CN1288239C - 一种具有杀线虫功能的食线虫真菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有杀线虫功能的食线虫真菌及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。本发明菌株通过液体发酵后，从代谢产物中提取杀线虫有效成分，制备为食线虫真菌。生产菌株为狮子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022，其液体发酵培养基配方为：0.1-0.2%明胶；0.6-0.8%胰蛋白胨；0.1-0.2%酵母浸出粉；0.05%硫酸铵；0.001%硫酸亚铁；0.05%硫酸镁；1.129%磷酸氢二钠；1.238%磷酸二氢钠pH6.5，余下为水。提取杀线虫有效成分的方法是，将发酵培养物取上清液，按1∶0.56的比例缓慢加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8500rpm离心15分钟，弃上清。用10mM磷酸缓冲液重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于10-20倍的10mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时。本发明产品对线虫具有毒力高的突出优点，具有较好的潜在应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种具有杀线虫功能的食线虫真菌及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70多种，为害3000多种植物，每年造成的损失巨大。据联合国粮农组织统计，每年因线虫造成损失全球高达1000亿美元。我国线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等主要经济作物，成为发展这些作物的重要限制因子。长期以来，线虫防治主要依赖于化学防治。尽管化学杀线虫剂在线虫防治中发挥了重要作用，但随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用。造成环境污染，危害人体健康，相继有不少被禁用或即将禁用。特别是植物寄生线虫发生于作物根部，由于土壤环境的特殊性，必须大剂量施用才能保证其防效。而大剂量化学农药对地下水污染非常严重。因此，研究开发高效低毒低残留杀线虫剂已经是农业可持续发展中的重要课题。
食线虫菌物是一类线虫天敌，目前市场上成功上市的线虫生防制剂均来源这类菌物。其中，隔指孢菌是重要的类群。
发明内容：
本发明的目的是通过对一株产生胞外蛋白酶分解线虫体壁的狮子山隔指孢真菌的研究，开发生物杀线虫剂。
狮子山隔指孢系本发明人在开展的食线虫菌物研究中，从大量样品中分离发现的一株对线虫具有很好毒杀作用的隔指孢属新种，命名为狮子山隔指孢(Dactylellashizishanna)YMF1.00022，YMF1.00022菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2005年1月27日；保藏登记入册的编号CGMCC No.1311。
本发明狮子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022菌株形态特征为：菌落在CMA培养基上近无色，气生菌丝稀疏，菌丝透明，分隔，分枝，通常宽2.5-3.7μm；分生孢子梗从基质菌丝上长出，单个直立，偶有分枝，高35-200μm，基部宽1.5-2.5μm，向顶部渐细，顶端宽0.5-1.0μm，单个分生孢子着生于分生孢子梗末端；分生孢子透明，棒状，远端钝圆，下端渐细，大小为：22.5-73.8μm，有厚垣孢子，捕食器官为三维菌网。
本发明是这样实现的：
扩大培养狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022，提取杀线虫有效成分，进行杀线虫药效试验，确定其对线虫的作用。
狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022培养方法(以下为重量百分比)：
1、试管种培养
培养基配方为：1-2％葡萄糖，10-20％马铃薯汁(煮沸20分钟后过滤所得)，1.8-2％琼脂；pH自然。将菌丝体接种到培养基上，25-28℃下培养10-14天，获得试管种；
2、液体扩大培养
液体培养基配方为：0.1-0.2％明胶；0.6-0.8％胰蛋白胨；0.1-0.2％酵母浸出粉；0.05％硫酸铵；0.001-0.002％硫酸亚铁；0.05-0.1％硫酸镁；1.129％磷酸氢二钠；1.238％磷酸二氢钠pH6.5，余下为水。将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装60ml，于22-28℃下摇床培养培养时间6-9天，转速为200-230rpm。
3、提取杀线虫活性成份
将发酵培养物用干净纱布滤去菌丝体，取上清液，按1∶0.56的比例缓慢加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8500rpm离心15分钟，弃上清。用10mM磷酸缓冲液(68.5ml的10mM磷酸二氢钠加31.5ml的10mM磷酸氢二钠，pH为6.5)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW：8,000-14400KDa)于10-20倍的10mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。
杀线虫活性试验：
1、制备试验用药剂
按前述液体扩大培养方法培养狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。
2、制备对照用药剂
对照1：按前述制备试验用药剂方法制备对照用药剂，但培养基中不接入狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株。
对照2：为了证明杀线虫有效成份是毒蛋白或者是酶，将制备供试药剂煮沸灭活后作为对照。
对照3：以清水作为对照。
3、制备试验用线虫
1)制备Panagrellus redivivus线虫
将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)
在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3、试验方法：
(1)药效试验方法
取试验用药剂200μl于1.5ml离心管中，分别加入Panagrellus redivivus线虫和松材线虫60条，离心管平放，置于25℃下，分别于12小时、24小时、36小时检查计算线虫的死亡率。并在光学显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况
鉴定死亡的方法为：在处理离心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
分别用3种对照药剂，每处理重复三次。
4、试验结果
表1狮子山隔指孢YMF1.00022对Panagrellus redivivus线虫杀虫效果
| 药剂处理 | 线虫被固定死亡情况 | |||||
| 12小时 | 24小时 | 36小时 | ||||
| 死亡率％ | 线虫变化 | 死亡率％ | 线虫变化 | 死亡率％ | 线虫变化 | |
| 试验用药剂 | 90 | 虫体僵直 | 98 | 体壁大多溶解 | 100 | 绝大部份溶解 |
| 对照1 | 10 | 无变化 | 20 | 未溶解 | 30 | 体壁完整 |
| 对照2 | 10 | 无变化 | 10 | 未溶解 | 20 | 体壁完整 |
| 对照3 | 10 | 无变化 | 10 | 未溶解 | 21 | 体壁完整 |
表2狮子山隔指孢YMF1.00022对松材线虫杀虫效果
| 药剂处理 | 线虫被固定和死亡情况 | |||||
| 12小时 | 24小时 | 36小时 | ||||
| 死亡率(％) | 线虫变化 | 死亡率(％) | 线虫变化 | 死亡率(％) | 线虫变化 | |
| 试验用药剂 | 40 | 虫体僵直 | 60 | 虫体僵直 | 80 | 虫体僵直 |
| 对照1 | 5 | 体壁完整 | 10 | 体壁完整 | 15 | 体壁完整 |
| 对照2 | 10 | 体壁完整 | 15 | 体壁完整 | 25 | 体壁完整 |
| 对照3 | 11 | 体壁完整 | 13 | 体壁完整 | 22 | 体壁完整 |
结果表明，从狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株液体发酵产物中提取的试验用药剂对Panagrellus redivivus线虫具较好的毒杀作用，线虫24小时的死亡率达98％，体壁大都溶解(图1)。从处理线虫的变化来看，经历了从部份体壁溶解到虫体全部溶解的过程，说明活性成份主要为分解线虫的酶类。而将同批提取的试验用药剂经过煮沸，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象(图2)，这也证明了狮子山隔指孢对线虫的活性成份主要为酶类。
结果同时表明，狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株对松材线虫有一定的毒杀作用，线虫36小时的死亡率达80％，虫体僵直，说明本发明菌株对松材线虫的毒杀作用明显低于Panagrellus redivivus线虫，作用时间延缓。
本发明狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.0，0022菌株对线虫的毒力显著高于目前其他所发现的同类微生物。同时在本发明培养条件下生长很快，具备了很好的应用开发前景。
附图说明：
图1显示处理线虫分解情况。
图2显示对照头部保持完好的对照线虫
具体实施方式：
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
将狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌丝体接种到平板琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基配方。将狮子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌丝体接种到培养基上，28℃下培养10-14天，获得平板种。
将平板种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装60ml)，液体培养基配方为：0.15％明胶；0.8％胰蛋白胨；0.1％酵母浸出粉；0.05％硫酸铵；0.001％硫酸亚铁；0.05％硫酸镁；1.129％磷酸氢二钠；1.238％磷酸二氢钠pH6.5，余下为水。于27℃下摇床培养培养时间7天，转速为220rpm。
将发酵培养物用干净纱布滤去菌丝体，取上清液，按1∶0.56的比例缓慢加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8500rpm离心15分钟，弃上清。用10mM磷酸缓冲液(68.5ml的10mM磷酸二氢钠加31.5ml的10mM磷酸氢二钠，pH为6.5)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW：8,000-14400KDa)于10-20倍的10mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。
实施例二：
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：0.1％明胶；0.6％胰蛋白胨；0.15％酵母浸出粉。
实施例三：
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：0.2％明胶；0.7％胰蛋白胨；0.2％酵母浸出粉。
Claims (4)
1、一种具有杀线虫功能的食线虫真菌，由生产菌株经试管种培养、液体发酵培养工序制备，其特征在于生产菌株为狮子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022，保藏日期：2005年1月27日，保藏号：CGMCC No.1311。
2、权利要求1所述的具有杀线虫功能的食线虫真菌的制备方法，包括试管种培养、液体发酵培养、从液体发酵培养物中获得食线虫真菌，其特征在于所用的液体发酵培养基配方为：0.1-0.2％明胶；0.6-0.8％胰蛋白胨；0.1-0.2％酵母浸出粉；0.05％硫酸铵；0.001％硫酸亚铁；0.05％硫酸镁；1.129％磷酸氢二钠；1.238％磷酸二氢钠pH6.5，余下为水，以上均是重量百分比。
3.、从权利要求2的液体发酵产物中提取杀线虫有效成分的方法，包括：将发酵培养物用干净纱布滤去菌丝体，取上清液，按1∶0.56的比例缓慢加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8500rpm离心15分钟，弃上清；用10mM磷酸缓冲液重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于10-20倍的10mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时。
4、权利要求1所述食线虫真菌的用途，其特征在于该真菌对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有毒杀作用，可以应用于植物寄生线虫生防。
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