CN120059959A - 雨生红球藻km2-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及微生物技术领域，提供了一种雨生红球藻KM2‑1及其应用。本公开提供了一种雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2‑1，于2025年04月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2025704；本公开还提供了一种雨生红球藻KM2‑1在富集类胡萝卜素中的应用；本公开还提供了一种雨生红球藻KM2‑1在制备富含类胡萝卜素的制品中的应用。本公开提供的雨生红球藻KM2‑1对于光的胁迫具有较好的耐受性，能够在高强度的光的胁迫条件下促进类胡萝卜素的积累，从而更好地对类胡萝卜素进行富集。

Description

雨生红球藻KM2-1及其应用

技术领域

本公开涉及微生物技术领域，例如涉及一种雨生红球藻KM2-1及其应用。

背景技术

微藻是生物燃料、化妆品、药物、营养、食品添加剂以及水产养殖等优质原料，也可在农业中用作生物刺激剂和生物肥料和生物修复剂。部分微藻具有重要的高价值色素资源，例如类胡萝卜素。类胡萝卜素不仅具有多种健康益处，例如抗糖尿病、抗炎、营养保健和制药应用以及预防心血管疾病、某些类型的癌症和一些免疫系统疾病，而且还具有很强的抗氧化能力，可以防止过早衰老、紫外线辐射以及光氧化等。由于类胡萝卜素具有多种健康益处，其市场需求正在迅速增长。与类胡萝卜素积累相关的微藻由于其生长迅速、代谢活跃、生化前体/途径均衡，有望满足日益增长的增值生物产品市场需求。在环境压力下积累次级类胡萝卜素的微藻可能是天然类胡萝卜素的极好来源。世界范围内鼓励开发生产天然类胡萝卜素的微藻以供应用。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种常见的生存于淡水中的单细胞绿藻，因其能在高盐分、高温、高光强等非生物胁迫条件下大量积累类胡萝卜素（例如，虾青素）而备受广泛关注。然而，高强度的光胁迫条件虽然能够有效诱导雨生红球藻中类胡萝卜素（例如，虾青素）的含量提高，但同时也会限制雨生红球藻的生长。例如，在文献“高产虾青素的雨生红球藻胁迫条件和中试研究”中提到了对于雨生红球藻而言，光强在较低水平时可以提高虾青素在藻细胞中的含量，但是当光强超过8000 Lux时不仅会抑制藻细胞的生长还会损害其积累虾青素的能力。

综上所述，目前亟需一种对光胁迫具有较好的耐受性，从而能够在高强度的光的胁迫条件下更好地富集类胡萝卜素的雨生红球藻。

发明内容

本公开的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种雨生红球藻KM2-1及其应用，该雨生红球藻KM2-1对于光的胁迫具有较好的耐受性，能够在高强度的光的胁迫条件下促进类胡萝卜素的积累，从而更好地对类胡萝卜素进行富集。

一方面，提供一种雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2-1。所述雨生红球藻KM2-1于2025年04月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: M2025704。

另一方面，提供一种如上述实施例中任一项所述的雨生红球藻KM2-1在富集类胡萝卜素中的应用。

在一些实施例中，所述应用包括：将所述雨生红球藻KM2-1用于在光的胁迫条件下富集类胡萝卜素。

在一些实施例中，所述光包括蓝光和白光中的至少一种。

在一些实施例中，所述蓝光的波长范围为400~500 nm。

在一些实施例中，所述白光的波长范围为400~800 nm。

在一些实施例中，所述光的胁迫条件的光照强度为小于或等于600 μmol·m^-2·s^-1。

在一些实施例中，所述类胡萝卜素包括虾青素。

又一方面，提供一种如上述实施例中任一项所述的雨生红球藻KM2-1在制备富含类胡萝卜素的制品中的应用。

在一些实施例中，所述类胡萝卜素包括虾青素。

本公开的有益效果是：

本公开提供的一种雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2-1对于光的胁迫具有较好的耐受性，能够在高强度的光的胁迫条件下促进类胡萝卜素的积累，从而达到了更好地富集类胡萝卜素的效果。

生物保藏

本公开提供的一种雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2-1，于2025年04月03日保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），其保藏号为CCTCC NO: M 2025704，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，邮政编码为430072。

附图说明

图1为实施例3的第1部分中藻株的藻细胞的形态示意图；其中，A示出了藻细胞的形态变化过程，B示出了藻细胞的分裂变化过程；

图2为实施例3的第2部分中藻株的18S rRNA基因序列在NCBI数据库中的BLAST序列比对结果图；

图3为实施例3的第2部分中藻株的ITS基因序列在NCBI数据库中的BLAST序列比对结果图；

图4为实施例3的第2部分中藻株的tufA基因序列在NCBI数据库中的BLAST序列比对结果图；

图5为实施例3的第2部分中基于藻株的18S rRNA基因序列构建的邻接树；

图6为实施例3的第2部分中基于藻株的ITS基因序列构建的邻接树；

图7为实施例3的第2部分中基于藻株的tufA基因序列构建的邻接树；

图8为实施例4的第2部分中不同雨生红球藻的平板培养结果图；其中，A示出了F797的平板培养结果，B示出了F827的平板培养结果，C示出了KM2-1的平板培养结果；

图9为实施例5的第2部分中不同雨生红球藻在不同光照条件下生长的宏观表型图；其中，A示出了不同雨生红球藻在蓝光条件下生长的宏观表型图，B示出了不同雨生红球藻在白光条件下生长的宏观表型图；

图10为实施例6的第2部分中不同光质处理对KM2-1的藻液颜色和细胞颜色的影响结果图；

图11为实施例6的第2部分中KM2-1在不同光质处理下的生长曲线图；

图12为实施例6的第2部分中KM2-1在不同光质处理下培养第7天时的生物量结果图；

图13为实施例7的第2部分中KM2-1在不同光质处理下的光合效率结果图；其中，A示出了KM2-1细胞的叶绿素荧光效果的变化，B示出了KM2-1的最大光化学效率的变化，C示出了KM2-1的实际光化学效率的变化；

图14为实施例8的第2部分中不同光质处理对KM2-1的藻细胞中色素含量的影响结果图；其中，A示出了叶绿素a含量的变化，B示出了叶绿素b含量的变化，C示出了总类胡萝卜素含量的变化；

图15为实施例9的第2部分中不同光质处理对KM2-1的藻细胞中类胡萝卜素含量的影响结果图；其中，A示出了叶黄素含量的变化，B示出了β-胡萝卜素含量的变化，C示出了虾青素含量的变化，D~G分别示出了第9天的空白处理组、蓝光处理组、白光处理组以及黑暗处理组的高效液相色谱峰图。

具体实施方式

下面将对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

除非上下文另有要求，否则，在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”被解释为开放、包含的意思，即为“包含，但不限于”。

在描述一些实施例时，可能使用了“A和/或B”的表达。容易理解的是，“A和/或B”包括以下三种组合：仅A，仅B，以及A和B的组合。

在描述一些实施例时，可能使用了“A、B和C中的至少一种”与“A、B或C中的至少一种”的表达，两者具有相同含义，均包括以下A、B和C的组合：仅A，仅B，仅C，A和B的组合，A和C的组合，B和C的组合，及A、B和C的组合。

实施例1 培养基

1. BG-11培养基，其组成为：NaNO₃ 1.500 g/L、K₂HPO₄ 0.030 g/L、MgSO₄·7H₂O0.075 g/L 、Na₂CO₃ 0.020 g/L 、柠檬酸 0.006 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036 g/L 、柠檬酸铁铵 0.006 g/L 、EDTA·2Na 0.001 g/L、微量元素1 mL；

其中，微量元素的组成为：H₃BO₃ 2.860 g/L、MnCl₂·4H₂O 1.810 g/L、ZnSO₄·7H2O0.222 g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.390 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.079 g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.049 g/L。

2. BG-11液体培养基，其组成为：ddH₂O 1 L、BG-11培养基 1.7 g、无水乙酸钠1.5g。

3. BG-11固体平板，其组成为：ddH₂O 1 L、BG-11培养基 1.7 g、无水乙酸钠1.5g、琼脂15 g。

实施例2 藻种的采集、分离、培养以及纯化

1. 藻种的采集

于2024年01月12日采用孔径64 μm（200目）的浮游植物网从云南省昆明市石林彝族自治县石林风景名胜区（东经103°32′76′′，北纬24°81′61′′）采集水样。

2. 藻种的活化

将采集的水样转移至15 mL离心管静置1~2 h，轻轻去掉大部分上清，保留底部2~3mL液体，充分混匀后在温度为25±1℃、转速为100~180 rpm的条件下摇床培养6 h以充分活化样品。

3. 藻种的分离和培养

吸取10 μL活化后的样品滴于载玻片上，在显微镜下观察确认含有疑似目标藻种细胞后，采用毛细管虹吸分离法在显微镜下挑取单个细胞，反复进行吸取、镜检以及稀释，直到水滴中只含单个目标藻种细胞，再转移至含有100 μL BG-11液体培养基（不含抗生素）的96孔板中静置培养，光暗周期为12 h/12 h，光照强度为20~30 μmol/m^-2/s^-1，培养温度为25±1℃，静置培养期间根据情况适当补充BG-11液体培养基至100 μL左右。

4. 藻种的纯化

将单个目标藻种细胞静置培养20~30 d后镜检藻种生长状况。若藻细胞生长良好，则梯度稀释成10⁰、10^-1、10^-2及10^-3的浓度充分混匀，从每个梯度稀释液中分别吸取200 μL涂布在含有50 mg/L氨苄青霉素（Amp⁵⁰⁺）、50 mg/L卡那霉素（Kan⁵⁰⁺）及100 mg/L头孢霉素（Cef¹⁰⁰⁺）的BG-11固体平板上，将平板置于恒温光照培养箱中倒置培养，光暗周期为12 h/12 h，光照强度为10~30 μmol/m^-2/s^-1，培养温度为23±1℃，倒置培养7~15 d至单藻落长出，观察平板单藻落及杂菌生长情况。若平板有明显杂菌，则挑取单藻落至200 μL BG-11液体培养基（含有Amp¹⁰⁰⁺、Kan⁵⁰⁺、Cef¹⁰⁰⁺）吸打混匀，梯度稀释成10^-1和10^-2浓度充分混匀，重新涂布于BG-11固体平板（还含有Amp¹⁰⁰⁺、Kan⁵⁰⁺、Cef¹⁰⁰⁺）上培养。通过多次涂板纯化藻种，直至平板和单藻落均无明显杂菌，则挑取单藻落至BG-11液体培养基（含有Amp²⁵⁺、Cef⁵⁰⁺），按照1:10的比例接种逐级扩大培养，培养温度为25±1℃，培养转速为150~180 rpm，光暗周期为12 h/12 h，光照强度为30~50 μmol/m^-2/s^-1，得到藻株的藻液，从而为后续的步骤储备藻细胞。

实施例3 藻株的鉴定和保藏

1. 藻株的形态观察

首先收集处于不同生长时期的藻株的藻液，吸取10 μL滴至干净的载玻片上，随后将载玻片放置于倒置显微镜载物台上，在合适的放大倍数下，仔细观察藻细胞的形态特征，并使用显微镜配套的图像采集设备进行拍照记录。

通过倒置显微镜下观察到藻株在不同时期的单个细胞的形态特征，结果如图1所示。

其中，如图1的A所示，藻株在不同生长时期内，其细胞形态会有所不同：在生长初期会有两条鞭毛和透明的细胞壁，可自由游动，此时称为游动孢子；随着培养时间的增加，鞭毛会逐渐退去，细胞形态呈球形且细胞壁变厚，转变为不动细胞；前期细胞生长旺盛，繁殖速度较快，细胞内不含虾青素或含量极低，此时为绿色细胞；在绿色营养阶段施加光照等胁迫条件，细胞会由中间开始变红，逐渐转变为红色不动孢子，大量积累虾青素。

此外，如图1的B所示，其中的1~5分别为藻株的未分裂细胞、二分裂细胞、四分裂细胞、八分裂细胞以及十六分裂细胞，说明该藻株具有较高的繁殖速度。

2. 藻株的分子鉴定

将纯化后的藻株5000 rpm离心5 min收集藻体，用无菌水多次重悬浮去除液体培养基，收集藻体进一步进行分子鉴定。采用天根生化科技有限公司的多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（货号：DP360），按照说明书操作提取藻株的基因组DNA；采用New EnglandBiolabs公司Q5® High-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增。

50 μL的PCR反应体系为：藻株的基因组DNA 2 μL、5×Q5® Reaction Buffer 10μL、2.5 mM dNTP 4 μL、10 μM上下游引物各2.5 μL、Q5® High-Fidelity DNA Polymerase0.5 μL、ddH₂O 28.5 μL。

采用内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、18S核糖体RNA（18Sribosomal RNA gene，18S rRNA）以及翻译延伸因子（translation elongation factorTu，tufA）三个基因进行PCR分子鉴定，反应条件为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延长2 min。

其中，分子鉴定引物有三对，分别为：

1）扩增ITS区域的上游引物5’-GCGGAGGGATCATTGAATCTATC-3’和下游引物5’-AGTACATGGGGTAGGGGCCTGTTT-3’；

2）扩增18S rRNA区域的上游引物5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’和下游引物5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’；

3）扩增tufA区域的上游引物5’-TGAAACAGAAMAWCGTCATTATGC-3’和下游引物5’-CCTTCNCGAATMGCRAAWCGC-3’。

将PCR扩增18S rRNA区域、ITS区域以及tufA区域分别得到的产物用Takara胶回收试剂盒回收和纯化，并送生工生物工程（上海）股份有限公司成都分公司进行测序，将测序结果分别提交至美国国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）数据库进行Nucleotide BLSAT序列比对，结果分别如图2~4所示。可以发现，18S rRNA区域对应的产物、ITS区域对应的产物以及tufA区域对应的产物的基因测序结果与雨生红球藻（Haematococcus lacustris）对应序列覆盖度（Query Cover）分别为100%、98%、100%，一致度（Per. Ident）分别为100%、99.72%、100%，且E值（E value）均为0。

其中，该藻株的18S rRNA、ITS以及tufA的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2以及SEQ ID No.3所示，该藻株的18S rRNA、ITS以及tufA的基因序列的联合邻接法进化树分别如图5~7所示，该藻株的18S rRNA、ITS以及tufA的基因序列的NCBI登录号分别为PV259193.1、PV259852.1以及PV290084.1。

分析表明，该藻株与雨生红球藻（Haematococcus lacustris）处于同一进化分支。

3. 藻株的保藏

综合形态观察和分子鉴定的结果分析，本实施例得到的藻株为雨生红球藻属（Haematococcus lacustris），将该藻株命名为雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2-1，于2025年04月03日保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center for TypeCulture Collection，CCTCC），保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为CCTCC NO: M 2025704。

实施例4 不同雨生红球藻的比较

1. 实验方法

分别将处于同一生长期（此处为稳定期）的雨生红球藻KM2-1、雨生红球藻FACHB-797（简称为F797，购买自中国科学院淡水藻种库）以及雨生红球藻FACHB-827（简称为F827，购买自中国科学院淡水藻种库）的藻液同时进行平板划线处理。培养1~2个月后，观察平板上各个藻株的藻落的数量、形状、大小以及颜色等。与此同时，使用倒置显微镜，直接观察藻细胞的形态和结构完整性；其中，活性高的细胞形态通常呈正圆形，具有完整的细胞壁和细胞膜；活性受损的细胞可能会出现细胞皱缩和破裂等现象。

2. 实验结果

如图8所示，每组平板上的藻落数量、形状、大小及颜色各不相同；如图8的A和B所示，F797和F827藻落形状不规则，颜色变红，且在显微镜下观察到藻细胞变红，部分细胞出现死亡；如图8的C所示，KM2-1藻落形状呈规则的圆形，颜色呈绿色，且在显微镜下观察到藻细胞形态结构完整，未受到胁迫而变红。

综上所述，KM2-1的细胞活性及抗逆性显著优于其他雨生红球藻。

实施例5 不同雨生红球藻藻株对不同光质的响应

1. 实验方法

1.1 预培养

采用平板划线法（方法同实施例2的第3部分）分别将雨生红球藻KM2-1、雨生红球藻FACHB-712（简称为F712，购买自中国科学院淡水藻种库）、雨生红球藻FACHB-797（简称为F797，购买自中国科学院淡水藻种库）、雨生红球藻FACHB-827（简称为F827，购买自中国科学院淡水藻种库）以及雨生红球藻FACHB-872（简称为F872，购买自中国科学院淡水藻种库）进行分离纯化。平板上分离纯化的微藻培养物接种到无菌的100 mL锥形瓶中，瓶中加入40mL BG-11液体培养基，放置在人工气候箱中进行培养（培养条件：白光强度为20 μmol·m^-2·s^-1、培养温度为23℃、光暗周期为24 h/0 h），每天摇瓶3次；培养7 d后依次转接至250mL锥形瓶、500 mL锥形瓶进行扩大培养，放置在白光强度为50 μmol·m^-2·s^-1、培养温度为25±1℃、光暗周期为12 h/12 h、转速为150rpm的振荡培养箱中培养7~10d，注意每次转接前使用倒置显微镜确认藻液是否干净无污染。

1.2 光质筛选

将各个雨生红球藻的藻液在倒置显微镜下观察，确定细胞状态是否一致。确定细胞状态后，锥形瓶静置2 h，倒掉瓶中的上清液，将沉淀转移至无菌的新锥形瓶中，加入新配置的BG-11液体培养基，调整液体量，使藻液初始OD₆₈₀=0.5±0.05。然后将调整好的藻液依次分装至100mL锥形瓶中，每瓶液体量V=50±2 mL。将100 mL锥形瓶放置在带有冷光源（MGC-250-LED，宁波普朗特）的震荡培养箱中培养，除了光照强度和光质不同，其他培养条件同上述振荡培养箱条件一致。蓝光和白光的振荡培养箱的光照强度和光照波长由光谱彩色照度计（PLA-30，杭州）检测，蓝光和白光的光照强度均为600 μmol·m^-2·s^-1，蓝光的波长为400~500 nm，白光（由多种波长的光混合而成）的波长为400~800 nm。每个处理3个平行实验。在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的同一时间点拍照记录藻液的颜色变化。

2. 实验结果

上述6种雨生红球藻在蓝光条件和白光条件下生长的宏观表型如图9所示。如图9的A所示，在蓝光条件的处理下，F712和F872在第2天藻细胞就出现大量死亡；F797和F827的表型虽优于前两组，但在培养结束时，藻液颜色明显逊色于KM2-1的红色；经倒置显微镜观察，F797和F827也出现大量细胞死亡，而KM2-1不仅死细胞数量远少于F797和F827，而且细胞颜色及细胞状态也优于F797和F827。如图9的B所示，在白光条件的处理下，除F827和KM2-1以外，其他组在培养结束时均出现大量细胞死亡，藻液颜色呈白色；KM2-1的藻液颜色显著优于F827，且在倒置显微镜下观察到F827的死细胞数量明显多于KM2-1。

综上所述，KM2-1的总体表型显著优于其他雨生红球藻，抗逆性最强。

实施例6 不同光质对雨生红球藻KM2-1藻细胞生长的影响

1. 实验方法

1.1 预处理

分别在黑暗条件、白光条件以及蓝光条件下对雨生红球藻KM2-1的藻液进行处理，在黑暗条件下的处理是将锥形瓶瓶身用锡箔纸包住并放置在白光的振荡培养箱中，在白光条件和蓝光条件下的处理方法同实施例5的第1部分。每个处理3个平行实验。在0 d、1 d、3d、5 d、7 d、9 d的同一时间点吸取适量藻液，进行各项生理生化指标的测定。

1.2 藻细胞的形态观察

每组在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一时间点吸取适量藻液，制片，置于倒置显微镜下观察藻细胞状态，并使用电脑配套的显微成像系统拍照记录，同时使用相机拍照记录锥形瓶中藻液的宏观表型。

1.3 藻细胞的细胞密度的测定

每组在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一时间点吸取200 μL藻液于96孔透明孔板中（吸取前摇匀，防止藻细胞沉淀，测量结果不准），使用酶标仪测量雨生红球藻KM2-1在680nm处的光密度（即OD₆₈₀），并绘制生长曲线。同时，每组还需吸取200 μL藻液于96孔黑色不透明孔板中，以备后续进行叶绿素荧光参数的测定。

1.4 藻细胞的鲜重和干重的测定

1.4.1 鲜重的测定

在第7天时，准备适量的50 mL离心管，使用万分之一电子天平称量管重，即W₁，精确到小数点后四位。然后分别吸取40 mL藻液于50 mL离心管（已提前称量管重）中，在4℃和4000 rpm的条件下离心5 min，收集藻细胞。用PBS缓冲液洗涤藻细胞2~3次，最后一次用吸水纸尽量将水分吸取干净。然后再次使用万分之一电子天平称量管重，即W₂，精确到小数点后四位。最后得到细胞鲜重=W₂-W₁。

1.4.2 干重的测定

将收集到的藻细胞置于冻干机中，干燥72 h。干燥完成后，再次使用万分之一电子天平称量管重，即W₃，精确到小数点后四位。最后得到细胞干重=W₃-W₁。

2. 实验结果

2.1 不同光质对藻细胞的形态的影响

如图10所示，不同光质处理条件下，藻液颜色及细胞颜色随培养时间延长发生明显变化。培养第3天时，蓝光处理组和白光处理组的藻液颜色呈褐色，且蓝光处理组的褐色表型比白光处理组的更显著，黑暗处理组的藻液颜色仍呈绿色；与此同时，蓝光处理组和白光处理组的细胞颜色开始变红，黑暗处理组的细胞颜色仍呈绿色。培养第5天时，蓝光处理组和白光处理组的藻液颜色转变为红褐色，且黑暗处理组的藻液颜色仍呈绿色。培养第7天时，蓝光处理组和白光处理组的藻液颜色呈红色，且蓝光处理组的红色表型比白光处理组的更显著，黑暗处理组的藻液颜色仍呈绿色；与此同时，蓝光处理组和白光处理组的细胞颜色呈现红色加深现象，黑暗处理组的细胞颜色仍呈绿色。

以上结果表明，蓝光确实更加有利于雨生红球藻KM2-1的虾青素的积累。

2.2 不同光质对藻细胞的密度的影响

如图11所示，蓝光处理组和白光处理组的藻细胞的生长情况总体呈现先下降后上升趋势，可能是初期藻细胞分别受到强蓝光和强白光的胁迫，造成光合作用过程不同程度的损伤，使藻细胞因光氧化损伤而出现部分细胞死亡；但在第7天时，可能是虾青素的大量积累使得细胞生长情况有所恢复，出现回升。总体而言，对于雨生红球藻KM2-1而言，蓝光培养下的生长情况优于同一时间段白光培养下的生长情况。

黑暗处理组的藻细胞的生长情况总体呈现先升后降趋势，符合微生物生长特征的“S”型生长曲线。一般来讲，以分裂方式进行无性繁殖的微藻等微生物，接种到适应的液体培养基中，生长曲线会出现四个阶段：缓慢生长期、对数增长期、稳定期和凋亡期。本实验是以1:10的比例进行藻液接种，因此，没有出现缓慢生长期。在第5天时，经倒置显微镜观察到黑暗处理组出现细胞凋亡，因此后期生长情况出现下降趋势。

2.3 不同光质对藻细胞的生物量的影响

如图12所示，培养第7天时，黑暗处理组的细胞鲜重和细胞干重最高，蓝光处理组的细胞鲜重和细胞干重次之，白光处理组的细胞鲜重和细胞干重最低，但三组间差异不显著（p>0.05）。通过细胞鲜重和细胞干重的测定同时得到了不同光质处理下的细胞含水量，蓝光处理组的细胞含水量为84.5%，白光处理组的细胞含水量为85%，黑暗处理组的细胞含水量为85.5%，三组间差异不显著（p>0.05），不同光质处理并不影响细胞含水量的变化。

实施例7 不同光质对雨生红球藻KM2-1藻细胞光合效率的影响

1. 实验方法

1.1 预处理

同实施例6的第1部分。

1.2 光系统II的最大光化学效率的测定

使用叶绿素荧光成像系统（MAXI-IMAGING-PAM，WALZ，Germany）用于评估藻类光合作用特性。样品被彻底混合后用移液枪吸取200 µL悬浮液加入到黑色96孔板的孔中。将96孔黑色不透明孔板置于仪器检测平台的中间位置，经过5 min的暗适应后，调整测量光（Meas.Light），点击“Fo.Fm”按钮，得到光系统II的最大光化学效率，即Fv/Fm。

1.3 光系统II的实际光化学效率的测定

完成Fv/Fm的测定后，对藻细胞进行5 min的光适应，然后点击“SAT-Pulse”按钮，在光适应下对植物进行饱和脉冲光冲击，得到光系统II的实际光化学效率，即Y(II)。

2. 实验结果

如图13的A所示，雨生红球藻KM2-1的Fv/Fm和Y(II)的叶绿素荧光的变化趋势为：第1天时，雨生红球藻KM2-1在蓝光和白光下Fv/Fm和Y(II)的叶绿素荧光发生骤降，可能是初期强蓝光和强白光的处理对藻细胞造成了损伤，从而影响了细胞的光化学效率；随着培养天数的增加，蓝光处理组的Fv/Fm和Y(II)的叶绿素荧光逐步恢复，白光处理组的Fv/Fm和Y(II)的叶绿素荧光在第5天检测不到，在第7天荧光有所恢复；与此同时，随着培养天数的增加，黑暗处理组的Fv/Fm和Y(II)的叶绿素荧光呈平稳下降趋势。

如图13的B所示，雨生红球藻KM2-1的Fv/Fm的变化趋势为：第1天时，雨生红球藻KM2-1在蓝光和白光下Fv/Fm值发生骤降，可能是初期强蓝光和强白光的处理对藻细胞造成了损伤，从而影响了细胞的光化学效率；随着培养天数的增加，蓝光处理组的Fv/Fm值以稳定速率递增至0.35，白光处理组的Fv/Fm值在第5天递减至0并在第7天恢复至0.18，但在培养期间蓝光处理组的Fv/Fm值始终高于白光处理组；与此同时，随着培养天数的增加，黑暗处理组的Fv/Fm值呈平稳下降趋势，在第7天递减至0.35。

如图13的C所示，雨生红球藻KM2-1的Y(II)的变化趋势为：培养前3天，雨生红球藻KM2-1在蓝光和白光下Y(II)值也发生骤降；随着培养天数的增加，蓝光处理组的Y(II)值平稳递增至0.15，白光处理组的Y(II)值在第5天递减至0并在第7天恢复至0.1，但在培养期蓝光处理组的Y(II)值优于白光处理组；与此同时，随着培养天数的增加，黑暗处理组的Y(II)值呈平稳下降趋势，第7天递减至0.04。

实施例8 不同光质对雨生红球藻KM2-1藻细胞叶绿素a、b和总类胡萝卜素含量的影响

1. 实验方法

1.1预处理

同实施例6的第1部分。

1.2 叶绿素a、b和总类胡萝卜素含量的测定

每组在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一时间吸取8 mL藻液于15 mL离心管中，5000 rpm离心5 min，倒掉部分上清液，保留大约2 mL左右的藻液，随后将藻液转移至提前称好重量的2mL离心管中，加入ddH₂O定容至同一液面，6000 rpm离心5 min，倒掉上清（在该步需要用吸水纸去除水分），再次测量离心管重量，计算藻样鲜重（即两次离心管重量之差）。向2 mL离心管中加入三颗钢珠，放入组织研磨仪中60 Hz处理30 s，重复3次，使细胞充分研磨破碎；破碎完全后用3 mL甲醇溶液分3次清洗2 mL离心管（确保清洗干净），转移至5mL离心管中，合并提取液，继续加入甲醇定容至4 mL；超声提取10 min（向底部容器加入一定量的冰控制提取温度），设定仪器功率为60%，最高温度25℃；超声完成后将提取液放置常温黑暗条件静置2~4 h，随后8000 rpm离心5 min，藻渣至底部（该步骤应观察到藻渣为白色，代表色素提取完全），吸取200 μL上清液于黑色不透明96孔板中，使用酶标仪测定470nm、653 nm、666 nm处的吸光度值A₄₇₀、A₆₅₃、A₆₆₆，计算色素含量公式如下：

2. 实验结果

雨生红球藻细胞色素含量随培养时间的变化如图14所示。从图14的A~B可以看出，蓝光处理组和白光处理组的藻细胞叶绿素a、b发生降解，二者含量随培养时间的延长呈显著下降趋势，第7天藻细胞内叶绿素a、b含量变化趋于稳定；而黑暗处理组的叶绿素a、b含量随培养时间的延长基本保持不变。与此同时，从图14的C可以看出，蓝光处理组和白光处理组的藻细胞总类胡萝卜素含量随培养时间的延长呈显著递增趋势，且培养结束时蓝光处理组的总类胡萝卜素含量明显高于白光处理组；黑暗处理组的总类胡萝卜素含量随培养时间的延长略有增加。

结果表明，强蓝光和强白光对雨生红球藻KM2-1的生长形成胁迫，并造成了一定程度的光损伤，但此时藻细胞内总类胡萝卜素含量的提高可能与虾青素的大量合成有关。

实施例9 不同光质对雨生红球藻KM2-1藻细胞类胡萝卜素含量的影响

1. 实验方法

1.1 预处理

同实施例6的第1部分。

1.2 类胡萝卜素含量的测定

每组在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一时间离心收集一瓶藻液于50 mL离心管中，4000 rpm离心5 min；液氮速冻后，立刻放入冷冻干燥机中，冷冻干燥3d，从而获得冷冻干燥的藻粉。称取冷冻干燥的藻粉50±5 mg，参照国家标准（GB/T 311520-2015）提取虾青素等类胡萝卜素，采用HPLC-DAD和LC-QTOF-MS进行类胡萝卜素的检测，参照标准品进行定量。标准品购自Sigma-Aldrich公司。

2. 实验结果

如图15的A~C所示，在雨生红球藻KM2-1中，β-胡萝卜素与叶黄素的变化趋势一致，而虾青素则与叶黄素和β-胡萝卜素的变化趋势完全相反。

如图15的A所示，蓝光处理组和白光处理组的雨生红球藻KM2-1中叶黄素的含量随培养时间的延长呈显著下降趋势，第7天藻细胞内叶黄素的含量变化趋于稳定；而黑暗处理组的叶黄素的含量随培养时间的延长基本保持不变。

如图15的B所示，蓝光处理组和白光处理组的β-胡萝卜素的含量随培养时间的延长呈显著下降趋势，第7天藻细胞内β-胡萝卜素的含量变化趋于稳定；而黑暗处理组的β-胡萝卜素的含量随培养时间的延长略有下降。

如图15的C所示，蓝光处理组和白光处理组的虾青素的含量随培养时间的延长呈显著增长趋势，且培养结束时蓝光处理组的虾青素的含量明显高于白光处理组；而黑暗处理组的虾青素的含量随培养时间的延长基本保持不变。

需要说明的是，图15的D~G分别为第9天的空白处理组、蓝光处理组、白光处理组以及黑暗处理组的高效液相色谱峰图；其中，1代表虾青素，2代表叶黄素，3代表β-胡萝卜素。

Claims (10)

1.一种雨生红球藻（Haematococcus lacustris）KM2-1，其特征在于，所述雨生红球藻KM2-1于2025年04月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: M2025704。

2.一种如权利要求1所述的雨生红球藻KM2-1在富集类胡萝卜素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：

将所述雨生红球藻KM2-1用于在光的胁迫条件下富集类胡萝卜素。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述光包括蓝光和白光中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蓝光的波长范围为400~500 nm。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述白光的波长范围为400~800 nm。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述光的胁迫条件的光照强度为小于或等于600 μmol·m^-2·s^-1。

8.根据权利要求2~7中任一项所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素包括虾青素。

9.一种如权利要求1所述的雨生红球藻KM2-1在制备富含类胡萝卜素的制品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素包括虾青素。