CN1194085C - 一种具有杀线虫功能的菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有杀线虫功能的菌剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。本发明菌剂的生产菌株为：Brevibacillus laterosporus G4，采用常规方法制备，其中液体发酵培养基配方为：1-3%酵母粉；10-20%大豆饼粉；0.5-2%鱼粉；1-4葡萄糖；pH7，余下为水。从液体发酵产物中提取杀线虫有效成分的方法是，将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清，用50mM磷酸缓冲液重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于10-20倍的50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时。本发明菌株通过液体发酵后，从代谢产物中提取杀线虫有效成分，制备为生物杀线剂。本发明产品对松材线虫具有毒力高的突出优点，具有较好的潜在应用前景。

Description

一种具有杀线虫功能的菌剂及制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种具有杀线虫功能的菌剂及制备方法和应用，属微生物农药技术领域。

背景技术：

植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70多种，为害3000多种植物，每年造成的损失巨大。据联合国粮农组织统计，每年因线虫造成损失全球高达1000亿美元。我国线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等主要经济作物，成为发展这些作物的重要限制因子。据全国烟草病虫害防治信息中心不完全统计，2001年全国烟草根结线虫发病面积已达55万公顷，直接经济损失5亿多元。仅云南省发病面积就达2.7万公倾，直接经济损失1.2亿元，间接损失更为严重。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。在山东、广东、海南和云南等蔬菜主产区，蔬菜根结线虫呈上升趋势。如山东的黄瓜因大量施用化学杀线虫剂后造成食用者腹泻、贵州省西洋参因严重发生根结线虫而只好停产。更严重的是由于根结线虫侵染后，造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。云南的三七根腐就是典型例子。化学杀线虫剂自上个世纪40年代发现以来，在线虫防治中发挥了重要作用。随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用，造成环境污染，危害人体健康。相继有不少被禁用或即将禁用。特别是植物寄生线虫发生于作物根部，由于土壤环境的特殊性，必须大剂量施用才能保证其防效。而大剂量化学农药对地下水污染非常严重。因此，研究开发高效低毒低残留杀线虫剂已经是农业可持续发展中的重要课题。

侧孢短芽孢杆菌是一类好氧的，可形成芽孢的细菌。前期研究表明，侧孢短芽孢杆菌可在其生活史中形成伴孢晶体而具有杀虫功能。而伴孢晶体的主要成份是杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋白对害虫具有良好毒杀功能。但在侧孢短芽孢杆菌中，不产生伴孢晶体，通过酶、毒蛋白或其他毒肽而产生杀虫功能目前尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是通过对一株具有产生酶而分解线虫功能的侧孢短芽孢杆菌研究，开发生物杀线虫剂。

本发明筛选到的一株对植物寄生线虫具有很好杀虫功能的侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus G4，G4菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2003年6月2日；保藏登记入册的编号CCTCC NO：M203045。

本发明Brevibacillus laterosporus G4菌株形态特征为：长杆状，个体较大，两端钝圆，多以凝集形式存在。在YPD平板培上菌落呈圆形、隆起、边缘较整齐，表面无光泽、粗糙、类似细小粉末状，菌苔白色。在YPD培养基上培养36小时以上可见极少数的内生孢子形成或释放到胞外的芽孢，在NA或LB培养基培养12-16小时，便可见大量脱落的芽孢，芽孢为椭圆形里独木舟状体。G4菌株与其他具有杀虫功能的侧孢短芽孢杆菌最大的差别是不形成伴孢晶体，其具有的杀线虫功能主要由蛋白、酶等成份构成的。其杀线虫机制理也完全不同。G4首先形成粗蛋白分解线虫体壁，通过体壁侵入线虫体内，最终将线虫全部分解。在整个杀线虫过程中，伴随着产生蛋白酶、几丁质酶对线虫的作用，其毒力显著高于同类侧孢短芽孢杆菌。

本发明人在开展杀线虫碱性胞外蛋白酶研究中，从构建的基因工程菌中分离出一株侧孢短芽孢杆菌G4，发现其对线虫具极高的杀虫活性。将菌株纯化后进行多批次杀线虫活性试验后，委托武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)对菌株进行鉴定，确定为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus G4。

本发明是这样实现的：

扩大培养G4菌株，提取杀线虫有效成分，进行杀线虫药效试验，确定其对线虫的作用。

G4培养方法(以下为重量百分比)：

1、试管种培养

培养基配方为：1-3％酵母浸膏，0.5-2％蛋白胨；1-4％葡萄糖；1.8-2％琼脂；pH6-7。将G4菌丝体接种到培养基上，28-32℃下培养1-4天，获得试管种；

2、液体扩大培养

液体培养基配方为：1-3％酵母粉；10-20％大豆饼粉；0.5-2％鱼粉；1-4葡萄糖；pH6-7，余下为水。将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装100ml，于25-35℃下摇床培养培养时间2-5天，转速为200-300rpm。

3、提取杀线虫活性成份

将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用50mM磷酸缓冲液(39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH为7)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW：8,000-14400KDa)于10-20倍的50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。

G4杀线虫活性试验：

1、制备试验用药剂

按前述液体扩大培养方法培养G4菌株，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。

2、制备对照用药剂

对照1：前述1制备试验用药剂方法制备对照用药剂，但培养基中不接入G4菌株。

对照2：以清水作为对照。

对照3：为了证明杀线虫有效成份是蛋白，将制备供试药剂煮沸灭活后作为对照。

2、制备试验用线虫

(1)制备Panagrellus redivivus线虫

将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。

(2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)

在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。

3、试验方法：

(1)药效试验方法

取试验用药剂200μl于1.5ml离心管中，加入活线虫150条，离心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus线虫分别于12小时、24小时、48小时；松材线虫分别于24小时、48小时、60小时检查计算线虫的死亡率。并在光学显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况

鉴定死亡的方法为：在处理离心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。

分别用3种对照药剂，每处理重复三次。

(2)G4分解线虫观察试验

将活线虫用试验用药剂于25℃下分别处理12小时与24小时，将处理后的样品用PBS缓冲液冲洗三次，用3％戊二醛与饿酸固定，用梯度甘油置换出水分，乙酸乙酯再次置换，真空冷冻干燥，镀金膜，最后固定在载片上，用扫描电镜观察(SEM)。用对照药剂同期处理观察。

4、试验结果

表1  G4对Panagrellus redivivus线虫杀虫效果

药剂处理	线虫被固定死亡情况
							12小时		24小时		36小时
	死亡率	线虫变化	死亡率	线虫变化	死亡率	线虫变化
							试验用药剂	85	虫体僵直	95	体壁出现溶解	98	大部份溶解
对照1	10	无变化	20	未溶解	30	体壁完整
							对照2	10	无变化	10	未溶解	20	体壁完整
对照3	10	无变化	10	未溶解	30	体壁完整

表2  G4对松材线虫杀虫效果

药剂处理	线虫被固定死亡情况
							24小时		48小时		60小时
	死亡率	线虫变化	死亡率	线虫变化	死亡率	线虫变化
							试验用药剂	80	虫体僵直	95	体壁粗糙，开始出现溶解	96	部份溶解
对照1	15	无变化	20	未溶解	30	未溶解
							对照2	5	无变化	10	未溶解	15	未溶解
对照3	20	无变化	20	未溶解	30	未溶解

结果表明，从G4菌株液体发酵产物中提取的试验用药剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫均具较好的杀虫效果，线虫的平均死亡率在95％以上。从处理线虫的变化来看，经历了从部份体壁溶解(图3)到虫体全部溶解的过程(图1)，说明活性成份主为要分解线虫的酶类。而将同批提取的试验用药剂经过煮沸，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象，这也证明了G4对线虫的活性成份主要为酶类。

本发明G4菌株是一类明显区别于其他产生伴孢晶体的侧孢短芽孢杆菌，其主要作用成份是酶，对线虫特别是松材线虫的毒力显著高于目前其他所发现的同类微生物。同时G4菌株在本发明培养条件下生长极快，具备了很好的应用开发前景。

附图说明：

图1显示处理线虫分解情况。

图2显示虫体保持完好的对照线虫。

图3显示处理线虫头部分解情况。

图4显示头部保持完好的对照线虫。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：

将Brevibacillus laterosporus G4菌体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为：2％酵母浸膏，1.5％蛋白胨；2％葡萄糖；1.8％琼脂；pH7。将G4菌丝体接种到培养基上，30℃下培养2天，获得试管种。

将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装100ml)，液体培养基配方为：2％酵母粉；15％大豆饼粉；1％鱼粉；3％葡萄糖；pH7，余下为水。于30℃下摇床培养培养时间3天，转速为220rpm。

将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用50mM磷酸缓冲液(39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH为7)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW：8,000-14400KDa)于10-20倍的50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。

实施例二：

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：3％酵母粉；10％大豆饼粉；2％鱼粉；1％葡萄糖。

实施例三：

基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：1％酵母粉；20％大豆饼粉；0.5％鱼粉；4％葡萄糖。

Claims (3)

1、一种具有杀线虫功能的菌剂，该菌剂由生产菌株和辅料经试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成份工序后得到，其特征在于生产菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4、CCTCC NO：M203045。

2、权利要求1所述菌剂的制备方法，包括试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成份工序，其特征在于：

2.1液体发酵培养基配方：1-3％酵母粉；10-20％大豆饼粉；0.5-2％鱼粉；1-4葡萄糖；pH7，余下为水；

2.2从液体发酵产物中提取杀线虫有效成分的方法是：将发酵培养物于8000rpm/min离心20分钟，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清，用50mM磷酸缓冲液重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于10-20倍的50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时。

3、权利要求1所述的菌剂，其特征在于该菌剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有毒杀作用，可以应用于植物寄生线虫生防。

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