プラスミド（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ）、ならびにパッケージングエレメントおよびＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ遺伝子を有するＣｉｓプラスミド。
レンチウイルスベクターの生成のために、４つのプラスミドは細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３ベースの細胞）の中に同時トランスフェクトされ、それによって、とりわけ、ポリエチレンイミンまたはリン酸カルシウムをトランスフェクション剤として使用することができる。レンチウイルスは、その後上清において採取される（レンチウイルスが活性になるのに細胞から出芽する必要性があり、そのため、細胞採取は不要であり／実行するべきでない）。上清を濾過（０．４５μｍ）し、次に、塩化マグネシウムおよびベンゾナーゼを加えた。さらなる下流のプロセスは広く異なってもよく、ＴＦＦおよびカラムクロマトグラフィーの使用が最もＧＭＰ適合性のものである。他のものは、カラムクロマトグラフィーと一緒に／なしで超遠心を使用する。レンチウイルスベクターの生成のための例示的なプロトコールは、その両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lesch et al., 2011, "Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538およびAusubel et al., 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43に見出すことができる。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するためのベクターは、関連する細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの網膜細胞）へのベクターの導入の後にＶＥＧＦ−Ｔｒａｐのグリコシル化および／またはチロシン硫酸化された変異体が細胞によって発現されるように、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードするものである。具体的な実施形態では、発現されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭは、本明細書に記載されるようにグリコシル化および／またはチロシン硫酸化パターンを含む。
５．２．３ 遺伝子発現のプロモーターおよび修飾因子
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、遺伝子送達または遺伝子発現をモジュレートする構成成分（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、遺伝子発現をモジュレートする構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、取込みの後に細胞の中のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の局在化に影響する構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出または選択するための、検出可能または選択可能なマーカーとして使用することができる構成成分を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、遺伝子送達または遺伝子発現をモジュレートする構成成分（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、遺伝子発現をモジュレートする構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、取込みの後に細胞の中のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の局在化に影響する構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出または選択するための、検出可能または選択可能なマーカーとして使用することができる構成成分を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、１つまたは複数のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターはＣＢ７プロモーターである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663を参照）。一部の実施形態では、ＣＢ７プロモーターは、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を強化する他の発現制御エレメントを含む。ある特定の実施形態では、他の発現制御エレメントには、ニワトリβ−アクチンイントロンおよび／またはウサギβ−グロビンｐｏｌＡシグナルが含まれる。ある特定の実施形態では、プロモーターはＴＡＴＡボックスを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは１つまたは複数のエレメントを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプロモーターエレメントは、お互いに対して反転または移動されてもよい。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、協働するように配置される。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ヒトＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）長い末端反復配列およびラットインスリンプロモーターからなる群から選択される１つまたは複数のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、ＡＡＶ、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲからなる群から選択される１つまたは複数の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、１つまたは複数の組織特異的プロモーター（例えば、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターまたは肝臓特異的プロモーター）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＲＰＥ６５プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーターまたはＭＩＲ１２２プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、ＶＭＤ２プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは誘導可能なプロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは低酸素誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ−１α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ−２α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、ＨＩＦ結合部位は、ＲＣＧＴＧモチーフを含む。ＨＩＦ結合部位の場所および配列に関する詳細については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Schodel, et al., Blood, 2011, 117(23):e207-e217を参照。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ転写因子以外の低酸素誘導性転写因子のための結合部位を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、低酸素において優先的に翻訳される１つまたは複数のＩＲＥＳ部位を含む。低酸素誘導性遺伝子発現およびそれに関与する因子に関する教示については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kenneth and Rocha, Biochem J., 2008, 414: 19-29を参照。具体的な実施形態では、低酸素誘導性プロモーターは、ヒトＮ−ＷＡＳＰプロモーターであるか（例えば、Salvi, 2017, Biochemistry and Biophysics Reports 9: 13-21（Ｎ−ＷＡＳＰプロモーターの教示について、参照により組み込まれる）を参照）、またはヒトＥｐｏの低酸素誘導性プロモーターである（Tsuchiya et al., 1993, J. Biochem. 1 13 :395-400（Ｅｐｏ低酸素誘導性プロモーターの開示について、参照により組み込まれる）を参照）。他の実施形態では、プロモーターは、薬物誘導性プロモーター、例えば、ラパマイシンまたはその類似体の投与によって誘導されるプロモーターである。例えば、薬物誘導性プロモーターの開示について、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第９４／１８３１７号パンフレット、国際公開第９６／２０９５１号パンフレット、国際公開第９６／４１８６５号パンフレット、国際公開第９９／１０５０８号パンフレット、国際公開第９９／１０５１０号パンフレット、国際公開第９９／３６５５３号パンフレットおよび国際公開第９９／４１２５８号パンフレット、ならびに米国特許第７，０６７，５２６号明細書の中のラパマイシン誘導性プロモーターの開示を参照。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、プロモーター以外の１つまたは複数の調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、エンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、リプレッサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、イントロンまたはキメライントロンを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ポリアデニル化配列を含む。
５．２．４ シグナルペプチド
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、タンパク質送達をモジュレートする構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、発現の後にＶＥＧＦ−ｔｒａｐ融合タンパク質に融合する１つまたは複数のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。シグナルペプチドは、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」と本明細書で呼ぶこともできる。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞において適切なパッケージング（例えばグリコシル化）を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞において適切な局在化を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞からの分泌を達成することを可能にする。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、タンパク質送達をモジュレートする構成成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、発現の後にＶＥＧＦ−ｔｒａｐ融合タンパク質に融合する１つまたは複数のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。シグナルペプチドは、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」と本明細書で呼ぶこともできる。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞において適切なパッケージング（例えばグリコシル化）を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞において適切な局在化を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子生成物（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が、細胞からの分泌を達成することを可能にする。
シグナルペプチドを選択する以下の２つのアプローチがある：発現されるものと同種のタンパク質からのシグナルペプチドを選択すること、またはタンパク質が発現、プロセシングおよび分泌される細胞型で発現されるタンパク質からのシグナルペプチドを選択すること。シグナルペプチドは、異なる種において発現される適切なタンパク質から選択することができる。豊富に発現されるタンパク質のシグナル配列が、好ましい可能性がある。しかし、シグナルペプチドは切断後に一部の生物学的機能、「標的化後」機能を有することができ、したがって、そのような標的化後機能を有することができるシグナルペプチドを回避するように注意するべきである。したがって、本明細書に記載される導入遺伝子は、ヒトＦｌｔ−１またはＫＤＲまたは関連したタンパク質由来または網膜もしくは肝臓細胞において発現されるタンパク質由来のシグナルペプチドを有することができる。
アフリベルセプトはＦｌｔ−１リーダー配列で発現され、したがって、Ｆｌｔ−１リーダー配列：ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）を有する導入遺伝子が本明細書で提供される（図１を参照）。代替的な実施形態では、シグナル配列は、ＫＤＲシグナル配列、ＭＱＳＫＶＬＬＡＶＡＬＷＬＣＶＥＴＲＡ（配列番号３７）である。あるいは、および好ましい実施形態では、使用されるリーダー配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）またはＭＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３９）であってもよい（図２、３および４を参照）。特に網膜細胞における発現のための、本明細書で提供されるベクターおよび導入遺伝子と共に使用されるシグナルペプチドの例は、例えば表３に見出すことができる。例えば、使用することができるシグナルペプチドについて、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Stern et al., 2007, Trends Cell. Mol. Biol., 2: 1-17およびDalton & Barton, 2014, Protein Sci, 23 : 517-525も参照されたい。
あるいは、肝臓細胞から発現され、分泌される導入遺伝子生成物のために、表４のシグナル配列の１つを使用することができる。
５．２．５ 非翻訳領域
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、１つまたは複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば３’および／または５’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、所望のレベルのタンパク質発現のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡ半減期のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの二次構造のために最適化される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、１つまたは複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば３’および／または５’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、所望のレベルのタンパク質発現のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡ半減期のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性のために最適化される。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの二次構造のために最適化される。
５．２．６ ポリシストロン性伝令 − ＩＲＥＳおよびＦ２Ａリンカー
１つのベクターの中の２つの別個の「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子が形質導入された細胞によって発現されるように、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳによって分離されている２つの「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子を含有するように、単一の構築物を工学的に操作することができる。Ｆｃなしの導入遺伝子はヒンジ領域を含有しても含有しなくてもよく、例えば、図４のＦｃなしの導入遺伝子である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ポリシストロン性（例えば、二シストロン性）伝令を提供する。例えば、ウイルス構築物は、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントで分離されている２つの「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子をコードすることができる（二シストロン性ベクターを作製するためのＩＲＥＳエレメントの使用の例については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gurtu et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 229(1):295-8を参照されたい）。ＩＲＥＳエレメントはリボソーム走査モデルを回避し、内部部位で翻訳を開始する。ＡＡＶにおけるＩＲＥＳの使用は、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Furling et al., 2001, Gene Ther 8(11): 854-73に記載される。ある特定の実施形態では、二シストロン性伝令はウイルスベクター内に含まれ、二シストロン性伝令内のポリヌクレオチドのサイズには制約がある。ある特定の実施形態では、二シストロン性伝令は、ＡＡＶウイルスベースのベクター（例えば、ＡＡＶ８ベースのベクター）内に含まれる。
１つのベクターの中の２つの別個の「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子が形質導入された細胞によって発現されるように、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳによって分離されている２つの「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子を含有するように、単一の構築物を工学的に操作することができる。Ｆｃなしの導入遺伝子はヒンジ領域を含有しても含有しなくてもよく、例えば、図４のＦｃなしの導入遺伝子である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、ポリシストロン性（例えば、二シストロン性）伝令を提供する。例えば、ウイルス構築物は、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントで分離されている２つの「Ｆｃなしの」アフリベルセプト導入遺伝子をコードすることができる（二シストロン性ベクターを作製するためのＩＲＥＳエレメントの使用の例については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gurtu et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 229(1):295-8を参照されたい）。ＩＲＥＳエレメントはリボソーム走査モデルを回避し、内部部位で翻訳を開始する。ＡＡＶにおけるＩＲＥＳの使用は、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Furling et al., 2001, Gene Ther 8(11): 854-73に記載される。ある特定の実施形態では、二シストロン性伝令はウイルスベクター内に含まれ、二シストロン性伝令内のポリヌクレオチドのサイズには制約がある。ある特定の実施形態では、二シストロン性伝令は、ＡＡＶウイルスベースのベクター（例えば、ＡＡＶ８ベースのベクター）内に含まれる。
他の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、自己切断性フューリン／Ｆ２Ａ（Ｆ／Ｆ２Ａ）リンカーなどの切断可能なリンカーによって分離されているＦｃなしの導入遺伝子の２つのコピーをコードする（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Fang et al., 2005, Nature Biotechnology 23 : 584-590およびFang, 2007, Mol Ther 15: 1153-9）。例えば、２つのＦｃなしのＶＥＧＦ−ｔｒａｐコード配列を分離するために、フューリン−Ｆ２Ａリンカーを発現カセットに組み込み、以下の構造を有する構築物をもたらすことができる：
リーダー−ＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ−フューリン部位−Ｆ２Ａ部位−リーダー−ＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ−ポリＡ。
リーダー−ＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ−フューリン部位−Ｆ２Ａ部位−リーダー−ＦｃなしのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ−ポリＡ。
アミノ酸配列ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号８８）を有するＦ２Ａ部位は自己プロセシングし、最終ＧとＰアミノ酸残基との間で「切断」をもたらす。使用することができるさらなるリンカーには、限定されずに以下のものが含まれる：
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号８９）
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９０）
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９１）
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９２）
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号８９）
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９０）
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９１）
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９２）
リボソームがオープンリーディングフレームのＦ２Ａ配列に遭遇する場合、ペプチド結合はスキップされ、翻訳の終止または下流配列の翻訳の継続をもたらす。この自己プロセシング配列は、ＦｃなしのＶＥＧＦ−ｔｒａｐの第１コピーのＣ末端の端に一連のさらなるアミノ酸をもたらす。しかし、そのようなさらなるアミノ酸は、次に宿主細胞のフューリンによって、Ｆ２Ａ部位の直前および第１のＦｃなしのＶＥＧＦ−ｔｒａｐ配列の後に位置するフューリン部位で切断され、カルボキシペプチダーゼによってさらに切断される。生じたＦｃなしのＶＥＧＦ−ｔｒａｐは、Ｃ末端に含まれる１つ、２つ、３つまたはより多くのさらなるアミノ酸を有することができるか、または、使用されるフューリンリンカーの配列およびリンカーをｉｎ ｖｉｖｏで切断するカルボキシペプチダーゼによって、それはそのようなさらなるアミノ酸を有することができない（例えば、Fang et al., 17 April 2005, Nature Biotechnol. Advance Online Publication；Fang et al., 2007, Molecular Therapy 15(6): 1153-1159；Luke, 2012, Innovations in Biotechnology, Ch. 8, 161-186を参照）。使用することができるフューリンリンカーは、一連の４つの塩基性アミノ酸、例えば、（配列番号９３）、ＲＲＲＲ（配列番号９４）、ＲＲＫＲ（配列番号９５）またはＲＫＫＲ（配列番号９６）を含む。このリンカーがカルボキシペプチダーゼによって切断されると、さらなるアミノ酸はそのままでよく、そのため、さらなる０、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸、例えば、Ｒ、ＲＲ、ＲＫ、ＲＫＲ、ＲＲＲ、ＲＲＫ、ＲＫＫ、ＲＫＲＲ（配列番号９３）、ＲＲＲＲ（配列番号９４）、ＲＲＫＲ（配列番号９５）またはＲＫＫＲ（配列番号９６）は、重鎖のＣ末端の上に残ることができる。ある特定の実施形態では、リンカーがカルボキシペプチダーゼによって切断されると、さらなるアミノ酸は残らない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される構築物によって生成されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ集団の５％、１０％、１５％または２０％は、切断の後、Ｃ末端の上に１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸が残されている。ある特定の実施形態では、フューリンリンカーは、配列Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒを有し、そのため、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐのＣ末端の上のさらなるアミノ酸は、Ｒ、ＲＸ、ＲＸＫ、ＲＸＲ、ＲＸＫＲまたはＲＸＲＲであり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）である。ある特定の実施形態では、さらなるアミノ酸がＶＥＧＦ−ＴｒａｐのＣ末端の上に残ることはできない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットはウイルスベクター内に含まれ、発現カセット内のポリヌクレオチドのサイズには制約がある。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶウイルスベースのベクター（例えば、ＡＡＶ８ベースのベクター）内に含まれる。
５．２．７ 逆方向末端反復配列
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、１つまたは複数の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ウイルスベクターのビリオンに組換え遺伝子発現カセットをパッケージするために、ＩＴＲ配列を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ、例えばＡＡＶ８またはＡＡＶ２に由来する（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379、米国特許第７，２８２，１９９号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、米国特許第８，３１８，４８０号明細書、米国特許第８，９６２，３３２号明細書および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６を参照）。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、１つまたは複数の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ウイルスベクターのビリオンに組換え遺伝子発現カセットをパッケージするために、ＩＴＲ配列を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ、例えばＡＡＶ８またはＡＡＶ２に由来する（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379、米国特許第７，２８２，１９９号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、米国特許第８，３１８，４８０号明細書、米国特許第８，９６２，３３２号明細書および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６を参照）。
ある特定の実施形態では、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを生成するために使用される改変されたＩＴＲを使用することができる（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2): 171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254ならびに米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書および同第７，４５６，６８３号明細書を参照。）
５．２．８ ベクターの製造および試験
本明細書で提供されるウイルスベクターは、宿主細胞を使用して製造することができる。本明細書で提供されるウイルスベクターは、哺乳動物の宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、一次線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を使用して製造することができる。本明細書で提供されるウイルスベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターからの宿主細胞を使用して製造することができる。
本明細書で提供されるウイルスベクターは、宿主細胞を使用して製造することができる。本明細書で提供されるウイルスベクターは、哺乳動物の宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、一次線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を使用して製造することができる。本明細書で提供されるウイルスベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターからの宿主細胞を使用して製造することができる。
宿主細胞は、導入遺伝子および関連するエレメントをコードする配列（すなわち、ベクターゲノム）ならびに宿主細胞の中でウイルスを生成する手段、例えば、複製およびカプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）により安定して形質転換される。ＡＡＶ８カプシドによって組換えＡＡＶベクターを生成する方法については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９号明細書の発明を実施するための形態のセクションＩＶを参照されたい。前記ベクターのゲノムコピー力価は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定することができる。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ２沈降によって回収することができる。
あるいは、ＡＡＶベクターを生成するために、昆虫細胞の中のバキュロウイルス発現系を使用することができる。レビューについては、製造技術のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Aponte-Ubillus et al., 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102: 1045-1054を参照。
本明細書に記載されるベクターからの導入遺伝子発現を測定し、したがって、例えばベクターの効力を示すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイを使用することができる。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（Ｌｏｎｚａ）、ヒト胚性網膜細胞または網膜色素上皮細胞から誘導される細胞株、例えば、網膜色素上皮細胞株ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）を、導入遺伝子発現を評価するために使用することができる。あるいは、肝臓または他の細胞型から誘導される細胞株、例えば、限定されずに、ＨｕＨ−７、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１およびＣＡＰ細胞を使用することができる。発現されると、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐに関連したグリコシル化およびチロシン硫酸化パターンの判定を含む、発現生成物（すなわち、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）の特徴を判定することができる。グリコシル化パターンおよびそれを判定する方法が、本明細書で議論される。さらに、細胞から発現されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐのグリコシル化／硫酸化からもたらされる恩恵は、当技術分野で公知のアッセイを使用して判定することができる。
５．２．９ 組成物
本明細書に記載される導入遺伝子をコードするベクターおよび好適な担体を含む組成物が記載される。好適な担体（例えば、網膜下および／または網膜内投与のためのまたは静脈内投与のための）は、当業者によって容易に選択され得る。
本明細書に記載される導入遺伝子をコードするベクターおよび好適な担体を含む組成物が記載される。好適な担体（例えば、網膜下および／または網膜内投与のためのまたは静脈内投与のための）は、当業者によって容易に選択され得る。
５．３ 翻訳後修飾：グリコシル化およびチロシン硫酸化
ある特定の態様では、ヒト翻訳後修飾を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンのヒト翻訳後修飾を含有する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、ヒト翻訳後修飾のみを含有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）および／またはガラクトース−α−１，３−ガラクトース（α−Ｇａｌ）の免疫原性非ヒト翻訳後修飾を含有しない（または、当技術分野で標準のアッセイ、例えば下記のものによって検出可能なレベルを含有しない）。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有する。一実施形態では、チロシン部位は、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの融合タンパク質のＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３および／またはＦｃドメインにおいて硫酸化される。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンを含有する。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカン、および少なくとも１つの硫酸化チロシン部位を含有する。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、完全ヒト翻訳後修飾を含有する（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）。図１は、Ｎグリコシル化することができ、したがって、α２，６−シアリル化グリカンを有するように改変することができる、アフリベルセプトのＶＥＧＦ−ｔｒａｐ配列のアミノ酸を黄色で強調する。したがって、配列番号１の３６、６８、１２３、１９６および２８２位のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの全てにおいてα２，６−シアリル化グリカンを有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが提供される（図１において黄色で強調される）。配列番号１の１１、１４０、２６３および２８１位のチロシンの１つ、２つ、３つまたは４つの全てで硫酸化される、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ分子も提供される（図１において赤色で強調される）。ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの翻訳後修飾は、導入遺伝子によって培養において適切な細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞（または、非網膜細胞では、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰもしくはＨｕＨ−７細胞株）を形質導入することによって評価することができ、それは、グリコシル化および／または硫酸化されるが、前記細胞培養において検出可能なレベルのＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成をもたらすことができる。あるいは、またはさらに、チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成は、ＰＥＲ．Ｃ６、ＲＰＥまたは非網膜細胞株、例えばＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰもしくはＨｕＨ−７を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認することができる。
ある特定の態様では、ヒト翻訳後修飾を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質が本明細書で提供される。一態様では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンのヒト翻訳後修飾を含有する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、ヒト翻訳後修飾のみを含有する。一実施形態では、本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）および／またはガラクトース−α−１，３−ガラクトース（α−Ｇａｌ）の免疫原性非ヒト翻訳後修飾を含有しない（または、当技術分野で標準のアッセイ、例えば下記のものによって検出可能なレベルを含有しない）。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有する。一実施形態では、チロシン部位は、アフリベルセプトのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの融合タンパク質のＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３および／またはＦｃドメインにおいて硫酸化される。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカンを含有する。別の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、α２，６−シアリル化グリカン、および少なくとも１つの硫酸化チロシン部位を含有する。他の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質は、完全ヒト翻訳後修飾を含有する（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）。図１は、Ｎグリコシル化することができ、したがって、α２，６−シアリル化グリカンを有するように改変することができる、アフリベルセプトのＶＥＧＦ−ｔｒａｐ配列のアミノ酸を黄色で強調する。したがって、配列番号１の３６、６８、１２３、１９６および２８２位のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの全てにおいてα２，６−シアリル化グリカンを有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが提供される（図１において黄色で強調される）。配列番号１の１１、１４０、２６３および２８１位のチロシンの１つ、２つ、３つまたは４つの全てで硫酸化される、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ分子も提供される（図１において赤色で強調される）。ある特定の態様では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの翻訳後修飾は、導入遺伝子によって培養において適切な細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥ細胞（または、非網膜細胞では、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰもしくはＨｕＨ−７細胞株）を形質導入することによって評価することができ、それは、グリコシル化および／または硫酸化されるが、前記細胞培養において検出可能なレベルのＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成をもたらすことができる。あるいは、またはさらに、チロシン硫酸化を含有する前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの生成は、ＰＥＲ．Ｃ６、ＲＰＥまたは非網膜細胞株、例えばＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰもしくはＨｕＨ−７を細胞培養において前記組換えヌクレオチド発現ベクターによって形質導入することによって確認することができる。
ある特定の態様では、ヒト網膜細胞およびＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を発現するヒト網膜細胞においてＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を生成する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする発現ベクターは、ヒト対象の目の中の網膜下空間に投与することができ、ここで、前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの発現は、前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化される。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする発現ベクターは、ヒトの不死化された網膜由来の細胞にトランスフェクトされ、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ヒトの不死化された網膜由来の細胞において発現され、発現の後にα２，６−シアリル化される。α２，６−シアリル化ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質を発現するヒトの不死化された網膜由来の細胞も、本明細書で提供される。さらに、またはあるいは、ヒト網膜細胞および／またはヒトの不死化された網膜由来の細胞は、少なくとも１つのチロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を発現することができる。そのような組換え糖タンパク質生成のために使用することができるヒト網膜細胞株には、少し例を挙げればＰＥＲ．Ｃ６およびＲＰＥが含まれる（例えば、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ糖タンパク質の組換え生成のために使用することができるヒト細胞株のレビューについては、参照によりその全体が組み込まれる、Dumont et al., 2015, Critical Rev in Biotech, 36(6): 1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives"を参照）。
ある特定の態様では、ヒト肝臓細胞ならびにＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を発現するヒト肝臓細胞においてＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を生成する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする発現ベクターは、ヒト対象に静脈内投与することができ、ここで、前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの発現は、前記ヒト対象の肝臓細胞における前記発現ベクターからの発現の後にα２，６−シアリル化される。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする発現ベクターは、ヒトの不死化された肝臓由来の細胞（または他の不死化ヒト細胞）にトランスフェクトされ、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子は、ヒトの不死化された肝臓由来の（または他のヒト不死化）細胞において発現され、発現の後にα２，６−シアリル化される。α２，６−シアリル化ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質を発現するヒトの不死化された肝臓由来の（または他のヒト不死化）細胞も、本明細書で提供される。さらに、またはあるいは、ヒト肝臓細胞および／またはヒトの不死化された肝臓由来の細胞は、少なくとも１つのチロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を発現することができる。そのような組換え糖タンパク質生成のために使用することができるヒト肝臓細胞株にはＨｕＨ−７細胞が含まれるが、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰおよびＰＥＲ．Ｃ６などの非肝臓由来細胞を含むこともできる（例えば、上のDumont et al.を参照されたい）。
本発明は、ヒト翻訳後修飾ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ）タンパク質を送達するための遺伝子療法を提供する。遺伝子療法またはタンパク質療法アプローチで生成されるあらゆる分子が完全にグリコシル化および硫酸化されることは必須でない。むしろ、生成される糖タンパク質の集団は、効能を示すのに十分なグリコシル化（２，６−シアリル化を含む）および硫酸化を有するべきである。本発明の遺伝子療法処置の目標は、疾患の進行を鈍化または停止させることである。本発明の１つの特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質はヒト翻訳後修飾の全てを有し、したがって、これらのタンパク質は完全なヒトグリコシル化および硫酸化を有する。他の実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質の集団の０．５〜１％のみが翻訳後修飾されて治療的に有効であるか、または分子の概ね２％もしくは１％〜５％、もしくは１％、もしくは１０％、もしくは１０％を超えて翻訳後修飾されて治療的に有効であってもよい。ある特定の実施形態では、２，６−シアリル化および／または硫酸化のレベルは有意により高く、そのため、分子の最大５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％でさえもグリコシル化および／または硫酸化を含有し、治療的に有効である。本明細書で提供される遺伝子療法処置の目標は、網膜の新血管形成を処置すること、および最小限の介入／侵襲的技法によって視力を維持もしくは向上させること、または転移性大腸がんを処置する、改善する、もしくはその進行を鈍化させることである。２，６シアリル化の存在は、当技術分野で公知の方法によって試験することができる。例えば、Rohrer, J.S., 2000, "Analyzing Sialic Acids Using High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection." Anal. Biochem. 283; 3-9を参照。
好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭタンパク質はまた、検出可能なＮｅｕＧｃおよび／またはα−Ｇａｌを含有しない。本明細書において、「検出可能なＮｅｕＧｃ」または「検出可能なα−Ｇａｌ」または「ＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しないか有しない」は、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが当技術分野で公知の標準のアッセイ方法によって検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌ部分も含有しないことを意味する。例えば、ＮｅｕＧｃは、ＮｅｕＧｃを検出する方法について、参照により本明細書に組み込まれる、Hara et al., 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection." J. Chromatogr., B: Biomed. 377, 111-119による、ＨＰＬＣによって検出することができる。あるいは、ＮｅｕＧｃは質量分析によって検出することができる。α−Ｇａｌは、ＥＬＩＳＡを使用して（例えば、Galili et al., 1998, "A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody." Transplantation. 65(8): 1129-32を参照）、または質量分析によって（例えば、Ayoub et al., 2013, "Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques." Landes Bioscience. 5(5):699-710を参照）検出することができる。Platts-Mills et al., 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260に引用される参考文献も参照。
５．３．１ グリコシル化
グリコシル化は、本明細書に記載される組成物および方法で使用されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子に多数の恩恵を付与することができる。大腸菌（E. coli）はＮ−グリコシル化のために必要とされる構成成分を天然に保有しないので、そのような恩恵は大腸菌（E. coli）におけるタンパク質の生成によって達成不能である。さらに、一部の恩恵は、例えばＣＨＯ細胞におけるタンパク質生成を通して達成不能であるが、その理由は、ＣＨＯ細胞はある特定のグリカン（例えば２，６シアル酸および二分岐のＧｌｃＮＡｃ）の付加のために必要とされる構成成分を欠いているからであり、およびＣＨＯ細胞はヒトに一般的でなく、および／またはヒトで免疫原性であるグリカン、例えばＮｅｕ５Ｇｃおよびα−Ｇａｌを加えることができるからである。例えば、Song et al., 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666を参照されたい。
グリコシル化は、本明細書に記載される組成物および方法で使用されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子に多数の恩恵を付与することができる。大腸菌（E. coli）はＮ−グリコシル化のために必要とされる構成成分を天然に保有しないので、そのような恩恵は大腸菌（E. coli）におけるタンパク質の生成によって達成不能である。さらに、一部の恩恵は、例えばＣＨＯ細胞におけるタンパク質生成を通して達成不能であるが、その理由は、ＣＨＯ細胞はある特定のグリカン（例えば２，６シアル酸および二分岐のＧｌｃＮＡｃ）の付加のために必要とされる構成成分を欠いているからであり、およびＣＨＯ細胞はヒトに一般的でなく、および／またはヒトで免疫原性であるグリカン、例えばＮｅｕ５Ｇｃおよびα−Ｇａｌを加えることができるからである。例えば、Song et al., 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666を参照されたい。
ヒト網膜細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化、網膜細胞における頑強なプロセスを含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。（例えば、ヒト網膜細胞によって生成される翻訳後修飾について、その各々は、参照によりその全体が組み込まれる、網膜細胞による糖タンパク質の生成を報告する、Wang et al., 2013, Analytical Biochem. 427: 20-28およびAdamis et al., 1993, BBRC 193: 631-638；ならびに、網膜細胞によって分泌されるチロシン硫酸化糖タンパク質の生成を報告する、Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567およびKanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133 : 126-131を参照する）。
ヒト肝細胞は、グリコシル化およびチロシン−Ｏ硫酸化を含む、分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。例えば、ヒト肝臓によって分泌される血漿タンパク質のプロテオーム同定については、https://www.proteinatlas.org/humanproteome/liverを；それらの分泌タンパク質のグリカンのスペクトルについては、Clerc et al., 2016, Glycoconj 33 :309-343およびPompach et al., 2014, J Proteome Res. 13 :5561-5569を；およびＴＰＳＴ−２（チロシン−Ｏ硫酸化を触媒する）は他の組織におけるより強く肝臓において発現されるが、ＴＰＳＴ−１は他の組織と同等の平均レベルで発現されることを報告している、E Mishiro, 2006, J Biochem 140:731-737を参照、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、アフリベルセプトは、９６．９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質分子量を有するＣＨＯ細胞において作製される二量体糖タンパク質である。それは概ね１５％のグリコシル化を有し、１１５ｋＤａの総分子量を与える。一次配列によって予測される各ポリペプチド鎖の上の全ての５つの推定上のＮ−グリコシル化部位は、炭水化物で占有することができ、末端シアル酸残基における不均一性を含む、ある程度の鎖不均一性を示す。
アフリベルセプトなどのＣＨＯ細胞生成物と異なり、ヒト網膜もしくは肝臓細胞、または他のヒト細胞によるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのグリコシル化は、安定性、半減期を向上させることができ、導入遺伝子生成物の望ましくない凝集を低減するグリカンの付加をもたらす。（抗体およびＦａｂにおけるグリコシル化の明らかとなってきた重要性のレビューについては、例えば、Bovenkamp et al., 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441を参照）。注目すべきことに、本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭに加えられるグリカンは、２，６−シアル酸を含有する高度にプロセシングされた複合型のＮ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うために要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有しないＣＨＯ細胞において作製されるアフリベルセプトに存在せず、ＣＨＯ細胞は二分岐のＧｌｃＮＡｃも生成しないが、それらは免疫原性であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）は生成する。例えば、Dumont et al., 2015, Critical Rev in Biotech, 36(6): 1110-1122を参照されたい。さらに、ＣＨＯ細胞は、高濃度でアナフィラキシーを誘発することができる、ほとんどの個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応する免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原を生成することもできる。例えば、Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子生成物の免疫原性を低減し、安全性および効能を向上させるはずである。
Ｏ−グリコシル化は、酵素によるセリンまたはトレオニン残基へのＮ−アセチルガラクトサミンの付加を含む。抗体のヒンジ領域に存在するアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化することができることが実証されている。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法で使用されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、ＩｇＧ Ｆｃヒンジ領域の全部または一部を含み、したがって、ヒト網膜細胞または肝臓細胞で発現される場合にＯグリコシル化することが可能である。Ｏ−グリコシル化の可能性は、大腸菌（E. coli）がヒトＯ−グリコシル化において使用されるものと同等の機構をやはり天然に含有しないので（代わりに、細菌が特異的Ｏ−グリコシル化機構を含有するように改変される場合のみ、大腸菌（E. coli）におけるＯ−グリコシル化が実証された。例えば、Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacterid. 189:8088-8098を参照）、大腸菌（E. coli）において生成されるタンパク質と比較して、本明細書で提供されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質に別の利点を付与する。
５．３．２ チロシン硫酸化
チロシン硫酸化は、Ｙの＋５〜−５の位置にグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）があるチロシン（Ｙ）残基において、Ｙの−１の位置は中性または酸性の荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効にする塩基性アミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）でない場合に生じる。したがって、本明細書に記載される組成物および方法は、少なくとも１つのチロシン硫酸化部位を含むＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質の使用を含み、それは、ヒト網膜細胞または肝臓細胞または他のヒト細胞において発現される場合、チロシン硫酸化されてもよい。
チロシン硫酸化は、Ｙの＋５〜−５の位置にグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）があるチロシン（Ｙ）残基において、Ｙの−１の位置は中性または酸性の荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効にする塩基性アミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）でない場合に生じる。したがって、本明細書に記載される組成物および方法は、少なくとも１つのチロシン硫酸化部位を含むＶＥＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質の使用を含み、それは、ヒト網膜細胞または肝臓細胞または他のヒト細胞において発現される場合、チロシン硫酸化されてもよい。
重要なことに、チロシン硫酸化タンパク質は、チロシン硫酸化のために必要とされる酵素を天然に保有しない大腸菌（E. coli）において生成することができない。さらに、ＣＨＯ細胞は、チロシン硫酸化の欠陥があり、それらは分泌細胞でなく、翻訳後チロシン硫酸化の能力が限られている。例えば、Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537を参照されたい。有利には、本明細書で提供される方法は、分泌性であり、チロシン硫酸化の能力を有する網膜細胞または肝臓細胞におけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子の発現を要求する。網膜細胞によって分泌されるチロシン硫酸化糖タンパク質の生成を報告する、Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567およびKanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131を参照されたい。
チロシン硫酸化は、いくつかの理由のために有利である。例えば、標的に対する治療抗体の抗原結合断片のチロシン硫酸化は、抗原結合力および活性を劇的に増加させることが示されている。例えば、Loos et al., 2015, PNAS 112: 12675-12680およびChoe et al., 2003, Cell 114: 161-170を参照されたい。チロシン硫酸化の検出アッセイは、当技術分野で公知である。例えば、Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164を参照されたい。
グリコシル化部位に加えて、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位を含有することができる；硫酸化部位は赤色で強調され、配列番号１の１１位（Ｆｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン）、１４０位（ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン）、２６３および２８１位（ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン）のアフリベルセプトのＦｌｔ−１ Ｉｇ様ドメイン２、ＫＤＲ Ｉｇ様ドメイン３およびＦｃドメインにおけるチロシン−Ｏ硫酸化部位を同定する、図１を参照。（例えば、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を囲んでいるアミノ酸の分析については、参照によりその全体が組み込まれる、Yang et al., 2015, Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照）。
５．４．遺伝子療法プロトコール
新血管形成の増加によって引き起こされる眼疾患を有するヒト対象への、導入遺伝子構築物の治療有効量の投与のための方法が記載される。より詳細には、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害を有する患者への、導入遺伝子構築物の治療有効量の投与のための方法が記載される。具体的な実施形態では、ベクターは、網膜下（局所麻酔下の対象での部分的硝子体切除および網膜への遺伝子療法の注射を含む、訓練された網膜外科医によって実行される外科的処置；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Campochiaro et al., 2016, Hum Gen Ther Sep 26 epub:doi: 10.1089/hum.2016.117を参照）、または硝子体内、または脈絡膜上に、例えばマイクロインジェクションまたはマイクロカニュレーションによって投与される。（例えば、その各々は、参照によりその全体が組み込まれる、Patel et al., 2012, Invest Ophth & Vis Sci 53 :4433-4441；Patel et al., 2011, Pharm Res 28: 166-176；Olsen, 2006, Am J Ophth 142:777-787を参照）。特定の実施形態では、導入遺伝子構築物の治療有効量の網膜下および／または網膜内投与のためのそのような方法は、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを網膜に送達するために、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞の１つまたは複数における導入遺伝子の発現をもたらす。
新血管形成の増加によって引き起こされる眼疾患を有するヒト対象への、導入遺伝子構築物の治療有効量の投与のための方法が記載される。より詳細には、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害を有する患者への、導入遺伝子構築物の治療有効量の投与のための方法が記載される。具体的な実施形態では、ベクターは、網膜下（局所麻酔下の対象での部分的硝子体切除および網膜への遺伝子療法の注射を含む、訓練された網膜外科医によって実行される外科的処置；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Campochiaro et al., 2016, Hum Gen Ther Sep 26 epub:doi: 10.1089/hum.2016.117を参照）、または硝子体内、または脈絡膜上に、例えばマイクロインジェクションまたはマイクロカニュレーションによって投与される。（例えば、その各々は、参照によりその全体が組み込まれる、Patel et al., 2012, Invest Ophth & Vis Sci 53 :4433-4441；Patel et al., 2011, Pharm Res 28: 166-176；Olsen, 2006, Am J Ophth 142:777-787を参照）。特定の実施形態では、導入遺伝子構築物の治療有効量の網膜下および／または網膜内投与のためのそのような方法は、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを網膜に送達するために、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞の１つまたは複数における導入遺伝子の発現をもたらす。
大腸がん細胞および／または大腸がん細胞を囲んでいる組織への送達のために、ヒト対象の肝臓にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを発現する細胞のデポーを形成するために、がん、特に転移性大腸がんを有するヒト対象への、導入遺伝子構築物の治療有効量の投与のための方法が記載される。詳細には、方法は、肝臓の血流を通した、例えば肝上静脈または肝臓動脈を介した、肝臓への静脈内投与または直接投与を提供する。そのような方法は、がん細胞および／またはがん細胞を囲んでいる新血管形成組織にＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを送達するために、肝臓細胞において導入遺伝子の発現をもたらす。
５．４．１ 標的患者集団
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、新血管形成の増加によって引き起こされる眼疾患と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、新血管形成の増加によって引き起こされる眼疾患と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、重度のＡＭＤと診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、減弱したＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、重度の滲出型ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、減弱した滲出型ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、重度の糖尿病性網膜症と診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、減弱した糖尿病性網膜症と診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）と関連した糖尿病性網膜症と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、重度の糖尿病性網膜症と診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、減弱した糖尿病性網膜症と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ融合タンパク質による処置に応答性であると同定された、ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、アフリベルセプトによる処置に応答性であると同定された、ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子療法による処置の前に硝子体内に注射される、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ融合タンパク質による処置に応答性であると同定された、ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子療法による処置の前に硝子体内に注射される、不死化されたヒト網膜細胞における発現によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭによる処置に応答性であると同定された、ＡＭＤと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）および／またはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）による処置に応答性であると同定された、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視、ポリープ様脈絡膜脈管障害と診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、がん、特に転移がんと診断された患者への投与のためである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ融合タンパク質による処置に応答性であると同定された、転移がん、特に転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ジブ−アフリベルセプトによる処置に応答性であると同定された、転移がん、特に転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子療法による処置の前に静脈内注入される、ジブ−アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ融合タンパク質による処置に応答性であると同定された、転移がん、特に転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子療法による処置の前に静脈内注入される、不死化されたヒト細胞における発現によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭによる処置に応答性であると同定された、転移がん、特に転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）（ジブ−アフリベルセプト）、および／またはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、および／またはＳＴＩＶＡＲＧＡ（登録商標）（レゴラフェニブ）による処置に応答性であると同定された、転移がん、特に転移性大腸がんと診断された患者への投与のためである。
５．４．２ 投薬量および投与様式
組換えベクターの治療有効用量は、目に、例えば網膜下空間に、または脈絡膜上の空間に、または硝子体内に、≧０．１ｍＬ〜≦０．５ｍＬ、好ましくは０．１〜０．２５ｍＬ（１００〜２５０μｌ）の範囲内の注射容量で送達するべきである。硝子体液において少なくとも約０．３３μｇ／ｍＬ〜約１．３２μｇ／ｍＬ、または眼房水（目の前眼房）において約０．１１μｇ／ｍＬ〜約０．４４μｇ／ｍＬのＣｍｉｎで検出可能である導入遺伝子生成物の濃度を３カ月間維持する用量が望まれ；その後、約１．７０〜約６．６０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高約２６．４０μｇ／ｍＬの導入遺伝子生成物の硝子体Ｃｍｉｎ濃度、ならびに／または約０．５６〜約２．２０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高８．８０μｇ／ｍＬの眼房水Ｃｍｉｎ濃度を維持するべきである。硝子体液濃度は、導入遺伝子生成物の患者の眼房水または血清の濃度を測定することによって推定および／またはモニタリングすることができる。あるいは、遊離ＶＥＧＦ血漿濃度の約１０ｐｇ／ｍＬへの低減を達成するのに十分な用量を使用することができる。（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Avery et al., 2017, Retina, the Journal of Retinal and Vitreous Diseases 0: 1-12およびAvery et al., 2014, Br J Ophthalmol 98: 1636-1641を参照されたい）。
組換えベクターの治療有効用量は、目に、例えば網膜下空間に、または脈絡膜上の空間に、または硝子体内に、≧０．１ｍＬ〜≦０．５ｍＬ、好ましくは０．１〜０．２５ｍＬ（１００〜２５０μｌ）の範囲内の注射容量で送達するべきである。硝子体液において少なくとも約０．３３μｇ／ｍＬ〜約１．３２μｇ／ｍＬ、または眼房水（目の前眼房）において約０．１１μｇ／ｍＬ〜約０．４４μｇ／ｍＬのＣｍｉｎで検出可能である導入遺伝子生成物の濃度を３カ月間維持する用量が望まれ；その後、約１．７０〜約６．６０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高約２６．４０μｇ／ｍＬの導入遺伝子生成物の硝子体Ｃｍｉｎ濃度、ならびに／または約０．５６〜約２．２０μｇ／ｍＬの範囲内のおよび最高８．８０μｇ／ｍＬの眼房水Ｃｍｉｎ濃度を維持するべきである。硝子体液濃度は、導入遺伝子生成物の患者の眼房水または血清の濃度を測定することによって推定および／またはモニタリングすることができる。あるいは、遊離ＶＥＧＦ血漿濃度の約１０ｐｇ／ｍＬへの低減を達成するのに十分な用量を使用することができる。（例えば、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Avery et al., 2017, Retina, the Journal of Retinal and Vitreous Diseases 0: 1-12およびAvery et al., 2014, Br J Ophthalmol 98: 1636-1641を参照されたい）。
がん、特に転移性大腸がんの処置のために、治療有効用量は、２週毎に４ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合に、２週または４週後に、導入遺伝子の血漿濃度がジブ−アフリベルセプトの少なくともＣｍｉｎ血漿濃度のレベルで維持されるように、患者に好ましくは静脈内投与するべきである。
５．５ バイオマーカー／サンプリング／効能モニタリング
視覚的欠陥に対する本明細書で提供される処置方法の効果は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）、眼圧、スリットランプ生体鏡検査法および／または間接検眼によって測定することができる。
視覚的欠陥に対する本明細書で提供される処置方法の効果は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）、眼圧、スリットランプ生体鏡検査法および／または間接検眼によって測定することができる。
目／網膜への身体的変化に対する本明細書で提供される処置方法の効果は、ＳＤ−ＯＣＴ（ＳＤ光学式干渉断層撮影）によって測定することができる。
効能は、網膜電図検査（ＥＲＧ）によって測定されるように、モニタリングすることができる。
本明細書で提供される処置方法の効果は、視力喪失、感染、炎症および網膜剥離を含む他の安全性事象の徴候を測定することによってモニタリングすることができる。
本明細書で提供される処置の効能を判定するために、網膜の厚さをモニタリングすることができる。いかなる特定の理論によっても縛られないが、網膜の厚さは、臨床情報として使用することができ、ここで、網膜の厚さの低減がより大きいほど、または網膜の肥厚までの時間がより長いほど、その処置はより有効である。網膜の機能は、例えば、ＥＲＧによって判定することができる。ＥＲＧは、ヒトで使用するためにＦＤＡの承認を得た、網膜機能の非侵襲的電気生理学的試験であり、それは、目の光感受性細胞（桿体および錐体）およびそれらを接続する神経節細胞、特に閃光刺激へのそれらの応答を検査する。網膜の厚さは、例えば、ＳＤ−ＯＣＴによって判定することができる。ＳＤ−ＯＣＴは、目的の物体から反射される後方散乱光のエコー時間遅延および大きさを判定するために低コヒーレンス干渉計法を使用する、三次元画像化技術である。ＯＣＴは組織試料（例えば、網膜）の層を３〜１５μｍの軸分解能によって走査するために使用することができ、ＳＤ−ＯＣＴは以前の形態の技術に対して軸分解能および走査速度が向上している（Schuman, 2008, Trans. Am. Opthamol. Soc. 106:426-458）。
がん、特に転移性大腸がんの処置の効能は、抗がん／抗転移剤の効能、例えば腫瘍サイズの低減、転移の数および／またはサイズの低減、全体生存率、無進行生存、奏効率、安定疾患の発生率の増加を評価するための当技術分野で公知の任意の手段によってモニタリングすることができる。
５．６ 併用療法
本明細書で提供される処置方法は、１つまたは複数のさらなる療法と組み合わせることができる。一態様では、本明細書で提供される処置方法は、レーザー光凝固と共に投与される。一態様では、本明細書で提供される処置方法は、ベルテポルフィンまたは眼内ステロイドによる光力学療法と共に投与される。
本明細書で提供される処置方法は、１つまたは複数のさらなる療法と組み合わせることができる。一態様では、本明細書で提供される処置方法は、レーザー光凝固と共に投与される。一態様では、本明細書で提供される処置方法は、ベルテポルフィンまたは眼内ステロイドによる光力学療法と共に投与される。
一態様では、本明細書で提供される処置方法は、ヒト細胞株において生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ（Dumont et al., 2015、上記）、または他の抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブもしくはペガプタニブを非限定的に含む、抗ＶＥＧＦ剤による硝子体内（ＩＶＴ）注射と共に投与される。他の利用可能な処置の送達を伴う目／網膜へのＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの送達の組合せが、本明細書に記載される。遺伝子療法処置の前、同時、または後に、さらなる処置を投与することができる。本発明の遺伝子療法と組み合わせることができる、ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ｃＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害のための利用可能な処置には、レーザー光凝固、ベルテポルフィンによる光力学療法、およびアフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはペガプタニブを限定されずに含む抗ＶＥＧＦ剤による硝子体内（ＩＶＴ）注射、ならびに炎症を低減する硝子体内ステロイドによる処置が限定されずに含まれる。遺伝子療法と組み合わせることができる転移性大腸がんのための利用可能な処置には、がん、特に転移性大腸がんの処置に有用な手術および／または化学療法剤が限定されずに含まれる。特定の実施形態では、遺伝子療法は、転移性大腸がんの処置のために使用されるレジメン、具体的には、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）もしくはフォリン酸（ロイコボリン、ＦＡまたはフォリン酸カルシウムとも呼ばれる）、５−フルオロウラシル、および／またはオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）、ならびにジブ−アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブもしくはレゴラフェニブを限定されずに含む抗ＶＥＧＦ剤による静脈内投与と共に投与される。
本明細書で提供される処置方法は、１つまたは複数のさらなる療法と組み合わせることができる。一態様では、本明細書で提供される眼疾患のための処置方法は、レーザー光凝固と共に投与される。一態様では、本明細書で提供される眼疾患のための処置方法は、ベルテポルフィンまたは眼内ステロイドによる光力学療法と共に投与される。
一態様では、本明細書で提供される処置方法は、ヒト細胞株において生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭ（Dumont et al., 2015、上記）、または他の抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブまたはレゴラフェニブを非限定的に含む、抗ＶＥＧＦ剤による硝子体内（ＩＶＴ）注射または静脈内投与と共に投与される。
遺伝子療法処置の前、同時、または後に、さらなる処置を投与することができる。
遺伝子療法処置の効能は、医療標準を使用するレスキュー処置、例えば、ヒト細胞株において生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭまたは他の抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブもしくはペガプタニブを非限定的に含む、抗ＶＥＧＦ剤による硝子体内注射の削除またはその回数の低減によって示すことができる。
[実施例１]
アフリベルセプトｃＤＮＡ（およびコドン最適化）
Ｆｌｔ−１シグナル配列ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）を有する配列番号１のアフリベルセプト配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図１を参照）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される（例えば、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列）。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ａに提供される。
アフリベルセプトｃＤＮＡ（およびコドン最適化）
Ｆｌｔ−１シグナル配列ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧ（配列番号３６）を有する配列番号１のアフリベルセプト配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図１を参照）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される（例えば、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列）。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ａに提供される。
[実施例２]
代替リーダーを有するアフリベルセプト
リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）を有する配列番号１のアフリベルセプト配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図２に提供されたアミノ酸配列）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される（例えば、配列番号２または配列番号３のリーダー配列がないアフリベルセプトのアミノ酸配列）。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ｂに提供される。
代替リーダーを有するアフリベルセプト
リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）を有する配列番号１のアフリベルセプト配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図２に提供されたアミノ酸配列）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される（例えば、配列番号２または配列番号３のリーダー配列がないアフリベルセプトのアミノ酸配列）。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ｂに提供される。
[実施例３]
「無効化されたＦｃ」（Ｈ４２０Ａ；Ｈ４２０Ｑ）を有するアフリベルセプト
４２０位（Ｆｃの通常の番号付けにおける４３５位に対応する）のヒスチジンがアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）で置き換えられていること以外は配列番号１のアフリベルセプト配列をコードし、Ｎ末端リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図３に示す）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ｃ（アラニン置換）および５Ｄ（グルタミン置換）に提供する。
「無効化されたＦｃ」（Ｈ４２０Ａ；Ｈ４２０Ｑ）を有するアフリベルセプト
４２０位（Ｆｃの通常の番号付けにおける４３５位に対応する）のヒスチジンがアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）で置き換えられていること以外は配列番号１のアフリベルセプト配列をコードし、Ｎ末端リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築する（図３に示す）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。ベクターの地図は、図５Ｃ（アラニン置換）および５Ｄ（グルタミン置換）に提供する。
[実施例４]
Ｆｃ（−）アフリベルセプト
配列番号１のアフリベルセプト配列のＦｃなしの形態をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターが構築され、導入遺伝子は、配列番号１の１〜２０４位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または配列番号１の１〜２０５位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンを有するがＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または１〜２１６位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域の一部を有する）、または配列番号１の１〜２２２位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域を有する）、または１〜２２７位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐをコードする（図４を参照）。構築物は、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐのＮ末端でリーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）もコードする（図２に提供されたアミノ酸配列）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。
Ｆｃ（−）アフリベルセプト
配列番号１のアフリベルセプト配列のＦｃなしの形態をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、アフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターが構築され、導入遺伝子は、配列番号１の１〜２０４位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または配列番号１の１〜２０５位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンを有するがＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または１〜２１６位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域の一部を有する）、または配列番号１の１〜２２２位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域を有する）、または１〜２２７位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐをコードする（図４を参照）。構築物は、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐのＮ末端でリーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３８）もコードする（図２に提供されたアミノ酸配列）。導入遺伝子配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。
[実施例５]
Ｆｃ（−）アフリベルセプト二重構築物
配列番号１のアフリベルセプト配列のＦｃなしの形態をコードする２つヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、タンデム型のアフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターが構築され、導入遺伝子は、配列番号１の１〜２０４位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または配列番号１の１〜２０５位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンを有するがＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または１〜２１６位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域の一部を有する）、または配列番号１の１〜２２２位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域を有する）、または配列番号１の１〜２２７位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐを各々コードする２つの（好ましくは同一の）ヌクレオチド配列を含む。構築物は、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ配列の各々のＮ末端で、網膜細胞発現のためには表３のまたは肝臓細胞発現のためには表４のリーダー配列もコードする。２つのＶＥＧＦ−ｔｒａｐコード配列をコードするヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳエレメントまたは２Ａ切断部位によって分離されて二シストロン性ベクターを作製する。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。例示的なベクターを、図５Ｅおよび５Ｆに示す。
Ｆｃ（−）アフリベルセプト二重構築物
配列番号１のアフリベルセプト配列のＦｃなしの形態をコードする２つヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、タンデム型のアフリベルセプトｃＤＮＡベースのベクターが構築され、導入遺伝子は、配列番号１の１〜２０４位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または配列番号１の１〜２０５位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＫＤＲ配列の末端リジンを有するがＩｇＧ１ Ｆｃドメインが欠失）、または１〜２１６位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域の一部を有する）、または配列番号１の１〜２２２位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域を有する）、または配列番号１の１〜２２７位のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐを各々コードする２つの（好ましくは同一の）ヌクレオチド配列を含む。構築物は、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ配列の各々のＮ末端で、網膜細胞発現のためには表３のまたは肝臓細胞発現のためには表４のリーダー配列もコードする。２つのＶＥＧＦ−ｔｒａｐコード配列をコードするヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳエレメントまたは２Ａ切断部位によって分離されて二シストロン性ベクターを作製する。ベクターは、ＣＢ７などの遍在的に活性である構成的プロモーター、または任意選択で、低酸素誘導性プロモーターをさらに含む。例示的なベクターを、図５Ｅおよび５Ｆに示す。
均等物
本発明はその具体的な実施形態を参照して詳述されているが、機能的に同等である変形形態が本発明の範囲内であることが理解されよう。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変形が、前述の記載および添付図から当業者に明らかになる。そのような改変形は、添付の請求項の範囲内にあるものとする。当業者は、単にルーチンの実験操作を使用して、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
本発明はその具体的な実施形態を参照して詳述されているが、機能的に同等である変形形態が本発明の範囲内であることが理解されよう。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変形が、前述の記載および添付図から当業者に明らかになる。そのような改変形は、添付の請求項の範囲内にあるものとする。当業者は、単にルーチンの実験操作を使用して、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
この明細書で指摘される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、ここに参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (29)
- ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットを含む発現構築物であって、前記発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、発現構築物。
- 前記導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、請求項１に記載の発現構築物。
- ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；およびＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含む、アデノ随伴ウイルスベクター。
- 前記導入遺伝子が図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
- それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、前記発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むＡＡＶベクターを含み、
前記ＡＡＶベクターは、前記対象の目に対する網膜下、硝子体内または脈絡膜上投与のために製剤化されている、医薬組成物。 - それを必要とするヒト対象における、加齢性黄斑変性症を含む眼障害を処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ．７ｍ８カプシドのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、前記発現カセットは、ヒト網膜細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むＡＡＶベクターを含み、
前記ＡＡＶベクターは、前記対象の目に対する網膜下、硝子体内または脈絡膜上投与のために製剤化されている、医薬組成物。 - それを必要とするヒト対象における、転移性大腸がんを含むがんを処置するための医薬組成物であって、
ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも９５％同一であるウイルスカプシド；および
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含むウイルスゲノムであって、前記発現カセットは、ヒト肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、ウイルスゲノム
を含むＡＡＶベクターを含み、
前記ＡＡＶベクターは、前記対象への静脈内投与のために製剤化されている、医薬組成物。 - 前記ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐが図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄに示すアミノ酸配列を有する、請求項６または７に記載の医薬組成物。
- 新生血管加齢性黄斑変性症（ｎＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜中心静脈閉塞（ＲＶＯ）、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の網膜に、ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマクリン細胞；網膜神経節細胞（小人細胞、日傘細胞、二層細胞、巨大網膜神経節細胞、光感受性神経節細胞およびミュラーグリア）；および網膜色素上皮細胞を含むヒト網膜細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- 転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞または前記がん細胞の周囲の新血管形成組織に、ヒト肝臓細胞によって生成されるＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項９または１０に記載の方法。
- ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象の目の網膜に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- 転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞または前記がん細胞の周囲の新血管形成組織に、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- 転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞または前記がん細胞の周囲の新血管形成組織に、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの治療有効量を送達することを含む方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが検出可能なＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
- ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
- ｎＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＤＭＥ、ＲＶＯ、病的近視またはポリープ様脈絡膜脈管障害と診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の目の網膜下空間に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
- 転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、α２，６−シアリル化グリカンを含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
- 転移性大腸がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、チロシン硫酸化を含有するＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを放出するデポーが形成されるように、前記ヒト対象の肝臓に、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターの治療有効量を投与することを含む方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭがＮｅｕＧｃもα−Ｇａｌも含有しない、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
- 前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭが、図１、図２、図３、図４、図７Ｃ〜７Ｈまたは図８Ｃ〜８Ｄの１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ８ウイルスベクターである、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えヌクレオチド発現ベクターがＡＡＶ．７ｍ８ウイルスベクターである、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
- ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ導入遺伝子を含むＡＡＶ８ウイルスベクターを製造する方法であって、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む核酸ベクターで安定して形質転換された宿主細胞を、前記ＡＡＶ８ウイルスベクターの生成に適切な条件下で培養することであって、前記発現カセットは、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において前記導入遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードする導入遺伝子を含み、前記ＡＡＶ８複製およびカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含む、こと；および前記宿主細胞によって生成される前記ＡＡＶ８ウイルスベクターを回収することを含む方法。
- ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを製造する方法であって、ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞において前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭの発現を制御する１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されている、前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された不死化ヒト網膜細胞または不死化ヒト肝臓細胞を培養することと、前記ヒト網膜細胞またはヒト肝臓細胞によって発現される前記ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＨｕＰＴＭを単離することとを含む方法。
- 組換えＡＡＶを生成する方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットは、網膜細胞または肝臓細胞において導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結されている、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐをコードする導入遺伝子を含む、人工ゲノム；
（ｉｉ）培養において宿主細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質の発現を駆動する発現制御エレメントに作動可能に連結されているＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタンパク質をコードし、トランスに前記ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を供給する、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いているトランス発現カセット；
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶカプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製およびパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
を含有する宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記人工ゲノムをカプシドに包んでいる組換えＡＡＶを細胞培養から回収することと
を含む方法。
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