CN1294088C - 工程菌株处理合成制药废水的生物技术方法 - Google Patents
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Abstract
一种特效菌株降解处理合成制药废水的方法，由白腐真菌(亲株1)、土著细菌XZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，用所述基因工程菌处理制药废水：废水先经调节池进行酸碱调节，pH值，6.8-8.0；然后在反应器中曝气、沉淀，并将污泥池中污泥回流至曝气反应池，处理温度，30±2℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。本发明降解合成制药废水的最大比降解率qmax＝11.188d-1，具有高降解、高絮凝、高适应优势；提高生物负荷效率56%以上，节约68%反应器体积的建筑费用。原生质体融合不产生新基因，NJU-Xhhh1特效菌株不存在基因污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程微生物Xhhh菌株处理合成制药废水的生物技术方法。
背景技术
国际上已有多种处理废水工程菌株，但是没有应用原生质体融合工程菌株处理合成制药废水的专利。典型的如日本的EM，又如美国PARADISF公司的高智能微生物HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)等.而国内外应用原生质体融合工程菌株专用于处理合成制药废水目前仍是空白。如某公司合成生产神经调节类药物，废水中含有机氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其中持久性有机污染物POPs(persistent organic pollutants)及环境激素EH(environmental hormone)类污染物多达16种以上。它们难以被土著微生物快速降解，对人类存在着致癌症和降低精子数量与质量的分子遗传毒性，对环境潜在着破坏生物多样性的分子生态毒性。现有的菌种不能有效和长期稳定的处理高浓度的制药有机废水。
发明内容
本发明目的是提供原生质体融合工程菌株高效处理合成制药废水的方法。尤其是应用本发明构建的原创性的基因工程工程菌NJU-Xhhh1为出发菌株，具有白腐真菌的高降解性、土著细菌XZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理合成制药有机废水。
本发明的目的是这样实现的：将原创性工程菌株处理合成制药有机废水生物技术。(1).技术构思：以本发明构建的原创性的基因工程工程菌NJU-Xhhh1为出发菌株，菌株具有白腐真菌的高降解性、土著细菌XZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理合成制药有机废水。配套相关的应用技术，在国内外具有原创性与持久性。
(2).技术构成：
出发菌株NJU-Xhhh1工程菌：是本发明的原创性科研成果。NJU-Xhhh1工程菌由白腐真菌(亲株1)、土著细菌XZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌，即中国微生物菌种普通微生物中心的1087号微生物。NJU-Xhhh1工程菌集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理制药有机废水。国际公认原生质体融合构建的新菌株，不存在基因污染问题，所以NJU-Xhhh1工程菌剂也不存在基因污染问题。
用所述基因工程菌处理制药废水的方法是：废水先经调节池进行酸碱调节，pH值，6.8-8.0；然后在反应器中曝气、沉淀，并将污泥池中污泥回流至曝气反应池，其处理工艺参数为：处理温度，30±2℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。
NJU-Xhhh1工程菌由
亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、
亲 株2土著细菌XZ1(Bacillus)、
亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体融合而成。先经原生质体制备：用蜗牛酶脱去真菌的细胞壁或用溶菌酶脱去细菌的细胞壁、生成原生质体并经离心收集原生质体、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的
亲株1白腐真菌细胞和
亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Xhh；而
亲株1白腐真菌细胞和
亲株2土著细菌XZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长；第二次融合：上次得到的等量的Xhh和
亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在SIM1、SIM2、SIM3三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Xhhh1或Xhhh。
其中：白腐真菌PC[真核细胞]、土著菌XZ1[原核细胞]、酿酒酵母SC[真核细胞]。
SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)；
SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)；
SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
制备NJU-Xhhh1工程菌剂的液体培养基：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO30.5g；Na2SO4 0.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度：35±2℃；最适pH：7.0。
制备NJU-Xhhh1工程菌剂的发酵工艺：
发酵设备：全自控生物反应器；
发酵工艺：连续稳定发酵系统；发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应器中溶解氧，≥2mg/L；，矿物盐流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌体浓度，2-10g/L；在含C、P、N培养液中培养。
表1.NJU-Xhhh1工程菌剂发酵工艺参数
| 工艺参数 | 数值 | 工艺参数 | 数值 |
| T，发酵温度，℃P，罐压，(1大气压＝105Pa)，PaFa，清洁空气供气量，m3/kgCODRr，搅拌转速，rpmPHDO，反应器中溶解氧，mg/LVa，反应液装量，％So，培养液C源浓度，gCOD/LSn，培养液N源浓度，gTN/L | 30±25×105＜75≤10007.0±1≥280≤8.480.50 | Sp，培养液P源浓度，gTP/LSf，C/N/P培养液流量，V/(V.d)Mr，矿物盐流量，V/(V.d)X，菌体浓度，g/LHRT，反应液发酵时间，hFr，加硅油消泡剂流速μ，比增长率，mg/mgL h-1q，培养液比利用率，h-1Yo，菌体产量率系数，％ | 0.100.330.0034.998Sf＜0.1270.21159 |
发明的有益效果：
(1)NJU-Xhhh1工程菌剂的生产成本低，仅为500元/吨左右，售价可以远低于进口的菌剂；
(2)NJU-Xhhh1工程菌剂具有三亲株的三高优势；提高处理效率和节约费用50％以上；
(3)NJU-Xhhh1工程菌剂既可处理有毒有机废水，也可处理常规有机废水；
(4)NJU-Xhhh1工程菌剂应用原生质体融合工程菌，不产生新基因，没有基因污染问题。
总之，本发明菌剂比土著菌提高降解废水效率和节约运行费用50％以上。本发明是应用原生质体融合的原创性工程菌，是制备处理合成制药废水工程菌剂的首例。尤其是应用具有国际原创性的工程菌，制备的工程菌剂在成本和售价上具有国内推广的优势。降解合成制药废水具有高降解、高适应、高絮凝优势，并有较好的稳定适应性。
附图说明
图1为本发明工程菌株NJU-Xhhh1处理合成制药废水工艺流程示意图
具体实施方式
参见图1NJU-Xhhh1工程菌剂制备技术的发酵工艺流程：尤其是通过多级曝气池(如图中三级)进行曝气，沉淀池中回流至第一曝气池。经过二至三级的反应器曝气。
实施例：NJU-Xhhh1工程菌剂制备及其降解合成制药废水
(1)NJU-Xhhh1工程菌剂制备物的保存配方(4℃)
配方1：NJU-Xhhh1工程菌剂发酵液，不加任何其它成份；
配方2：NJU-Xhhh1工程菌剂发酵液+抗氧化剂巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；
配方3：NJU-Xhhh1工程菌剂发酵液+Fe3+，(终浓度0.14％)；
配方4：NJU-Xhhh1工程菌剂发酵液+Fe3+-巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；
(2)NJU-Xhhh1工程菌剂制备实例总结
制备工程菌剂的发酵工艺控制条件是：DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液体培养基流量)＝0.33(V/V)；搅拌转速：1000rpm；硅油除泡沫；矿物盐流量：0.003(V/V)；保存NJU-Xhhh1工程菌剂的最佳条件是：4℃保存，工程菌发酵液+巯基乙醇(SH)；
(3)NJU-Xhhh1工程菌株降解处理合成制药废水的水质参数背景
| 参数名称 | 参数值 | 参数名称 | 参数值 | 参数名称 | 参数值 |
| CODcr(mg/L)BOD5(mg/L)PHT(℃)TP(mg/L)TN(mg/L)Al(mg/L)Ba(mg/L)Be(mg/L) | 4123276.5-8.0250.603.001.000.094＜0.002 | Ca(mg/L)Cd(mg/L)Co(mg/L)Cr(mg/L)Cu(mg/L)Fe(mg/L)K(mg/L)Mg(mg/L)Mn(mg/L) | 136＜0.0030.006＜0.0080.2101.24011320.087 | Na(mg/L)Pb(mg/L)Se(mg/L)Si(mg/L)Sr(mg/L)Ti(mg/L)V(mg/L)Zn(mg/L)PoPs种类 | 202＜0.050＜0.0500.2400.5200.015＜0.0030.24016种以上 |
(4)NJU-Xhhh1工程菌株(剂)降解合成制药废水动力学参数：
| 序号 | 动力学参数 | XZ亲株 | PC亲株 | SC亲株 | Xhhh |
| 123456 | 最大比降解率qmax(d-1)qmax/2常数KSq(mg/L)最大比增长率μmax(d-1)μmax/2常数Ksμ(mg/L)理论产率系数YT(％)细胞衰减系数Kd(d-1) | 3.8060.5172.1970.5450.5690.012 | 11.9980.9000.3570.5710.0470.026 | 2.5340.7120.2201.0350.0990.024 | 11.1880.9782.4691.0910.2060.019 |
(5)NJU-Xhhh1工程菌株(剂)降解合成制药废水生物技术优化结果：其主要控制参数为：污泥回流浓度控制为5-5.5(kg/m3)；水力停留时间为0.6-0.65d；污泥停留时间为20-21d；
| 序号12 | 参数名称与单位进水流量Qo(m3/d)进水So(CODcr，kg/m3) | 工程菌株Xhhh优化技术6000.412 | 土著细菌XZ原有技术6000.412 |
| 34567891011121314151617181920 | 出水Se(CODcr，kg/m3)出水悬浮固体Xe(kg/m3)曝气池生物量X(kg/m3)水力停留时间θ(d)污泥停留时间θc(l/μ，d)回流污泥浓度Xr(kg/m3)回流污泥流量Qr(m3/d)污泥排放浓度Xs(kg/m3)污泥排放流量Qs(m3/d)观察产率系数Yobs(％)理论产率系数YT(％)污泥内源呼吸率Kd(d-1)比增长率μ(d-1)比降解率q(d-1)曝气反应总生物量Wa(kg)污染物去除总量U(Kg/d)污泥排放干重Ws(Kg/d)所需曝气池体积V(m3) | 0.0250.00022.7360.63721.885.3956005.39510.0000.20010.20580.01920.04570.22221045232.247.8Vmin＝382 | 0.1350.07003.0610.92718.666.0366006.03615.1140.54860.56890.00180.05360.09771702166.291.2V＝556 |
节约68％反应器体积的建筑费用；提高生物负荷效率56％。
Claims (9)
1、一种工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是由亲株1白腐真菌、亲株2土著细菌、亲株3酿酒酵母三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌；然后用所述基因工程菌处理制药废水的方法是：废水先经调节池进行酸碱调节，pH值，6.8-8.0；然后在反应器中曝气、沉淀，并将污泥池中污泥回流至曝气反应池，其处理工艺参数为：处理温度，30±2℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。
2、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是；在含P、N营养元素中处理，所述P、N营养元素矿物盐包括Na2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O。
3、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是制备所述基因工程菌的液体培养基的组成是：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO3 0.5g；Na2SO4 0.1g；MgSO4·7H2O； 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；培养方法是在121℃、103kPa、湿热灭菌20min后，接种发酵，培养温度：33-37℃；pH：7.0，发酵10-25小时。
4、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是所述基因工程菌剂制备物保存在抗氧化剂巯基乙醇终浓度0.1-0.3‰+Fe3+终浓度0.1-0.14％的工程菌剂发酵液中。
5、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥回流浓度控制为5-5.5kg/m3；水力停留时间为0.6-0.65d；污泥停留时间为20-22d；回流量控制为100％。
6、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥回流浓度控制为5.395kg/m3。
7、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是水力停留时间为0.6-0.65d。
8、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥停留时间为20-22d。
9、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是经过二至三次反应器中曝气。
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