CN120005036A - 用于老年相关性黄斑变性的治疗的基因治疗药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于AMD治疗的基因治疗药物。本发明提供了具有特定分泌信号肽序列的抗VEGF融合蛋白，能够有效表达和分泌抗VEGF蛋白。本发明还提供了用于提高抗VEGF蛋白视网膜转导效率的改造的AAV载体。本发明的融合蛋白和改造的AAV载体能够用于治疗新生血管性眼病。

Description

用于老年相关性黄斑变性的治疗的基因治疗药物

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于老年相关性黄斑变性的治疗的基因治疗药物。

背景技术

老年相关性黄斑变性(age-related macular disease,AMD)是目前危害视觉健康的重大公共卫生问题。年龄是AMD的首要危险因素。综合蓝山眼科研究所、Beaver Dam眼科研究所、Rotterdam研究中心的研究发现，在55-64岁、65-74岁、75-84岁以及85岁以上人群中，新生血管性(湿性)老年相关性黄斑变性(nAMD)发病率分别为0.17％、0.54％、2.52％和5.76％(Smith et al.2001)。在中国，50岁以上人群中AMD的患病率为15.5％。随着人口老龄化的加剧以及眼底病筛查手段的进步，中国nAMD患者由1990年的171万人增至2015年的381万人，预计2050年将达到884万人(中国年龄相关性黄斑变性的临床路径.2013；Song etal.2017)。

针对nAMD的基因治疗的现有技术大多使用腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体携带抗-VEGF(vascular endothelial growth factor)分子的表达盒进行眼内注射。但表达元件和其他调控元件和抗VEGF分子的搭配，以及具有不同转导效率和细胞组织嗜性的AAV载体和注射方式的组合都可能会影响治疗药物的效果和安全性。

目前已批准的抗VEGF药物的治疗方案通常包括开始3个月的负荷阶段，以及随后的维持阶段。其中维持阶段包括每月一次、每2个月一次或每3个月一次的固定治疗方案、“按需”(PRN)方案及“治疗-延长”(T&E)方案等，均需要患者定期随访，多次注射，对患者依从性要求较高，给患者和医疗服务者带来了较大负担(Mitchell et al.2018；罗曼等.2020)。

现有技术经常会使用较强的广谱启动子CMV(参见如Preclinical Evaluation ofADVM-022,a Novel Gene Therapy Approach to Treating Wet Age-Related MacularDegeneration,doi:10.1016/j.ymthe.2018.11.003.，以下简称“ADVM-022”)，但在灵长类和临床实验中，CMV启动子存在被沉默的风险，对眼部的光感受器和视网膜色素上皮细胞存在一定的毒性。

同时，现有技术公开的血清型一般是AAV2、AAV8和AAV2.7m8(参见如ADVM-022，或如Delivery of nVEGFi using AAV8 for the treatment of neovascular age-relatedmacular degeneration,doi:10.1016/j.omtm.2022.01.002.，以下简称“nVEGFi”)。其中，野生型AAV2和AAV8无法高效穿透视网膜的内界膜(inner limiting membrane,ILM)到达大多类型nAMD病灶的主要细胞组织(RPE和PR)，所以一般采用视网膜下腔给药的方式，这种给药方式虽然可以有效递送目的基因，但对临床手术的要求较高。在采取玻璃体腔给药(临床的难度交底，患者随从性更好)的途径下，这两款野生型AAV载体会导致大部分rAAV和表达的抗VEGF分子残留在玻璃体腔液中，可能会影响临床治疗效果。而ADVM-022技术中公开的AAV2.7m8比野生型AAV2有较好的视网膜穿透力，可以用于玻璃体腔注射；但在转导效率和细胞嗜性方面仍存在可优化的空间。

因此，本领域需要开发一种能够便于给药，能够高效递送和表达目的基因的基因治疗药物，用于老年相关性黄斑变性的治疗。

发明内容

本发明的目的就是提供用于老年相关性黄斑变性治疗的能够高效递送和表达目的基因的基因治疗药物。

在本发明的第一方面，提供了一种抗VEGF融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端具有式I结构：

L-V-H-Fc(I)

式中，各“-”独立地为键或连接肽；

L为分泌信号肽，所述分泌信号肽来源于Ig kappa链；

V为抗VEGF蛋白，所述的抗VEGF蛋白包括VEGFR1(VEGF recptor 1)的IgC结构域2和VEGFR2的IgC结构域3；

H为任选的铰链区；

Fc为任选的免疫球蛋白可结晶片段。

在另一优选例中，所述分泌信号肽的序列如SEQ ID NO:11所示。

在另一优选例中，所述V的序列如SEQ ID NO:3第1-202位所示。

在另一优选例中，所述的铰链区氨基酸序列为GPG。

在另一优选例中，所述的Fc为人IgG1的Fc片段。

在另一优选例中，所述的抗VEGF融合蛋白还包括HA标签。

在本发明的第二方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含编码如本发明第一方面所述抗VEGF融合蛋白的核酸分子。

在另一优选例中，所述表达盒从5’-3’端具有式II结构：

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5(II)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无或5'ITR序列；

Z1为启动子；

Z2为内含子；

Z3为编码如本发明第一方面所述的抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列；

Z4为无或hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)序列；

Z5为无或3'ITR序列。

在另一优选例中，所述Z3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述的启动子包括组织特异性启动子。

在另一优选例中，所述启动子选自下组：UBC(ubiquitin C)启动子、CAG启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述的UBC启动子序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述的CAG启动子序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的内含子选自下组：UBC-CAG嵌合内含子、CAG内含子、UBC内含子、或其组合。

在另一优选例中，所述UBC-CAG嵌合内含子序列如SEQ ID NO:7所示。

在另一优选例中，所述UBC内含子序列如SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述CAG内含子序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为0-30nt，较佳地0-15nt。

在另一优选例中，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述载体还含有额外的一个或多个启动子、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的选择性标记包括抗性标记和荧光素标记，较佳地，所述的选择性标记为卡那霉素抗性序列。

在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的质粒为穿梭质粒。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合；较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达如本发明第一方面所述的抗VEGF融合蛋白。

在本发明的第四方面，提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体含有如本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述腺相关病毒的血清型选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAVHSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAVclone 32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、AAVr3.45、AAV2或AAV5、或其组合。

在另一优选例中，所述的AAV载体为AAV2载体或AAV9载体。

在另一优选例中，所述的AAV载体为改造的AAV载体。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体的衣壳蛋白VP1相对于野生型AAV9衣壳蛋白VP1，第584-598位氨基酸替换为LQRGNRQAATADVNT(SEQ ID NO:17)。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体衣壳蛋白包含插入的功能肽。

在另一优选例中，所述插入的功能肽具有选自下组的功能：

1)增强AAV衣壳蛋白变体的组织特异靶向性；

2)改变野生型AAV衣壳蛋白的受体结合基序空间结构；或

3)弱化野生型AAV衣壳蛋白与半乳糖(Glu)的结合活性。

在另一优选例中，所述的功能肽包含如LALGDVTRPA(SEQ ID NO:18)所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的功能肽插入到对应野生型AAV衣壳蛋白VP1氨基酸序列的第586位和587位之间、第587位和588位之间、或第588位和589位之间。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体衣壳蛋白的VP1相对于野生型AAV9衣壳蛋白VP1具有以下突变：第584-598位氨基酸替换为如LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT(SEQ ID NO:19)所示的序列。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体衣壳蛋白的VP1相对于野生型AAV衣壳蛋白VP1具有以下突变：

a)第240位异亮氨酸I突变为苏氨酸T(I240T)；

b)第708位缬氨酸V突变为异亮氨酸I(V708I)；

c)第444位酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F(Y444F)；

d)上述a)-c)的任意组合。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体衣壳蛋白的VP1相对于野生型AAV衣壳蛋白VP1具有以下突变：I240T、V708I。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体衣壳蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)如SEQ ID NO:13或15所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO:13或15所示的氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。

在另一优选例中，所述AAV载体用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体相对于对应的野生型AAV载体，感光细胞嗜性至少提升1个数量级，优选2个数量级。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体对内界膜的穿透力高于对应的野生型AAV载体。

在另一优选例中，所述改造的AAV载体相对于对应的野生型AAV载体，内界膜穿透力提升至少15％，优选提升至少25％，更优选提升至少35％。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的AAV载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK细胞、感光细胞(包括视锥细胞和/或视杆细胞)、其他视觉细胞(如双极细胞、水平细胞)、神经节细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗VEGF相关眼部疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于抑制眼内VEGF表达。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于减轻激光损伤导致的渗漏和/或抑制血管新生。

在另一优选例中，所述VEGF相关眼部疾病选自下组：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变或其组合。

在另一优选例中，所述黄斑变性为年龄相关性黄斑变性，更佳地为湿性年龄相关性黄斑变性。

在本发明的第七方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗VEGF相关眼部疾病。

在另一优选例中，所述VEGF相关眼部疾病选自下组：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变或其组合。

在另一优选例中，所述黄斑变性为年龄相关性黄斑变性，更佳地为湿性年龄相关性黄斑变性。

在本发明的第八方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述的施用选自下组：静脉内施用、肌内施用、皮下施用、口服施用、粘膜接触、腹膜内施用、病灶内施用、或其组合。

在另一优选例中，将所述腺相关病毒载体注射到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述的注射包括视网膜下腔注射、脉络膜上注射、玻璃体腔注射；较佳地为玻璃体腔注射。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗VEGF相关眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述的方法还包括向所述对象施用免疫调节剂。

在另一优选例中，所述的方法中，每次以1×10⁶-1×10¹⁶VG/眼的剂量施用所述载体，较佳地1×10⁷-1×10⁸VG/眼。

在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第一方面所述的抗VEGF融合蛋白的制备方法，包括培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而得到抗VEGF融合蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了穿梭基因GOI-D02质粒图谱和调控元件对目的基因表达的影响。

图2显示了不同分泌信号肽在细胞水平对表达分泌的影响。

图3显示了AAV感染细胞表达分泌的VEGF trap蛋白能有效与VEGF抗体竞争结合VEGF165蛋白，并能抑制VEGFR1下游的信号传导活性。

图4显示了改造的AAV血清型(RC-C14和RC-C07V5系列)在鼠眼内的转导活性和组织部分比较。

图5显示了改造的衣壳在体外HEK293细胞高效递送和表达分泌VEGF trap蛋白。

图6显示了重组AAV在小鼠眼内注射能长期表达VEGF trap蛋白分子并显著抑制小鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型新生血管渗漏。

图7显示了重组AAV在非人灵长类动物(non-human primate,NHP)眼内注射能长期表达VEGF trap蛋白分子并显著抑制非人灵长类CNV模型新生血管渗漏。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种用于AMD治疗的基因治疗药物。本发明的治疗药物包含了采用优化的表达调控元件和特定分泌信号肽序列的基因表达盒，能够有效表达和分泌抗VEGF蛋白。本发明的表达盒适用于常见的可用于视网膜下注射的野生型腺相关病毒，以及定向改造而得到的可用于玻璃体腔和视网膜下注射并能有效转导视网膜全层的AAV载体。从而，本发明能够在多类型AMD病灶组织内表达分泌抗VEGF蛋白，发挥及时有效的治疗作用。在此基础上，完成了本发明。

本发明筛选的基因表达盒和分泌肽表现出了有效的分子表达和分泌。同时，本产品的改造AAV衣壳在体内外展现了高转导效率，在体内玻璃体腔给药方式下，对视网膜组织各层的转导活性在动物眼内均有显著提升。

和其他临床及临床前研究中的相关基因治疗药物相比，本发明的药物分子可以在相同剂量水平下更高效地表达和分泌抗VEGF蛋白分子。同时，改造后的高效靶向载体也能够允许目的基因以玻璃体腔注射的方式进行递送。综合而言，本发明的药物分子具有较已知AMD基因治疗药物更好的量效关系(更低的治疗有效量)，以及长期有效的临床表现。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。

抗VEGF融合蛋白

如本发明所用，术语“本发明的融合蛋白”、“本发明多肽”、“抗VEGF融合蛋白”、“VEGF trap融合蛋白”可互换使用，均指本发明第一方面所述的融合蛋白。

本发明的融合蛋白从N端到C端具有式I结构：

L-V-H-Fc(I)

式中，各“-”独立地为键或连接肽；

L为分泌信号肽，所述分泌信号肽来源于Ig kappa链；

V为抗VEGF蛋白，所述的抗VEGF蛋白包括VEGFR1的IgC结构域2和VEGFR2的IgC结构域3；

H为任选的铰链区；

Fc为任选的免疫球蛋白可结晶片段。

本发明的融合蛋白具有来源于Ig kappa免疫球蛋白轻链的分泌信号肽(或称分泌肽或信号肽)，相较于现有技术中使用的VEGFR1来源的分泌肽能够获得更好的胞外分泌效果。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白可以含有免疫球蛋白可结晶片段(Ig片段)，所述的Ig片段可以来源于Ig1、Ig4、或其他免疫球蛋白。Ig片段与抗VEGF蛋白序列之间可以通过铰链区连接，例如GPG铰链区。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白还可以含有其他协助纯化或表达的标签，例如HA标签。

在一种优选的实施方式中，本发明的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

表达盒

本发明提供了表达抗VEGF融合蛋白的表达盒，其包含编码本发明抗VEGF融合蛋白的核酸序列。表达盒的结构如本发明第二方面所述。

在一种实施方式中，编码本发明融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。

本发明的表达盒中，启动子、内含子即其他调控元件可以进行改动和优化，使得在同等载体剂量的情况下，进一步优化活性成分的表达量和效果，实现达到眼内长期有效表达抗VEGF分子。

在一种实施方式中，本发明的表达盒含有泛素基因UBC启动子。在一种实施方式中，本发明的表达盒含有UBC-CAG嵌合内含子。

在一种实施方式中，本发明表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ IDNO:2所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

本发明的表达盒可以是DNA形式或RNA形式的核酸。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的AAV病毒载体表达抗VEGF融合蛋白。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的抗VEGF融合蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的核酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述核酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的核酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的核酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的核酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达抗VEGF融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的核酸序列获得表达本发明抗VEGF融合蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

本发明还提供了一种表达抗VEGF融合蛋白的表达载体，它含有本发明的抗VEGF融合蛋白编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。

在一种实施方式中，本发明的载体为穿梭质粒载体，较佳地，其全长DNA序列如SEQID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replication defective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型1到AAV血清型13)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。

合适的启动子的一个例子为人UBC启动子。该启动子来源于人泛素蛋白C基因(GENE ID：7316)的上游表达调控序列(-1225 -6)。

许多表达载体可应用抗VEGF融合蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供一种包含抗VEGF融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带抗VEGF融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达抗VEGF融合蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高抗VEGF融合蛋白的表达量。

AAV载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体。在优选的实施方式中，病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或9载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV 9载体。

可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10⁶-1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内，例如1×10⁷-1×10¹²个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体可以是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

AAV载体改造

本发明还提供了用于在眼内高效递送靶基因的AAV载体，其具有改造的衣壳蛋白。

具体地，本发明基于理性设计基于理性设计对AAV衣壳蛋白进行氨基酸短肽的插入和特定位点突变，获得了能够在眼内高效递送靶基因的AAV载体。

1)AAV2.7m8变体

血清型AAV2的衣壳进入细胞的主要受体是硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)，同时也可以借助整合素，FGFR，HGFR，LamR，AAVR等辅助受体进入细胞。

基于理性设计，对AAV2.7m8(RC-C01)的衣壳蛋白VP1进行了突变改造，获得了RC-C02(2点突变I240T-V708I)和RC-C03(3点突变I240T-V708I-Y444F)。RC-C02病毒包装稳定性提高，体外转导效率与AAV2.7m8血清型相比进一步提升。

进一步通过计算机模拟组织靶向性短肽，筛选出了RC-C14等血清型。RC-C14与RC-C02衣壳相比，在VP1第587位后插入了10个氨基酸(587-LALGDVTRPA)。对RC-C14衣壳的三维空间结构分析发现：上述VP1VIII可变区域的10肽整合在AAV衣壳蛋白表面引入了特点靶向性短肽，改变了原先的受体结合的空间结构，使得衣壳产生了与潜在新受体特异性结合的开关，同时弱化了rAAV2与HSPG的结合活性。因此，RC-C14可通过多受体(而非依赖肝素识别受体HSPG为主要结合受体)结合高效进入光感受器和黑色素上皮细胞，在体外细胞系和体内视网膜组织中的转导效率显著提升。

RC-C14血清型与野生型AAV2 VP1衣壳氨基酸比较，包含以下变异：587-LALGDVTRPA-588插入以及I240T-V708I点突变。RC-C14在体外ARPE19和293T中的转导活性最强。RC-C14详细描述于申请号CN202310084749.8中。

2)AAV9变体

野生型AAV9以半乳糖(Galactose)为主要受体，本发明基于理性设计对AAV9衣壳蛋白进行氨基酸特定位置的突变以及在衣壳表面(VR可变区)嵌合组织靶向性肽后，产生了以RC-C07V5为代表的一系列衣壳变体。例如，RC-C07V5血清型是通过将AAV9衣壳VP1的VRVIII可变区(584-598aa)的15个功能氨基酸(HQSAQAQAQTGWVQN)突变替换为25个特定氨基酸(LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT)得到的。VRIII区域的突变弱化了AAV9衣壳结合细胞表面半乳糖苷酶受体的结合能力，同时使RC-C07V5衣壳获得了更高效的内界膜穿透能力，从而更适用于玻璃体腔给药。RC-C07V5对感光细胞的嗜性与亲本相比提高了1-2个数量级，优于现有已知的AAV血清型(包括但不限于AAV1-13血清型)。无论是视网膜下还是玻璃体腔给药，RC-C07V5均能在视网膜全层分布，同时稳定持续表达外源的增补蛋白。改造后的病毒的稳定性与现有血清型保持一致。改造的血清型(RC-C07V5)的可通过多受体(包括肝素识别受体HSPG主受体，Galactose辅助受体)进入细胞，显著增加了静态屏障(ILM)的穿透力，抵达视网膜外层组织，与亲本血清型相比，转导效率得到显著提升。

在本发明的一种实施方式中，本发明的核酸序列包含在改造的AAV载体(例如RC-C14或RC-C07V5血清型)中，从而进一步改善抗VEGF蛋白在眼内的表达和分布。本发明的改造AAV载体对视网膜细胞全层(尤其是PR和RPE)的嗜侵性与现有血清型显著增强，同时保证了高效的内界膜穿梭能力。与现有血清型相比，对视网膜色素上皮细胞和感光细胞的嗜侵性进一步提高。无论是视网膜下还是玻璃体腔给药，改造AAV载体均能在视网膜全层分布，稳定持续表达外源增补蛋白，病毒的稳定性优于现有已知血清型。

在优选的实施方式中，本发明所述的携带抗VEGF融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体衣壳蛋白的序列如SEQ ID NO:13或15所示。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，较佳地，所述药物制剂用于治疗用于治疗VEGF相关眼部疾病，较佳地，用于治疗黄斑变性和/或糖尿病视网膜病变，更佳地，用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过选自下组的方法施用：静脉内、肌内、皮下、口服、粘膜接触、腹膜内、病灶内，但不限于此。

在本发明中，所述载体可通过注射向眼睛施用。例如，所述载体可通过视网膜下注射、脉络膜上注射、或玻璃体腔内注射向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码抗VEGF融合蛋白的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产抗VEGF融合蛋白，含所述抗VEGF融合蛋白的制剂可应用于制备治疗眼部疾病的药物。

治疗方法

本发明提供了治疗VEGF介导的新生血管性眼病的方法，所述方法包括将包含编码抗VEGF融合蛋白核酸序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向视网膜下、脉络膜上或玻璃体腔内施用含本发明核酸的载体。

本发明提供了用于通过向细胞提供感光细胞功能在治疗新生血管性眼病的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列。本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

如本文所用，治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状，包括减少血管渗漏、减少新生血管生成等。

本发明的方法包括将编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与包含编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒，更佳地为腺相关病毒)接触。优选地，细胞是视网膜细胞，优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁶-1×10¹⁶病毒的范围，例如1×10⁷-1×10¹²的范围。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的抗VEGF融合蛋白优化了VEGF trap蛋白的胞外分泌信号肽，与CN112342228A中的融合蛋白相比，在同剂量的AAV产品下能够实现更高的VEGF trap分子表达分泌水平。

(2)本发明的抗VEGF基因表达盒通过优化元件选择，特别是启动子和内含子的组合，实现了比现有药物更高效的目的基因表达，预期能够发挥更优秀且长期的疗效。

(3)本申请的AAV2/GOI-D02基因治疗药物组合用于单次视网膜下腔注射，与现有的nVEGFi药物相比，在动物CNV模型中的治疗有效量更低(40倍)，可以更高效地抑制新生血管渗漏。

(4)本申请的核酸可以使用AAV2.RC-C14(CN202310084749.8)和AAV9.RC-C07V5系列的改造AAV载体进行表达。与野生型AAV2和AAV9相比，改造的AAV载体可以更有效穿透视网膜内外界膜，转导视网膜全层，包括光感受器层(photoreceptor,PR)和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)。与现有AAV2.7m8相比，改造的AAV载体在灵长类动物中有更好的全视网膜的感染和RPE的转导，更适合以玻璃体腔注射(intravitrealinjection,IVT)给药方式将穿梭基因递送到视网膜多层的疾病，包含不同类型的AMD。与现有药物ADVM-022相比，RC-C14/GOI-D02基因治疗药物具有有更好的剂量和目的基因表达关系(～4倍)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1穿梭基因质粒图谱和调控元件对目的基因表达的影响

首先，构建了多个具有不同的启动子和内含子的组合的GOI质粒。采用SEQ ID NO:4所示的VEGF trap编码序列，其中已对CpG序列的百分比、人源密码子等进行了优化。使用Ig kappa chain分泌信号肽(SEQ ID NO:11)。将该编码序列构建在CAG启动子(SEQ ID NO:6)和泛素基因UBC启动子(SEQ ID NO:5)的下游，并与CAG内含子(SEQ ID NO:9、10)、或者UBC内含子(SEQ ID NO:8)、或者UBC-CAG嵌合内含子(SEQ ID NO:7)组合，形成不同组合的GOI质粒。采用不同设计的GOI质粒、野生型AAV2衣壳质粒和辅助质粒进行3质粒转染HEK293悬浮细胞进行AAV病毒包装和纯化(AAV亲和层析及阴离子层析2步纯化)。纯化后的病毒用于HEK293T细胞的感染和表达检测。

将293T细胞按4E5/孔接种到24孔板内，按常规方法培养。次日，根据孔板中细胞数量，并按照不同的MOI(3000VG/cell)计算每孔细胞所需AAV的量，将所需AAV加入细胞中进行感染。继续培养72h，收集细胞和上清混合悬液。通过非变性SDS-PAGE和WB(使用HRP辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L))检测VEGF trap的表达。

图1的WB结果显示，不同的启动子和内含子组合展现出不同的VEGF trap表达水平，虽然较长的CAG内含子可以提升CAG启动子(CAGp)下的表达，且略高于UBC启动子/UBC内含子的组合，但UBC-CAG嵌合内含子与UBC启动子(UBCp)的组合展示出了更高的VEGF trap表达水平。灰度定量显示，UBCp-UBC/CAG嵌合内含子组合产生的VEGF trap蛋白表达量比CAGp-长CAG内含子高22％，比UBCp-UBC内含子高35％。

图1左侧展示了穿梭基因质粒GOI-D02图谱(SEQ ID NO:1)，其中包装在AAV质粒衣壳中的单链DNA序列(SEQ ID NO:2)包括5’-ITR(inverted terminal repeat)、UBC(泛素C)启动子(SEQ ID NO:5)、UBC-CAG嵌合内含子(SEQ ID NO:7)、Ig kappa chain分泌信号肽(SEQ ID NO:11)，VEGF trap编码序列(SEQ ID NO:4)，hGH poly(A)人生长激素聚腺苷酸化信号，3’-ITR的元件序列。

实施例2不同分泌信号肽在细胞水平对表达分泌的影响

为了进一步比较不同信号肽对于VEGF trap蛋白表达分泌的影响，将不同信号肽的编码序列构建于上述质粒中，进行三质粒包装和纯化(采用AAV2衣壳)。采用类似实施例1的实验方法，纯化后的病毒在不同的MOI(0、300、1000、3000、10000VG/cell)条件下感染HEK293T细胞，继续培养72h，分别收集细胞和上清。通过非变性SDS-PAGE和WB(使用HRP辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L))检测VEGF trap的表达和在细胞内外的分布。

图2的WB(半定量估计)显示，来自Ig kappa chain(SEQ ID NO:11)和VEGFR1(SEQID NO:12，参见CN112342228A)的信号肽都可以帮助表达和分泌VEGF trap蛋白，但Igkappa chain和VEGFR1信号肽相比表达效果更优。Ig kappa chain分泌肽(SEQ ID NO:11)转导的细胞的VEGF trap总表达量约是携带VEGFR1分泌肽分子的细胞的1.86倍(图2中对应于300、1000、3000、10000VG/cell的表达倍数分别为2.78，2.29，1.47，1.28倍)。根据MOI量和表达水平计算，表达相当量的VEGF trap蛋白时，所需要的携带Ig kappa chain信号肽的病毒量仅为带VEGFR1信号肽病毒的1/3，大大提升了表达效率，减少了病毒需求量。同时，携带Ig kappa chain信号肽和VEGR1信号肽的表达载体VEGF trap蛋白的胞外分泌量和胞内量的比值分别为2.47和2.08，提示Ig kappa chain分泌肽能够促进VEGF trap分泌到胞外。Ig kappa chain分泌肽产生的具有生物活性的VEGF trap胞外分泌量是VEGFR1分泌肽的1.96倍(图2中300、1000、3000、10000VG/cell分别为2.50，2.30，1.48，1.15倍)。

本实施例的结果提示，Ig kappa chain来源的信号肽对于VEGF trap的表达分泌效果更具优势。

实施例3AAV感染细胞表达分泌的VEGF trap蛋白能有效与VEGF抗体竞争结合VEGF165蛋白，并能抑制VEGFR1下游的信号传导活性

实验方法：

用实施例1中制备的重组病毒感染HEK293T细胞(MOI：5000VG/cell)，72小时后收集上清样本，用Amicon Ultra离心式过滤器浓缩上清中的VEGF trap蛋白，并用WB方法定量表达的VEGF trap蛋白浓度。

VEGF165(VEGFa最常见的一个蛋白亚型)竞争结合ELISA实验：通过ELISA试剂盒检测游离VEGF165含量，判断与VEGF trap蛋白结合的VEGF165含量，从而反映分泌的VEGFtrap蛋白的活性。使用阿柏西普作为对照。按照Human VEGF165 ELISA Kit(Sinobiological,KIT11066)的操作手册进行，体系中使用了2ng/ml VEGF165蛋白。实验结果如图3A所示。

基于H_VEGF Reporter 293细胞(吉满生物科技，GM-C09057)检测VEGF165竞争活性：VEGF165可结合H_VEGF Reporter 293细胞的表面VEGFR受体，促进细胞中荧光酶素表达。当VEGF165被重组AAV感染细胞表达分泌的VEGF trap蛋白结合后，H_VEGF Reporter293细胞中荧光酶素表达下降，因此通过检测细胞荧光酶素表达水平可反映VEGF trap蛋白的活性。使用阿柏西普作为对照。

实验结果：

图3显示了检测AAV2/GOI-D02感染HEK293T细胞后表达分泌的蛋白分子在体外竞争性结合VEGFA(图3A)及对其下游的细胞生物活性抑制作用(图3B)。与作为对照的阿柏西普相比，重组分子转导细胞后表达分泌的VEGF trap蛋白显示了较优的体外结合力和生物活性。AAV2/GOI-D02表达的VEGF trap蛋白和阿柏西普在体外竞争性结合VEGF165的ELISA实验中的平均IC₅₀分别是9.6和33.6pM；在基于H_VEGF Reporter 293细胞报告基因的实验中的平均IC₅₀分别是242.95和496.0pM。这也显示了GOI-D02编码的VEGF trap有较好的VEGFA结合及抑制其与VEGFR作用和下游的细胞信号传导的作用。该生物活性优势可能是由于GOI-D02编码的蛋白中增加的GPG连接肽进一步改善了蛋白分子的稳定性。

实施例4改造的AAV血清型(RC-C14和RC-C07V5及系列)在鼠眼内的转导活性和组织分布比较

自发荧光(autofluorescence,AF)检测方法：

活体自发荧光检测(AF)的检测步骤：将6-8周龄的C57小鼠(集萃生物提供)按每组2只小鼠分为6组，双眼玻璃体腔给药；每组检查4只眼睛的AF。双眼眼表进行滴加药物进行散瞳，使用舒泰混合液按照60mg/kg麻醉剂量麻醉小鼠，双眼滴加表面麻醉剂，眼表涂上凝胶佩戴角膜接触镜。将检查设备的HRA控制面板进入IR模式，对焦小鼠眼底直至图像清晰，然后切换至FA模式，调节SENS值至100，调节焦距至能清晰看到视网膜的血管，降低SENS值至60，开始进行照片的拍摄，保证照片的曝光强度在合理区间。

现有文献记载，在IVT眼内给药方式下，AAV2.7m8血清型病毒在鼠视网膜组织的转导效率与AAV2相比有显著提高。本实施例中采用RC-C14(AAV2.7m8变体血清型，其病毒衣壳VP1序列如SEQ ID NO:13所示)和AAV2血清型作为对照，检测RC-C07变体血清型的转导活性。RC-C07血清型是AAV9的改造体，实施例2结果得出野生型AAV2体外转导活性较低，推测亲本在玻璃体注射途径下转导视网膜的组织的能力有限，而理性设计的变体血清型在光感受器细胞中的转导活性得到了显著提升。在此通过体内实验对变体衣壳的转导活性进行有效性验证。

图4A-4B显示了在IVT玻璃体注射方式下，RC-C07系列的四个变体衣壳与现有两种血清型载体在视网膜组织中病毒分布和转导活性的比较。将6种血清型(AAV2、RC-C14、RC-C07V1、RC-C07V2、RC-C07V5和RC-C07V7，其中RC-C07V1，RC-C07V2，RC-C07V7结构及序列参见中国专利申请202311491510.9)分别通过玻璃体腔内给药，每只眼的病毒给药剂量是E9vg。在给药6周后评估rAAV-EGFP病毒在视网膜组织中的转导活性。在给药2周，4周和6周三个时间点进行活体自发荧光拍照(BAF)，检测每组小鼠左右眼底的荧光强度。

图4A-4B显示，IVT给药两周后，四个变体血清型对应的小鼠眼底均能够检测到自发绿色荧光信号，其中AAV2给药组的荧光信号最弱，RC-C14给药组的荧光信号较其他血清型略强，但存在个体之间的差异。给药6周后，C07V1，C07V2和C07V7变体的荧光信号随着给药时间的延长而持续增强，对照组(RC-C14)未见明显的增强。

荧光面积(图4C-4D)和平均荧光强度(图4E-4F)的统计结果进一步显示，在玻璃体腔内给药6周后，RC-C07V2和RC-C07V7给药组小鼠眼底荧光信号与4周相比显著增强，而RC-C07V5给药组小鼠的眼底荧光强度和荧光面积与实验对照(RC-C14)相当。

进一步将给药6周后的小鼠进行眼球取材，将视网膜组织的冰冻切片，进行RPE65抗体或Opsin抗体(购自Abcam)的免疫荧光染色(红色标记的是RPE细胞层，或光感受器细胞；DAPI标记的细胞核；绿色荧光代表的是rAAV感染细胞后的自发荧光)。从小鼠视网膜组织的免疫荧光图片可以发现，IVT给药的方式(图4G-4H)，除对照组(AAV2)外，其余四种变体血清型(RC-C07V1、RC-C07V2、RC-C07V5，RC-C07V7)均能够高效感染视网膜内层组织(神经节细胞层、神经纤维层，内核层)。从全自动扫描拍照设备拼接的视网膜完整大图上可以清晰的观察到变体血清型的组织分布，其中RC-C07V5(其病毒衣壳VP1序列如SEQ ID NO:15所示)表达的绿色荧光信号在视网膜内层组织中分布最广，荧光亮度最强。进一步比较分析视网膜外层的荧光情况可以发现，RC-C07V2和RC-C07V5两个变体可以充分转导视网膜的外网状层，外核层以及部分光感受器层(PR)的内节，进一步表明RC-C07V2和RC-C07V5经玻璃体腔注射后，能在整个视网膜组织中广泛分布，荧光亮度与对照组AAV2相比得到了显著增强，对内界膜(ILM)的穿透力高于现有血清型(AAV2.7m8)。

实施例5：改造的衣壳在体外HEK293细胞高效递送和表达分泌VEGF trap蛋白

类似实施例2中，采用3质粒转染方法制备RC-C14/GOI-D02重组AAV病毒并体外感染HEK293T细胞。72小时后分别收集细胞和上清进行WB检测，用GAPDH作为细胞内参。

图5的结果显示衣壳RC-C14包装的重组AAV也能高效感染HEK293T细胞，表达和分泌VEGF trap蛋白，且蛋白分泌不受AAV衣壳改造的影响，胞外和胞内蛋白量的比值约为2.1-3.1(WB半定量检测)。

实施例6：重组AAV在小鼠眼内注射能长期表达VEGF trap蛋白分子并显著抑制小鼠CNV模型新生血管渗漏

小鼠视网膜下注射和眼底激光光凝诱导CNV模型造模

野生型C57BL/6J小鼠(6-8月鼠龄)分为4组，包括3个AAV2/GOI-D02剂量组(1E8和1E7、1E6 VG/eye)、溶媒制剂对照组、和无处理对照组(NC)。经腹腔注射麻醉剂进行全身麻醉，麻醉剂为60mg/kg的50+8mg/kg盐酸赛拉嗪，用0.9％氯化钠注射液配至所需浓度。用0.5％复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)散瞳，0.4％盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)眼睛局部麻醉，氧氟沙星眼膏(迪可罗)眼表涂抹。在手术显微镜下，用一次性注射针头在角巩膜缘内侧刺穿巩膜，用带有36G平针头的微量注射器沿穿刺口进入并绕过晶状体后到达玻璃体，然后逐渐进针至视网膜下腔隙，缓慢推注，完成视网膜下腔药物递送，注射结束将小鼠置于温暖的环境进行复苏，待苏醒后将其放回笼盒。

激光造模当日定为第0天。使用如上方法麻醉小鼠。将眼科激光治疗仪(激光光凝仪)参数调整为激光能量160mw，激发时间0.1s，激光光斑直径50μm。用盖玻片轻轻压住小鼠眼睛，充分暴露视轴，调节激光光凝仪位置直到能够看到清晰眼底和激光点为止，发射激光进行造模，每只小鼠的双眼根据实际情况各光凝3或4个点。造模结束将小鼠置于温暖的环境进行复苏，待苏醒后将其放回笼中。小鼠在持续饲养6个月后进行激光造模。

眼底荧光血管造影检测(FFA)

在激光造模后第3、5、10、13天分别进行小鼠眼底荧光血管造影(FFA)检查。荧光素钠原液稀释10倍备用。经腹腔注射麻醉剂进行全身麻醉，0.5％复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)散瞳，0.4％盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)眼睛局部麻醉。待小鼠完全麻醉后，给其戴上角膜接触镜，将小鼠放置在共焦激光同步血管造影系统(HRA)的前置操作台上。每只小鼠皮下注射10％荧光素钠稀释液0.1mL，共焦激光同步血管造影系统(HRA)调整到FA模式并且开始计时，注射荧光素钠后5-15分钟内完成眼底荧光成像。以拍到所有激光形成的CNV病灶造影为目的。

CNV病灶分析

将小鼠眼底荧光血管造影的拍摄结果用ImageJ软件进行亮度调整。在保证检查仪器参数不变的前提下，在原始图片中选取一张眼底动静脉亮度适中的图片作为参照亮度，使用ImageJ对其余图片进行对应的亮度调节，最终达到所有图片中视网膜中心血管亮度接近。根据CNV病灶分级标准(表1)区分记录各个病灶级别。使用Graphad的列联表(Ccontingency tables)卡方检验(Chi-square test)检验组间某一时间点不同CNV病灶的个数比例在不同组间是否有显著性差异。因为3-4级的CNV病灶毛细血管渗漏程度过高，有时会出现相邻的3-4级病灶融合，对于融合的CNV病灶，仍按照激光导致的光斑个数进行统计。

表1 CNV病灶分级标准

CNV病灶分级	荧光表现
		0级	无荧光
1级	无高荧光
		2级	高荧光无渗漏
3级	光斑高荧光，轻度荧光素渗漏，渗漏不超过光斑边缘
		4级	光斑高荧光，显著荧光素渗漏，渗漏超过光斑边缘

结果

为了观察本发明描述的药物在动物体内的长期表达效果，在用药后的6个月中，阶段性地取材(用药后2、4、5、6个月)并检测整个眼球中VEGF trap的蛋白(图6A)和RNA(图6B)表达量，结果均以相应的beta-actin表达量为内参进行归一化。注射溶媒制剂液和无药物干涉(NC)的小鼠眼中未能检测到相应的蛋白或者RNA；而3个剂量组呈现了明显的剂量依赖的稳定表达，且随着时间看到VEGF trap蛋白水平的提高。

另外，在中老年小鼠(12-14月龄)中观察了AAV2/GOI-D02在眼内下腔注射后对激光诱导的CNV新生血管渗漏的治疗作用。图6C显示，野生型C57BL/6J小鼠眼底激光光凝诱导CNV模型后的观察期内，病灶和渗漏程度变得更为严重(NC和溶媒(buffer)组)。而注射了1E8和1E7 VG/eye AAV2/GOI-D02药物的2组小鼠显示了明确的药效，体现在D5、D10和D13有明显的高级病灶减少甚至消失。而超低剂量组(1E6 VG/eye)没有显示出明确的药效。

该结果与观察到的目的基因表达量相符。更重要的是，该结果说明AAV2/GOI-D02在视网膜下用药时也可以有效表达VEGF trap蛋白，抑制小鼠激光诱导的CNV模型的新生血管渗漏；并且1E7 VG/eye是针对该模型的最低的有效剂量。

与现有药物的比较

与现有的CNV基因治疗药物比较，本发明中的AAV2/GOI-D02分子所需要的有效剂量非常低，体现了本发明的基因治疗药物的优势。

在结构上，本发明的VEGF trap蛋白包含VEGFR1的IgC结构域2，VEGFR2的IgC结构域3，GPGlinker/Fc-Hinge铰链区；与现有技术CN112342228A差异之处在与本发明分子的C-端为IgG1 Fc CH2结构域，CN112342228A中采用了IgG4 Fc CH2结构域并带有C端HA标签。HA标签并非VEGF trap活性所必须，IgG1和IgG4的序列和功能比较相似。另一个差异是本发明采用的是来自Ig kappa chain免疫球蛋白轻链的分泌信号肽；而CN112342228A中采用的是来自VEGFR1的信号肽。

与阿柏西普(应用于ADVM-022技术)比较，本发明的VEGF trap分泌蛋白没有N端的3个氨基酸“SDT”，但在Fc-Hinge铰链序列前加了一个GPG的短linker。

图6D显示了利用类似实验方法检测CN112342228A中的AAV2分子对小鼠CNV模型药效的结果。结果显示1E8和1E9 VG/eye的剂量使用可以很好地抑制小鼠激光诱导的新生血管渗漏，而低剂量1E7VG/ml几乎没有改善。在相同的给药途径下，CN112342228A中的药物分子在小鼠CNV模型中的最低有效剂量约为1E8VG/eye，是本发明的AAV2/GOI-D02的10倍。

另一种现有抗VEGF分子是nVEGFi，在结合并抑制VEGF方面，其活性与阿柏西普Aflibercept相当。两者(nVEGFi&Aflibercept)都使用含CB7(chicken beta actin)启动子的基因表达盒及AAV8作为递送系统，用于C57BL/6J小鼠的视网膜下腔给药和CNV模型的治疗实验中。两者表现出类似的最低有效剂量，均为4E8 VG/eye。AAV8/CB7-nVEGFi在4E6和4E7 Vg/eye的用药剂量时，都和PBS buffer组一样对CNV新生血管渗漏没有任何改善。本发明的AAV2/GOI-D02相比于现有药物分子AAV8/nVEGFi和AAV8/Aflibercept，最低有效剂量降低了40倍，在临床应用有效性、减少副作用、降低生产成本中有更大的优势。

实施例7：重组AAV在NHP眼内注射能长期表达VEGF trap蛋白分子并显著抑制非人灵长类CNV模型新生血管渗漏。

采用激光光凝法建立恒河猴脉络膜新生血管(CNV)模型，考查AAV2/GOI-D02单次视网膜下腔给药(Subretinal，组IV)和RC-C14/GOI-D02单次玻璃体腔注射(IVT，组III)给药后对恒河猴CNV的抑制作用。作为对照，设置溶媒对照组(组I)和AAV2/GOI-D02单次玻璃体腔注射组(组II)。激光造模前4周进行给药，给药体积均为50μl，病毒给药剂量为2.5E11VG/眼。给药后3周进行眼底激光光凝仪诱导CNV模型，试验期间每天对动物进行一般临床观察，并阶段性地进行眼科检查及眼底照相(FP)。于给药后5、6、7、8周对动物进行FFA检测，用4级法对CNV进行分级，根据4级(重度)渗漏光斑的荧光渗漏面积和视网膜下高反射信号物质(SHRM)厚度进行有效性评价。

实验结果显示，溶媒制剂对照组在激光造模后的新生血管渗漏没有改善，其眼底照相(FP)和FFA影像中可以观察到部分病灶的恶化和融合。而AAV2/GOI-D02单次视网膜下腔给药(组IV，图7A)和RC-C14/GOI-D02单次玻璃体腔注射(组III，图7B)后5-8周都能看到明显的改善，表现为病灶的减少和渗漏面积的降低。统计结果见图7C，其中a表示与溶媒对照组比较，p≤0.05；b表示与AAV2/GOI-D02单次玻璃体腔给药比较，p≤0.05。这些影像结果与VEGF trap蛋白的检测结果相符(图7D)。溶媒对照组玻璃体液和视网膜/脉络膜复合物中VEGF trap蛋白均为阴性。玻璃体腔注射AAV2/GOI-D02组的视网膜/脉络膜复合物中未检测出表达产物；玻璃体液中蛋白表达产物浓度平均值为37.63ng/mL。玻璃体腔注射RC-C14/GOI-D02组的视网膜/脉络膜复合物、玻璃体液中蛋白表达产物浓度分别为197.41和1727.82ng/mL。视网膜下腔注射AAV2/GOI-D02组在视网膜/脉络膜复合物、玻璃体液中浓度分别为2308.02和380.72ng/mL。

与预期相符，AAV2野生型衣壳适用于视网膜下腔的新生血管疾病的治疗，但不能很好地用于玻璃体腔注射；由AAV2定向改造得到的RC-C14新型衣壳可以很好地用于玻璃体腔注射，高效表达VEGF trap，甚至达到视网膜/脉络膜复合物。同时，以上结果说明GOI-D02基因表达盒可以很好地用于不同衣壳和注射方式，长期高效表达分泌VEGF trap蛋白，起到抑制新生血管渗漏的效果。

与现有药物的比较

现有药物ADVM-022的实验中，在非人灵长类的眼视网膜下腔注射了ADVM-022(AAV2.7m8/CMVp-Aflibercept)，剂量为2E12 VG/eye，在3个月后大部分猴眼的玻腔液中检测到的Aflibercept的量约为2-4ug/ml。本实施例的III组中RC-C14/GOI-D02的单次玻璃体腔注射2.5E11 Vg/eye(ADVM-022的剂量的1/8)，但在玻腔液中检测到的VEGF trap蛋白量平均值约为1.7ug/ml，仅稍稍低于ADVM-022药物的表达量。本发明的RC-C14/GOI-D02组合的量效优势至少达到ADVM-022的3-4倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列

SEQ ID NO:1穿梭质粒GOI-D02全长DNA序列(6529bp)

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATAGAACCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTAAGGCGCGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGAGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGACAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcaagcttaagaattccaccatgggcagcgcagctctgctgctgtgggtgctgctgctctgggtgcccagctccagagccggaagacccttcgtggagatgtacagcgagatccccgagatcattcacatg

accgaaggcagagagctggtgatcccctgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgaccctgaaaaagttcc

ccctcgacacactgatccccgacggcaaaagaatcatctgggacagcagaaagggctttatcattagcaacgc

cacctacaaggaaatcggcctcctgacctgcgaagccaccgtgaacggccacctgtacaagaccaactacctg

acacaccggcagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgtccccctcccacggcatcgagctgtccgttggcg

agaaactggtgctgaactgcaccgcccgcaccgaactgaacgtgggcatcgacttcaactgggagtaccccag

cagcaagcaccaacacaagaagctggtgaaccgggacctgaagacccaatccggctccgaaatgaagaaattc

ctgagcactctgaccatcgacggcgtgaccagaagcgaccagggactgtacacctgcgccgcatcctccgggc

tgatgaccaaaaagaacagcactttcgtcagagtgcacgagaagggccccggagacaagacccacacatgccc

tccctgccccgcccctgaactgctgggcggcccctccgtgttcctgttcccccctaagcctaaagacactctg

atgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtcgtggacgtctcccacgaagatcccgaggtgaagttca

actggtacgtggacggcgtcgaagtccacaacgccaaaaccaaaccccgcgaagaacagtacaacagcacata

cagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctcaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagc

aacaaggccctgcccgcccctatagagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgt

acaccctgcctcccagccgcgacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttcta

ccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctcccgtg

ctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacg

tgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccctgg

caagtgaGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCT

CTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGT

CTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGAC

AACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATC

TCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCA

GGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTA

ATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCT

GTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCAC

TCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG

GCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATC

TGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCG

GGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCC

CTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATT

TAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGA

TAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAA

CACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAA

TGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTC

AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGAC

GGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTT

TTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATG

ATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTT

TCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG

GAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGAT

TTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGC

CCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAG

ACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGG

TTACTCACCACTGCGATCCCTGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATA

TTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGA

TCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGAC

GAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAG

TCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGT

TGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCT

TCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGA

TGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTT

TTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG

TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCT

GCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTT

TCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCAC

CACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTG

GCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC

GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTA

TGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAG

AGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACT

TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTA

CGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

SEQ ID NO:2穿梭基因DNA序列(1-3977bp)

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATAGAACCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTAAGGCGCGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGAGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGACAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcaagcttaagaattccaccatgggcagcgcagctctgctgctgtgggtgctgctgctctgggtgcccagctccagagccggaagacccttcgtggagatgtacagcgagatccccgagatcattcacatgaccgaaggcagagagctggtgatcccctgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgaccctgaaaaagttccccctcgacacactgatccccgacggcaaaagaatcatctgggacagcagaaagggctttatcattagcaacgccacctacaaggaaatcggcctcctgacctgcgaagccaccgtgaacggccacctgtacaagaccaactacctgacacaccggcagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgtccccctcccacggcatcgagctgtccgttggcgagaaactggtgctgaactgcaccgcccgcaccgaactgaacgtgggcatcgacttcaactgggagtaccccagcagcaagcaccaacacaagaagctggtgaaccgggacctgaagacccaatccggctccgaaatgaagaaattcctgagcactctgaccatcgacggcgtgaccagaagcgaccagggactgtacacctgcgccgcatcctccgggctgatgaccaaaaagaacagcactttcgtcagagtgcacgagaagggccccggagacaagacccacacatgccctccctgccccgcccctgaactgctgggcggcccctccgtgttcctgttcccccctaagcctaaagacactctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtcgtggacgtctcccacgaagatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtcgaagtccacaacgccaaaaccaaaccccgcgaagaacagtacaacagcacatacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctcaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccctatagagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgtacaccctgcctcccagccgcgacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccctggcaagtgaGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

VEGF trap蛋白和编码

SEQ ID NO:3VEGF trap蛋白

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGPGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SEQ ID NO:4VEGF trap编码DNA(1989-3312)

ggaagacccttcgtggagatgtacagcgagatccccgagatcattcacatgaccgaaggcagagagctggtgatcccctgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgaccctgaaaaagttccccctcgacacactgatccccgacggcaaaagaatcatctgggacagcagaaagggctttatcattagcaacgccacctacaaggaaatcggcctcctgacctgcgaagccaccgtgaacggccacctgtacaagaccaactacctgacacaccggcagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgtccccctcccacggcatcgagctgtccgttggcgagaaactggtgctgaactgcaccgcccgcaccgaactgaacgtgggcatcgacttcaactgggagtaccccagcagcaagcaccaacacaagaagctggtgaaccgggacctgaagacccaatccggctccgaaatgaagaaattcctgagcactctgaccatcgacggcgtgaccagaagcgaccagggactgtacacctgcgccgcatcctccgggctgatgaccaaaaagaacagcactttcgtcagagtgcacgagaagggccccggagacaagacccacacatgccctccctgccccgcccctgaactgctgggcggcccctccgtgttcctgttcccccctaagcctaaagacactctgatgatcagcagaacccccgaagtgacctgcgtggtcgtggacgtctcccacgaagatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtcgaagtccacaacgccaaaaccaaaccccgcgaagaacagtacaacagcacatacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctcaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccctatagagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgtacaccctgcctcccagccgcgacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccctggcaagtgaGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATC

启动子

SEQ ID NO:5Ubc启动子(150-549)

GGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGT

SEQ ID NO:6CAG启动子

TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

内含子

SEQ ID NO:7UBC-CAG嵌合内含子(550-1844)

GAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATAGAACCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTAAGGCGCGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGAGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGACAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACC

SEQ ID NO:8 Ubc内含子:

GAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATAGAACCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAGCTAAGGCGCGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATCTAGAGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAA

SEQ ID NO:9 CAG嵌合内含子(long):

GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG

SEQ ID NO:10 CAG嵌合内含子(short)

TCTAGACAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACC

分泌信号肽

信号肽来源	信号肽序列
		Human Ig kappa chain(SEQ ID NO:11)	MGSAALLLWVLLLWVPSSRA
Human VEGFR1(SEQ ID NO:12)	MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSG

AAV载体衣壳

SEQ ID NO:13RC-C14 VP1氨基酸序列(来自专利申请号CN 2023100847498)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVTTTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGDVTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:14RC-C14 VP1碱基序列

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCAcCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGATGTAACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTaTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

SEQ ID NO:15RC-C07V5 VP1氨基酸序列(来自专利申请号2023114915109)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNLQRGNLALGDVTRPARQAATADVNTQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

SEQ ID NO:16RC-C07V5 VP1碱基序列

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACCAACCTCCAGAGAGGCAACCTAGCACTCGGCGACGTGACAAGACCTGCTAGGCAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

SEQ ID NO:17AAV9衣壳蛋白替换肽

LQRGNRQAATADVNT

SEQ ID NO:18衣壳蛋白插入的功能肽

LALGDVTRPA

SEQ ID NO:19AAV9衣壳蛋白替换肽

LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT。

Claims (10)

1.一种抗VEGF融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有式I结构：

L-V-H-Fc(I)

式中，各“-”独立地为键或连接肽；

L为分泌信号肽，所述分泌信号肽来源于Ig kappa链；

V为抗VEGF蛋白，所述的抗VEGF蛋白包括VEGFR1的IgC结构域2和VEGFR2的IgC结构域3；

H为任选的铰链区；

Fc为任选的免疫球蛋白可结晶片段。

2.如权利要求1所述的抗VEGF融合蛋白，其特征在于，所述分泌信号肽的序列如SEQ IDNO:11所示。

3.如权利要求1或2所述的抗VEGF融合蛋白，其特征在于，所述V的序列如SEQ ID NO:3第1-202位所示。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含编码如权利要求1所述抗VEGF融合蛋白的核酸分子。

5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’-3’端具有式II结构：

Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5(II)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无或5'ITR序列；

Z1为启动子；

Z2为内含子；

Z3为编码如权利要求1所述的抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列；

Z4为无或hGHpA序列；

Z5为无或3'ITR序列。

6.如权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述启动子选自下组：UBC启动子、CAG启动子、或其组合。

7.如权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述的内含子选自下组：UBC-CAG嵌合内含子、CAG内含子、UBC内含子、或其组合。

8.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

9.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的表达盒。

10.一种AAV载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体含有如权利要求4所述的表达盒。