CN1268141A - 胰岛素c肽的重组表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产胰岛素C肽的方法,它包括在宿主细胞内表达含胰岛素C肽多份拷贝的多聚多肽,剪切所述的多肽释放出胰岛素C肽单拷贝。本发明还提供用于上述方法的核酸分子,表达载体,和宿主细胞,以及上述方法中表达和被剪切的胰岛素C肽多聚多肽。

Description

胰岛素C肽的重组表达

本发明涉及由重组DNA分子生产胰岛素C肽，这些重组DNA分子包含编码胰岛素C肽基因序列的多份拷贝。

胰岛素是一种参与血糖调节的蛋白类激素。胰岛素以前体胰岛素原的形式在肝脏中合成，胰岛素原由胰岛素的A链和B链通过C肽(后文中，衍生自胰岛素原的这一C肽被称作“胰岛素C肽”)连接而成。胰岛素本身只含B链和A链。近期的研究指出C肽与临床有关(Johansson等，Diabetologia(1992)35，121-128和J.Clin.Endocrinol.Metab.(1993)77，976-981)。在缺乏内源C肽的I型糖尿病患者中，使用该肽增强了肾功能，促进肌肉兴奋和对葡萄糖的利用，并改善血液-视网膜屏障(Johansson等，1992，同上)。

虽然还未被广泛认同，但是医疗界开始越来越认识到胰岛素C肽的治疗用途。所以，目前需要一种合成胰岛素C肽方便、经济而有效的方法。虽然目前肽的化学合成方法(例如在固相上逐步添加氨基酸)已经很成熟，尽管它们可以自动化，但是它们仍然很费时，更重要的是很昂贵，而且因可合成的最大肽长度有限而不经济，不可靠。目前已经发展了生产肽的另一种方法，即表达重组DNA，但是这也有缺点，例如得率问题。

目前胰岛素C肽的生产方法一般以胰蛋白酶和羧肽酶B对胰岛素原的加工为基础(Nilsson等，(1996)，J.Biochem.48，241-250；Jonasson等，(1996)Eur.J.Biochem.236，656-661)。胰岛素原在合成时是能够在大肠杆菌中高效表达的融合蛋白，融合蛋白经基因工程处理为融合伴侣能够在胰岛素原被加工成胰岛素和C肽的同时切除。胰岛素原合成时与ZZ形成融合蛋白，后者是结合IgG(免疫球蛋白)的葡萄球菌蛋白A衍生的一种合成亲合性融合标签(Nilsson等，(1987)，Prot.Eng.1，107-113)。挑选该融合标签是因为它具有抗蛋白酶水解稳定性，IgG结合能力，高表达水平和可溶性。所选的生产方法允许使用亲合性标签在先溶解包含体再复性后有效纯化，无需为切割去除ZZ亲合性标签的其他单元操作。已经证明，所述的标签可在胰蛋白酶/羧肽酶B将胰岛素原消化成胰岛素和C肽时同时切除。但是，通过表达大融合蛋白来生产小肽通常得率很低，因为终产物只占所表达基因产物的小部分。

Shen在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4627-4631，1984中说明了一种制备人胰岛素原的方法，即通过表达融合或非融合的基因产物，其中包含多个串联的胰岛素原多肽结构域拷贝。这种基因产物可以通过溴化氰处理切割成单个胰岛素原单位。他提出，人胰岛素可以用胰蛋白酶/羧肽酶B切割胰岛素原来制备。但是，其中没有解决提高胰岛素C肽得率的问题。

所以，还是需要一种重组表达方法来提高非融合产物形式的胰岛素C肽的得率。本发明解决了这一需要。

本发明的目的在于改善现有的重组表达肽的方法，主要基于这样一个概念，即，表达单一基因产物形式的包含多份靶肽(胰岛素C肽)拷贝的多聚体(即多聚多肽)，然后切割这样的多聚基因产物(即多聚多肽)以释放单体单位形式的靶肽，由此提高靶肽(在本发明中是胰岛素C肽)的表达量。

所以，本发明一方面提供了一种生产胰岛素C肽的方法，它包括在宿主细胞内表达包含所述胰岛素C肽多份拷贝的多聚多肽，将所述的表达出的多肽切割成单个胰岛素C肽拷贝(即由多聚体释放胰岛素C肽单体)。

多聚多肽(基因产物)由包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列多份拷贝的基因结构(即核酸分子)编码。多拷贝或重复序列在结构中的连接方式使得它们被一起转录和翻译成单一的多基因产物(即多聚多肽)，即“连读方式”，例如，多份核苷酸序列在结构中以匹配读码框内的方式连接。实际上，基因结构宜包含一个由胰岛素C肽编码核苷酸序列构成的串联体。较好的是，基因结构包含编码聚核苷酸的串联拷贝。这样，制备这样的基因结构，然后用标准方法导入宿主细胞，并表达。然后，可回收表达的基因产物(多肽)，切割释放胰岛素C肽单体。

在另一方面内容中，本发明还提供了一种生产胰岛素C肽的方法，它包括培养宿主细胞，细胞中含有包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列多份拷贝的核酸序列，培养条件允许所述核酸所编码的多聚多肽被表达，切割表达的多肽，释放胰岛素C肽的单个拷贝。

在本发明中，“多”或“多聚”指胰岛素C肽或其核苷酸序列的2份或更多份拷贝，以2至50，2至30或2至20份为宜，2至15或2至10份更好。其他的举例性范围还包括3至20，3至15或3至10份。

通常，所述结构包含3份或更多份编码胰岛素C肽的核苷酸序列的拷贝，例如3至7或5至7份。7份或7份以上的范围，例如7至30，7至20或7至15份也可使用。

“胰岛素C肽”在本发明中包括天然或合成胰岛素C肽的所有形式。这样的胰岛素C肽可以是人肽，或来自其他动物，以哺乳动物为佳。所以，对天然胰岛素C肽的各种改变和修饰也包括在内，只要它们保留有胰岛素C肽的活性。胰岛素C肽可以表达成天然形式，即它们天然存在于不同物种或因地域不同所致的不同等位基因变体，或是功能相当的变体或衍生体，彼此的差异可在于氨基酸序列例如截短(从N或C末端，或从N和C两端)或其它氨基酸的缺失、增加或取代。已知，改变蛋白质或肽的序列但同时保留它们有用的活性可以用文献中多有记载的本领域的标准技术做到，例如随机或定点诱变，核酸的切割和连接等。所以，根据本领域熟知的技术可方便地制得天然胰岛素C肽序列的功能相当的变体或衍生体，其中包含具有天然胰岛素C肽功能活性(例如生物活性)的肽序列。所以，就上述的活性而言，例如，已知胰岛素C肽具有刺激Na⁺K⁺ATPase的活性，这一活性可能与报道中胰岛素C肽的许多治疗活性有关，例如治疗糖尿病或治疗或预防诸如糖尿病性神经病、肾病和视网膜病等糖尿病综合征。天然或合成胰岛素C肽序列的片段可能也具有所需的原肽的功能，所以也包括在内。需要特别指出的可能是Wahren等在WO98/13384中所述的肽片段。所有这些胰岛素C肽的类似物、变体、衍生体或片段都包括在本发明的范围内，都包涵于“胰岛素C肽”这一概念。

通常，可使用天然人胰岛素C肽，见图2C(SEQ ID NO：1)。

在本发明方法的另一优选实施例中，基因结构还包含一段编码融合伴侣的序列(融合标签)，例如能够结合基因表达产物加工中所用的基体的融合伴侣，。

“融合伴侣”指经翻译后与胰岛素C肽邻接在一起的蛋白质或肽分子或其衍生物或片段，此特性可用于所表达的融合产物的进一步加工。

融合伴侣与基体之间的相互作用可基于亲合性，螯合肽，疏水性或电荷相互作用，或本领域已知的各种其它机制。通常，融合伴侣是一对亲合性结合配对或配体中的一员，例如能够选择性或特异性与一种配体结合或反应的蛋白质、多肽或肽序列。合适的融合伴侣有，例如，链球菌蛋白G和葡萄球菌蛋白A以及它们的衍生物，谷胱甘肽-S-转移酶和亲合素或链霉亲合素，或上述蛋白的片段或衍生物，它们分别与免疫球蛋白G、底物类似物或抗体和生物素具有强亲合性。上述相互作用可用来从复杂的混合物中纯化融合蛋白产物。蛋白A的ZZ片段(参见Nilsson等，同上)是一例可用的蛋白质片段。当结合诸如Zn²⁺，Cu²⁺或Ni²⁺等金属离子时，可用组氨酸肽作为融合伴侣，并可通过降低pH或用EDTA洗脱(Ljungquist等，(1989)Eur.J.Biochem.186，563-569)。特别好的多肽融合伴侣是链球菌G(spG)的25kDa的血清白蛋白结合区(BB)(Nygren等，(1988)J.Mol.Recogn.1，69-74)或其它SpG衍生的白蛋白结合标签(Stahl & Nygren(1997)Path.Bio.45，66-76)。Oberg等说明了一种表达载体pTrp BB(SEQ ID NO：14)，适用于插入表达所需产物的基因片段，表达出的是与BB形成的融合蛋白(Peoceedings of the 6thEuropean Congress on Biotechnology，1994，179-182)。这些融合伴侣对白蛋白具有强亲合性，所以，可用例如带有白蛋白的层析柱以配体亲合性层析为基础纯化所表达的融合蛋白。最好将白蛋白固定在固相支持物上。

可用各种常规方法进行切割，即由多聚多肽(即表达的基因产物)，或与融合伴侣(可能存在)分离，切割成单体胰岛素C肽。通常，这可用酶来实现。较好的是，最初的基因表达产物，即包含融合伴侣和胰岛素C肽多拷贝(单体)的多聚多肽或融合产物或融合蛋白，是在一步中用一种或多种蛋白水解酶切割的，得到不融合的胰岛素C肽的单独拷贝。胰蛋白酶与羧肽酶B(例如源自牛、猪或其他来源)的联合处理是获取所需剪切产物特别好的方法。胰蛋白酶从蛋白质的C末端开始在每个精氨酸残基处切断，羧肽酶B则在胰蛋白酶消化后去除各肽上的C末端精氨酸。蛋白酶剪切条件是本领域所熟知的，本领域熟知的还有其它合适的蛋白水解酶，例如：枯草杆菌蛋白酶(包括它们的突变体)，肠激酶，Xa因子，凝血酶，IgA蛋白酶，3C蛋白酶和intein。已知，例如，将表达的基因产物与蛋白水解酶(例如胰蛋白酶和羧肽酶B)一起孵育60分钟足以充分加工表达的蛋白。通常，要充分加工融合蛋白使得经常规SDS PAGE检测无融合或多聚蛋白，5分钟孵育就够了。或者，最初的基因表达产物可用诸如CNBr，羟基胺或甲酸等化学试剂来切割。

根据胰岛素C肽和所用核酸分子(基因结构)的确切性质，(例如蛋白水解酶的)剪切位置可以是天然存在的，也可以是通过用诸如定点诱变，编码适当剪切位置的核苷酸序列的连接等已知技术对基因结构进行适当操作而引入的。

通常，表达出的多聚多肽包含一段接头区，即含有或提供一个剪切位置的一段接头残基或肽。较好的是，剪切位置具有被蛋白水解酶识别并剪切的可剪切基序。接头区可位于多聚结构中各“单体”之间，和/或位于融合伴侣(如果存在)与单体肽之间。较好的是，每个单体肽与接头区串联。较好的是，适当的接头序列在多聚体中位于胰岛素C肽单体的两侧，从而确保剪切释放的胰岛素C肽没有任何接头区的残基。接头区可包含1至15个，例如1至12个或1至10个氨基酸残基，但是这一长度并不重要，可以根据方便或具体情况进行选择。1至8，例如1、5和7各残基的接头区可能比较适宜。每个结构中的各接头区可以相同也可以不同，但是为方便起见，通常是相同的。所以，例如，对于胰蛋白酶和羧肽酶B的联合剪切，可提供开始或终止于精氨酸残基的接头。

另一种接头包含单个或作为较长序列一部分的赖氨酸，也可以被胰蛋白酶/羧肽酶B联合剪切。

就位于胰岛素C肽单体之间而言，这样的接头最好开始于和终止于例如N末端和C末端的精氨酸残基这类剪切位置，从而确保释放的胰岛素C肽不含任何其它氨基酸。就位于融合伴侣与胰岛素C肽多聚体末端之间或位于胰岛素C肽多聚体末端而言，可以在接头的合适末端(或位于适合剪切的相应位置，这取决于确切的接头序列和所用的剪切酶)具有单独一个剪切位点(例如Arg)。

代表性接头区实例包括：位于C肽单体之间的-RTASQAR-(SEQ ID NO：2)，位于融合伴侣与C肽多聚体之间的-ASQAR-(SEQ ID NO：3)和位于多聚体末端的-RTASQAVD(SEQ ID NO：4)。

如上所述，可用本领域熟知的标准方法引入接头序列。

本发明的另一方面内容是包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列多份拷贝的核酸分子，所述的核酸分子编码多聚多肽，后者可经剪切而得到所述胰岛素C肽的单拷贝。

从另一方面看，本发明这方面的内容可看成是提供了一种包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列串联体的核酸分子。

上文和后文所述的本发明各方面内容包括这样的实施例：其中，多聚多肽(基因产物)没有胰岛素A肽和B肽；或者，其中的核酸分子不编码胰岛素A肽和B肽。更具体地说，在这样的实施例中，多聚多肽中，或核酸分子所编码的胰岛素C肽的拷贝数是二，多聚多肽不包含或核酸分子不编码胰岛素A肽和B肽。

在本发明一个特别优选的实施例中，核酸分子还包含一段编码融合伴侣的核苷酸序列，这有助于进一步加工所编码的多聚多肽，例如用于纯化所表达的蛋白产物。编码融合伴侣的基因将位于正确的位置和方向以便与胰岛素C肽的多份拷贝一同表达，形成最初的、单个融合肽。合适的融合蛋白参见前文。

较好的是，核酸分子还包含一段或多段编码接头区的核苷酸序列，所述的接头区如前所述含有剪切位点。

作为本发明的核酸分子，可以是例如编码结构式(I)多肽的那些。

                H₂N-A-(C-X)_n-COOH             (I)

其中，

C是胰岛素C肽；

A是一个键或基团F，F是融合伴侣，或基团-(F-X)-；

X是包含至少一个剪切位置的接头区，各X相同或不同；

n是整数2至50。

本发明这方面的内容包括这样一个实施例，其中，结构式(I)的条件是n＝2，所述的多肽(I)不含胰岛素A链和B链。

胰岛素C肽(基团C)，融合伴侣(基团F)和接头区(基团X)的定义如前所述。同样，n的定义可参见前文有关“多”或“多聚”所述。

本发明所用的核酸分子或基因结构宜包含一段调控宿主细胞内表达的合适的调控序列。这样的调控或表达调控序列包括例如以匹配读码框形式与编码序列连接的转录(例如启动子-操纵子区，核糖体结合位点，末端终止序列，增强元件等)和翻译(例如起始和终止密码子)调控元件。

任何合适的宿主细胞均可使用，包括原核细胞和真核细胞，可根据所选的表达系统(例如细菌、酵母、(例如带有杆状病毒的)昆虫或哺乳动物表达系统)来选择。许多表达系统是本领域已知的，在文献中多有记载。例如，大肠杆菌可用作生产肽的宿主细胞，此时，调控序列包含例如大肠杆菌trp启动子。其它合适的宿主包括除大肠杆菌之外的革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，酵母，昆虫，植物或动物细胞(例如，一般是基因工程细胞系)。

包含上述核酸分子的表达载体构成了本发明的另一方面。

任何常用载体都可用来进行本发明方法的表达，许多是本领域已知的并在文献中多有记载。合适的载体包括质粒，粘粒或基于病毒的载体。但是，这些被引入宿主进行表达的载体最好是质粒，噬菌体或病毒载体。这些载体可包含以匹配读码框形式与本发明核酸分子连接的合适的调控序列。根据本领域熟知的技术，还可以包含其它基因元件，例如复制子，协助或促进载体向宿主细胞内转移，稳化功能(例如协助载体在宿主细胞内维持)的序列，克隆位置，限制性核酸内切酶剪切位点或编码标记的序列。载体在宿主细胞内可以是游离体，或者，如果是质粒或其它插入性载体，则插入宿主细胞的染色体。整合到宿主染色体内可能是随机、非特异性的，但是以特异性同源整合为佳。这方面的技术是本领域已知的(参见，例如，Pozzi等，(1992)J.Res.Microbiol.143，449-457和(1996)Gene 169，85-90)。整合为“同源”是因为质粒插入载体具有一段宿主细胞染色体DNA节段。

适合表达本发明基因结构或核酸分子的代表性质粒包括pTrpBB(Oberg等，同上)或其衍生物。或者，可以根据需要修饰所述质粒，以去除编码融合伴侣的序列。任何具有Trp-启动子之类元件的高拷贝载体均可使用。

许多本领域熟知的技术可用于将上述载体引入原核或真核细胞进行，所述技术例如细菌转化技术，转染，电穿孔。经转化或转染的真核或原核细胞(即含有前述本发明核酸分子的宿主细胞)构成本发明的又一方面内容。

如实施例中详细说明的那样，含有本发明核酸分子的表达载体，尤其是质粒，具有在宿主细胞内遗传稳定的优点；根据限制性酶切图，在由生长到高细胞密度的培养物制备的质粒中，没有发现遗传不稳定性。

本发明的另一方面内容提供了一种制备编码多聚多肽的核酸分子的方法，所述的多聚多肽含有多份胰岛素C肽拷贝，其中，表达出的多聚多肽然后可被切割成胰岛素C肽单拷贝，该方法包括产生如下核酸分子：其中包含以匹配读码框形式连接的多份编码胰岛素C肽的核苷酸拷贝。

许多本领域熟知的用来产生基因或基因片段多拷贝的技术都可用于本发明方法。例如，可用设计好的单链非回文突出末端从头至尾聚合成合成DNA片段。然后，可将聚合DNA片段直接与限制性酶产生的匹配突出端连接(Ljungquist等，(1989)Eur.J.Biochem.186，563-569)。其它基因片段多聚方法以使用Bsp MI(Stahl等，(1990)Gene 89，87-193)或Bsm I(Haydn和Mandecki(1988)DNA 7，571-577)等IIS限制性内切酶为基础。其它方法包括基因结构的聚合和含有限制性位点的接头分子的连接以允许进一步亚克隆(Aslund等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84，1399-1430和Irving等，(1988)Technological Advance in Vaccine Development，A.R.Liss Inc.，New York 97-105)。重新合成基因的方法也是已知的，这涉及使用聚合酶链反应(PCR)，适合生成多聚基因片段(Majumder(1992)Gene 110，89-94和Nguyen等，(1994)Advances in Biomagnetic Separation，Eaton Publishing Co.，Natick 73-78)。

在本发明方法的一个优选实施例中，纯化的基因片段(即编码胰岛素C肽的核苷酸序列)是由所设计的非回文突出端从头至尾聚合而成的，然后连接到用限制性内切酶(以Sfi I为宜)消化的质粒中。

在一特别优选的实施例中，包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列(例如基因片段)的质粒经消化切下所述的序列或基因片段，并在所述序列或基因片段经多聚之后又连接返回到经消化的质粒中。最好用PCR筛选技术来筛选转化体(Stahl等，(1933)Biotechniques 14，424-434)，由此扩增一份或多份编码胰岛素C肽的节段。可用琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段的比较。在另一优选实施例中，分离出编码所需数量(例如3或7份)串联胰岛素C肽的基因片段，并连接到用相同于切取胰岛素C肽编码片段所用限制性内切酶消化的另一质粒中。更好的是，被用于转化宿主细胞的后一质粒还含有合适的启动子和一段编码胰岛素C肽的合适融合伴侣的序列。

本发明的另一方面内容包括上述方法的产物，即胰岛素C肽聚合体和所述聚合体经剪切产生的单个胰岛素C肽。

具体地说，本发明的这方面内容提供了一种多聚多肽，它包含胰岛素C肽的多份拷贝，能够经剪切而释放出所述胰岛素C肽的单拷贝。或者，多聚多肽还可以包含融合伴侣，和/或位于所述胰岛素C肽单体两侧的包含一个剪切位点的接头区。

本发明还提供了一种生产多聚多肽的方法，所述的多聚多肽包含胰岛素C肽的多份拷贝，能够经剪切而释放出所述胰岛素C肽的单拷贝，该方法包括：在允许所述多聚多肽表达的条件下培养宿主细胞，宿主细胞内含有编码所述多聚多肽的核酸分子，回收表达出的多聚多肽。

可用本领域的已知技术来培养宿主细胞，例如分批培养或连续培养。

可用本领域熟知的标准方法由宿主细胞培养物回收多聚基因产物或多肽，例如标准细胞裂解法和蛋白质纯化技术。如前所述，如果多聚多肽中含有融合伴侣，纯化可以基于融合伴侣的亲合性方便地实现。

本领域已知的多种从细胞或细胞培养基分离天然表达或重组表达的蛋白质或多肽的的技术均可使用。可用本领域已知并在文献中多有记载的各种方法进行细胞裂解，以释放胞内的蛋白/多肽，而且，根据使用的方法是分批培养还是连续培养，如果必要，还可以再进行纯化，这也是基于本领域的已知技术。

现发现，通过热处理裂解细胞并回收多肽对于本发明的胰岛素C肽多聚多肽特别有效，例如WO90/00200所述的方法以及它的修改形式。这类方法涉及将含细胞的培养基在例如50-100℃加热一段时间，通常不超过1小时，所表达的多肽于是以较好的基本纯形式释放到培养基中。这被认为是所表达多肽选择性释放的结果。具体地说，出人意料的是，不论是否重组多肽产物，如果它可溶而且对热处理稳定，这类方法都有效(该方法因此更为通用)，但是对本发明的胰岛素C肽多聚多肽特别有效，此时可以出人意料的高得率获得高纯度产物。所以，例如，这样的热处理可以是在例如80-100℃(例如85-99℃或90-95℃)加热5-20分钟(例如8-10分钟)，然后冷却至0-4℃或在冰上冷却。

回收多聚多肽之后，可通过其切割释放出的胰岛素C肽单个单体。所以，本发明的另一方面内容提供了一种生产胰岛素C肽的方法，该方法包括剪切上述多聚多肽，释放所述胰岛素C肽的单拷贝。

如上所述剪切多聚多肽获得C肽单个单体后，还可以用众所周知的纯化技术(例如超滤、分子量排阻层析、澄清、反相层析等)进一步纯化直至(例如)均一(例如经SDS-PAGE检验)。

本发明的另一方面内容是上述方法所产生的剪切多肽产物的治疗用途。剪切产生的胰岛素C肽可用于治疗I型糖尿病或糖尿病综合征。所以，本发明还包括一种治疗I型糖尿病或糖尿病综合征的方法，它包括给予用上述方法中任一种所制备的胰岛素C肽。

通过非限定性实施例和以下附图将对本发明进行更为详细的描述，附图中：

图1是本发明基因结构的生产，包括编码C肽的基因片段的多聚反应。

图2A和B是两基因产物BB-C3(A)和BB-C7(B)的图，其中C肽两侧的接头区用单字母代码表示。每个C肽两侧都有精氨酸残基(粗体)。

图2C显示以单字母代码表示的C肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图3是两融合蛋白BB-C3(泳道1)和BB-C7(泳道2)经HAS-琼脂糖亲合性纯化后，还原条件下的SDS-PAGE凝胶(10-15％)电泳照片拷贝。泳道M中是分子量分别为94、67、43、30、20和14kDa的标记蛋白。

图4A是BB-C3与胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同时间后还原条件下的SDS-PAGE凝胶(10-15％)电泳照片拷贝。泳道1显示未被消耗的融合蛋白，泳道2是经5分钟胰蛋白酶和羧肽酶B处理后的蛋白消化产物。泳道M显示分子量分别为94、67、43、30、20和14kDa的标记蛋白。

图5分别显示对等摩尔量BB-C7(上)和BB-C3(中)胰蛋白酶和羧肽酶B剪切混合物的反相层析(RPC)分析。以购自Sigma的胰岛素C肽作为对照(下)。

图6是BB-C7融合产物经胰蛋白酶(质量比5000∶1)和羧肽酶B(质量比2000∶1)处理不同时间后分子量排阻层析(Superdex Peptide，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)图的重叠。

图7显示由BB-C7处理产生的胰岛素C肽(A)与Eli Lilly提供的胰岛素C肽(B)或购自Sigma的胰岛素C肽(C)进行比较的反相层析分析。

图8显示包含融合伴侣BB和7份胰岛素C肽拷贝的肽产物的单字母氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。

图9显示合成融合蛋白BB-C1(泳道1)，BB-C3(泳道2)和BB-C7(泳道3)在HAS琼脂糖上亲合性纯化后的SDS-10-15％PAGE分析。分子量以kDa表示。

图10分别是等摩尔量BB-C1，BB-C3和BB-C7的胰蛋白酶+羧肽酶B剪切混合物的RPC分析。以购得的C肽标准物(Sigma)作为对照(图底)。

图11显示pTrpBB-C7质粒在大肠杆菌内培养0(泳道1)、7(泳道2)、27(泳道3)或31(泳道4)小时后KpnI-PsntI限制性酶切的琼脂糖凝胶(1％)电泳分析。泳道5显示最初转化大肠杆菌细胞的原pTrpBB-C7质粒的KpnI-PsntI限制性酶切，泳道6是培养31小时后未被剪切的pTrpBB-C7。标记物泳道(M)含有PstI限制性酶切的λ噬菌体DNA。箭头指示C7片段的位置。

图12显示BB-C7培养样品的SDS-PAGE分析(还原条件下)。泳道1：2μl未处理培养物的培养基。泳道2：0.5μl超声波处理的培养物。泳道3：0.5μl热处理培养物后的培养基。箭头指示BB-C7融合蛋白的位置。泳道M显示分子量为94、67、43、30、20和14kDa的标记蛋白。

实施例1-DNA结构的制备将以下4条合成寡核苷酸磷酸化，并通过70℃孵育10分钟退火配对(Jope10：Jope12和Jope11：Jope13)，然后冷却至室温：Jope10：CGGCCTCCCAGGCCCGCGAAGCTGAGGACCTGCAAGTTGGTCAGGTTGAACTGGGCGGTGGCCCGGGTGCAGGC(SEQ ID NO：6)，Jope11：TCTTTGCAGCCGCTGGCTTTAGAAGGTTCTCTTCAGCGTACGGCCTCCCAGGCCGTCGACTAACTGCA(SEQ ID NO：7)，Jope12：CATGGCCGGAGGGTCCGGGCGCTTCGACTCCTGGACGTTCAACCAGTCCAACTTGACCCGCCACCGGG(SEQ ID NO：8)和Jope13：CCCACGTCCGAGAAACGTCGGCGACCGAAATCTTCCAAGAGAAGTCGCATGCCGGAGGGTCCGGCAGCTGATTG(SEQ ID NO：9)。将创制的接头混合，并与KpnI-PstI消化的质粒pUC18连接(Yanish-Perron等，1985，Gene 33，103-106)(图1)，用连接混合物转化dcm-大肠杆菌GM31(Marinus，(1973)Mol.Gen.Menet.127，47-55)。用基于PCR的固相DNA测序(Hultman等，(1989)Nucl.Acids Res.17，4937-4946)鉴定出含有插入胰岛素C肽编码基因片段正确核苷酸序列的转化体(PUC-C1)。由pUC-C1制备质粒DNA，用SfiI限制性酶切，用Mermaid试剂盒(glass-milk)(BIO 101 Inc.，CA，USA)或GeneClean-试剂盒(BIO 101 Inc.，CA，USA)分别纯化切下的胰岛素C肽编码基因片段和载体部分。

利用人工设计的非回文突出序列从头至尾聚合纯化的胰岛素C肽基因片段，然后连接返回SfiI消化的质粒中。用连接混合物转化大肠杆菌RRIΔM15细胞(Ruther，(1982)Nucl.Acid.Res.10，5765-5772)，用PCR筛选技术(Stall等，(1993)同上)筛选转化体。简而言之，将单个集落挑取到含有50μlPCR反应混合物(20mMTAPS，pH9.3，20℃，2mM MgCl₂，50mM KCl，0.1％Tween-20，0.2mM dTMP，6pmol引物(RIT27：GCTTCCGGCTCGTATGTGTG(SEQ ID NO：10)和RIT28：AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG(SEQ ID NO：11))和1.0单位Taq聚合酶)的PCR管中。两PCR引物RIT27和RIT28具有pUC18内位于胰岛素C肽片段插入点两侧的退火位点。由集落经PCR扩增得到的片段具有不同数量的插入寡核苷酸，以pUC18作为参照用琼脂糖凝胶电泳进行比较，鉴定出带有1至7份插入片段的转化体。所得的质粒因此称为pUC-C1，pUC-C2等。

制备质粒，用KpnI-PstI消化切下含有所需数量插入片段的基因片段。分别分离出编码1个，3个或7个串联胰岛素C肽的基因片段，并与同样消化的pTrpBBT1T2连接，所得的质粒分别称为pTrpBB-C1，pTrpBB-C3和pTrpBB-C7。质粒pTrpBBT1T2是通过在质粒pTrpBB(Oberg等，(1994)Proc.6^th Eur.CongressBiotechnol；Elsevier science B.V.179-182)中插入质粒pKK223-3(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)的转录终止序列构建而成的。转录终止序列是用标准PCR扩增方案(Hultman等，1989，同上)和寡核苷酸HEAN-19：CCCCCTGCAGCTCGAGCGCCTTTAACCTGTTTTGGCGGATG(SEQ ID NO：12)和HEAN-20：CCCCAAGCTTAGAGTTTGTAGAAACGC(SEQ ID NO：13)由pKK223-3获得的。

由PCR引入的限制性位点用PstI和HindIII消化，然后插入预先已用相同酶消化过的pTrpBB。所得的表达载体pTrpBBT1T2编码一个亲合柄(affinityhandle)，它包含trp操纵子的前导序列(8氨基酸)和链球菌蛋白G的血清白蛋白结合区BB(25kDa)(Nygren等，(1988)，同上)。转录受大肠杆菌trp启动子的调控。此外，质粒带有卡那霉素抗性基因。实施例2-蛋白质的表达与纯化

分别含有编码融合蛋白BB-C3和BB-C7的pTrpBB-C3和pTrpBB-C7的大肠杆菌细胞在10ml含有补充了酵母提取物(Difco)(5g/l)和一硫酸卡那霉素(50mg/l)的胰朊酶大豆培养液(Difco USA)(30g/l)的摇瓶中37℃培养通宵。将通宵培养物稀释10倍成为100ml，加入含有相同培养基的带搅拌摇瓶中于37℃培养。在对数期中期(A₆₀₀nm≈1)，加25mg/l β-吲哚丙烯酸诱导基因表达。诱导后20小时，6000g离心10分钟收获细胞。以20倍培养体积将细胞重悬于TST(50mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，0.05％Tween20，1mM EDTA)，超声波裂解，40,000g离心。离心沉淀摇瓶培养物，然后将细胞重悬于30ml冷TST缓冲液中，由此制成用于超声波处理的样品。在Sonics and Materials Inc.(Danbury，Connecticut，USA)的振动架上(500W)，用13mm标准倾角(horn tip)，70％负载周期(20kHz)，并将输出控制设定为6.5，进行2分钟脉冲超声波处理。过滤含有可溶胞质蛋白的上清液，用TST稀释至100ml。如Stahl等在(1989)J.Immunol.Meth.124，43-52中所述，在人血清白蛋白(HAS)-琼脂糖(Nygren等(1988)同上)上通过亲合层析分离可溶融合蛋白。测定280nm处的吸光度，检测洗脱流份，冷冻干燥相关流份。

图3显示经一步HSA-琼脂糖上亲合性纯化后的BB-C3和BB-C7。为主的是两种融合蛋白的全长产物，而且它们的迁移都符合它们的分子量；分别为39.1和54.2kDa。两种融合蛋白的摇瓶培养表达水平几乎相当；BB-C3为130mg/l，BB-C7为120mg/l。实施例3-融合蛋白的蛋白酶水解消化

长久以来都用从C末端剪切碱性氨基酸残基的胰蛋白酶剪切融合蛋白。虽然已知其特异性较低，但是胰蛋白酶经证明能够特异性剪切融合蛋白，留下位于未剪切折叠蛋白结构域内的碱性残基(Wang等，(1989)J.Biol.Chem.264，21116-21121)。胰蛋白酶的优点还在于价廉和易得。在此，我们将胰蛋白酶与羧肽酶B联用来处理BB-C3和BB-C7，以获得天然人胰岛素C肽。这样，用胰蛋白酶消化后，胰蛋白酶将从C末端开始在每个胰岛素C肽的精氨酸残基处切断融合蛋白。

为了分析处理效率，两种融合蛋白BB-C3和BB-C7与胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同的时间，并进行SDS/PAGE分析。发现，对两种融合蛋白的处理都很迅速，5分钟的处理后，SDS/PAGE分析显示不再有融合蛋白。(图4A和B)。

此外，还在剪切融合蛋白BB-C3和BB-C7之后比较了胰岛素C肽单体相对得率。用胰蛋白酶和羧肽酶B处理等摩尔的BB-C3和BB-C7，然后用反相HPLC(250mm，Kromasil C8层析柱，4.6mm内径，7μm粒径，Hewlett Packard 1090)分析剪切混合物。用含0.1％三氟乙酸的10-40％乙腈梯度洗脱，40℃，30分钟。如图5所示，与剪切BB-C3融合蛋白相比，剪切BB-C7得到的胰岛素C肽产物(洗脱时间约为25.4分钟)与其它剪切产物(来自BB融合伴侣)之比明显更高。胰岛素C肽峰面积积分得峰面积之比为2.43，接近理论值2.33。

由此并不能得知融合蛋白何时被完 全处理。为了确定胰蛋白酶-羧肽酶B处理何时达到完全，对融合蛋白BB-C7进行不同时间的酶处理。将冷冻干燥的融合蛋白BB-C7溶于含0.1(体积)％Tween20的100mM磷酸盐缓冲液，pH7.5中，蛋白质浓度为1mg/ml，加入胰蛋白酶(T-2395，Sigma，St.Louis，MO，USA)和羧肽酶B(Boehringer Mannheim)，分别使胰蛋白酶/融合蛋白之比为1/5000(质量比)，羧肽酶B/融合蛋白之比为1/2000(质量比)。在15，30，60和120分钟后，从剪切混合物中采集样品，并通过加HAc将pH降低至3以终止反应。为了稳定剪切产物，加入20(体积)％乙腈。

用分子量排阻层析(Superdex Peptide柱，SMART^TM系统，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)分析剪切物质，并将层析图重叠(图6)，可得出结论，在上述条件下，60分钟后，BB-C7被处理完全，因为延长孵育时间不再增加胰岛素C肽。以上结果还显示，可以由包含多聚形式胰岛素C肽的融合蛋白获得一定量的胰岛素C肽。实施例4-所得胰岛素C肽的描述：反相层析(RPC)和质谱

为了证实所得的肽的确是天然人胰岛素C肽，进行了两种不同的分析。首先，用反相层析(RPC)比较RPC纯化的处理BB-C7所到胰岛素C肽和胰岛素C肽标准物，所述的标准物是Eli Lilly(CA，USA)提供的C肽和市售的胰岛素C肽片段3-33(购自Sigma，USA)。在Sephasil C8 5μm SC2.1/10柱上，用SMART^TM系统(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行胰岛素C肽制剂的RPC分析。用含0.1(体积)％三氟乙酸的26-36％乙腈梯度在25℃进行20分钟洗脱。流速为100μl/min，测定240nm处的吸光度。可以得出结论：三种制剂基本相同，因为都具有相同的滞留时间和同样低的杂质含量(图7)。第二，对由BB-C7获得的胰岛素C肽进行质谱分析(表1)。用配备电子喷射单元的JEOL SX102质谱仪(JEOLJapan)测定蛋白质分子量。结果发现，和在比较性RPC分析中所观察到的与胰岛素C肽标准物的相似性一样，分子量非常一致(表1)，这说明获得的是天然人胰岛素C肽。表1.胰岛素C肽的分子量(Da)计算值             3020.3实验值             3019.7±1.8实施例5-所得胰岛素C肽单体的描述：放射性免疫测试(RIA)

用用于检测(例如)血液和尿液中人胰岛素C肽含量的市售放射性免疫试验(Euro-Diagnosia，Malmo，Sweden；cat.no.MD315)分析剪切融合蛋白BB-C7所得的胰岛素C肽单体。为了进行比较，还对已知具有生物活性的(Johansson等，(1992)Diabetologia 35：1151-1158)胰岛素C肽制剂(Eli Lilly Co.，Indianapolis，Ind，USA)进行了分析。将两种C肽制剂稀释于0.05M磷酸钠缓冲液，pH7.4，5％人血清白蛋白(HSA)和0.02％Thimreosal，最终浓度分别为3.31和3.30nmol/l，然后称重，由此制备分析样品。简而言之，试验用到兔抗人C肽抗血清，¹²⁵I-人胰岛素C肽示踪剂，山羊抗兔Ig抗血清-PEG试剂，人胰岛素C肽标准物和对照样品，用于在建立标准曲线后确定样品中人胰岛素C肽的量。两份样品的分析结果概括于表2。结果显示，两种制剂被RIA试验同等地识别和定量。表2.比较性RIA分析：已知具有生物活性的胰岛素C肽和剪切重组融合蛋白BB-C7获得的胰岛素C肽样品                        估计浓度(nM)          测得浓度(nM)胰岛素C肽(剪切融合蛋         2.34(71％)               3.31白BB-C7所得)胰岛素C肽(购自Eli-           2.41(73％)               3.30Lilly)实施例6-融合蛋白BB-C1、BB-C3和BB-C7的表达、纯化和蛋白酶水解

本实施例进一步提供实施例2和3中实验有关BB-C1融合蛋白的比较结果。

培养分别含有质粒pTrpBB-C1，pTrpBB-C3和pTrpBB-C7的大肠杆菌(实施例1)，如实施例2所述表达，收获，纯化和分析融合蛋白。

分析pTrpBB-C1，pTrpBB-C3或pTrpBB-C7转化的大肠杆菌细胞显示，所编码的融合蛋白BB-C1，BB-C3和BB-C7胞内积累，是可溶性基因产物(未有数据)。裂解细胞后，HSA亲合性层析有效的纯化了产生的融合蛋白。图9显示经一步HSA-琼脂糖亲合性纯化后的BB-C1，BB-C3和BB-C7。为主的都是三种融合蛋白的全长产物，它们的迁移符合它们的分子量；分子量分别为31.5，39.1和54.2kDa。摇瓶培养物的表达水平可以再现，而且三种不同融合蛋白水平相当，都在40-60mg/l范围内。

为了检测处理三种亲合性纯化的融合蛋白的效率，BB-C1，BB-C3和BB-C7与胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同的时间，并进行SDS-PAGE分析。三种融合蛋白都被迅速处理：5分钟后，SDS-PAGE检测无全长融合蛋白残留(未有数据)。

进一步如实施例3所述测定蛋白酶水解处理的效率，发现，60分钟后，BB-C7被剪切完全。

为了更充分地比较BB-C1，BB-C3和BB-C7融合蛋白经剪切后胰岛素C肽单体的相对得率，进行反相HPLC分析(如实施例3所述)。分析的是等摩尔BB-C1，BB-C3和BB-C7经胰蛋白酶+羧肽酶B处理120分钟后的剪切混合物。测定A_220nm。结果显示(图10)，与剪切BB-C1融合蛋白相比，BB-C3和BB-C7融合蛋白的C肽产物与其它剪切产物之比明显更高。大致等摩尔量的各种融合蛋白上样在RPC柱上，这可以由三张层析图中胰蛋白酶消化产生的BB-标签产生的相等峰高来证明(图10)。C肽峰面积积分的结果为：C3∶C1为2.5，C7∶C1为6.0，分别接近理论值3和7。

以上结果进一步表明，与单融合蛋白(C1)相比，胰岛素C肽多聚体(C3，C7)产生胰岛素C肽单体的得率提高了。实施例7-编码BB-C7融合蛋白的质粒pTrpBB-C7的遗传稳定性研究

该实施例说明如何评价编码BB-C7融合蛋白的质粒pTrpBB-C7的遗传稳定性。含质粒pTrpBB-C7的大肠杆菌培养不同的时间，在培养0，7，27和31小时时取样。31小时类似于大规模发酵生产BB-C7的培养时间。根据标准方法从样品中回收质粒(Sambrook等，A Laboratory Mannul，2th版，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)。对该质粒进行KpnI-PstI限制性酶切，以切取编码C7串的片段(见图1)。用于最初转化大肠杆菌的原pTrpBB-C7质粒被作为对照，因此也接受KpnI-PstI限制性酶切。如图11所示，所有样品的限制性酶切片段大小都相同，这证明，随着培养时间的延长，质粒pTrpBB-C7是遗传稳定的。实施例8-为BB-C7选择性释放进入培养基的热处理

该实施例说明BB-C7融合蛋白如何经热处理而选择性释放到培养基中，并由此显著提高用于进一步纯化BB-C7的起始物的纯度。背景：与释放大肠杆菌胞内产生的重组蛋白最常用的方法(包括离心，将细胞沉淀重悬于合适的缓冲液和用高压均质化裂解细胞等操作单元)相比，热处理释放基因产物具有许多优点：(i)包括热处理的生产流程减少了一步；(ii)因为宿主细胞的蛋白酶被热变性，提高了基因产物的稳定性；(iii)通过沉淀其它大肠杆菌蛋白，初步纯化了大部分基因产物，和(iv)与全细胞裂解相比，核酸释放减少。该方法也适用于释放其它胞内表达的重组蛋白，这样的蛋白必须可溶，表达水平高，而且对于释放蛋白所需的热处理稳定。

如实施例2所述培养含有编码BB-C7的质粒pTrpBB-C7的大肠杆菌。与所述超声波裂解细胞(实施例2)不同的是，用一步热处理选择性地、有效地使BB-C7释放到培养基中。在培养结束时，将培养物浸没在水中，将水煮沸8-10分钟。此时，培养物的温度达到约90℃。然后将摇瓶置于冰上。如图12(泳道3)所示，在此温度，BB-C7融合蛋白释放进入培养基，但基本上没有宿主细胞蛋白释放。宿主蛋白很可能被该处理完全变性。相反，超声波处理(图12，泳道2)和其他裂解细胞的机械法释放全部宿主蛋白和核酸，使得进一步纯化BB-C7的起始物非常混杂。大肠杆菌正常分泌的蛋白很少(图12，泳道1)。BB-C7被发现对热稳定，可以进一步如实施例1-3所述纯化和处理，以释放C肽单体。

                      序列表(1)一般信息：

 (i)申请人：

      (A)名称：Creative Peptides Sweden AB

      (B)街道：Dahlbergsstigen 6

      (C)城市：Djursholm

      (E)国家：瑞典

      (F)邮编：S-182 64

 (i)申请人：

      (A)名称：Stefan Stahl

      (B)街道：c/o Royal Institute of Technology

      (C)城市：Stockholm

      (E)国家：瑞典

      (F)邮编：S-100 44

 (i)申请人：

      (A)名称：Mathias Uhlen

      (B)街道：c/o Royal Institute of Technology

      (C)城市：Stockholm

      (E)国家：瑞典

      (F)邮编：S-100 44

 (i)申请人：

      (A)名称：Per-Ake Nygren

      (B)街道：c/o Royal Institute of Technology

      (C)城市：Stockholm

      (E)国家：瑞典

      (F)邮编：S-100 44

 (i)申请人：

      (A)名称：Per Jonasson

      (B)街道：c/o Royal Institute of Technology

      (C)城市：Stockholm

      (E)国家：瑞典

      (F)邮编：S-100 44

 (ii)发明名称：胰岛素C肽的重组表达

 (iii)序列数：14

 (iv)计算机可读形式：

      (A)介质类型：软盘

      (B)计算机：IBM PC兼容机

      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

      (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：31氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：肽

 (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

 1                5                  10                  15

 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln

             20                  25              30(2)SEQ ID NO：2的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：7氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：肽

 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

 Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg

 1               5(2)SEQ ID NO：3的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：5氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：肽

 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

 Ala Ser Gln Ala Arg

 1                5(2)SEQ ID NO：4的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：8氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：肽

 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

 Arg Thr Ala Ser Gln Ala Val Asp

 1                5(2)SEQ ID NO：5的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：521氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp1               5                   10                  15Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys

        20                  25                  30Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln

    35                  40                  45Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr

50                  55                  60Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr65                  70                  75                  80Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu

            85                  90                  95Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn

        100                 105                 110Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu

    115                 120                 125Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp

130                 135                 140Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu145                 150                 155                 160Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

            165                 170                 175Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu

        180                 185                 190Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr

    195                 200                 205Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

210                 215                 220Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro225                 230                 235                 240Ile Leu Glu Asn Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala

            245                 250                 255Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

        260                 265                 270Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala

    275                 280                 285

 Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu

     290                 295                 300

 Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly

 305                 310                 315                 320

 Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln

                 325                 330                 335

 Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln

             340                 345                 350

 Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg

         355                 360                 365

 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

     370                 375                 380

 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg

 385                 390                 395                 400

 Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val

                 405                 410                 415

 Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

             420                 425                 430

 Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp

         435                 440                 445

 Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser

     450                 455                 460

 Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln

 465                 470                 475                 480

 Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly

                 485                 490                 495

 Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

             500                 505                 510

 Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Val Asp

         515                 520(2)SEQ ID NO：6的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：74碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑：线性

 (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG      60GCCCGGGTGC AGGC                                                        74

(2)SEQ ID NO：7的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：68碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC      60TAACTGCA                                                               68

(2)SEQ ID NO：8的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：68碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG      60CCACCGGG                                                               68

(2)SEQ ID NO：9的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：74碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其他核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CCCACGTCCG AGAAACGTCG GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT     60CCGGCAGCTG ATTG                                                       74

(2)SEQ ID NO：10的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：20碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)说明：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GCTTCCGGCT CGTATGTGTG                                                 20

(2)SEQ ID NO：11的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：23碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG                                           23

(2)SEQ ID NO：12的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：41碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其他核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CCCCCTGCAG CTCGAGCGCC TTTAACCTGT TTTGGCGGAT G                       41

(2)SEQ ID NO：13的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：27碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″寡核苷酸″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CCCCAAGCTT AGAGTTTGTA GAAACGC                                       27

(2)SEQ ID NO：14的信息：

     (i)序列特征：

          (A)长度：4646碱基对

          (B)类型：核酸

          (C)链型：单链

          (D)拓扑：线性

     (ii)分子类型：其它核酸

          (A)描述：/desc＝″载体″

     (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GCGGCCGCTA ATTCATGCTG TGGTGTCATG GTCGGTGATC GCCAGGGTGC CGACGCGCAT      60CTCGACTGCA CGGTGCACCA ATGCTTCTGG CGTCAGGCAG CCAATCGGAA GCTGTGGTAT     120GGCTGTGCAG GTCGTAAATC ACTGCATAAT TCGTGTCGCT CAAGGCGCAC TCCCGTTCTG     180GATAATGTTT TTTGCGCCGA CATCATAACG GTTCTGGCAA ATATTCTGAA ATGAGCTGTT     240GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA     300ATTATGAAAG CAATTTTCGT ACTGAATGCG CAACACGATG AAGCCGTAGA CGCGAATTTC     360GACCAATTCA ACAAATATGG AGTAAGTGAC TATTACAAGA ATCTAATCAA CAATGCCAAA     420ACTGTTGAAG GCGTAAAAGA CCTTCAAGCA CAAGTTGTTG AATCAGCGAA GAAAGCGCGT     480ATTTCAGAAG CAACAGATGG CTTATCTGAT TTCTTGAAAT CACAAACACC TGCTGAAGAT     540ACTGTTAAAT CAATTGAATT AGCTGAAGCT AAAGTCTTAG CTAACAGAGA ACTTGACAAA     600TATGGAGTAA GTGACTATCA CAAGAACCTA ATCAACAATG CCAAAACTGT TGAAGGTGTA     660AAAGACCTTC AAGCACAAGT TGTTGAATCA GCGAAGAAAG CGCGTATTTC AGAAGCAACA     720GATGGCTTAT CTGATTTCTT GAAATCACAA ACACCTGCTG AAGATACTGT TAAATCAATT     780GAATTAGCTG AAGCTAAAGT CTTAGCTAAC AGAGAACTTG ACAAATATGG AGTAAGTGAC     840TATTACAAGA ACCTAATCAA CAATGCCAAA ACTGTTGAAG GTGTAAAAGC ACTGATAGAT     900GAAATTTTAG CTGCATTACC TAAGACTGAC ACTTACAAAT TAATCCTTAA TGGTAAAACA     960TTGAAAGGCG AAACAACTAC TGAAGCTGTT GATGCTGCTA CTGCAAGATC TTTCAATTTC    1020CCTATCCTCG AGAATTCGAG CTCGGTACCG GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG    1080CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT    1140TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT    1200GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA    1260GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC CGCGAAGCTG AGGACCTGCA AGTTGGTCAG    1320GTTGAACTGG GCGGTGGCCC GGGTGCAGGC TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT    1380CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA    1440CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGCTCTTTG CAGCCGCTGG CTTTAGAAGG TTCTCTTCAG    1500CGTACGGCCT CCCAGGCCCG CGAAGCTGAG GACCTGCAAG TTGGTCAGGT TGAACTGGGC    1560GGTGGCCCGG GTGCAGGCTC TTTGCAGCCG CTGGCTTTAG AAGGTTCTCT TCAGCGTACG    1620GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC    1680CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC    1740CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT    1800GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC   1860GTCGACTAAC TGCAGCTCGA GCGCTTAACT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC   1920TGATACAGAT TAAATCAGAA CGCAGAAGCG GTCTGATAAA ACAGAATTTG CCTGGCGGCA   1980GTAGCGCGGT GGTCCCACCT GACCCCATGC CGAACTCAGA AGTGAAACGC CGTAGCGCCG   2040ATGGTAGTGT GGGGTCTCCC CATGCGAGAG TAGGGAACTG CCAGGCATCA AATAAAACGA   2100AAGGCTCAGT CGAAAGACTG GGCCTTTCGT TTTATCTGTT GTTTGTCGGT GAACGCTCTC   2160CTGAGTAGGA CAAATCCGCC GGGAGCGGAT TTGAACGTTG CGAAGCAACG GCCCGGAGGG   2220TGGCGGGCAG GACGCCCGCC ATAAACTGCC AGGCATCAAA TTAAGCAGAA GGCCATCCTG   2280ACGGATGGCC TTTTTGCGTT TCTACAAACT CTAAGCTTTG GTGCAGGGGG GGGGGGGAAA   2340GCCACGTTGT GTCTCAAAAT CTCTGATGTT ACATTGCACA AGATAAAAAT ATATCATCAT   2400GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTTATG AGCCATATTC   2460AACGGGAAAC GTCTTGCTCG AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT GATTTATATG   2520GGTATAAATG GGCTCGCGAT AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT CGATTGTATG   2580GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT GCCAATGATG   2640TTACAGATGA GATGGTCAGA CTAAACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT CCGACCATCA   2700AGCATTTTAT CCGTACTCCT GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC CCCGGGAAAA   2760CAGCATTCCA GGTATTAGAA GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT GATGCGCTGG   2820CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT AACAGCGATC   2880GCGTATTTCG TCTCGCTCAG GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT GATGCGAGTG   2940ATTTTGATGA CGAGCGTAAT GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAAGAA ATGCATAAAC   3000TTTTGCCATT CTCACCGGAT TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT GATAACCTTA   3060TTTTTGACGA GGGGAAATTA ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA ATCGCAGACC   3120GATACCAGGA TCTTGCCATC CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT TCATTACAGA   3180AACGGCTTTT TCAAAAATAT GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG CAGTTTCATT   3240TGATGCTCGA TGAGTTTTTC TAATCAGAAT TGGTTAATTG GTTGTAACAC TGGCAGAGCA   3300TTACGCTGAC TTGACGGGAC GGCGGCTTTG TTGAATAAAT CGAACTTTTG CTGAGTTGAA   3360GGATCAGATC ACGCATCTTC CCGACAACGC AGACCGTTCC GTGGCAAAGC AAAAGTTCAA   3420AATCACCAAC TGGTCCGGAT CCCGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC   3480AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT   3540AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC   3600ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC   3660GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG   3720ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA   3780ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC   3840CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT   3900GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA   3960CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC   4020TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC   4080CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT   4140GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT   4200GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC   4260TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG   4320ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC   4380GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG   4440CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA   4500GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT   4560TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA   4620ACAGCTATGA CCATGATTAC GAATTA                                        4646

Claims (21)

1.一种生产胰岛素C肽的方法，它包括在宿主细胞内表达包含所述胰岛素C肽多份拷贝的多聚多肽，剪切所表达的多肽释放胰岛素C肽单拷贝。

2.一种核酸分子，包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列的多份拷贝，所述的核酸分子编码能够经剪切释放所述胰岛素C肽单拷贝的多聚多肽。

3.一种生产核酸分子的方法，所述的核酸分子编码包含胰岛素C肽多份拷贝的多聚多肽，所表达的多聚多肽能够再经剪切而产生胰岛素C肽单拷贝，所述的方法包括产生包含编码胰岛素C肽的核苷酸序列多份拷贝的核酸分子，以匹配读码框形式连接。

4.一种多聚多肽，它包含胰岛素C肽的多份拷贝，能够经剪切释放所述胰岛素C肽的单拷贝。

5.一种生产多聚多肽的方法，所述多聚多肽包含胰岛素C肽的多份拷贝，并能够经剪切释放所述胰岛素C肽单拷贝，所述的方法包括在所述多聚多肽被表达的条件下培养含有编码所述多聚多肽的核酸分子的宿主细胞，回收所表达的多聚多肽。

6.一种生产胰岛素C肽的方法，所示的方法包括剪切权利要求4所述的多聚多肽。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述胰岛素C肽或编码胰岛素C肽的核苷酸序列的多份拷贝串联排列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽包含所述胰岛素C肽的2至30份拷贝。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽包含所述胰岛素C肽的3至7份拷贝。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽还含有融合伴侣。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中的融合伴侣是亲合性结合对或配体中的一方。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的融合伴侣是链球菌蛋白G的25kDa的血清白蛋白结合区(BB)。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述多聚多肽中胰岛素C肽单体的两侧是含有剪切位点的接头区。

14.根据权利要求13所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的剪切位点可被蛋白水解酶剪切。

15.根据权利要求13所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的剪切位点包含被胰蛋白酶和羧肽酶B剪切的精氨酸残基。

16.根据权利要求1至3和7至14中任一项所述的方法或核酸分子，所述的核酸分子还包含一个或多个调控或表达调控序列。

17.一种表达载体，它包含权利要求2和7至16中任一项所述的核酸分子。

18.根据权利要求17所述的表达载体，它是质粒。

19.根据权利要求18所述的表达载体，它以质粒pTrpBB(SEQ ID NO：14)为基础或是它的衍生物。

20.一种宿主细胞，它包含权利要求2和7至16中任一项所述的核酸分子。

21.一种胰岛素C肽，它是用权利要求1或6所述的方法制备的。

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