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TWI589693B - 克萊曼都普帝藻（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｏｄｉｕｍ ｓｐ.）及其用途 - Google Patents

克萊曼都普帝藻（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｏｄｉｕｍ ｓｐ.）及其用途 Download PDF

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TWI589693B
TWI589693B TW105115081A TW105115081A TWI589693B TW I589693 B TWI589693 B TW I589693B TW 105115081 A TW105115081 A TW 105115081A TW 105115081 A TW105115081 A TW 105115081A TW I589693 B TWI589693 B TW I589693B
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俞銘誠
邱士詮
鍫景瑜
江尹玲
劉意如
董志宏
林志強
朱燕華
簡美枝
黃英娥
廖麗玲
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財團法人食品工業發展研究所
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Description

克萊曼都普帝藻( CHLAMYDOPODIUM SP.)及其用途
本發明係關於新穎克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)分離株，該分離株可在不同材質上生長形成生物膜，且可利用生物膜培養模式進行培養，以減少對水資源及土地的需求，並簡化採收流程，降低採收成本。該分離株可產生高量的三酸甘油酯，可做為生產生質柴油及食用油的原料。
自18世紀工業革命以來，人類對石化能源的需求與日俱增，然而石化能源之天然蘊藏量有限，因此逐漸需要尋求新的替代能源。第一代生質能源係以甘蔗、甜菜、玉米、大豆等糧食作物做為原料，利用水解、發酵及轉酯化(transesterification)等技術來製造生質能源，但會造成農耕地需求上升、糧食作物價格上昂等問題；第二代生質能源係以稻桿、玉米桿、木屑及蔗渣等非糧食作物為原料，利用纖維素水解等技術來製造生質能源，但此類生質能源具有原料來源有限、處理成本過高等問題；第三代生質能原係起源於西元1970年能源危機爆發時，美國所推動的藻類生質柴油開發計畫，以藻類為主要原料，利用油脂萃取、氫化(hydrogenation)及轉酯化等技術來製造生質能源。
微藻(microalgae)係屬於一種單細胞藻類，其細胞大小介於幾微米(μm)至幾百微米之間，一般無法以肉眼直接觀察，需利用顯微鏡輔助觀察。微藻之分佈範圍非常廣泛，在淡水、海洋或潮濕的土壤中皆可 發現其蹤跡，據估計，地球上大約有20萬至80萬種微藻，其中已發現並有記錄的僅有3萬5千種，其生物多樣性非常複雜，無論是以基礎研究或是開發的角度而言，為一個幾乎未積極開發的領域。
微藻具備生長速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培養、受病菌污染機率較小及所需土地面積較小等優點，並可在短時間內蓄積大量的生物質，可作為生產生質柴油、生物乙醇及生物氫等生質燃料的原料。此外，微藻可使用非農耕地、苦鹹水、工廠排放的廢水及煙道氣等進行培養，大大減少了土地與淡水的需求，從而減少與糧食及經濟作物的資源競爭。加上其細胞結構簡單且缺乏細胞分化，相較於棕櫚、油菜、大豆及甘蔗等產油作物，其操作性較植物細胞更為簡易，且具有與植物相似的醣化後轉譯修飾機制以利細胞基因表現(Yen,H.W.et al.,Microalgae-based biorefinery-From biofuels to natural products.,Bioresour.Technol.,2013,135：166-174)。
目前，微藻生物質中所含的醣類(如藻多醣)、蛋白質(如類胡蘿蔔素(carotenoid)及藻膽蛋白(phycobilin))及脂質(如三酸甘油脂、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid；EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid；DHA)等，已被廣泛應用於醫療保健、美容、食品加工、水產養殖及生物能源等產業中(Spolaore,P.et al.,Commercial applications of microalgae.,J.Biosci.Bioeng.,2006,101：87-96)。
生長快速、產油量高的藻種係製備微藻生質燃料的基礎。微藻生長需要光、二氧化碳、水、氮、磷及鉀等要素，其養殖方式包含自營、異營及混營培養等，自營培養係指微藻利用光源及無機碳(如二氧化碳)行光合作用得到生長所需之能量；異營培養係指微藻在無照光之條件下，利用培養基中的有機碳作為碳源(如醋酸鈉、葡萄糖)來 生長；混營培養則係指微藻可同時進行自營及異營生長。一般而言，微藻之藻體量大約每6至72小時會增加1倍，微藻生長的速度越快，其可採收的頻率越高，然而，通常含油量較高的藻種生長速度較含油量較低的藻種來的慢。不同的培養方式及培養基成份對微藻生長速度、油脂的累積、產率及組成亦會產生不同程度的影響(Dhup,S.& Dhawan,V.,Effect of nitrogen concentration on lipid productivity and fatty acid composition of Monoraphidium sp.,Bioresour.Technol.,2014,152：572-575)。此外，當培養條件不利於微藻生長時(如氮剝奪)，反而常會促使微藻將所吸收之碳轉變成油脂累積起來(Griffiths M.J.& Harrison S.T.,Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production.,Journal of Applied Phycology,2009,21：493-507)。
微藻所產的藻油主要由三酸甘油脂、各式脂肪酸及固醇類所組成，然而，並非所有微藻所產的藻油皆適合用於製備生質燃料，其中所含脂肪酸的不飽和程度(degree of unsaturation)及三酸甘油脂的比例，亦會影響該藻油是否適合用於製備生質燃料。因此，有研究指出藻油的脂肪酸圖譜可作為篩選藻種的指標之一(Ramos,M.J.et al.,Influence of fatty acid composition of raw materials on biodiesel properties.,Bioresour.Technol.,2009,100：261-268)。
目前以微藻作為生質能源的原料，其生產成本與技術上仍有待克服與突破之處，以自營培養模式為例，微藻自營培養主要是將微藻懸浮培養於培養液中，然而，目前仍無法將培養液中藻體濃度提升至1%以上。此外，由於培養液中藻體濃度低且微藻細胞相當地微小，使得在養殖結束後，要將微藻從培養液中濃縮分離出來並進行乾燥脫水，變得相當費時耗能，造成藻體的採收成本可占全部生產成本的 20~30%。因此，目前仍需要生長快速、生物質產率高、藻油含量高、藻體易於回收等特點之優良藻種。
本發明係於台灣台北三芝採集到含微藻的水樣樣品後，以C培養基進行微藻的培養與分離，選取出可產生藻油，且經鑑定為克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)之AA013藻株，經藻油含量、脂肪酸圖譜及油脂組成等分析，發現該AA013藻株可作為製造生質能源及食用油之潛力藻種。此外，AA013藻珠可貼附生長於不同材質之載體表面上，形成生物膜，可以生物膜培養模式生產藻油，在藻體採收時僅需將載體表面之藻體刮取下來，即可得到高濃度之藻泥，可簡化微藻養殖過程中的採收流程，並降低生產成本。
因此，本發明之一目的係在於提供一種克萊曼都普帝藻分離株，該克萊曼都普帝藻分離株之培養產物可用做生產生質柴油及食用油的原料。
本發明之另一目的係在於提供一種培養該克萊曼都普帝藻分離株以獲得克萊曼都普帝藻培養產物的方法。
本發明之另一目的係在於提供一種由上述方法所獲得的克萊曼都普帝藻培養產物。
本發明之另一目的係在於提供一種由上述克萊曼都普帝藻培養產物中獲得三酸甘油酯之方法。
本發明在以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點可易見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。
圖1為AA013藻株的顯微鏡檢圖。圖1A為明視野觀察，细胞直徑約為5~15μm，顯微倍率1,000X；圖1B為以Nile Red染色，以螢光顯 微鏡觀察，藻體內部有黃色之油滴分佈，顯微倍率1,000X。
圖2為AA013藻株18S rDNA序列之演化樹分析圖。
圖3為AA013藻株ITS區域序列之演化樹分析圖。
圖4為AA013藻株在不同培養溫度(20℃、25℃、30℃及40℃)下之生長結果。
圖5為AA013藻株在不同pH值(pH4、pH7.5及pH9)之C培養基中之生長結果。
圖6為AA013藻株在含有不同鹽度(0‰(w/v)、15‰(w/v)及30‰(w/v))之C培養基中之生長結果。
圖7為AA013藻株生長於不同材質之貼附載體之貼附與含油情形。組別A為各種不同材質之貼附載體；組別B為AA013藻株貼附於各載體之生長情形；組別C為貼附於各載體之藻體的顯微鏡明視野觀察圖，顯微倍率為400X；組別D為貼附於各載體之藻體經Nile red染色後的螢光顯微鏡觀察圖，顯微倍率為400X。
圖8為不同生長方式下之AA013藻株經Nile Red染色的螢光顯微鏡檢圖，顯微倍率400X。圖8A為貼附生長之AA013藻株；圖8B為懸浮生長之AA013藻株。
本發明可藉由下述實施方式中所揭示之各種發明態樣、實施例及表列之相關敘述所瞭解。除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用之術語(包含技術及科學術語)應具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解之含義。且當可瞭解，除非本文中提供之定義另作說明，在任何潛在歧義之情況，術語之定義應與該等普遍使用之術語(如詞典中所定義)一致。可進一步瞭解者，本案所使用的術語僅係用作描述特定實施態樣之目的，而非用於限定。
必須注意的是，除非有清楚的相反指示，於說明書或申請專利範 圍使用之單數格式「一種」及「該」亦包含複數表示。因此，除非上下文另有需要，單數術語應包含複數，而複數術語亦包含單數。
本發明的範圍以「自一『約』特定數值及/或至另一『約』特定數值」表示。當範圍藉上述方式表示時，其包含自一特定數值及/或至另一特定數值之範圍。同樣地，當數值可藉由術語「約」以表示近似值，將可了解其為一特定值的另一個態樣。可進一步了解，當提及有關其它端點及其他端點本身而言，每一範圍的兩端點皆為有意義的。根據本發明，「約」可表示±20%，較佳為±10%，更佳為±5%。
於本發明中，術語「經分離」或「分離」意謂使物質自其原始環境(若天然存在則為天然環境)中移出。術語"經分離"或"分離"並不一定指物質係經純化者。
本發明之目的一在於提供一種克萊曼都普帝藻分離株，其包含與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少95%相似度之18S rDNA序列，且與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少95%相似度之ITS區域序列。換言之，該克萊曼都普帝藻分離株中之18S rDNA序列與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有95%、96%、97%、98%、99%或100%之相似度，且ITS區域序列與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有95%、96%、97%、98%、99%或100%之相似度。
兩個核酸序列間的差異可出現於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處，或個別散布於參考序列中之核苷酸當中，或散布於參考序列內之一或多個鄰近基團中之彼等末端位置之間的任何地方。任何特定核酸分子是否與參考核苷酸序列95%、96%、97%、98%、99%或100%相似係指使用此項技術中所熟知之標準演算法在兩個分子之間所進行的比較，且可常規使用公開可用之電腦程式(諸如BLASTN演算法)來判定。
於本發明之一較佳實施態樣中，該克萊曼都普帝藻分離株為寄 存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980038之藻株，或為與寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980038之藻株具有實質上完全相同特徵之變異株。
上述「變異株」意謂涵蓋全體細胞遺傳組成已藉由如化學突變誘發、自發突變、遺傳工程、轉化或轉染而改變，以致影響其物理或生物化學特性之任何克萊曼都普帝藻株。然而，該變異株應具有寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980038之克萊曼都普帝藻株的所有識別特徵。
本發明之另一目的係在於提供一種製備克萊曼都普帝藻培養產物之方法。於本發明之實施態樣中，該方法其包含將本發明之克萊曼都普帝藻分離株接種於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物。於本發明之一較佳實施態樣中，該方法包含將本發明之克萊曼都普帝藻分離株與載體共同培養於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物，其中該克萊曼都普帝藻分離株與該載體係分別加入該液態培養基中，或先將該克萊曼都普帝藻分離株接種於該載體上後，再將經接種之載體加入該液態培養基中。
本文中所謂「培養產物」意旨將微藻培養於培養基中後，所獲得富含微藻細胞的產物，而該培養產物中之微藻細胞不必須與該培養基分離，且該培養產物可呈液態、固態或黏稠狀。
本發明中所述用於培養克萊曼都普帝藻分離株之「液態培養基」可為任何容許克萊曼都普帝藻分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸之水性培養基，例如C培養基[每100mL中包含15mg Ca(NO3)2‧4H2O、10mg KNO3、5mg β-甘油磷酸二鈉‧5H2O、4mg MgSO4‧7H2O、0.01μg維生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na2EDTA‧2H2O、19.6mg FeCl3‧6H2O、3.6mg MnCl2‧4H2O、1.04mg ZnCl2、0.4μg CoCl2‧6H2O、0.25μg Na2MoO4‧2H2O及水)、50mg Tris(hydroxymethyl)aminomethane及水]、BG-11培養基[每100mL包含1,500mg NaNO3、40mg K2HPO4、75mg MgSO4．7H2O、27.18mg CaCl2、6mg檸檬酸、6mg檸檬酸鐵銨、1mg Na2．Mg．EDTA．2H2O、20mg Na2CO3、2.86mg HBO3、1.181mg MnCl2‧4H2O、0.222mg ZnSO4‧7H2O、0.39mg Na2MoO4‧2H2O、0.0718mg CuSO4‧5H2O、0.049mg Co(NO3)2．6H2O及水]，以及MA培養基[每100mL中包含10mg Ca(NO3)2‧4H2O、10mg KNO3、5mg NaNO3、4mg Na2SO4、5mg MgCl2‧6H2O、10mg β-甘油磷酸二鈉‧5H2O、0.5mg Na2EDTA‧2H2O、0.05mg FeCl3‧6H2O、0.5mg MnCl2‧4H2O、0.05mg ZnCl2、0.5mg CoCl2‧6H2O、0.08mg Na2MoO4‧2H2O、2mg H3BO3及50mg Bicine]。
本發明中用於培養克萊曼都普帝藻分離株之條件意指如培養基之pH值、培養溫度、照光、通氣條件及培養時間等條件，其可容許該克萊曼都普帝藻分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技術領域之人士可根據既有知識針對培養基的成分及培養條件作調整。
於本發明之實施態樣中，用於培養克萊曼都普帝藻之液態培養基之pH值可為約pH2.5至約pH10(例如約pH2.5、約pH3、約pH3.5、約pH4、約pH4.5、約pH5、約pH5.5、約pH6、約pH6.5、約pH7、約pH7.5、約pH8、約pH8.5、約pH9、約pH9.5或約pH10)，較佳為約pH4至約pH9。
於本發明之實施態樣中，克萊曼都普帝藻培養溫度可為約15℃至約45℃(例如約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃或約50℃)，較佳為約20℃至約40℃；且照光量可為約100lux至約4,000lux，較佳為約2,000lux之亮度持續照光。
本文中所謂「通氣」意旨於液體培養基中持續地通入含有二氧 化碳之空氣，而通氣量可為約0.05vvm至約1vvm，較佳為約0.1vvm至約0.5vvm，最佳為約0.1vvm。該空氣中之二氧化碳的濃度可為約0.04%(v/v)至約10%(v/v)，較佳為約0.1%(v/v)至約5%(v/v)。
本文中所謂「載體」意指可供克萊曼都普帝藻貼附及/或固定於其表面上並生長之任何基質，其包括(但不限於)網狀物質(例如，纖維濾紙、棉布、麻布、濾布、木漿布、不織布、牛仔布及碎花布)、泡棉(例如，聚乙烯醇(PVA)泡棉)或其任意的組合；該載體可呈任何形狀，包括(但不限於)片狀、球形、環狀、螺旋體、正方體、長方體及多邊體。
本文中所謂「生物膜」意指由本發明之克萊曼都普帝藻細胞所聚集而形成之膜狀群落。
本發明製備克萊曼都普帝藻培養產物之方法中，可視需要包含分離該培養產物的步驟，而該分離步驟可為如離心、過濾、聚集凝結及/或將生物膜從載體上刮下收集等習知的方法步驟。
本發明亦提供由上述方法所獲得之培養產物。本發明之培養產物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，特別是三酸甘油酯，可用作獲得三酸甘油酯的原料，進而可用於製造生質燃料及食用油。有研究指出，微藻在貼附生長下所產生之油脂量僅佔藻體乾重10%(w/w)以下，遠低於懸浮生長所產生之油脂量(Gross,M.& Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresource Technol.,2014,171：50-58；及Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production by microalgae in a new biofilm based photobioreactor,Young Biotechnologist National Conference,2014,Szeged)。然而，本發明之克萊曼都普帝藻分離株於貼附培養下之藻體含油量為26.13%，遠高於一般藻株於貼附培養下之藻體含油量。
本文中之「三酸甘油酯」意旨具有1個甘油分子及3個脂肪酸分子之酯類化合物，其中該3個脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相異之碳數及不飽和鍵。
本文中之「脂肪酸」意旨具有8至30個碳原子及0至6個不飽和鍵的羧酸化合物，其較佳為具有12至20個碳原子及0至5個不飽和鍵的羧酸化合物，更佳為具有16至18個碳原子及0至3個不飽和鍵的羧酸化合物。
三酸甘油酯及脂肪酸之獲得可使用本技術領域所熟知的任何萃取及分離方法，例如Folch等人(The Journal of biological Chemistry,1956,23：497-509)、Balasubramanian等人(Bioresource Technology,2011,102：3396-3403)及Sajilata等人(Journal of Food Engineering,2008,84：321-326)的方法。簡而言之，該方法可包含將克萊曼都普帝藻細胞以如研磨法或超音波法等方式擊碎，藉由適當的溶劑萃取克萊曼都普帝藻細胞中之三酸甘油酯及/或脂肪酸，再藉由如HPLC及/或離子交換樹脂的技術獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸。
本文所述之所有公開案、專利及專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。
提供以下實例以輔助熟習此項技術者實施本發明。即使如此，不應將該等實例視為本發明之限制，因為本發明所屬技術領域中具有通常知識者在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行的修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。
實施例 材料與方法 1. C培養基
依序加入Ca(NO3)2‧4H2O 15mg、KNO3 10mg、β-甘油磷酸二 鈉‧5H2O 5mg、MgSO4‧7H2O 4mg、維生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺(Thiamine)HCl 1μg、PIV微量元素溶液0.3mL與Tris(hydroxymethyl)aminomethane 50mg，隨後將其體積補水至100mL，調整pH至7.5後進行高壓滅菌。若為1.5%(w/v)洋菜固體培養基則需加入15g的洋菜膠一同滅菌。
PIV微量元素溶液的配製為依序加入Na2EDTA‧2H2O 100mg、FeCl3‧6H2O 19.6mg、MnCl2‧4H2O 3.6mg、ZnCl2 1.04mg、CoCl2‧6H2O 0.4μg與Na2MoO4‧2H2O 0.25μg，隨後將其體積補水至100mL後進行高壓滅菌。
2. 藻樣採集、分離與培養
取台灣台北三芝養殖池之水樣樣品約10ml置於50ml離心管中，加入約30mL C培養基，於25℃下照光培養。培養期間以顯微鏡觀察是否有藻體生長，之後取出適量含藻體之培養液，將其轉至平板培養基，於25℃下照光培養。待藻體生長後取單一藻種將其於平板培養基中塗開，以上步驟需重覆至篩到單一藻體為止。平板培養則取單一藻落塗至C培養基平板上，於25℃下照光培養。大量培養則自平板培養基上刮取新鮮培養之單一藻體，添加至C液態培養基中，使其培養液吸光值(OD682nm)約達0.1~0.15，並於25℃照光通氣培養。
3. 油脂染色分析
將培養好的藻體取20μL與1μL Nile Red(於二甲基亞碸中0.1mg/mL)混合以進行油滴染色，染色後於室溫靜置5分鐘，再利用螢光顯微鏡進行觀察。(Chen,W.et al.,A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.,Journal of Microbiological Methods,2009,77：41-47及Huang,G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence., Biomass and bioenergy,2009,33：1386-1392)。
4. 藻種之分子鑑定 4.1 藻體基因體(genomic)DNA之抽取
自平板培養基上刮取適量之新鮮培養的藻體，將其收集在2mL微量離心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM kit說明書操作取得基因體DNA，並以NanoDrop(ND-1000分光光度計)檢測DNA之濃度。
4.2 PCR增幅
將藻體基因體DNA作為PCR模板，以18S rRNA與ITS區域(包含18S核糖體RNA的後端、內轉錄間隔區1、5.8S核糖體RNA、內轉錄間隔區2與28S核糖體RNA的前端等序列)的相關引子組(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)來增幅其基因片段。PCR反應溶液如下：適量的基因體DNA溶液作為PCR模板、10mM dNTP 3μL、10X PCR緩衝液4μL、10mM 5'端引子與3'端引子各0.5μL及Taq酵素5U。PCR反應條件為96℃，5分鐘；(96℃，30秒、50℃，20秒、72℃，3分鐘)共40次循環；72℃，10分鐘；最後保持在4℃。取5μL產物進行電泳跑膠分析。
4.3 定序分析
將PCR產物純化後以適當引子(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)進行定序，將序列結果以Vector NTI Suite 9軟體(VNTI)與NCBI/Blastn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列重組與序列相似性比對分析。另，分別將定序所得的結果經NCBI/Blastn後所得相近的藻株還有藻屬，以及數個藻種中心較接近的藻株及藻屬列為比較範圍，進行演化樹分析，以MEGA 6.0做比對，接著利用最 大概似法(Maximum Likelihood)以GTR+G+I的方式繪製演化樹，Bootstrap則為100次。
5. 藻種培養特性分析 5.1 培養溫度
測試AA013藻株在不同培養溫度下之生長耐受性。取適量藻體接種於C培養基平板上，分別於20℃、25℃、30℃與40℃等不同溫度下進行照光培養，之後於培養第7天及第14天觀察藻體在不同溫度之生長情形。
5.2 培養pH值
測試AA013藻株在不同培養pH值下之生長耐受性。製備pH4、pH7.5及pH9之C培養基平板，分別取適量藻體接種於不同pH值之C培養基平板上，以25℃進行照光培養，於培養第7天及第14天觀察藻體生長情形。
5.3 培養鹽度
測試AA013藻株在不同培養鹽度下之生長耐受性。首先製備含有0‰(w/v)、15‰(w/v)及30‰(w/v)之鹽度的C培養基平板，作法為添加海水素(佳欣，台灣)至C培養基中，並充分溶解後，以鹽度計(ATAGO CO.,LTD，MASTER-S/Millα，日本)量測鹽度，培養基再以高溫高壓滅菌後製成平板。分別取適量藻體接種於各鹽度培養基平板上，以25℃進行照光培養，於培養第7天及第14天觀察藻體生長情形。
5.4. 藻體貼附培養
觀察AA013藻株於9種不同材質之載體上的生長貼附情形。所測試之載體包含：(1)纖維濾紙；(2)棉布a；(3)濾布；(4)木漿布；(5)棉布b；(6)不織布；(7)牛仔布；(8)碎花布及(9)聚乙烯醇(PVA)。將不同載體分別與AA013藻株置於C培養基中，以75 rpm之轉速共同振盪培養21天後，將載體取出觀察藻體之貼附情形，並將貼附於載體上之藻體以Nile red染色，室溫靜置2分鐘後，以螢光顯微鏡觀察。
6. 藻體分析 6.1 藻體含油量分析
收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法參考修飾Folch等人的方法(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue.,The Journal of biological Chemistry,1957,23：497-509)來進行，其過程為取30mg冷凍乾燥的藻粉(A值)至2mL微量離心管，加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)與適量大顆玻璃珠，以撞擊式細胞破碎儀(Retsch® MM400)振盪約5分鐘，重複兩次。以10,000rpm離心5分鐘後，取上清液到拋棄式15mL離心管中，隨即於2mL微量離心管內加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)，再以超音波振盪與離心，取上清液到拋棄式15mL離心管中，直到萃取液無色為止。於裝有萃取液的15mL離心管中加入等體積的145mM NaCl溶液後，以試管旋轉混合器混和均勻後，經4,500rpm離心10分鐘，以玻璃吸管取下層液體到已秤重的玻璃瓶(B值)中。將此玻璃瓶內液體隔夜風乾再秤重(C值)，計算藻乾含油量的百分比(D值)。藻乾含油量計算公式：
6.2 脂肪酸圖譜分析
刮取適量乾燥藻體置於玻璃試管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL及ddH2O 150mL)，震散藻體。於100℃加熱5分鐘，再將所有藻體震散，繼續加熱25分鐘。加入2 mL溶液II(6N HCl 325mL及甲醇200mL)，於80℃加熱10分鐘，完成後迅速冷卻。加入1.25mL溶液III(己烷200mL、三級丁基甲基醚200mL)，緩慢混合10分鐘，以玻璃吸管尖吸取下層液體並丟棄。將上層液體加入3mL溶液IV(NaOH 10.8g及ddH2O 900mL)，混合5分鐘後，吸取上層液體以GC/MS(HP 5973 GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法參考2007年Valencia,I.等人的方法(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich in docosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.：Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidation stability.,Food Chemistry,2007,104：1087-1096)。GC/Mass分析條件為：毛細管管柱：SP-2560，75m x 0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度：250℃；離子源温度：250℃；管柱烘箱溫度：起始溫度140℃，保持5分鐘後以4℃/min之昇温速率昇温至240℃，保持2分鐘；載送氣體：氦；管柱流量：40cm/sec，在175℃下；待分析樣品注射體積：1μL；分流比：1/100；脂肪酸標準品：37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)。設定好條件後，先分析標準品確認圖譜正確後再進行樣品分析。分析完成之結果整理在表格中以方便比對。
6.3 油脂組成分析
將抽取的藻油樣品以HPLC分析其油脂組成，HPLC分析條件：分離管柱為德國Merck公司製造之Silica gel(4.6mm id×250mm，顆粒大小5μm)；沖提溶劑A為己烷；沖提溶劑B為己烷/乙酸乙酯/異丙醇(80：10：10(v/v))，在0分鐘溶劑A/B為98：2(v/v)，在8分鐘線性增加至溶劑A/B為50：50(v/v)，在8.5分鐘線性增加至溶劑A/B為2：98(v/v)，15分鐘維持相同梯 度，20分鐘線性減少至溶劑A/B為98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector；ELSD)條件：氣體流量2.6L/min；蒸發器溫度為40℃(詹國靖等人，以甘油與植物油利用脂解酶之轉酯化反應生產1,3-雙醯甘油。台灣農業化學與食品科學，2010，45：19-25)。
7. 藻體貼附培養之產油效率分析
將藻體以懸浮培養之方式大量培養後，將藻液濃度調整至其吸光值(OD682nm)為0.5，再取30~40ml之藻液，以抽氣過濾的方式將藻體固定於乾燥並完成稱重之0.45μm之硝酸纖維/乙基纖維膜表面，記錄濾紙乾重(WP)，取一組空白組進行冷凍乾燥，扣除濾紙乾重後，記錄培養前之藻體乾重(WAI)。取經無菌處理過之吸水載體(如海棉、厚濾紙…等)，置於無菌平板底部，加入適量培養液使其維持濕潤，再將含固定化藻體之濾紙平放至吸水載體上方，將平板置於夾鏈袋中防止水份蒸發流失，並以30℃進行24小時照光培養。培養14天後，將含固定化藻體之濾紙自平板中取出以冷凍乾燥方式將藻體乾燥後，稱重，並扣除濾紙乾重，記錄培養後之藻體乾重(WAF)。完成藻體稱重後，將藻體自載體表面刮下進行含油量分析，記錄貼附藻體含油量(OCA)。計算藻體生物質產率及油脂含量之計算公式為：PAB=(WAF-WAI)/A/T
PAO=OCA×PAB
PAB：貼附培養之藻體生物質產率(g/m2/day)
PAO：貼附培養之藻體油脂產率(g/m2/day)
WAF：藻體貼附培養後之乾重(g)
WAI：藻體貼附培養前之乾重(g)
A：藻體貼附培養之面積(m2)
T：藻體貼附培養之天數(day)
OCA：貼附培養之藻體含油量(%)(w/w)
實例一、藻株鑑定
於台灣台北三芝的養殖池水樣樣品中，分離純化得到AA013藻株。以顯微鏡(1,000X)觀察其形態，發現AA013藻株以非群聚之單一藻體存在，细胞呈圓形，依其藻體培養天數之不同，細胞直徑約為5~15μm(圖1A)。經Nile Red染色後，以螢光顯微鏡觀察到藻體內部有大量明顯且呈黃色之油滴分佈，顯示其藻體內可以蓄積油滴(圖1B)。
將AA013藻株之18S rDNA及ITS區域進行DNA定序，分別得到長度1732bp之18S rDNA序列(SEQ ID NO：1)及長度674bp之ITS序列(SEQ ID NO：2)。將該等序列分別與NCBI的nr資料庫比對後，發現以下5株藻株(1)Rhopalosolen saccatus SAG 26.95(Acession No.KM020179.1)；(2)Chlamydopodium starrii SAG 16.87(Acession No.AB983625.1)；(3)Characium saccatum(Acession No.M843195.1)；(4)Characium vacuolatum(Acession No.M63001.1)；及(5)Chlorococcum sp.CCAP 11/52(Acession No.FR865591.1)之序列與AA013藻株之18S rDNA序列(SEQ ID NO：1)具有高達99%之相似度。另，發現以下4株藻株(1)Chlamydopodium starrii SAG 16.87(Acession No.AB983644.1)；(2)Chlorococcum tatrense(Acession No.HQ404882.1)；(3)Chlorococcum tatrense(Acession No.HQ404881.1)；及(4)Macrochloris rubrioleum(Acession No.AB983643.1)之序列與AA013藻株之ITS序列(SEQ ID NO：2)具有86%之相似度。
此外，抽取自德國藻種中心(Culture Collection of Algae at Göttingen University；SAG)所購入之Rhopalosolen saccatus SAG 26.95的基因體DNA，將其ITS區域進行DNA定序，並將所得長度為679bp之ITS序列(SEQ ID NO：3)與AA013藻株之ITS序列(SEQ ID NO：2)進行序列比對分析，發現其相似度為86%。
進一步以AA013藻株之18S rDNA及ITS序列進行演化樹比對分析，結果顯示AA013藻株之18S rDNA序列(SEQ ID NO：1)與Rhopalosolen saccatus SAG 26.95(Acession No.KM020179.1)及Chlamydopodium starrii SAG 16.87(Acession No.AB983625.1)(Kawasaki,Y.,Nakada,T.& Tomita,M.,Taxonomic revision of oil-producing green algae,Chlorococcum oleofaciens(Volvocales,Chlorophyceae),and its relatives.,J.Phycol.,2015,51(5)：1000-1016)最為接近，而與其他綠球藻(Chlorococcum)屬之藻株分屬不同演化樹分支(圖2)。此外，AA013藻株之ITS序列與Chlamydopodium starrii SAG 16.87(Acession No.AB983644.1)及Rhopalosolen saccatus SAG 26.95最為接近，而與其他綠球藻(Chlorococcum)屬之藻株分屬不同演化樹分支(圖3)。由上述序列比對分析結果顯示，AA013藻株可能屬於克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium)屬，但與Chlamydopodium starrii分屬不同種之藻株。
由於AA013藻株之形態與Chlamydopodium starrii(Kawasaki,Y.,Nakada,T.& Tomita,M.,Taxonomic revision of oil-producing green algae,Chlorococcum oleofaciens(Volvocales,Chlorophyceae),and its relatives.,J.Phycol.,2015,51(5)：1000-1016)及Rhopalosolen saccatus SAG 26.95極為不同，因此，綜合其形態與分子鑑定之結果，初步鑑定AA013藻株應屬於Chlamydopodium sp.，且極可能為一新種，命名為Chlamydopodium sp.AA013。
Chlamydopodium sp.AA013已於2016年4月13日寄存於財團法人食 品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，其寄存編號為BCRC980038；且其亦於2016年3月28日寄存於中國典型培養物保藏中心，其寄存編號為CCTCC M 2016152。
實例二、AA013藻株之培養條件 (1)培養溫度測試
結果顯示在20℃、25℃、30℃及40℃之培養溫度下，AA013藻株於C培養基平板上可持續且明顯的生長(圖4)。據此，AA013藻株可生長在約20℃至約40℃之溫度範圍中。
(2)培養基pH值測試
結果顯示AA013藻株在pH4、pH7.5及pH9之C培養基平板上可持續且明顯的生長(圖5)。據此，AA013藻株可生長在約pH4至約pH9之環境中。
(3)培養基鹽度測試
結果顯示AA013藻株在鹽度0‰(w/v)之C培養基平板中，有持續且明顯的生長，然而在鹽度15‰(w/v)及30‰(w/v)之培養基中並未觀察到有藻體生長的情形(圖6)。因此，AA013藻株可生長在鹽度為0‰(w/v)之環境中。
實例三、AA013藻株之貼附培養
將AA013藻株分別與以下9種不同材質之載體：(1)纖維濾紙；(2)棉布a；(3)濾布；(4)木漿布；(5)棉布b；(6)不織布；(7)牛仔布；(8)碎花布；及(9)聚乙烯醇(PVA)共同培養，以測試其貼附性。結果顯示，上述9種載體皆可被AA013藻株所貼附，且大部份藻體皆生長於載 體上(圖7)。此外，將貼附於各載體上之藻體以Nile red染色後，以螢光顯微鏡觀察，發現藻體內有大量的油滴分佈(圖7)。
實例四、AA013藻株之油脂含量及組成分析
將AA013藻株與纖維濾紙載體以75rpm之轉速照光振盪培養，在25℃下培養21天後，將AA013藻株於載體表面形成之生物膜及培養液中之懸浮藻體以Nile red染色，結果顯示生物膜之藻體油脂含量(圖8A)高於懸浮藻體中之油脂含量(圖8B)。
分別將AA013藻株懸浮培養於1L的C培養基中及與纖維濾紙貼附培養，並於30℃照光培養14天後，收集藻體將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉萃取其油脂，分析其藻體含油量、油脂及脂肪酸組成。結果顯示懸浮生長之AA013藻體含油量為21.5%(w/w)，而相較於一般藻株其藻體含油量在貼附生長時會較懸浮生長時下降至10%之狀況(Gross,M.& Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresource Technol.,2014,171：50-58)，貼附生長之AA013藻體含油量(26.13%(w/w))反而高於懸浮生長時之藻體含油量。
懸浮及貼附培養下之AA013藻株藻體油脂成分及含量，則如下表一及表二所示。
Bioresour.Technol.,2009,100：261-268)
表一之結果顯示，懸浮培養之AA013藻體中所含的油脂主要為三酸甘油酯(佔90.62%(w/w))，另包含少量游離脂肪酸(佔4.42%(w/w))及1,3-雙醯基甘油酯(佔4.96%(w/w))；而貼附培養之AA013藻體中所含的油脂主成分亦為三酸甘油酯(佔98.75%(w/w))，另包含少量1,3-雙醯基甘油酯(佔0.95%(w/w))、1,2-雙醯基甘油酯(佔0.10%(w/w))及單醯基甘油酯(佔0.09%(w/w))。
表二之結果顯示，懸浮培養之AA013藻體脂肪酸組成主要為C16及C18脂肪酸，佔總脂肪酸含量的84.5%(w/w)，而貼附培養與懸浮培養之AA013藻體脂肪酸組成並無顯著差異，主要亦包含C16及C18脂肪酸，僅組成比例上有些微差異。此外，經計算後，懸浮培養與貼附培養之AA013藻體所含油脂其不飽和程度(DU)分別為116.2及106.9，符合歐盟所定之生質柴油標準值。上述結果顯示，懸浮培養與貼附培養之AA013藻株所產的油脂適合作為生質柴油的原料，此外，根據油脂中脂肪酸組成與三酸甘油酯含量，該等油脂亦適合作為食用油之原料。
實例五、AA013藻株貼附培養之產油效率
將AA013藻株與纖維濾紙貼附培養，於30℃下24小時照光培養，14天後收集藻體，計算其載體表面之藻體生物質產率及油脂產率，結果分別為1.51g/m2/天及0.39g/m2/天。
結論
本發明首先發現經初步鑑定為Chlamydopodium sp.之克萊曼都普 帝藻分離株AA013。該藻株可生長在溫度約20℃至約40℃、鹽度0‰(w/v)及約pH4至約pH9之環境中。此外，AA013藻株具備有良好的貼附特性，可貼附生長於不同材質之載體上。進一步發現，貼附生長之藻體所形成之生物膜中油脂含量高於懸浮生長之藻體(乾燥藻體之含油量為26.13%(w/w)高於懸浮培養的21.5%(w/w))，且貼附生長之藻體三酸甘油脂含量佔油脂總含量的98.75%(w/w)，脂肪酸組成以C16及C18脂肪酸為主，脂肪酸不飽和程度為106.9。以上結果顯示，AA013藻株(Chlamydopodium sp.)可以貼附培養模式來形成生物膜以生產油脂，作為生產生質柴油及食用油之原料。
<110> 財團法人食品工業發展研究所
<120> 克萊曼都普帝藻(CHLAMYDOPODIUM SP.)及其用途
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1732
<212> DNA
<213> 克萊曼都普帝藻
<220>
<221> 18S rDNA
<222> (1)..(1732)
<400> 1
<210> 2
<211> 674
<212> DNA
<213> 克萊曼都普帝藻
<220>
<221> ITS
<222> (1)..(674)
<400> 2
<210> 3
<211> 679
<212> DNA
<213> Rhopalosolen saccatus
<220>
<221> ITS
<222> (1)..(679)
<400> 3

Claims (15)

  1. 一種克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)分離株，其包含與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少95%相似度之18S rDNA序列，且與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少95%相似度之ITS區域序列。
  2. 如請求項1之克萊曼都普帝藻分離株，其中該18S rDNA序列具有SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，且該ITS區域序列具有SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2之克萊曼都普帝藻分離株，該克萊曼都普帝藻分離株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980038之藻株。
  4. 一種製備克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)培養產物之方法，其包含將如請求項1至3中任一項之克萊曼都普帝藻分離株接種於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物。
  5. 如請求項4之方法，其中該克萊曼都普帝藻分離株係與載體共同培養於該液態培養基中。
  6. 如請求項5之方法，其中該克萊曼都普帝藻分離株與該載體係分別加入該液態培養基中，或先將該克萊曼都普帝藻分離株接種於該載體上後，再將經接種之載體加入該液態培養基中。
  7. 如請求項5或6之方法，其中該載體係網狀物質、泡棉或其任意組合。
  8. 如請求項7之方法，其中該網狀物質係濾紙、棉布、濾布、木漿布、不織布、牛仔布或碎花布。
  9. 如請求項7之方法，其中該泡棉係聚乙烯醇(PVA)泡棉。
  10. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該液態培養基之pH值為約pH2.5至約pH10。
  11. 如請求項4至6中任一項之方法，其中該克萊曼都普帝藻分離株係以約15℃至約45℃之溫度進行培養。
  12. 如請求項4至6中任一項之方法，其進一步包含分離該培養產物的步驟。
  13. 一種克萊曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)培養產物，其可由如請求項4至12中任一項之方法來獲得。
  14. 如請求項13之克萊曼都普帝藻培養產物，其包含三酸甘油酯及脂肪酸。
  15. 一種製備三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法，其包含自如請求項13或14之克萊曼都普帝藻培養產物中分離出三酸甘油酯及/或脂肪酸。
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