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CN1278724A - 抑制酪氨酸激酶活性的茚并[1,2－c]吡唑衍生物 - Google Patents

抑制酪氨酸激酶活性的茚并[1,2－c]吡唑衍生物 Download PDF

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CN1278724A
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phenyl
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methoxyphenyl
chlorphenyl
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L·D·阿诺尔德
徐亚军
T·巴尔洛萨里
P·拉夫尔提
M·霍克利
A·特纳
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Abstract

茚并[1,2－c]吡唑的衍生物化合物是酪氨酸激酶活性的抑制剂。数种酪氨酸激酶(它们的活性受这些化合物的抑制)与血管生成过程有关。所以,这些化合物能改善疾病状态(该疾病中血管发生或内皮细胞增殖是一种因素)。本发明的化合物还抑制血管渗透性过高的诱发以及相关的水肿、腹水和渗出物的形成。

Description

抑制酪氨酸激酶活性的茚并[1，2—C]吡唑衍生物
蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)包括一大类多种具有酶活性的蛋白质。PTKs在控制细胞生长和分化方面起重要作用(关于综述，参见Schlessinger&Ullrich，1992，神经元(Neuron)，9：383～391)。
例如，受体酪氨酸激酶介导的信号转导是通过与特异性生长因子(配体)的细胞外相互作用引发的，通常接着是受体二聚、内源性蛋白质酪氨酸激酶活性的瞬时刺激和磷酸化。于是产生细胞内信号转导分子的结合位点，从而导致含一系列促进合适的细胞应答的胞质信号分子的复合体的形成。(例如，细胞分裂，代谢效果，对胞外微环境的应答)参见Schlessinger和Ullrich，1992，神经元，9∶1～20。
至于受体酪氨酸激酶，还证实了酪氨酸磷酸化位点起信号分子的SH2(src同源性)域高亲和性结合位点的作用(Fantl等，1992，细胞(Cell)，69：413～423；Songyang等，1994，分子细胞生物学(Mol．Cell．Biol．)，14：2777～2785；Songyang等，1993，细胞，72：767～778；以及Koch等，1991，科学(Science)，252：668～678)。已鉴定了与受体酪氨酸激酶(RTKs)相关的数种胞内基质蛋白质。它们大体上可分为两类：(1)具有催化域的基质；和(2)缺乏这种域但起连接物的作用并与催化活性分子相关的基质(Songyang等，1993，细胞，72：767～778)。受体或蛋白质与它们的基质的SH2域之间相互作用的特异性是通过紧邻磷酸化酪氨酸残基的氨基酸残基确定的。SH2域与包围特定受体上磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间结合亲和性的差异同在它们的基质磷酸化图式中观察到的差异相符(Songyang等，1993，细胞，72：767～778)。这些观察结果启示，各种受体酪氨酸激酶的功能不仅由它的表达模式和配体有效性决定，还由被特定的受体活化的那组下游信号转导途径决定。因此，磷酸化提供了一个重要的调节步骤，它决定了由特异性生长因子受体以及分化因子受体募集的信号途径的选择性。
已证实在PTKs中异常的刺激、表达或突变会导致未控制的细胞增殖(例如恶性肿瘤生长)或者导致关键发育或修复过程中的缺陷。因此，生物医学界耗用了很大物力试图揭示PTK族成员的特定的生物作用，它们在分化过程中的功能，它们在肿瘤发生和其它疾病中的牵连，作为在配体刺激时活化的信号转导途径的基础的生化机制以及新药物的开发。
酪氨酸激酶可以是受体类(具有胞外域、跨膜结构域和胞内域)或非受体类(全部是胞内的)。
受体酪氨酸激酶(RTKs)。RTKs包括一大族具有多种生物活性的跨膜受体。受体酪氨酸激酶(RTK)族包括对多种类型的细胞的生长和分化来说至关重要的受体(Yarden和Ullrich，生物化学年鉴(Ann．Rev．Biochem．)，57：433～478，1988；Ullrich和Schlessinger，细胞，61：243～254，1990)。RTKs的内在功能在配体结合时被活化，它导致受体和多细胞基质的磷酸化，接着导致一系列细胞响应(Ullrich&Schlessinger，1990，细胞，61：203～212)。
现在，已鉴定了至少十九(19)个不同的RTK亚族。认为有一个RTK亚族(被称为HER亚族)包括EGFR、HER2、HER3和HER4。受体的HER亚族的配体包括：上皮生长因子(EGF)、TGF—α、双调蛋白、HB—EGF、β—动物纤维素和heregulin。认为HER2／erbB2激酶活性的异常调节促进转化的致瘤表型(尤其在乳腺癌中)。另外的两个RTK亚族被称为胰岛素受体亚族(它包括INS—R、IGF—1R和IR—R)和“PDGFR”亚族(它包括PDGFα—和β—受体、CSF—1R和c—kit)。
有人认为，数种受体酪氨酸激酶和同它结合的生长因子在血管发生中起作用，不过有些可能间接地促进血管发生(Mustonen和Alitalo，细胞生物学杂志(J．Cell Biol．)，129：895～898，1995)。一种被称为胎肝激酶1(flk—1)的这样的受体酪氨酸激酶是RTKs的Ⅲ型亚类的一个成员。一种人flk—1的备选物是含激酶插入域的受体(KDR)(Terman等，癌基因(Oncogene)，6：1677～83，1991)。另一种flk—1／KDR的备选物是“血管内皮细胞生长因子受体2”(VEGFR—2)。flk—1／VEGFR—2的鼠译本也被称为NYK(Oelrichs等，癌基因，8(1)：11～15，1993)。已分离了编码小鼠flk—1、大鼠flk—1和人flk—1的DNAs，并报导了核苷酸序列和编码氨基酸序列(Matthews等，美国国家科学院院报(Proc．Nat1．Acad．Sci．USA)，88：9026～30，1991；Terman等，1991，同上；Terman等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem．Biophys．Res．Comm．)，187：1579～86，1992；Sarzani等，同上；以及Mllauer等，细胞，72：835～846，1993)。
被称为fms样酪氨酸激酶—1(flt—1)的Ⅲ型亚类RTK与flk—1／KDR相关(DeVries等，科学，255：989～991，1992；Shibuya等，癌基因，5：519～524，1990)。一种flt—1的备选物是“血管内皮细胞生长因子受体1”(VEGFR—1)。迄今，已发现flk—1／KDR／VEGFR—2和flt—1／VEGFR—1亚族的成员主要是在内皮细胞上表达的。这些亚类成员被配体的血管内皮细胞生长因子(VEGF)族的成员特异性地刺激(Klagsburn和D’Amore，细胞因子&生长因子综述(Cytokine&GrowthFactor Reviews)，7：259～270，1996)。认为Flt—1是血管形成过程中内皮细胞组构所必需的。Flt—1表达与小鼠胚胎中早期血管形成有关，并与创伤愈合过程中的新血管化有关(Mustonen和Alitalo，同上)。在成熟器官中flt—1的表达启示了该受体与细胞生长无关的其它功能(Mustonen和Alitalo，同上)。
与flt—1和flk—1／KDR相关的另一RTK是flt—4(Galland等，癌基因，8：1233～40，1993；Pajusola等，癌基因，8：2931～37，1993)。这三种受体共有的特征包括在它们的胞外区中存在七个类似免疫球蛋白的域。flt—4的氨基酸序列表现出与flt—1和flk—1的序列的显著同源性，在酪氨酸激酶域中尤其如此(Galland等，同上)。但是，与flt—1和flk—1／KDR不同，flt—4的前体形式在翻译后加工过程中切割成两个二硫键连接的多肽(Pajusola等，同上)。对发育过程中flt—4表达的研究支持了淋巴管的静脉源理论(Kaipainen等，美国国家科学院院报，92：3566～70，1995年4月)。
假定内皮细胞在血管发生中起关键作用，那么，作用于内皮细胞的生长因子对调节血管化的研究来说尤其引人关注。一种这样的因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，它既与flk—1也与flt—1以较高亲和力结合，并且对血管内皮细胞促有丝分裂(Terman等，1992，同上；Mustonen等，同上；DeVries等，同上)。VEGF不与flt—4结合(Pajusola等，同上)。报导于Millauer等(同上)的研究启示，VEGF和flk—1／KDR／VEGFR—2都是配体—受体对，它们各自在血管的形成和萌发(被称为血管发生和血管生成)中起重要作用。
已报导了由mRNA的可变剪接产生的VEGF的不同形式，包括Ferrara等(细胞生物化学杂志(J．Cell．Biochem．)，47：211～218，1991)描述的四种。Ferrara等(同上)鉴定了分泌型和主要与细胞相关的VEGF二者，并且已知该蛋白质以二硫键连接的二聚体形式存在。
还已知，关于个体中隐伏水肿和水肿状态的形成存在种种生理机制和生化机制。在一种或多种这些机制中一个重要的介体是“血管内皮细胞生长因子”(VEGF)。该介体又被称为“血管渗透因子”(VPF)。该因子上调血管内皮细胞的转运，并且引起很多血管床(包括皮肤、皮下组织、腹膜壁、肠系膜、隔膜、气管、支气管、十二指肠和子宫)渗透性的增大。在这些部位显著的血细胞渗出、穿过内皮的交换的变化、大分子的外渗和沉积以及长期低血压可能伴随这些增大的渗透效果。认为这些过程有利于阻止新血管形成。VEGF是在炎症部位被炎性T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等表达的。该因子通过低氧、某些血管加压激素、生长因子、生殖激素和多种炎性细胞因子上调。VEGF介导的血管渗透性与这样的疾病有关：肿瘤腹水、子宫内膜异位症、对灼伤和创伤的水肿响应、糖尿病中的内皮功能障碍、卵巢过度刺激综合征并发病和眼浮肿。
因此，显然VEGF生产或活性的抑制应是有益的，对于阻滞上面列举的疾病的出现尤其如此。特别是，能阻滞VEGF介导的渗透性过高和水肿和相关的综合征的作用剂应适用于减轻这些疾病。
胎盘生长因子(PlGF)具有表现出与VEGF序列显著同源性的氨基酸序列(Park等，生物化学杂志(J．Biol．Chem．)，269：25646～54，1994；Maglione等，癌基因，8：925～31，1993)。至于VEGF，不同种类的PlGF是从mRNA的可变剪接产生的，并且该蛋白质以二聚形式存在(Park等，同上)。PlGF高亲和力地结合flt—1，但不结合flk—1／KDR(Park等，同上)。当VEGF以低浓度存在时，PlGF增强VEGF对内皮细胞的促有丝分裂效果，但当VEGF以更高浓度存在时，却没有检测到该效果(Park等，同上)。
RTKs的其它两种亚族被称为FGF受体族(FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4)以及Met亚族(c—met和Ron)。
由于PDGF亚族和FLK亚族之间的相似性，所以这两个亚族常被一起考虑。Plowman等，1994，DN&P 7(6)：334～339(该文献被并入本文作参考)鉴定了已知的RTK亚族。
抑制血管发生在某些临床情况中(例如抑制实体瘤的生长和转移，或者在治疗类风湿性关节炎时)是需要的，但促进血管化对于治疗其它疾病(例如创伤愈合)来说是有益的。因此，通过转导信号经过上述受体而促进血管发生的分子以及能抑制这样的信号转导的分子都是引人关注的。
非受体酪氨酸激酶。非受体酪氨酸激酶表示一批缺乏胞外序列和跨膜序列的细胞酶。现在，已鉴定了二十四种以上个体非受体酪氨酸激酶，包括十一(11)个亚族(Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes／Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK)。目前，非受体酪氨酸激酶的Src亚族包括很多PTKs并且包括Src，Yes，Fyn，Lyn，Lck，Blk，Hck，Fgr和Yrk。Src亚族酶与肿瘤发生有关。对于非受体酪氨酸激酶更详细的讨论由Bolen提供，参见1993，癌基因，8：2025～2031)中，将该文献并入本文作参考。
发现了很多酪氨酸激酶(无论是RTK还是非受体酪氨酸激酶)与涉及很多致病条件(pathogenic conditions)的细胞信号途径有关，所述致病条件包括：癌、牛皮癣、以及其它超增殖性障碍或超免疫响应。
调制PTKs的化合物的开发。鉴于推测的PTKs在控制、调节和调制细胞增殖、与异常细胞增殖相关的疾病和障碍方面的重要性，进行了很多试验，试图应用多种方法鉴定受体和非受体酪氨酸激酶“抑制剂”，所述方法包括应用突变配体(美国申请No．4，966，849)，可溶性受体和抗体(申请号WO 94／10202；Kendall&Thomas，1994，国家科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．)，90：10705～09；Kim等，1993，自然(Nature)，362：841～844)，RNA配体(Jellinek等，生物化学(Biochemistry)，33：10450～56；Takano等，1993，Mol．Bio．Cell，4：358A；Kinsella等，1992，实验细胞研究(Exp．Cell Res．)，199：56～62；Wright等，1992，细胞生理学杂志(J．CellularPhys．)，152：448～57)和酪氨酸激酶抑制剂(WO 94／03427；WO92／21660；WO 91／15495；WO 94／14808；美国专利No．5，330，992；Mariani等，1994，美国癌研究协会会报(Proc．Am．Assoc．CancerRes．)，35：2268)。
最近，进行了试验以鉴定起酪氨酸激酶抑制剂作用的小分子。例如，二个单环的、二环的或杂环的芳基化合物(PCT WO 92／20642)，以及亚乙烯基—吖吲哚衍生物(PCT WO 94／14808)常被描述为酪氨酸激酶抑制剂。苯乙烯基化合物(美国专利No．5，217，999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美国专利No．5，302，606)、某些喹唑啉衍生物(EP申请No．0556266 A1)、硒代吲哚(seleoindoles)和硒化物(PCT WO94／03427)、三环多羟基化合物(PCT WO 92／21660)和苄基膦酸化合物(PCT WO 91／15495)已被描述成适用作酪氨酸激酶抑制剂用于治疗癌的化合物。
因此，需要鉴定这样的有效小化合物：它们通过调制受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶的活性特异性地抑制酪氨酸信号转导，从而调节和调制异常的或不适当的细胞增殖。
本发明涉及下式化合物
Figure 9881111500111
其中：
X是羰基、亚甲基或取代亚甲基；
R1是氢或甲基；以及
R2是吡啶基、苯基或取代苯基；条件是，当X是亚甲基时，R1是甲基。这些化合物的对映异构体、互变异构体及其混合物都包括于本发明中。这些化合物的药物上可接受的酸加合盐也包括于本发明中。
本发明的化合物适用作酪氨酸激酶活性的抑制剂。具体地说，本发明的化合物适用作血管发生过程中重要的那些酪氨酸激酶的抑制剂。这些化合物还适用作血管渗透性过高过程中重要的那些酪氨酸激酶的抑制剂。由于这些化合物抗血管发生并抑制血管渗透性过高，所以它们是抑制进行性疾病状态(其中，血管发生和血管渗透性过高是重要部分)的重要物质。
本发明特别优选的化合物是式Ⅰ的化合物，其中，R1、R2和X如表Ⅰ中所示：表Ⅰ
    R1     R2     X
    H     苯基     CO
    H     4-甲基苯基     CO
    H     4-氟苯基     CO
    H     3-氯苯基     CO
    H     4-氯苯基     CO
    H     4-溴苯基     CO
    H     4-羟基苯基     CO
    H     3-甲氧基苯基     CO
    H     4-甲氧基苯基     CO
    H     4-羟基-3-甲氧基苯基     CO
    H     3-吡啶基     CO
    H     4-吡啶基     CO
    H     3,4-(OCH3)2苯基     CO
    H     苯基     CH(OH)
    CH3     苯基     CO
    CH3     4-甲基苯基     CO
    CH3     3-氯苯基     CO
    CH3     4-氯苯基     CO
    CH3     4-溴苯基     CO
    CH3     4-羟基苯基     CO
    CH3     3-甲氧基苯基     CO
    CH3     4-甲氧基苯基     CO
    CH3     4-氨基苯基     CO
    CH3     3-吡啶基     CO
    CH3     4-氯苯基     CH2
    CH3     4-甲氧基苯基     CH2
    CH3     苯基     CH(OH)
    CH3     4-氯苯基     CH(OH)
    CH3     3-吡啶基     CH(OH)
    CH3     4-甲氧基苯基     CH(NH2)
    CH3     苯基     CH(NHC3H7)
    CH3     苯基 CH(NHC2H4N(CH3)2)
本发明进一步包括这些化合物在药物组合物中的应用，所述药物组合物含药物上有效量的上述化合物和药物上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以给个体施用从而减慢或防止血管发生辅助的疾病中血管发生的过程。
本发明的化合物具有抗血管发生的性能。为此，这些化合物可用作抗下列疾病状态的活性剂：关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管发生、冠状和脑侧血管化(coronary and cerebralcollateral vascularization)、局部缺血性肢血管发生、创伤愈合、消化性溃疡、螺杆菌属(Helicobacter)相关的疾病、骨折、猫抓热、潮红、角膜病、新生血管性青光眼和视网膜病(例如与糖尿病性视网膜病或黄斑变性相关的视网膜病)，或者依赖于血管发生维持的血液和营养供应或依赖于内皮细胞过度增殖性障碍的类似疾病状态。此外，这些化合物中的某些可用作抗生育剂或用作堕胎药。
本发明的化合物抑制酪氨酸激酶的催化活性。也就是说，这些化合物调制通过酪氨酸激酶的信号转导。具体地说，这些化合物选择性地抑制KDR／FLK—1／VEGFR—2酪氨酸激酶的活性。本发明的某些化合物还抑制其它酪氨酸激酶例如 flt—1／VEGFR—1，Src—亚族激酶例如Lck、Src、fyn、yes等的活性。本发明的化合物对特定的酪氨酸激酶的抑制活性的发生和效力依赖于这些化合物取代基(即X、R1和R2)的性质、数量和排列。
当本发明的化合物施用给需要这些化合物的个体时，还抑制这些个体中的血管渗透性过高和水肿的形成。人们认为这些化合物是通过抑制由VEGF受体介导的活性而起作用的，所述VEGF受体与血管渗透性过高和水肿形成过程有关。VEGF是独特的，因为它是已知直接促成血管渗透性过高和水肿形成的仅有的血管发生生长因子。确实，与其它很多生长因子的表达或引入相关的血管渗透性过高和水肿似乎是通过VEGF的产生而介导的。血细胞渗出也常常伴随血管渗透性过高。同样，过度的血管渗透性过高能破坏关键组织和器官(例如肝和肾)中穿过内皮的正常分子交换，从而扰乱功能并引起大分子外渗和沉积。通过抑制VEGF受体的激酶活性，渗透性过高，以及相关的外渗，随后的水肿或腹水形成和基质沉积就受到抑制并被降到最低程度。
此外，本发明化合物的N—甲基化形式或N—甲基化类似物还可充当前体药物，用作代谢活化的抗血管发生剂。
预计上面列出的障碍在相当大的程度上被蛋白质酪氨酸激酶活性(包括KDR／VEGFR—2和／或flt—1／VEGFR—1酪氨酸激酶)介导。通过抑制这些酪氨酸激酶的活性，列出的障碍或生理条件的进程就受到抑制，因为这些疾病状态或生理条件的血管发生部分被急剧减少了。本发明的化合物的作用(通过它们对特定酪氨酸激酶的选择性)，导致如果应用选择性更低的酪氨酸激酶抑制剂就会出现的副作用最少化。
本发明的上位化合物的效力和特异性通常可通过取代基的改变和构象限制而改变和最佳化。
在本发明中，如下定义是适用的：
“药物上可接受的酸加合盐”表示保持游离碱的生物有效性和性能的那些盐，它们是通过与下列酸的反应获得的，即与无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，或者与有机酸，例如磺酸、羧酸、有机磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、乳酸、酒石酸等。
在本发明的化合物中，当R2是苯基时，R2的取代基可以是1或2个碳原子的低级烷基、卤原子、低级烷氧基、羟基或氨基。在本发明的化合物中，X可以是羰基、亚甲基、羟基亚甲基、氨基亚甲基或低级烷基氨基亚甲基。药物制剂和施药途径
本发明的确定的化合物可以由病人自己施药，或者呈药物组合物(此时，将它们与合适的载体或赋形剂混合)以治疗或改善种种障碍的剂量给病人施药。治疗上有效的剂量进一步指所述化合物的量足以导致症状的改善。本申请的化合物的配制技术和施药方法可见于“雷明登药物科学”(“Remington’s Pharmaceutical Science”)，MackPublishing Co．，Easton，PA，最新版。施药途径
合适的施药途径例如可包括经口的、滴眼剂、经直肠的、经粘膜的、局部的或肠内的施药；肠胃外送递，包括肌内的、皮下的、髓内的注射液，以及鞘内的、直接心室内的、静脉内的、腹膜内的、鼻内的或眼内的注射液。
也可将所述化合物以局部方式而不是全身方式施药，例如，常以缓释型制剂形式通过关节内注射所述化合物(例如，治疗类风湿性关节炎)。
此外，还可呈靶向药物送递体系施药，例如，呈用肿瘤特异性抗体涂覆的脂质体。该脂质体将被导向肿瘤并被肿瘤选择性地吸收。组合物／制剂
本发明的药物组合物可按本来已知的方法制备，例如，通过常规混合、溶解、造粒、糖锭剂制作、研磨、乳化、包胶、捕集或冻干的方法。
于是，按本发明应用的药物组合物可以利用一种或多种生理上可接受的载体按常规方法配制成药物上可应用的制剂，所述载体包括有助于所述活性化合物加工成制剂的赋形剂和助剂。合适的制剂依赖于选定的施药途径。
就注射液来说，本发明的作用剂可被配制成水溶液，优选用生理相容性缓冲液(例如汉格氏液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)来配制。就经粘膜施药来说，适合待渗透的屏障的渗透剂可被用于该制剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
就经口施药来说，可容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药物上可接受的载体结合而配制所述化合物。这样的载体能使本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮剂等，用于由待治疗的患者经口咽下。经口施用的药物制剂可这样获得：将活性化合物与固体赋形剂结合，任选研磨形成的混合物，如果需要的话，添加合适的助剂，接着加工该颗粒混合物而得片剂或锭剂芯。合适的赋形剂尤其是：填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，和／或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或者藻酸或其盐(例如藻酸钠)。
用合适的包衣物质涂覆锭剂芯。为此，可应用浓缩的糖溶液，该溶液可任选含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊尔凝胶、聚乙二醇，和／或二氧化钛、漆溶液(lacquer solutions)，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加到片剂或锭剂包衣物质中用来鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可经口施用的药物制剂包括：从明胶制作的推入配合胶囊，以及从明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制作的软密封胶囊。所述推入配合胶囊可含与下列物质掺合的活性组分：填充剂(例如乳糖)，粘合剂(例如淀粉)，和／或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可被溶于或悬浮于合适的液体(例如脂肪油、液体石蜡、或液态聚乙二醇)中。此外，可添加稳定剂。用于经口施药的所有制剂应呈适合这样施药的剂量。
至于口腔含化给药法，所述组合物可呈按常规方法配制的片剂或锭剂形式。
至于通过吸入施药，按本发明应用的化合物就便呈加压包的气溶胶喷射包装规格或喷雾剂的形式，应用合适的喷射剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压的气溶胶来说，剂量单位可通过提供一个用于送递经计量的量的阀来确定。用于吸入器或吹入器中的(例如明胶的)胶囊和管壳剂可被配制为含所述化合物和合适的粉状基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
所述化合物可被配制供通过注射(例如大丸剂注射或连续输注)肠胃外施药。供注射的制剂可呈单元剂型给出，例如，呈添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器。所述组合物可以呈这样的形式：油性或水性介质中的悬浮剂、溶液或乳剂，并且可含配制用剂(formulatoryagent)(例如悬浮剂、稳定剂和／或分散剂)。
供肠胃外施药的药物制剂包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，所述活性化合物的悬浮剂可作为合适的油性注射悬浮剂配制。合适的亲脂性溶剂或载体包括：脂肪油(例如芝麻油)，或者合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂质体。水性注射悬浮剂可含能增大该悬浮剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。该悬浮剂任选还可含合适的稳定剂或作用剂(它们增大所述化合物的溶解度使得能制备高度浓缩的溶液)。
或者，所述活性组分可呈粉末形式，供使用前用合适的载体(例如灭菌无热原水)配制。
所述化合物还可被配制成直肠用药组合物(例如栓剂或保留灌肠剂)，该组合物例如含常规栓剂基料(例如可可脂或其它甘油酯)。
除了前述制剂外，所述化合物还可被配制成缓释型制剂。这样的长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内或者通过肌内注射)施药。于是，例如，所述化合物可用下列物质配制：合适的聚合物或疏水性物质(例如可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或者微溶的衍生物(例如微溶的盐)。
用于本发明的疏水性化合物的药物载体是一种共溶剂体系，它包括：苄醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。该共溶剂体系可以是VPD共溶剂体系。VPD是一种这样的溶液，即含3％w／v苄醇、8％w／v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65％w／v聚乙二醇300，用无水乙醇补充至容积。所述VDP共溶剂体系(VPD：5W)包括用5％葡萄糖水溶液稀释成1∶1的VPD。该共溶剂体系完全溶解疏水性化合物，并且它自身对系统施药产生低毒性。当然，该共溶剂体系的比率可以大幅度地改变而不破坏它的溶解性和毒性特征。此外，所述共溶剂组分的特性可以改变：例如，可应用其它低毒非极性表面活性剂代替聚山梨酯80；聚乙二醇的级分尺寸(fraction size)可以改变；可用其它生物相容性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)代替聚乙二醇；并且可用其它糖或多糖代替葡萄糖。
也可应用疏水性药物化合物的其它送递体系。脂质体和乳液是疏水性药物送递载体的熟知实例。还可应用某些有机溶剂(例如二甲亚砜)，不过通常以更大的毒性为代价。此外，可应用缓释体系送递所述化合物，例如含治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质。已确定了各种缓释物质，并且它们是本领域技术人员熟知的。缓释胶囊可以根据它们的化学性质在数周到100天以上释放所述化合物。依赖于治疗剂的化学性质和生物稳定性，可应用关于蛋白质稳定化的其它措施。
所述药物组合物还可包括合适的固体或凝胶态载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂实例包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(例如聚乙二醇)。
本发明的很多PTK调制化合物可作为与药物相容性反离子形成的盐提供。药物相容性盐可用很多酸形成，该酸包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于比相应的游离碱形式更易溶于水性溶剂或其它质子溶剂。有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物：其中，含有效量的活性组分而实现其预期的目的。更具体地说，“治疗有效量”表示有效地防止受治疗患者的现有症状发展或减轻现有症状的量。有效量的确定完全属于本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文提供的详细公开内容。
就本发明方法中应用的任意化合物来说，治疗有效剂量最初可从细胞分析估测。例如，可在动物模型中配制一个剂量而达到循环浓度范围，该范围包括如细胞分析中测定的IC50(即试验化合物实现对PTK活性的半最大抑制时的浓度)。该信息可被用来更准确地确定人体中的适用剂量。
治疗有效剂量表示导致患者的症状改善或延长患者的生存期的化合物的量。这类化合物的毒性和疗效可通过在细胞培养物或试验动物中的标准药物测试方法测定，例如，关于测定LD50(种群的50％致死的剂量)和ED50(种群的50％治疗有效的剂量)的方法。毒性效果和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，它可被表示为LD50和ED50之间的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。得自这些细胞培养物分析和动物研究的数据可被用于配制在人体中应用的剂量范围。这类化合物的剂量优选处于循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很小毒性或无毒性的ED50。所述剂量在该范围内变化，它依赖于应用的剂型和采用的施药途径。准确配方、施药途径和剂量可由各位医师根据患者的状况选择。(例如参见Fingl等，1975在“治疗学的药理基础”(“ThePharmacological Basis of Therapeutics”)，Ch．1p．1中描述的)。
可以单独地调节剂量和间隔使活性成分的血浆浓度足以保持激酶调制效果或最小有效浓度(MEC)。该MEC将随各种化合物而变，但可从体外数据估测；例如应用本文描述的分析法达到激酶的50～90％抑制所需的浓度。达到该MEC所需的剂量将依赖于个体特征和施药途径。但是，可应用HPLC分析法或生物测定法来测定血浆浓度。
剂量间隔也可应用该MEC值确定。应该应用一个用药法施用化合物，该用药法保持血浆水平高于MEC的时间占10～90％，优选在30～90％之间，最优选在50～90％之间。在局部施药或选择性吸收的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
施用的组合物量当然将依赖于受治疗者，依赖于患者的体重、患病的严重性、施药的方式和开处方医师的判断。包装
如果需要的话，所述组合物可呈包装或分配装置提供，它可能包括一个或多个含所述活性组分的单元剂型。该包装可例如包括金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。该包装或分配装置可以附有施药说明书。包括用相容性药物载体配制的本发明化合物的组合物还可被制备后放入合适的容器，并标明指示的疾病的治疗。标签上指示的合适的疾病可能包括：细胞过度增殖病的治疗，血管发生的抑制，纤维变性、糖尿病、水肿、腹水等的治疗。例示Ⅰ．化合物的合成
本发明的化合物(式Ⅰ)可应用如下方案合成。
茚并[1，2—c]吡唑环体系的合成
该茚并[1，2—c]吡唑环体系可通过Braun和Mosher的方法(Braun，R．A．；Mosher，W．A．美国化学学会会志(J．Am．Chem．Soc．)，1958，80，4919以及Braun，R．A．；Mosher，W．A．有机化学杂志(J．Org．Chem．)，1959，24，648)通过将适当酰化的2，3—二氢—1，3—茚二酮与肼或甲肼反应而合成。
Figure 9881111500201
桥连碳的官能作用：
桥连羰基可经过相应的腙的Wolf—Kishner还原作用而转变成亚甲基(Mosher，W．A_Tawfik，E．—Z．，Lipp，D．W．有机化学杂志，1971，36，3890)。
桥连羰基的官能作用的另外方法和具体实例可见于日本专利申请JP 60 130521 A2和B．Loev，美国专利3，004，983(1960)中。
实施例
通过如下只是作为例子给出的实施例进一步阐述了本发明。这些实施例中每一个的最终产物是通过下列方法的一种或多种表征的：高效液相色谱法、元素分析、核磁共振波谱法、红外光谱和高分辨质谱法。应用了如下缩写：
  DMF=二甲基甲酰胺；
  IMS=工业用甲醇变性酒精；以及
  LCMS=液相色谱／质谱
实施例1和2是通过JP60—130521中概述的方法制备的。实施例1
3—(3，4—二甲氧基苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮，(可从Menai Organics Ltd．，Unit 5，Menai Technology Centre DeiniolRoad，Bangor Gwynedd，N．Wales LL57 2UP UK商购)。实施例2
3—(3，4，5—三甲氧基苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮，m．p．268～272℃。实施例3a)在20℃的氮气氛中和在搅拌下，将邻苯二甲酸二甲酯(15．0g)的四氢呋喃(100ml)溶液加到甲醇钠(8．31g)于四氢呋喃(60ml)的悬浮液中，接着添加4′—氯苯乙酮(11．8g)的四氢呋喃(100ml)溶液。然后在回流下将该混合物煮18小时，再冷却到20℃，倾入乙醚(250ml)和水(250ml)中。分离水层，用水(3×75ml)洗涤有机层。用浓盐酸酸化合并后的水提取液和洗涤液，通过过滤收集沉淀的固体。用二氯甲烷提取滤液，干燥并蒸发。将残余物从乙醇中重结晶而给出2—(4—氯苯甲酰)—茚—1，3—二酮。b)将得自a)的产物(1．23g)悬浮于乙醇(40ml)中，在氮气氛中添加水合肼(0．216g)。在氮气氛中和回流下将该混合物煮4小时，然后使它冷却到室温并放置16小时，再过滤而给出3—(4—氯苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮，m．p．＞330℃。实施例4
在20℃的氮气氛中，将3—(4—氯苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮(0．68g)溶于N，N—二甲基甲酰胺(30ml)。添加氢化钠(106mg，于矿物油中的60％分散液)，将该混合物搅拌30分钟，然后添加碘代甲烷(0．38g)。在20℃下搅拌该混合物达2小时，再倾入水(50ml)中。通过过滤收集黄色固体，用石油醚(25ml)洗涤。将该固体溶于热乙酸乙酯后预先吸收到二氧化硅上，将该二氧化硅加到二氧化硅柱的顶部。通过急骤柱色谱法应用二氯甲烷／石油醚／甲醇(50∶50∶1)分离该混合物。收集各级分，合并适当的级分，蒸发得一固体，将它从乙酸乙酯中结晶而给出3—(4—氯苯基)—1—甲基茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮，m．p．219—221℃．δH[2H6]DMSO(250MHz)4．07(3H，s，NMe)，7．41(1H，t，Ar)，7．55(4H，m，Ar)，7．65(1H，d，Ar—8—H)，8．13(2H，d，Ar)。由核欧沃豪斯效应的存在验证该结构。实施例5a)按与实施例4类似的方法，在20℃下将3—苯基茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮(1．0g)与碘代甲烷(0．64g)反应，通过急骤柱色谱法分离后给出1—甲基—3—苯基茚并[1，2—c]吡唑—4(2H)—酮，m．p．187～188℃。实施例6
将3—(3，4—二甲氧基苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮(0．6g)和硼氢化钠(0．16g)在无水乙醇(100ml)中的混合物在回流下煮5小时。冷却该反应混合物，减压除去乙醇。添加水(20ml)，用乙酸乙酯(3×50ml)提取该混合物。用水洗涤合并的乙酸乙酯提取液，干燥，过滤，蒸发而给出一固体，将该固体通过制备性高效液相色谱法应用乙腈／甲酸三乙铵缓冲液作为洗脱剂在Dynamax C18反相柱(41．4×250mm)上纯化，给出3—(3，4—二甲氧基苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑—4—醇，m．p．197～199℃。实施例7
在室温下将3—苯基茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮(0．86g)、硼氢化钠(0．26g)和无水乙醇(200ml)的混合物搅拌72小时。过滤该混合物而除去少量的固体(弃去)，减压浓缩滤液至少量体积，于是形成晶体。用水稀释该悬浮液至大约250ml，通过过滤收集固体，从甲醇中重结晶而给出3—苯基—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑—4—醇，m．p．269～272℃。实施例8a)在室温下，将1，2—二氢化茚—1，3—二酮(5．85g)、哌啶(0．46ml)和吡啶—4—甲醛(4．31g)的混合物在IMS(40ml)中搅拌50分钟。将该混合物在冰浴中冷却(但不出现结晶)。让该溶液暖至室温，然后减压除去溶剂而给出一残余物，通过急骤柱色谱法部分地纯化该残余物，即在二氧化硅上先后应用10％工业用甲醇变性酒精的二氯甲烷溶液和20％工业用甲醇变性酒精的二氯甲烷溶液作为流动相。收集、合并和蒸发先行级分(leading fractions)给出一固体，将它与冰冷的乙醚研制，过滤，给出2—(4—吡啶基亚甲基)茚—1，3—二酮，m．p．152～157℃。b)将得自a)的产物(0．64g)溶于二氯甲烷(5．5ml)和甲醇(5．5ml)的混合物并在室温下搅拌该混合物，边搅拌边添加2M氢氧化钠水溶液(1．36ml)，接着添加100体积过氧化氢水溶液(0．55ml)。在室温下搅拌该混合物达45分钟。添加水(25ml)和二氯甲烷(25ml)，分离水相，用二氯甲烷提取。减压蒸发合并的二氯甲烷提取液而给出粗形式的1，3—二氧代—3′—(4—吡啶基)—螺[茚—2，2′—环氧乙烷]，将它直接用于该实施例的下一步。c)在回流下将得自b)的环氧化物(0．51g)、甲醇(20ml)、冰醋酸(20滴)和水舍肼(1ml通过用甲醇稀释1ml水舍肼至10ml总体积而配制的溶液)的混合物煮18小时。让该混合物冷却，再减压除去溶剂。通过急骤柱色谱法先用5％后用10％IMS的二氯甲烷溶液作流动相在二氧化硅上纯化残余物。合并适当的级分，蒸发而给出一固体，将它与乙醚研制，过滤后给出3—(4—吡啶基)茚并[1，2—c]吡唑—4—(1H)—酮，m．p．＞300℃。实施例9a)通过Gilson 215液体输送装置(liquid handler)将1∶1(体积比)混合的二氯甲烷∶甲醇(1ml)加到盛于隔膜密封的管内的2—(4—氟亚苄基)—1，3—茚二酮(50．7mg)中，接着添加2M氢氧化钠水溶液(100．5μl)，接着添加100体积过氧化氢水溶液(41．1μl)。然后在室温下振荡形成的反应混合物达20小时。在LCMS分析后，进一步添加100体积过氧化氢水溶液(41．1μl)，这次是通过带塑料尖端的吸移管手工添加的。又继续振荡24小时。
将反应混合物在二氯甲烷(约5ml)和水(约2ml)之间平衡，通过Empore_芯形过滤器滤出有机相，用二氯甲烷(约2ml)洗过。蒸发二氯甲烷相，将残余物进一步真空干燥而给出46mg物质。将产物直接用于下一步(基于相应的2，3—环氧酮)。
b)通过Gilson 215液体输送装置将正丁醇(2ml)加到盛于隔膜密封的管内、得自a)的产物中，接着添加10vol％水合肼的正丁醇溶液(100 μl，1．2摩尔当量)。最后通过注射器手工添加冰醋酸(2滴)。在100℃下加热反应混合物达6小时。将该反应混合物蒸发至干，通过色谱法在二氧化硅上纯化残余物(用乙酸乙酯洗脱)，如果需要的话，用石油醚(b．p．40～60℃)稀释。蒸发适当的级分，真空干燥。通过制备性HPLC进一步纯化该产物，给出3—(4—氟苯基)茚并[1，2—c]吡唑—4(1H)—酮(1．3mg，保留时间4．42分，MH+相应于C16H9FN2O=264(通过LCMS分析))。通过LCMS应用下面给出的条件证实产物的特征。
LC
柱：        5μHYPERSIL BDS C18(100×2．1mm)
流动相：    0．1％甲酸：MeCN(梯度—见下文)
条件：      10—100％MeCN在8分钟内
(梯度)      100％MeCN达1分钟
            100—10％MeCN在2分钟内
            (全部分析耗时11分钟)
流速：      1ml／min
波长范围：  206—320nm
注射体积：  10μl
MS
电离        APcI+ve／—ve
质量范围：  150—500m／z
尖峰电压：  20
这些实施例中生产的化合物的化学结构如表Ⅱ中所示：
表Ⅱ
实施例号     X     R1     R2
    1     CO     H  3，4—(OCH3)2苯基
    2     CO     H  3，4，5—(OCH3)3苯基
    3     CO     H     4—Cl苯基
    4     CO     CH3     4—Cl苯基
    5     CO     CH3     苯基
    6     CHOH     H  3，4—(OCH3)2苯基
    7     CHOH     H     苯基
    8     CO     H     4—吡啶基
    9     CO     H     4—F苯基
Ⅱ．体外PTK分析
可应用如下体外分析法测定本发明的不同化合物的活性水平和对一种或多种PTKs的效果。可按同样方式应用本领域熟知的技术对其它酪氨酸激酶设计类似的分析法。
A．应用杆状病毒体系的KDR蛋白质生产：
应用从HUVEC细胞分离的cDNAs通过PCR产生编码KDR胞内域(aa789—1354)的编码序列。还在该蛋白质的N端引入聚His6序列。将该片段克隆入Xba1和Not1位点上的转染载体 pVL1393。应用BaculoGo1d转染试剂(PharMingen)通过共转染产生重组杆状病毒(BV)。将重组BV进行蚀斑纯化并通过蛋白质分析(Western analysis)检定。至于蛋白质生产，使SF—9细胞以2×106／ml的密度生长于SF—900—Ⅱ培养基中，以每个细胞0．5个蚀斑形成单位(MOI)感染。在感染后48小时收获细胞。
B．KDR的纯化
通过往得自1L细胞培养物的细胞粒状沉淀中添加50ml TritonX—100裂解缓冲液(20mM Tris，pH 8．0，137mM NaCl，10％甘油，1％Triton X—100，1mM PMSF，10μg／ml抑蛋白酶肽，1μg／ml亮抑蛋白酶肽)裂解表达(His)6KDR(aa789—1354)的SF—9细胞。在4℃下的Sorval SS—34转子中以19，000rpm将溶胞产物离心30min。将溶胞产物加到用50mM HEPES(pH7．5)、0．3M NaCl平衡过的5ml NiCl2螯合琼脂糖柱上。应用含0．25M咪唑的相同缓冲液洗脱KDR。应用SDS—PAGE和ELISA分析法(下文，该方法测定激酶活性)分析柱级分。将纯化的KDR交换入25mM HEPES(pH7．5)、25mM NaCl、5mM DTT缓冲液并在—80℃下贮存。
C．人Tie—2激酶生产和纯化
应用从人胎盘分离的cDNAs作为模板通过PCR产生人Tie—2胞内域(aa775—1124)的编码序列。在N端引入聚—His6序列并将该构建物克隆入Xba1和Not1位点上的转染载体pVL 1939。应用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染产生重组BV。将重组BV进行蚀斑纯化并通过蛋白质分析检定。至于蛋白质生产，使SF—9昆虫细胞以2×106／ml的密度生长于SF—900—Ⅱ培养基中，在0．5的MOI感染。应用于筛查的His—标记的激酶的纯化与关于KDR所述方法相似。
D．人Flt—1酪氨酸激酶生产和纯化
应用了杆状病毒表达载体pVL1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)。应用从HUVEC细胞分离的cDNA文库通过PCR产生编码激酶域的核苷酸序列。将编码聚—His6的核苷酸序列接在编码人Flt—1的整个胞内激酶域(氨基酸786～1338)的核苷酸区的5′位。该组氨酸残基能使得按与关于KDR(B部分)和ZAP70(F部分)的类似方式亲和纯化所述蛋白质。以0．5感染复数感染SF—9昆虫细胞并在感染后48小时收获。
E．Lck和EGFR酪氨酸激酶来源
Lck或Lck的截短形式是商购的(例如Upstate BiotechnologyInc．，Saranac Lake，NY或Santa Cruz Biotechnology，Inc．，SantaCruz，CA)或者是应用常规方法从已知的天然或重组来源纯化的。EGFR购自Sigma(Cat#E—3641；500个单位／50μl)，EGF配体得自Oncogene Research Products／Calbiochem(Cat#PF011—100)。
F．ZAP70酪氨酸激酶生产
应用了杆状病毒表达载体pVL 1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)。将编码聚—His6的核苷酸序列接在编码整个ZAP70(氨基酸1～619)的核苷酸区的5′位。应用从Jurkat无限增殖化T细胞分离的cDNA文库通过PCR生编码ZAP70编码区的核苷酸序列。该组氨酸残基能使得亲和纯化所述蛋白质。LVPRGS桥构成一条用于通过凝血酶进行蛋白酶切割的识别序列，于是能使得从该酶除去亲和标记物。以0．5感染复数感染SF—9昆虫细胞并在感染后48小时收获。
G．ZAP70的纯化
在含20mM Tris(pH8．0)、137mM NaCl、10％甘油、1％TritonX—100、1mM PMSF、1μg／ml亮抑蛋白酶肽、10μg／ml抑蛋白酶肽和1mM原钒酸钠的缓冲液中裂解SF—9细胞。将可溶性溶胞产物加到用50mM HEPES(pH7．5)、0．3M NaCl平衡的螯合琼脂糖Hi Trap柱(Pharmacia)上。用250mM咪唑洗脱该融合蛋白。将回收的酶贮存在含50mM HEPES(pH7．5)、50mM NaCl和5mM DTT的缓冲液中。
H．酶联免疫吸附测定法(ELISA)
可应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测酪氨酸激酶活性的存在。可按例如描述于下列文献中的已知方案进行ELISA：Voller等，1980，“酶联免疫吸附测定法”，临床免疫学手册(Manual of ClinicalImmunology)，第2版，由Rose和Friedman编辑，pp 359～371，美国微生物学学会(Am．Soc．of Microbiology)，Washington，D．C．
可应用该方案来测定关于特定RTK的活性。例如，下文提供了对KDR进行ELISA试验的优选的方案。用于测定某化合物对RTK族的其它成员以及非受体酪氨酸激酶的活性的这些方案的采用完全属于本领域人员能力范围。为了测定抑制剂选择性，应用了通用PTK底物(例如聚(Glu4Tyr)20，000～50，000 MW的无规共聚物)与ATP(通常5μM)(以大约是该测定分析中表观Km的两倍的浓度)。KDR体外ELISA
应用了如下方法测定本发明的化合物对KDR酪氨酸激酶活性的抑制作用：
缓冲液和溶液：1．PGT：聚(Glu，Tyr)4∶1
在—20℃下贮存粉末。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解粉末，得50mg／ml溶液。在—20℃下贮存1ml等分样。制备平板时，用Gibco PBS稀释至250μg／ml。2．反应缓冲液：
100mM Hepes，20mM MgCl2，4mM MnCl2，5mM DTT，0．02％BSA，200μM NaVO4，pH7．10。3．ATP：在—20℃下贮存100mM的等分样。用水稀释到20μM。4．洗涤缓冲液：
含0．1％吐温20的PBS5．抗体稀释缓冲液：
0．1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液6．TMB底物：
恰在应用前将TMB底物和过氧化物溶液(Peroxide solutions)以9∶1混合，或者应用得自Neogen的K—Blue Substrate7．终止溶液：
1M磷酸
方法1．平板制备：
用PBS稀释PGT原液(50mg／ml，冷冻的)至250 μ g／ml。往Corning改进的平底高亲和ELISA平板(Corning#25805—96)的每个孔添加125μl。往空白孔添加125μl PBS。用密封胶带覆盖并在37℃下保温一夜。用250μl洗涤缓冲液洗涤1x，在37℃的干燥培养箱中干燥约2小时。
将包被的平板在4℃的密封袋内贮存直至应用。2．酪氨酸激酶反应：
—用20％DMSO的水溶液制备4x浓度的抑制剂溶液
—制备反应缓冲液
—制备酶溶液，使得50μl中有所需的单位数，例如，对KDR
  来说，在反应中配成1ng／μl达每孔总量为50ng。在冰上贮
  存。
—从100mM原液用水配制4xATP溶液至20μM。在冰上贮存
—每孔添加50μl酶溶液
—添加25μl 4x抑制剂
—添加25μl 4X ATP用于抑制剂分析
—在室温下保温10分钟
—通过每孔添加50μl 0．05N HCl终止反应
—洗涤平板
**反应的最终浓度：
ATP：5μM
5％ DMSO3．抗体结合
—用0．1％BSA的PBS溶液通过2步稀释(100x，然后200x)稀
  释1mg／ml的PY20—HRP(Pierce)抗体的等分样至50ng／ml
—每孔添加100μl Ab。在室温下保温1hr。在4℃下保温1hr。
—将平板洗涤4x4．显色反应
—制备TMB底物并且每孔添加100μl
—在650nm处鉴测OD直至达到0．6
—用1M磷酸终止。在平板读出器上振荡。
—立即在450nm处读OD
最佳保温时间和酶反应条件随酶制剂稍微改变并且对每批来说都凭经验确定。
对Flt—1、Tie—2、EGFR和ZAP70应用类似的分析条件。至于Lck，应用的反应缓冲液是 100mM MOPSO(pH6．5)、4mM MnCl2、20mM MgCl2、5mM DTT、0．2％BSA、200mM NaVO4，在类似的分析条件下测定。PKC激酶来源
PKC的催化亚基可以商购(Calbiochem)。PKC激酶分析
按发表的方法(Yasuda，I．，Kirshimoto，A．，Tanaka，S．，Tominaga，M．，Sakurai，A．，Nishizuka，Y．，生物化学与生物物理学研究通讯，3：166，1220～1227(1990))应用了放射性激酶分析。简言之，所有反应都在激酶缓冲液中进行，该缓冲液含50mM Tris—HCl(pH7．5)、10mM MgCl2、2mM DTT、1mM EGTA、100μM ATP、8μM肽、5％DMSO和33P ATP(8Ci／mM)。在反应器中将化合物和酶混合，通过添加ATP和底物混合物引发反应。在通过添加10μl终止缓冲液(5mM ATP于75mM磷酸中)终止反应后，将一部分混合物滴在磷酸纤维素过滤器上。在室温下用75mM磷酸洗涤斑点样品3次达5～15分钟。通过液体闪烁计数法确定掺入的放射性标记的量。结果
获得了下列关于典型化合物的抑制浓度：这些结果表明，本发明的化合物对KDR酪氨酸激酶具有显著的抑制活性，当与对KDR酪氨酸激酶缺乏抑制活性的本发明范围外的化合物相比时特别显著。Ⅲ．细胞RTK分析
可应用下列细胞分析法测定本发明的不同化合物对一种或多种RTKs的活性水平和效果。可应用本领域熟知的技术按相同方式对其它酪氨酸激酶设计类似分析法。A．通过蛋白质印迹测定在人脐静脉细胞(HUVEC)中VEGF诱导的KDR磷酸化
1．从Clonetics(San Diego，CA)购得HUVEC细胞(来自混合供体)并按生产商的指示培养。只将早期传代细胞(3～8)用于该分析。应用完全EBM培养基(Clonetics)在100mm平皿(用于组织培养的Falcon；Becton Dickinson；Plymouth，England)中培养细胞。
2．为了估测某化合物的抑制活性，将细胞进行胰蛋白酶消化并在6孔聚簇板(Costar；Cambridge，MA)的每孔中以0．5～1．0×106个细胞／孔接种。
3．接种3～4天后，平板被90～100％铺满。除去所有孔的培养基，用5～10ml PBS漂洗细胞并且用5ml未添加补料的EBM基本培养基(即血清缺乏)将细胞培育18～24h。
4．往细胞中添加抑制剂于1ml EMB培养基中的系列稀释液(25uM、5uM或1uM最终浓度)，在37℃下培育一小时。然后，往所有孔中以50ng／ml的最终浓度添加人重组VEGF(165)(R&D Systems)于2ml EBM培养基中的溶液，在37℃下培育10分钟。应用未处理的或者只用VEGF处理的对比细胞估测背景磷酸化和通过VEGF的诱导。
5．然后用5～10ml含1mM原钒酸钠(Sigma)的冷PBS漂洗所有的孔，裂解细胞并刮入200μl RIPA缓冲液(50mM Tris—HCl pH7、150mMNaCl、1％NP—40、0．25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA)中，该缓冲液含蛋白酶抑制剂(PMSF 1mM、抑蛋白酶肽1μg／ml、胃蛋白酶抑制剂1μg／ml、亮抑蛋白酶肽1μg／ml、钒酸钠1mM、氟化钠1mM)和1μg／ml脱氧核糖核酸酶(全部化学品都得自Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)。将溶胞产物在14，000rpm下旋转30min而除去细胞核。
6．然后通过添加冷的(—20℃)乙醇(2体积)使等量的蛋白质沉淀最短1小时或最长一夜。用含5％β—巯基乙醇的Laemli样品缓冲液(BioRad；Hercules，CA)重新溶解粒状沉淀并煮5min。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％，1．5mm Novex，San Deigo，CA)分离所述蛋白质并应用该Novex体系将蛋白质转到硝酸纤维素膜上。在用牛血清白蛋白(3％)封阻后，在4℃下用抗KDR多克隆抗体(C20，Santa CruzBiotechnology；Santa Cruz，CA)或者用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G10，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)探测所述蛋白质一夜。在洗涤并且与山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG的HRP—结合的F(ab)2保温1小时后，应用发射化学发光(ECL)系统(Amersham LifeSciences，Arlington Height，IL)观测条带。
例如，当式Ⅰ的化合物中X是羰基、R1是氢、R2是苯基时，按该方法测得的细胞IC50是3μM。B．HUVEC有丝分裂发生检测
在EGM完全培养基(按供应商的指示补加了10％FBS、氢化可的松、上皮生长因子和牛脑提取物的内皮生长培养基)中培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。细胞、培养基和补料都购自Clonetics(San Diego，CA)。应用了HUVEC有丝分裂发生检测法来检测由VEGF、FGF或完全培养基诱导的有丝分裂发生的抑制。通过胰蛋白酶消化收获细胞，洗涤一次，以5，000个细胞／0．15ml的浓度悬浮于完全培养基(CM)中。将细胞以5，000个细胞／孔的密度接种入96孔板并在37℃下培育24小时。用无血清培养基(SFM)洗涤细胞一次，在无血清条件下培育24小时。在此期间用CM培养非血清缺乏的对比孔。用DMSO将试验化合物配制成10mM贮存液，用SFM稀释，以一定的浓度范围(0．005～50μM最终浓度)加到孔中。在添加50ng／ml VEGF或FGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)之前将细胞培育1小时。完全培养基刺激的细胞同时接受试验化合物和刺激物。培育5小时后，添加0．5Ci／孔的氚标记胸苷(Amersham)并将细胞培育一夜。通过将平板在—20℃下冷冻24小时而停止检测。用Tomtec Harvester将平板收获到过滤器滤垫上，用Betaplate液体闪烁计数器(Wallac)计数。
例如，当式Ⅰ的化合物中X是羰基、R1是氢且R2是苯基时，按该方法测得的HUVEC有丝分裂发生IC50＜0．10μM。
虽然参照其优选的实施方案具体地表现和描述了本发明，但本领域技术人员应明白可在其中作各种形式上和细节上的改变而不会偏离由后附的权利要求书定义的本发明的实质和范围。本领域技术人员应用常规试验就会认识到或能断定本文中具体描述的本发明特定实施方案的等效实施方案。这样的等效实施方案应包括在所附权利要求书的范围之内。

Claims (14)

1．一种抑制酪氨酸激酶活性的方法，它包括对所述酪氨酸激酶施用足够浓度的由下式表示的化合物：
其中：
X是羰基、亚甲基或取代亚甲基；
R1是氢或甲基；以及
R2是吡啶基、苯基或取代苯基
从而抑制所述酪氨酸激酶的酶活性；条件是，当X是亚甲基时，R1是甲基。
2．权利要求1的方法，其中，所述化合物呈对映异构体形式、互变异构体形式，呈与一种或多种其它所述化合物的混合物形式，或者既呈对映异构体形式，又呈与一种或多种其它所述化合物的混合物形式。
3．权利要求1的方法，其中，所述酪氨酸激酶或者是受体酪氨酸激酶，或者是非受体酪氨酸激酶。
4．权利要求3的方法，其中，所述酪氨酸激酶选自KDR、flt—1、TIE—2、Lck、Src、fyn和yes。
5．权利要求1的方法，其中，所述酪氨酸激酶的活性影响血管发生。
6．权利要求5的方法，其中，所述酪氨酸激酶的抑制是抗血管发生的。
7．权利要求6的方法，其中，所述酪氨酸激酶的所述抑制抑制了选自下组的疾病状态的进展：关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管发生、冠状和脑侧血管化、局部缺血性肢血管发生、角膜病、潮红、新生血管性青光眼、黄斑变性、创伤愈合、消化性溃疡、螺杆菌属相关的疾病、骨折、糖尿病性视网膜病和猫抓热。
8．权利要求1的方法，其中，所述酪氨酸激酶的活性影响血管渗透性过高。
9．权利要求1的方法，其中，所述化合物由下式表示：
Figure 9881111500031
其中，R2选自下组基团：苯基、4—甲基苯基、4—氟苯基、3—氯苯基、4—氯苯基、4—溴苯基、4—羟基苯基、3—甲氧基苯基、4—甲氧基苯基、3—甲氧基—4—羟基苯基、3—吡啶基、4—吡啶基和3，4—二甲氧基苯基。
10．权利要求9的方法，其中，R2选自苯基、4—氟苯基和4—羟基苯基。
11．权利要求1的方法，其中，所述化合物由下式表示：
Figure 9881111500041
其中，R2和X一起分别选自下组基团：苯基、CO；4—甲基苯基、CO；3—氯苯基、CO；4—氯苯基、CO；4—溴苯基、CO；4—羟基苯基、CO；3—甲氧基苯基、CO；4—甲氧基苯基、CO；4—氨基苯基、CO；3—吡啶基、CO；4—氯苯基、CH2；4—甲氧基苯基、CH2；苯基、CH(OH)；4—氯苯基、CH(OH)；3—吡啶基、CH(OH)；4—甲氧基苯基、CH(NH2)；苯基、(CH(NHC3H7)；以及苯基、CH(NHC2H4N(CH3)2)。
12．权利要求11的方法，其中，X是羰基，R2选自下组基团：4—氯苯基、4—溴苯基、4—羟基苯基、3—甲氧基苯基和4—甲氧基苯基。
13．权利要求1的方法，其中，R1是甲基，其中，所述酪氨酸活性的抑制与抗生育或堕胎作用有关。
14．权利要求1的方法，其中，X是羰基或取代亚甲基，并且R1是氢，其中，所述酪氨酸活性的抑制与抗生育或堕胎作用有关。
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