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CN120203162A - 一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法及其应用 - Google Patents

一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法及其应用 Download PDF

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CN120203162A
CN120203162A CN202510567250.1A CN202510567250A CN120203162A CN 120203162 A CN120203162 A CN 120203162A CN 202510567250 A CN202510567250 A CN 202510567250A CN 120203162 A CN120203162 A CN 120203162A
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fermented feed
feed
lactobacillus reuteri
fermentation
fermented
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杨华
肖英平
陈雨诗
付乐乐
李延涛
马剑钢
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Xianghu Laboratory Agricultural Zhejiang Provincial Laboratory
Original Assignee
Xianghu Laboratory Agricultural Zhejiang Provincial Laboratory
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Abstract

本发明公开了一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法及其应用，属于动物饲料技术领域。本发明通过将玉米、豆粕、黄酒糟混合，添加乳酸片球菌、地衣芽孢杆菌及复合酶制得发酵饲料。本发明同时公开了一种体外评估方法，通过将发酵饲料与猪粪便悬液按1:1混合，接种至特定培养基厌氧培养后，检测乳酸菌及罗伊氏乳杆菌含量。本发明解决了传统发酵饲料菌群调控不精准、评估方法不足等问题，实现了饲料营养与动物健康的双重提升，具有显著的经济效益和应用价值。

Description

一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于动物饲料技术领域，具体涉及一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法及其在畜禽生产中的应用。
背景技术
生猪养殖业是关乎国计民生的重要产业，在我国占有非常重要的地位，猪肉是我国居民最主要的肉食品。但生猪养殖面临严峻挑战：非洲猪瘟疫情爆发以来，严重影响我国生猪养殖，在非洲猪瘟等生物安全下如何保障生猪健康尚无公认的最优方案；饲料全面禁抗后猪生长性能和免疫力降低，如何做到生猪绿色健康养殖；环保和绿色养殖压力持续增大，如何改善生猪养分减排等等。
现有技术存在以下问题：
菌群调控不精准：传统发酵饲料难以靶向促进特定益生菌（如罗伊氏乳杆菌）增殖，导致效果不稳定；
评估方法不足：缺乏快速、可靠的体外模型评估发酵饲料对肠道菌群的影响；
生产性能提升有限：发酵工艺未优化，抗营养因子降解不彻底，饲料利用率低。
公开专利CN111820329A提出了一种一种乳仔猪发酵饲料，但其菌种组合未针对罗伊氏乳杆菌调控，且未提供体外评估模型。因此，亟需一种能够精准调控肠道菌群、提升生产性能的发酵饲料技术。
肠道微生态与猪的生长和健康息息相关，在提高消化吸收，机体免疫等方面具有重要作用。近年来一些研究发现，发酵饲料可以调节猪的肠道微生态，可预防肠道菌群失调引发的疾病，改善猪生产性能。一方面，发酵饲料可能作为潜在的益生元，促进肠道有益菌的生长；另一方面，发酵饲料也提供益生菌群，影响了肠道微生物。但是发酵饲料与猪肠道微生物的因果关联性，以及如何精确调控等问题亟需解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵饲料制备方法及其应用，通过特定菌种组合及工艺优化，靶向促进猪肠道罗伊氏乳杆菌增殖，同时建立体外评估模型验证其效果，实现饲料营养与动物健康的双重提升。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
1、发酵饲料制备方法
原料配比：玉米、豆粕、黄酒糟按质量比4:4:2至4.5:4.5:1混合；优选的，原料按质量配比为玉米：豆粕：黄酒糟=4:4:2。
菌种添加：按发酵原料总质量的0.06%～0.10%添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，保藏号CGMCC NO: 1.12332），按0.10%～0.12%添加地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，保藏号CGMCC NO: 1.9048）；按0.1-0.2%添加复合酶，所述复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶，按质量比1：1：1混合；优选的，复合酶还可以包括α-淀粉酶，其与所述纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶，按质量比1：1：1：1混合；优选的，乳酸片球菌菌粉添加量为0.08%，地衣芽孢杆菌菌粉添加量为0.11%，复合酶添加量为0.15%。
发酵工艺：调节水分至35%～40%，30℃恒温静置发酵3天，至pH降至4.5以下，最终饲料中乳酸片球菌活菌数达4.7×108 CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数达5.3×108 CFU/g。
2、体外评估方法
取发酵饲料煮沸后与猪粪便样本按1:1体积比混合；优选的，发酵饲料与粪便的混合比例为2.5 mL发酵饲料溶液与2.5 mL粪便悬液。
接种至无菌培养基（配方：蛋白胨2g/L、酵母粉2g/L、吐温80 0.16g/L、NaHCO32g/L、NaCl 0.1g/L、K2HPO40.04g/L、CaCl20.01g/L、MgSO40.01g/L、血红素0.02g/L）；
37℃厌氧条件下以155 rpm振荡培养12～14小时，检测乳酸菌丰度及罗伊氏乳杆菌绝对含量。
3、生产应用
将发酵饲料按日粮总重的10%等质量替代玉米和豆粕，并添加1.0%～2.0%大豆油；
显著提升母猪采食量（6.16 kg/d vs. 5.76 kg/d）、降低背膘损失（1.28 mm vs.2.11 mm），提高仔猪断奶增重（4.33 kg vs. 3.92 kg），并降低腹泻率（1.05% vs. 1.57%）。
本发明的有益效果在于：
1、营养提升：发酵后粗蛋白由27.38%增至28.27%，酸溶蛋白由3.57%增至12.52%，抗营养因子（如大豆球蛋白）降低85.3%（表1）；
2、菌群调控：发酵饲料组母猪粪便中罗伊氏乳杆菌绝对含量提升2.5倍，体外发酵液中乳酸菌丰度增加40%；
3、生产性能优化：母猪乳蛋白含量由4.38%提升至4.92%，乳脂含量由6.57%提升至7.31%，仔猪日增重提高3.58%（表3）。
附图说明
图1为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料主成分分析（PCA）散点图，横轴为 Axis 1 (49.3%)，代表主成分 1，解释了 49.3% 的数据变异；纵轴为 Axis 2(32.2%)，代表主成分 2，解释了 32.2% 的数据变异；粉色圆点代表对照组，青色圆点代表发酵饲料组。
图2为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料微生物群落组成堆叠柱状图，其中不同颜色层叠表示各细菌属的相对丰度，底部图例明确了每种颜色对应的细菌属名称，后文详细描述。
图3为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料对生长猪肠道菌群的影响，主成分分析（PCA）图，其中横轴为主成分 1，即发酵饲料组，解释了 18.4% 的数据变异，体现样本在该维度上的主要差异方向；纵轴为主成分 2，即对照组，解释了 17.3% 的数据变异，是次重要的变异维度；红色圆点代表对照组，被粉色椭圆圈定，组内样本聚集，显示组内相似性；绿色圆点代表发酵饲料组，被绿色椭圆圈定，组内样本也呈聚集分布。
图4为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料对生长猪肠道菌群的影响，热度图，颜色标尺（Z - score）：左侧颜色条显示 Z - score 范围，红色（0.6）表示高丰度，蓝色（-0.2）表示低丰度；微生物分类：右侧列出微生物名称，包含属（g__）、科（f__）、纲（c__）级别；样本分布：横轴为样本名，CON系列为对照组，MFD 系列为发酵饲料组。
图5为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料对生长猪肠道菌群微生物群落相对丰度的柱状图，纵轴为 “Relative abundance”（相对丰度），每根柱中各颜色层的高度反映对应微生物类群在该组样本中的丰度占比。
图6为本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料在母、仔猪肠道微生物中富集图，其中纵轴：Relative abundance, %，表示相对丰度（百分比），横轴：包含两个类别，分别为 “母猪肠道 OTU 4417690” 和 “仔猪肠道 OTU 561796”，其中OTU表示操作分类单元，“*”和“***”分别表示显著和极显著。
图7本发明靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料母仔猪粪便及体外发酵液罗伊氏乳杆菌的绝对定量图，其中“∗”表示两组间存在显著差异。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
发酵饲料制备
取玉米、豆粕和黄酒糟原料按质量4:4:2的比例预混合；在温水中加入发酵原料总质量的0.08%的乳酸肠球菌菌粉和0.11%的地衣芽孢杆菌菌粉，发酵种子液，接入预混好的发酵原料和0.15%的复合酶，使总水分含量占发酵体系总质量的35%～40%，搅拌混匀；上述乳酸片球菌菌粉（Pediococcus acidilactici）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：1.12332；地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买，保藏号为CGMCC NO：1.9048，具有较好的产乳酸能力。复合酶包括α-淀粉酶，其与所述纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶，按质量比1：1：1：1混合。将上述发酵体系装入普通饲料袋中，30摄氏度恒温静置发酵3天，袋中饲料pH降至4.5时即可使用。
表1 发酵前后饲料营养成分变化
项目 发酵前 发酵后
干物质，% 89.45 89.95
粗蛋白，% 27.38 28.27
酸溶蛋白，% 3.57 12.52
中性洗涤纤维，% 15.02 7.95
抗性淀粉，% 4.99 2.31
大豆球蛋白，mg/g 57.47 8.46
pH 6.72 4.62
地衣芽孢杆菌，cfu·g−1 - 5.3×108
乳酸片球菌，cfu·g−1 - 4.7×108
由表1可知，发酵提高饲料粗蛋白、酸溶蛋白和益生菌含量，降低抗营养因子和pH，大豆球蛋白降解率达85.3%。
体外评估发酵饲料对菌群的影响
粪便体外发酵培养基的配制如表2。取1 g发酵饲料置于25 mL无菌培养基，煮沸10min。将0.1 g（杜×长×大）生长猪（40.69±1.16kg体重）粪便样本接种到5 mL无菌培养基中。随后取2.5 mL均质粪便悬液与2.5 mL发酵饲料溶液混合，在37℃厌氧条件下，摇床（155rpm）培养14 h。取发酵液1 mL，-80摄氏度冻存后进行16S微生物检测。
表2 体外发酵培养基配制
成分 1L体系用量
蛋白胨 2g
酵母粉 2g
吐温80 0.16g
NaHCO3 2g
NaCl 0.1g
K2HPO4 0.04g
CaCl2 0.01g
MgSO4 0.01g
血红素 0.02g
由图1可知，饲料发酵前后对体外发酵的猪肠道菌群结构影响显著不同，由图2可知，发酵饲料组中，“乳酸菌属（Lactobacillus）” 以特定颜色（粉色系）标识，在柱中占据一定比例，显示其在该组中的丰度情况。通过对比可见，两组微生物组成存在差异，直观呈现了发酵饲料对微生物群落结构的影响，便于分析两组样本中各类微生物的相对丰度变化，可知发酵饲料可以促进猪肠道乳酸菌丰度。
图中，Escherichia：埃希氏菌属；Methanobrevibacter：短杆菌属；YRC22、CF231、L7A_E11、0206为未知组；Lactobacillus：乳酸菌属；Oscillospira：颤螺菌属；Pedococcus：片球菌属；Bacteroides：拟杆菌属；Eubacterium：真杆菌属；Clostridium：梭菌属；Enterococcus：肠球菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Lactococcus：乳球菌属；Dorea：多尔氏菌属；Not_Assigned：未分配；Parabacteroides：副杆菌属；Sporosarcina：芽孢八叠球菌属；Desulfovibrio：脱硫弧菌属；Paenibacillus：类芽孢杆菌属；Streptococcus：链球菌属；Phascolarctobacterium：考拉杆菌属；Treponema：密螺旋体属；Coprococcus：粪球菌属；Turicibacter：苏黎世杆菌属；Adlercreutzia：阿德勒克罗伊茨氏菌属；Blautia：布劳特氏菌属；Prevotella：普雷沃氏菌属；Ruminococcus：瘤胃球菌属；Peptococcus：消化球菌属；Bifidobacterium：双歧杆菌属。
发酵饲料组母仔猪粪便绝对定量。提取母猪粪便样本基因组DNA，使用超微量核酸分析仪测定DNA样品浓度和质量。利用SYBR Green 实时PCR建立罗伊氏乳杆菌拷贝数标准曲线，PCR引物如下。反应体系包括2×Taq PCR Master mix 12.5 μl，粪便DNA样本1μl，上下游引物各0.5μl和无菌H2O 10.5μl，混合体系在95℃ 5min；95℃ 10s， 52℃ 50s，40个循环；95℃ 15s，62℃ 15s。根据标准曲线计算样本罗伊氏乳杆菌丰度。
引物 5’----3’：
Lreu-1F CAGACAATCTTTGATTGTTTAG；
Lreu-4R GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC
如图6和图7所示，将母、仔猪肠道微生物中乳酸菌均在发酵饲料组中富集，将乳酸菌中差异最大的OTU与NCBI数据库比对，发现均为罗伊氏乳杆菌。罗伊氏乳杆菌绝对含量由1.2×106 CFU/mL增至3.0×106 CFU/mL。为了验证组学的数据，利用细菌绝对定量发现，母仔猪粪便中的罗伊氏乳杆菌在发酵饲料组中富集。进一步利用对照组母猪粪便体外厌氧发酵，结果显示以发酵饲料为底物的体外发酵液中LR罗伊氏乳杆菌的绝对含量显著升高。因此，体内外相对丰度和绝对含量的结果共同表明了发酵饲料可以靶向调控猪肠道乳酸菌，特别是罗伊氏乳杆菌增殖，反映出发酵饲料对罗伊氏乳杆菌的富集具有促进作用。
母猪生产性能试验
本试验选用健康的长大二元母猪60头，按母猪预产期、胎次、膘情、遗传背景和繁殖成绩等原则随机分为2个处理组，每组30头，处理1为基础饲粮（对照组），处理2在基础饲粮中添加10%的发酵饲料。试验周期为母猪妊娠85天至仔猪断奶21天。各组饲粮的粗蛋白和消化能相同，满足NRC（2012）的营养要求，湿拌料形式饲喂。
表3. 发酵饲料对母猪生产性能的影响
由表3结果显示：
试验组母猪平均日采食量提升6.9%（6.16 kg/d vs. 5.76 kg/d）；
背膘损失降低39.3%（1.28 mm vs. 2.11 mm）；
乳蛋白含量提升11.6%（4.92% vs. 4.38%），乳脂含量提升11.3%（7.31% vs.6.57%）。
与对照组相比，10%发酵饲料可以显著提高母猪采食和仔猪断奶窝重，降低死胎率，显著提高母猪产奶量和乳蛋白含量。（a, b表示显著差异）。
由图3可知，两组样本在图中明显分离，表明对照组与发酵饲料组在分析的变量（如微生物群落组成、代谢物含量等）上存在显著差异。PCA 通过降维，将高维数据投影到低维平面，直观呈现组间差异与组内聚集性，便于快速判断不同处理组样本的分布特征与差异程度。对照组样本集中于左侧，发酵饲料组样本集中于右侧，尤其在主成分1 即发酵饲料组上区分明显，纵轴也有一定分离，进一步验证了两组的差异。
由图4可知，这是一张热图，用于展示对照组（CO1 - CO6）和发酵饲料组（MFD1 -MFD6）中不同微生物类群的标准化丰度（Z - score）；g__Lactobacillus：乳杆菌属、g__Succiniclasticum：琥珀酸菌属、f__WCHB1 - 25：WCHB1 - 25 科、c__GKS2 - 174：GKS2 -174 纲、f__Clostridiaceae：梭菌科、f__Enterobacteriaceae：肠杆菌科、g__Turicibacter：苏黎世杆菌属、g__Klebsiella：克雷伯氏菌属、g__Clostridium：梭菌属、g__SMB53：SMB53 属、f__Peptostreptococcaceae：消化链球菌科。
综上，发酵饲料可以显著改变猪肠道菌群结构，并促进母猪肠道乳酸菌丰度。
仔猪生产性能试验
本试验选用40日龄左右健康的（杜×长×大）生长猪216头，平均体重为9.25±0.78 kg，饲喂期24 d，于25 d称重并各组取6头体重相近的仔猪进行屠宰取样。试验动物随机分为2个处理组，每个处理6个重复（公母各半），每个重复18头猪。试验包含2种日粮，处理1为玉米豆粕型基础饲粮（对照组）；处理2用10%的发酵复合饲料等氮替代基础日粮中玉米和豆粕，不添加抗生素，营养水平与基础组日粮保证一致，颗粒料饲喂。
表4. 发酵饲料对仔猪生产性能的影响
项 目 对照组 10%发酵饲料 标准误 P值
初重，kg 9.29 9.24 0.35 0.72
末重，kg 19.02 18.95 0.92 0.34
平均日增重，g 391 405 19.11 0.09
平均日采食量，g 599 621 29.93 0.42
料重比 1.53 1.52 0.06 0.15
腹泻率，% 8.23 6.18 0.22 0.02
由表4可知，与对照组相比，10%发酵饲料组仔猪日采食量分别增加了3.67%；日增重分别提高了3.58%，料重比降低1.65%，同时有效控制仔猪腹泻。
由图5可知，对照组与发酵饲料组微生物群落相对丰度的柱状图。纵轴为“Relative abundance”（相对丰度），不同颜色代表不同微生物类群（如Actinobacillus、 Alloprevotella、Lactobacillus等）。对照组与发酵饲料组分别通过多根堆叠柱状条呈现，每根柱中各颜色层的高度反映对应微生物类群在该组样本中的丰度占比。通过对比可见，两组微生物组成存在差异，不同类群在两组中的丰度分布有所不同，直观呈现了发酵饲料对微生物群落结构的影响。发酵饲料可以显著促进仔猪肠道乳酸菌（乳杆菌）丰度。216头仔猪分为对照组与试验组，饲喂24天后：
试验组仔猪日增重提高3.58%（405 g/d vs. 391 g/d）；
腹泻率降低24.9%（6.18% vs. 8.23%）；
肠道乳酸菌丰度提升35%。
本发明可广泛应用于饲料企业及养殖场，用于制备高效发酵饲料，替代抗生素并提升动物健康水平。权利人合作的养殖场应用本发明后，母猪产仔数提高6%，仔猪成活率提升8%，饲料成本降低12%，验证了其经济性与实用性。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种靶向调控猪肠道罗伊氏乳杆菌的发酵饲料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.原料预混合：将玉米、豆粕与黄酒糟按质量比4:4:2至4.5:4.5:1混合；
b.菌酶添加：按发酵原料总质量的0.06%～0.10%添加乳酸片球菌Pediococcus acidilactici菌粉，按0.10%～0.12%添加地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis菌粉，所述乳酸片球菌保藏号为CGMCC NO: 1.12332，地衣芽孢杆菌保藏号为CGMCC NO: 1.9048，按0.1-0.2%添加复合酶，所述复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶，按质量比1：1：1混合；
c.发酵条件控制：将菌粉与原料混合后调节水分至总质量的35%～40%，装入饲料袋中，30℃恒温静置发酵3天，至pH降至4.5以下。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述原料按质量配比为玉米：豆粕：黄酒糟=4:4:2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述乳酸片球菌菌粉添加量为0.08%，地衣芽孢杆菌菌粉添加量为0.11%，复合酶添加量为0.15%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述复合酶还可以包括α-淀粉酶，其与所述纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶，按质量比1：1：1：1混合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述发酵饲料的pH降至4.5时终止发酵，饲料中乳酸片球菌活菌数达4.7×108 CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数达5.3×108 CFU/g。
6.一种体外厌氧发酵评估发酵饲料对猪肠道菌群影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：i.取权利要求1制备的发酵饲料煮沸后与猪粪便样本混合；ii.接种至无菌培养基中，所述培养基包含蛋白胨2g/L、酵母粉2g/L、吐温80 0.16g/L、NaHCO3 2g/L、NaCl 0.1g/L、K2HPO4 0.04g/L、CaCl2 0.01g/L、MgSO4 0.01g/L、血红素0.02g/L；iii在37℃厌氧条件下以155 rpm振荡培养12～14小时；iv检测发酵液中乳酸菌丰度及罗伊氏乳杆菌绝对含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤i中所述发酵饲料与粪便的混合比例为2.5 mL发酵饲料溶液与2.5 mL粪便悬液。
8.一种权利要求1-5任一所述发酵饲料在畜禽生产中的应用，其特征在于，将权利要求1所述发酵饲料按日粮总重的10%等质量替代玉米和豆粕，并添加1.0%～2.0%的大豆油。
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