CN108813107B

CN108813107B - 花生壳粉生物发酵饲料及其制备方法

Info

Publication number: CN108813107B
Application number: CN201810917275.XA
Authority: CN
Inventors: 相宏宇; 于剑; 谢秋宏; 潘通; 刁桃桃
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: CN108813107A

Abstract

本发明公开了一种花生壳粉生物发酵饲料及其制备方法，制备方法包括以下步骤：取植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别进行活化得到活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种和活化枯草芽孢杆菌菌种；将活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种和活化枯草芽孢杆菌菌种分别进行培养后混合得到复合菌剂；将复合菌剂稀释后与花生壳粉混合，调节水分含量混合均匀，发酵后得到花生壳粉生物发酵饲料。本发明通过微生物发酵作用，分解秸秆中难以被动物利用的粗纤维，提高秸秆适口性，提高饲料的营养价值。发酵过程中微生物代谢产生的乳酸，可以抑制腐生菌生长，延长饲料贮存期。

Description

花生壳粉生物发酵饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料加工领域，特别涉及一种花生壳粉生物发酵饲料及其制备方法。

背景技术

近年来，随着我国农业产业结构的不断调整，目前我国粮食和牧草产量不足，形成了“人畜争粮”的局面，随着中国人民对动物性食品数量和质量的需求，这一矛盾呈更加突出的趋势。利用生物技术、微生物发酵工程技术、饲料加工工艺技术等现代生物技术和饲料营养技术手段，提高存量资源的利用效率，开发非粮饲料资源是解决饲料资源严重短缺，缓解国家粮食安全的根本出路。

2015年全国主要农作物秸秆总产量达10.4亿吨，可收集资源为9.0亿吨，其中花生壳产量达500万吨。这些资源经过有效的加工，可以成为畜禽的良好饲料，能有效缓解“人畜争粮”的局面。

花生壳直接作为饲料存在的问题有：花生壳粗纤维含量高，饲喂适口性差，饲料消化率较低。本发明公开一种利用花生壳粉制备生物发酵饲料的方法，为农业废弃物的利用提供新的途径，为畜禽饲料提供新的品种。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种移动式动物呼吸代谢测定装置。所述技术方案如下：

一方面，花生壳粉生物发酵饲料的制备方法，包括以下步骤：

取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分别进行活化得到活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种和活化枯草芽孢杆菌菌种；

将活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种和活化枯草芽孢杆菌菌种分别进行培养后混合得到复合菌剂；

将复合菌剂稀释后与花生壳粉混合，调节水分含量混合均匀，发酵后得到花生壳粉生物发酵饲料。

进一步的，植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活化方法为：

取植物乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化植物乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到活化植物乳杆菌菌种；

取鼠李糖乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化鼠李糖乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到活化鼠李糖乳杆菌菌种；

取副干酪乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化副干酪乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到活化副干酪乳杆菌菌种；

取枯草芽孢杆菌接种于LB培养基37±1℃好氧活化培养12h-24h，挑取活化枯草芽孢杆菌单菌落接种在另一LB培养基，37±1℃好氧活化培养12h-24h，得到活化枯草芽孢杆菌菌种。

MRS培养基组成：1％蛋白胨，0.5％牛肉粉，0.4％酵母粉，2％葡萄糖，0.2％磷酸氢二钾，0.5％乙酸钠，0.2％柠檬酸三铵，0.02％硫酸镁，0.005％硫酸锰，0.1％吐温80；作固体培养基时加1.5％琼脂粉；pH 6.2，115℃高压灭菌30min。

LB培养基组成：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；作固体培养基时加1.5％琼脂粉；pH 7.0，121℃高压灭菌30min。

进一步的，活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种和活化副干酪乳杆菌菌种的培养方法为：

取活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种，分别接种于三个50ml的MRS液体培养基中，37±1℃厌氧培养24h，当600nm波长下测各定菌液的OD值为1时，分别得到植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和副干酪乳杆菌种子液；

取植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和副干酪乳杆菌种子液，以2％的接种量分别接种于三个MRS培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h-36h，分别得到植物乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌菌液和副干酪乳杆菌菌液。

进一步的，活化枯草芽孢杆菌菌种的培养方法为：

取活化枯草芽孢杆菌菌种，接种于LB液体培养基中，37±1℃，150rpm，好氧培养12h，当600nm波长下测定菌液的OD值为1时，得到枯草芽孢杆菌种子液；

取枯草芽孢杆菌种子液，以2％的接种量接种于LB培养基中，37±1℃好氧扩大培养12h-24h，得到枯草芽孢杆菌菌液。

进一步的，植物乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌菌液、副干酪乳杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液的混合比例为1:1:1:1。

进一步的，将复合菌剂稀释后与花生壳粉混合，具体为：将复合菌剂稀释至OD₆₀₀＝1，每吨花生壳粉中加入10升复合菌剂。

进一步的，复合菌剂与花生壳粉混合后的发酵条件为常温厌氧发酵30天。

进一步的，复合菌剂与花生壳粉混合后调节水分为65％。

进一步的，复合菌剂添加量为活菌数大于10⁹cfu/g。

另一方面，一种花生壳粉生物发酵饲料，采用上述方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明通过微生物发酵作用，分解花生壳中难以被动物利用的粗纤维(木质素，纤维素，半纤维素等)，在提高秸秆适口性的基础上，提高饲料的营养价值。发酵过程中微生物代谢产生的乳酸，可以抑制腐生菌生长，延长饲料贮存期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明花生壳粉发酵过程中微生物变化的PCR-DGGE图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

一、复合菌剂的制备

(1)培养基制备

乳酸细菌培养基(MRS培养基)：

取蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和琼脂粉15.0g加去离子水定容至1.0L，加热溶解，调节pH值至6.2，115℃高压灭菌30min。需要固体培养基时，在上述组成的基础上添加1.5％的琼脂粉。

细菌基础培养基(LB培养基)

取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl 10.0g，加去离子水溶解，用5.0mol/L的NaOH调节pH值至7.0，用去离子水定容至1.0L，在121℃蒸汽灭菌30min。需要固体培养基时，在上述组成的基础上添加1.5％的琼脂粉。

(2)菌种活化

各菌种采购自工业微生物菌种保藏管理中心及中国普通微生物菌种保藏管理中心，具体订购信息参见表1和表2。

表1中国工业微生物菌种保藏管理中心订购信息

表2中国普通微生物菌种保藏管理中心订购信息

取植物乳杆菌保藏菌种在MRS固体平板培养基划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到一次活化植物乳杆菌菌种。挑取一个一次活化单菌落，在一个新的MRS固体平板培养基中划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到二次活化植物乳杆菌菌种。

取鼠李糖乳杆菌保藏菌种在MRS固体平板培养基划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到一次活化鼠李糖乳杆菌菌种。挑取一个一次活化单菌落，在一个新的MRS固体平板培养基中划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到二次活化鼠李糖乳杆菌菌种。

取副干酪乳杆菌保藏菌种在MRS固体平板培养基划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到一次活化副干酪乳杆菌菌种。挑取一个一次活化单菌落，在一个新的MRS固体平板培养基中划线，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到二次活化副干酪乳杆菌菌种。

取枯草芽孢杆菌保藏菌种在LB固体平板培养基划线，37±1℃好氧活化培养12h-24h，得到一次活化枯草芽孢杆菌菌种。挑取一个一次活化枯草芽孢杆菌单菌落，在一个新的LB固体平板培养基中划线，37±1℃好氧活化培养12h-24h，得到二次活化枯草芽孢杆菌菌种。

(3)扩大培养

挑取一个二次活化植物乳杆菌单菌落，接种于50mL MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h，OD₆₀₀为1.0左右，得到植物乳杆菌种子液。

挑取一个二次活化鼠李糖乳杆菌单菌落，接种于50mL MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h，OD₆₀₀为1.0左右，得到鼠李糖乳杆菌种子液。

挑取一个二次活化副干酪乳杆菌单菌落，接种于50mL MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h，OD₆₀₀为1.0左右，得到副干酪乳杆菌种子液。

挑取一个二次活化枯草芽孢杆菌单菌落，接种于50mL LB液体培养基中，37±1℃，150rpm，好氧扩大培养12h，OD₆₀₀为1左右，得到枯草芽孢杆菌种子液。

(4)制备复合菌剂

取植物乳杆菌种子液，以2％接种量接种到MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h-36h，得到植物乳杆菌菌液。

取鼠李糖乳杆菌种子液，以2％接种量接种到MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h-36h，得到鼠李糖乳杆菌菌液。

取副干酪乳杆菌种子液，以2％接种量接种到MRS液体培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h-36h，得到副干酪乳杆菌菌液。

取枯草芽孢杆菌种子液，以2％接种量接种到LB液体培养基中，37±1℃好氧扩大培养12h-24h，得到枯草芽孢杆菌菌液。

取植物乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌菌液、副干酪乳杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，按体积比1:1:1:1的比例混合均匀，得到复合菌剂。

二、花生壳粉发酵饲料的制备

(1)花生壳粉的准备

取没有霉变的花生壳，经齿轮粉碎机进行预粉碎，然后再经锤式粉碎机粉碎。粉碎机筛网直径为1毫米。粉碎后的花生壳粉全部过40目筛网。

(2)复合菌剂稀释

花生壳粉与水的料水比为(w/v)：3.5:6.5，即每350公斤花生壳粉需要加水650公斤。复合菌剂接种量为大于10⁹cfu/g。在650公斤水中预先将复合菌剂调整到6×10⁵cfu/ml水。

(3)混料装袋发酵

取350公斤花生壳粉，通过混料机将650公斤复合菌剂稀释液进行混合，然后分装到厌氧发酵袋中，每袋装50公斤，封口后堆放，进行发酵。在常温下厌氧发酵30天，即得到花生壳粉生物发酵饲料。

三、育肥猪饲喂效果试验

(1)试验对象及地点：选择120头健康松辽黑猪为试验对象，体重在45-50公斤，随机分为四组，即对照组(饲喂育肥饲料)，试验组(在育肥饲料中混入花生壳粉发酵饲料，根据混入的花生壳粉发酵饲料量的不同，本试验组再分为三组)，每组30头猪；本实验在吉林省农业科学院畜牧科学分院畜牧研究所进行。

(2)育肥饲料组成：见表3。

表3育肥猪饲料配比表

序号	组成	比例(％)
			1	玉米	63.0
2	豆粕	7.5
			3	玉米蛋白粉	9.0
4	麸皮	15.0
			5	鱼粉	2.0
6	骨粉	0.5
			7	石粉	1.0
8	食盐	0.5
			9	预混料	1.5

(3)试验方式及时间：

各组试验用饲料配方见表4；按正常饲喂、自由觅食；实验期为35天。

试验指标：记录每组采食量、体重增加量、粪便情况。计算平均日增重、平均日采食量和饲料转化率。

平均日增重：分别于正式试验的第一天和试验最后一天早晨，逐头空腹称重，由末重与始重之差除以实验天数，计算各组猪的平均日增重。

平均日采食量：记录各组的投料量和剩料量，投料量减去剩料量再除以实验天数，算出平均日采食量。

饲料转化率：用各组猪的平均日采食量除以各组猪的平均日增重，即得出个各组猪饲料转化率。

粪便情况观察：观察粪便是否正常，如：有形(圆柱形)，有形(软便)，不成形(粘稠)等。

表4各试验组饲料组成表

(4)结果

1、花生壳粉发酵饲料分析结果

花生壳粉发酵前后相关成分分析对比结果见表5。发酵前原料的pH为4.9，发酵后为3.54；另外，发酵前没有检出乳酸，发酵后乳酸含量大于100mg/g发酵产品。发酵饲料的pH越低、乳酸含量越高，有利于饲料长期保存。

本发明通过微生物发酵作用，分解秸秆中难以被动物利用的粗纤维(木质素，纤维素，半纤维素等)，在提高秸秆适口性的基础上，提高饲料的营养价值。发酵过程中微生物代谢产生的乳酸，可以抑制腐生菌生长，延长饲料贮存期。

发酵后与发酵前相比，干物质、粗蛋白均有提高，而水溶性碳水化合物的含量明显降低，说明益生菌利用碳水化合物作为菌体繁殖和乳酸代谢的营养物质。发酵后乳酸菌的含量明显增加，这些益生菌对于调节动物肠稳态具有促进作用。我们也通过PCR-DGGE的方法检测了发酵过程中微生物多样性变化，如图1所示，A是PCR-DGGE的图谱，其中0代表接种前花生壳粉中的微生物情况，10、20、30分表示发酵第10天、20天和30天；B是利用软件分析的图A中含有的条带数量，其中0、10、20、30所表示的意义同图A。从图B可以直观地看出，随着发酵时间的延长，微生物多样性减少，结合表5种检测的结果，花生壳粉接种复合菌剂后发酵30天，产品中的微生物集中在乳酸菌，原料中的多数微生物得到有效抑制。

表5花生壳粉发酵前后相关成分对比分析结果

成分	发酵前原料含量	发酵后产品含量
			pH值	4.9±0.03	3.54±0.03
干物质(DM，％)	36.84±0.00	37.73±0.03
			粗蛋白(CP，％DM)	8.45±0.28	8.74±1.41
氨态氮/总氮	5.18±0.28	5.92±0.36
			水溶性碳水化合物(WSC，mg/g)	24.00±0.04	9.72±0.49
中性洗涤纤维(NDF，％DM)	65.03±0.74	61.61±3.29
			酸性洗涤纤维(ADF，％DM)	43.03±0.83	55.91±0.47
乳酸菌(cfu/g)	1.00×10<sup>6</sup>	1.95×10<sup>10</sup>
			酵母菌(cfu/g)	1.00×10<sup>3</sup>	4.79×10<sup>3</sup>
乳酸(mg/g)	-	103.25±0.11
			乙酸(mg/g)	-	2.43±0.69

2、饲喂试验结果

表6花生壳粉发酵饲料不同添加量对育肥猪的影响

组别	对照组	试验组1	试验组2	试验组3
					头数(头)	30	30	30	30
开始平均体重(kg)	50.61±0.21	49.56±0.12	49.80±0.17	50.60±0.15
					末平均体重(kg)	79.17±1.21	79.52±0.51	80.11±0.28	80.21±0.50
平均日增重(kg/头)	0.816±0.04	0.856±0.01	0.866±0.01	0.846±0.02
					平均日耗饲料(kg/头)	2.342	2.337	2.33	2.377
料肉比	2.87	2.73	2.69	2.81

表6中，试验组1，花生壳粉发酵饲料的添加量为6.3％，相当于替代玉米的10％；试验组2，花生壳粉发酵饲料的添加量为12.6％，相当于替代玉米的20％；试验组3，花生壳粉发酵饲料的添加量为18.6％，相当于替代玉米的30％；

各组育肥猪饲料采食效果良好，单次采食率高，饲喂35天后的统计结果发现，添加花生壳粉发酵饲料的试验组较对照组相比每头猪的平均日耗饲料量相差不大，总体料肉比较对照组低，其中试验组2的效果显著，试验组3与对照组无明显差异。

从每天观察的粪便情况发现，添加了花生壳粉发酵饲料的试验组，粪便成形良好、细腻且不坚硬；粪便量较对照组有减少，且无显著地臭味和氨味。

上述结果表明，本发明在育肥猪饲喂试验中效果良好，可以替代全价饲料中的玉米，并能够提高动物的采食率、降低料肉比、改善环境。说明本发明在提高畜禽免疫力、抗病力、促生长方面有显著作用，增加养殖效益。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种花生壳粉生物发酵饲料及其制备方法，优点如下：

1、成本低，利用花生壳粉制备发酵饲料节粮、环保；以农业副产物花生壳为主要发酵原料，无需加入其它辅助原料处理，只需将花生壳粉碎。

2、耗能低、投资少、无污染；本发明所用菌种易培养；发酵中利用农业副产物花生壳，减少了花生壳带来的环境问题；发酵过程中没有废水、废渣的排放，减少了环境污染。

3、改善饲料的适口性，提高饲料的营养价值；本发明中复合菌剂中含有植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌，四种菌剂均为饲料添加剂允许添加的微生物，发酵饲料质量安全。植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌在发酵中可以产生大量有机酸，改善饲料风味；枯草芽孢杆菌可以代谢产生多种消化酶，分解花生中不被消化的纤维素，提高饲料利用率；同时枯草芽孢杆菌可以合成多种维生素，增加饲料营养。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.花生壳粉生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述活化植物乳杆菌菌种、所述活化鼠李糖乳杆菌菌种、所述活化副干酪乳杆菌菌种和所述活化枯草芽孢杆菌菌种分别进行培养后混合得到复合菌剂；

将所述复合菌剂稀释后与花生壳粉混合，调节水分含量混合均匀，常温厌氧发酵30天得到花生壳粉生物发酵饲料，所述复合菌剂添加量为活菌数大于10⁹cfu/g；

所述植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活化方法为：

取植物乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化植物乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到所述活化植物乳杆菌菌种；

取鼠李糖乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化鼠李糖乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到所述活化鼠李糖乳杆菌菌种；

取副干酪乳杆菌，接种于MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，挑取活化副干酪乳杆菌单菌落接种在另一MRS培养基，37±1℃厌氧活化培养24h-36h，得到所述活化副干酪乳杆菌菌种；

取枯草芽孢杆菌接种于LB培养基37±1℃好氧活化培养12h-24h，挑取活化枯草芽孢杆菌单菌落接种在另一LB培养基，37±1℃好氧活化培养12h-24h，得到所述活化枯草芽孢杆菌菌种；

所述活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种和活化副干酪乳杆菌菌种的培养方法为：

取活化植物乳杆菌菌种、活化鼠李糖乳杆菌菌种、活化副干酪乳杆菌菌种，分别接种于三个MRS液体培养基中，37±1℃厌氧培养24h，当600nm波长下测各定菌液的OD值为1时，分别得到植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和副干酪乳杆菌种子液；

取所述植物乳杆菌种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和副干酪乳杆菌种子液，以2％的接种量分别接种于三个MRS培养基中，37±1℃厌氧扩大培养24h-36h，分别得到植物乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌菌液和副干酪乳杆菌菌液；

所述活化枯草芽孢杆菌菌种的培养方法为：

取枯草芽孢杆菌种子液，以2％的接种量接种于LB培养基中，37±1℃好氧扩大培养12h-24h，得到枯草芽孢杆菌菌液；

所述植物乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌菌液、副干酪乳杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液的混合比例为1:1:1:1。

2.如权利要求1所述的花生壳粉生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，将所述复合菌剂稀释后与花生壳粉混合，具体为：将所述复合菌剂稀释至OD₆₀₀＝1，每吨所述花生壳粉中加入10升所述复合菌剂。

3.如权利要求2所述的花生壳粉生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述复合菌剂与花生壳粉混合后调节水分为65％。

4.一种花生壳粉生物发酵饲料，其特征在于，采用权利要求1-3任一项的方法制备得到。