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CN1264572C - 治疗hbv的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含HBV抗原的组合物，其可用于治疗或预防HBV感染。正如在此所描述的，该组合物的成分可以变化，但其中包含了应激蛋白或其部分(如片段)或衍生物，以及HBV抗原。

Description

治疗HBV的融合蛋白及其应用
本申请要求2001年2月5日提交的美国专利申请序列号60/266,733的权利。美国专利临时申请序列号60/266,733的内容在此以其全文引作参考。
发明领域
本发明的领域是乙肝病毒的免疫疗法。
发明背景
乙肝病毒(HBV)是一种感染人类的非细胞病变的DNA病毒，它可导致两种临床后果。在大多数成年人的临床感染病例(90-95％)中，病毒在几个星期或几个月后被清除，病人发展出一种终生的抗再次感染的免疫力。然而在其它病例中，病毒并没从组织中消除，病人仍处于慢性感染之中。慢性感染的后遗症相当严重，这些个体的肝组织非常可能发展成瘢痕化(肝硬化)并最终可能发展为肝细胞癌。
针对HBV已有预防性疫苗，许多发达国家已经进行了儿童接种计划以降低感染的总风险。不幸的是，因为由慢性HBV感染引起的发病和死亡时间跨度可达几十年，预防接种的影响要到将来才能实现。事实上，成年人HBV感染的年发生率在今后的八年中预计减少5％以下。到2008年，每年仅在美国就将新增150,000例感染，而在欧洲和日本预计有更多的病例。这些个体将构成一个巨大的病毒库，其中每年将出现多达20,000到40,000例慢性感染。可以清楚地看到，尽管已有疫苗可用，慢性HBV感染在今后许多年仍将继续是一个严重的健康难题。
现有的慢性HBV治疗方法包括α-干扰素(IFN-α)和拉米夫定(lamivudine)。评判这些疗法可根据它们减少病毒携带量以及引起血清转变或减少HBe抗原的能力，HBe抗原是HBV复制和高滴度病毒血症的标志。α-干扰素可以消除HBe，但是只在大约三分之一的病人中有效，这些病人所带病毒量较少。这种治疗方法价格昂贵，并有显著的令人讨厌的副作用。拉米夫定是一种小分子抗病毒剂，口服时具有良好的耐药性。这种化合物可以有效减少病人的病毒携带量，但是只有相对极少的病人能够减少HBe，而且治疗中断后病毒携带量经常会增加。另一方面，连续的治疗可能导致筛选出抗拉米夫定的突变株。使用α-干扰素和拉米夫定的组合疗法并没显示出增强的疗效。显然，一种成功的治疗HBV感染的免疫疗法非常值得期待。
发明概述
本发明的特征是组合物，这些组合物中包含应激蛋白或其部分，以及HBV抗原。这些组合物将在下面进行详细讨论。在此我们应注意的是，它们的成分可以有广泛的来源，它们的长度和成分可以变化。例如，该应激蛋白可以是由任何哺乳动物(如人或非人的灵长类动物)或任何其它能够表达应激蛋白的生物(如细菌或分枝杆菌)所天然表达的一种；该应激蛋白和/或HBV抗原可以是全长的、截短的或通过添加一个或多个氨基酸残基而延长的；此外，该应激蛋白或HBV抗原的组成可以变化(例如，应激蛋白或其部分，以及HBV抗原可以含有一个或多个氨基酸替代)。然而，任何变化必须仍然能够导致产生一种组合物，它在哺乳动物中可以诱导或增强针对HBV的免疫应答。在优选情况下，免疫应答足够强，从而使得HBV感染的病人在感染的症状中能够经历增强的过程(主动或被动的)。因此，抗原既包括全长和天然存在的抗原，也包括它的片段和其它变体，当给个体施用后(例如采用在此描述的方法)，可以引发针对该片段或变体中存在的一个或多个抗原决定簇的免疫应答。
同样地，除了全长的或天然存在的应激蛋白外，本发明的组合物也可以含有具有免疫刺激性的应激蛋白的片段(即可以促进针对抗原的免疫应答的片段)。应激蛋白或其片段可以促进免疫应答，此时免疫应答强于或总之优于HBV抗原单独给药时通常产生的免疫应答。
免疫应答可以是体液介导的也可以是细胞介导的反应。例如，抗原片段可以含有一个或多个HLA I型肽抗原，如在此所述。细胞介导的免疫应答包括免疫系统的抗原特异性细胞，如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可能还有辅助性T淋巴细胞(Th)，以及天生的免疫系统的细胞，如单核细胞、巨嗜细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞和γδT细胞。本领域一名普通专业技术人员能够充分检测或评估免疫应答，其通过例如细胞毒性T淋巴细胞的诱导(参见下面的实施例)、细胞增殖反应、细胞因子的诱导或这些事件的组合是显而易见的。
在特定的实施方案中，HBV抗原可以是HBV核心抗原或其片段或衍生物。HBV抗原的衍生物包括HBV的变体，比如那些含有一个或多个氨基酸替代的变体(例如保守的氨基酸替代)。例如，HBV抗原的变体可以含有1-2、2-5、5-10、10-25或更多个替代的氨基酸残基。或者，替代或其它的突变，比如缺失或截短，可以占全长HBV抗原序列的1-2％、2-5％、5-10％或10-25％。如同组合物中的抗原部分，应激蛋白的变体也可以含有一个或多个氨基酸替代(例如保守的氨基酸替代)。例如，应激蛋白的变体可以含有1-2、2-5、5-10、10-25或更多个保守的氨基酸替代。这里的替代或其它突变，比如缺失或截短，仍然可以占全长应激蛋白序列的1-2％、2-5％、5-10％或10-25％。
在本发明的范畴内，应激蛋白和HBV抗原也有多种组合方式。例如，本发明的组合物包括了那些组合，其中全长的HBV抗原与全长的应激蛋白相结合；由HBV抗原的片段或其它变体组成的抗原与全长的应激蛋白相结合；全长的HBV抗原与应激蛋白的片段或其它变体相结合；以及HBV抗原的片段或其它变体与应激蛋白的片段或其他变体相结合。当然，如在此所述，可以存在一个以上的每种这些成分(即多于一个的HBV抗原和多于一个的应激蛋白)，并且每一个成分可以以全长的蛋白或其具有免疫活性的片段或变体的形式存在。
此外，在此所述的任何排列方式中，HBV抗原和应激蛋白可以以任何形式相结合。例如，应激蛋白和HBV抗原可以以融合多肽的形式存在(其中在融合的可读框进行翻译的过程中应激蛋白和HBV抗原是共价连接的。或者，应激蛋白和HBV抗原也可以在分别翻译或合成后通过化学结合作用相连接。这些组分也可以是非共价结合的(例如以混合物或更有序的组成方式)。术语“多肽”和“蛋白”在此可以互换使用用于描述一条氨基酸残基组成的链，除非从上下文中可明显看出是为了表明截然不同的意义。
应激蛋白将在后面进一步讨论，在此我们应注意到应激蛋白可以是热休克蛋白(Hsp)。此外，热休克蛋白可以是分枝杆菌的热休克蛋白，如Hsp65(例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的Hsp65)，或来自任何物种的热休克蛋白家族的任何成员。
本发明的组合物可以以多种方式配制给个体施用，并可任选添加佐剂。在本发明组合物中可随意添加的成分包括在药物上可接受的稀释剂、赋形剂和载体。
本发明的特征还包括通过将本发明的组合物施用给被HBV感染的个体(例如哺乳动物，比如人)以治疗该个体的HBV感染的方法，以及在个体(例如哺乳动物，比如人)感染HBV以前将本发明的组合物施用给个体以防止HBV对该个体的感染(或减少其可能性)的方法。
该组合物的成分不必以多肽的形式直接施用给个体。相反，为应激蛋白、HBV抗原或含有一个或多个每种组分的融合蛋白编码的核酸也可以施用，蛋白、抗原或融合蛋白将在个体中体内表达。该核酸可以是病毒载体的一部分，例如病毒载体基因组的一部分，或包埋于例如脂质体中。或者，核酸还可以以裸核酸的形式递送，例如由可以在真核或哺乳动物细胞中可操作的调控序列所驱动的质粒DNA。给药核酸分子的方法在本领域内众所周知。
本发明进一步包括了本发明组合物(如含有HBV抗原的融合蛋白、编码它们的核酸分子以及包含它们的药物组合物)在生产用于按照在此描述的方法治疗HBV感染的药物中的应用。
本发明的其它特点和优点将从发明详述、附图和权利要求中变得一目了然。所有在此引用的专利申请、专利和出版物在此以其全文引作参考。
附图简述
图1是编码HBV(adw亚型)核心抗原(HBc)的DNA序列(SEQ IDNO：1)。
图2是HBV(adw亚型)核心抗原(HBc)的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。
图3是构建体hisHepCorT(149/87S97F)的DNA序列，它编码组氨酸标记的截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸；SEQ ID NO：3)。
图4是由图3所示的DNA序列所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)。
图5是构建体hisHepCor(97F)Hsp65的DNA序列，它编码组氨酸标记的融合蛋白，包括全长的HBV核心抗原和Hsp65蛋白(SEQ IDNO：5)。
图6是由图5所示的DNA序列所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)。
图7是构建体hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65的DNA序列，它编码组氨酸标记的融合蛋白，包括与Hsp65蛋白融合的截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸)(SEQ ID NO：7)。
图8是由图7所示的DNA序列所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)。
图9是构建体HepCorT(151/97F)Hsp65的DNA序列，它编码一个融合蛋白，包括与Hsp65蛋白融合的截短的HBV核心抗原(第1-151位氨基酸)(SEQ ID NO：9)。
图10是由图9所示的DNA序列所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：10)。
图11是构建体HepCor(97F)Hsp65的DNA序列，它编码一个融合蛋白，包括与Hsp65蛋白融合的全长的HBV核心抗原(SEQ IDNO：11)。
图12是由图11所示的DNA序列所编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：12)。
图13示出了在用不同的免疫原(HepCorT(151/97F)Hsp65；HepCor(97F)Hsp65；HepCorT(151/97F)；HepCor(97F)；以及hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引发活性(校正的溶胞百分数对效应物：靶比率)。对比用对照多肽MUT-1.52-59.Kb预脉冲的EL4细胞分析所得的CTL溶胞活性。对照小鼠用安慰剂(缓冲液)注射。
图14示出了在用不同的免疫原(同图13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引发活性(校正的溶胞百分数对效应物：靶比率)。对比用HBc抗原特异性多肽HBc.93-100.Kb预脉冲的EL4细胞分析所得的CTL溶胞活性。对照小鼠用安慰剂(缓冲液)注射。
图15示出了在用不同的免疫原(同图13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引发活性(校正的溶胞百分数对效应物：靶比率)。对比能够表达HBV核心抗原的EL4.HBc.1D7细胞分析所得的CTL溶胞活性。对照小鼠用安慰剂(缓冲液)注射。
图16示出了在用不同的免疫原(同图13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引发活性(γ-干扰素(pg/ml)对效应物：靶比率)。对比与HBc抗原特异性肽HBc.93-100.Kb共培养的EL4细胞分析生成的CTL分泌γ-干扰素(IFN-γ)的能力。对照小鼠用安慰剂(缓冲液)注射。
图17示出了在用不同的免疫原(同图13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引发活性(肿瘤坏死因子-α(OD410))。对比与HBc抗原特异性肽HBc.93-100.Kb共培养的EL4细胞分析生成的CTL分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的能力。对照小鼠用安慰剂(缓冲液)注射。
发明详述
本发明涉及含HBV抗原的组合物，可用于治疗或预防HBV感染。正如在此所描述的，所述组合物的成分可以变化，但其中包含了应激蛋白，或它的一部分(如片段)或衍生物，以及HBV抗原。适用于本发明方法的各种各样材料和步骤将在下面讨论。
因为编码应激蛋白和HBV蛋白的核酸序列已知并且可用，利用本领域常用方法可以很容易地制备为它们编码的核酸构建体(单独或融合构建体的形式)。例如为与抗原随意偶联的一种应激蛋白(热休克蛋白Hsp)编码的核酸可参见WO 89/12455、WO 94/29459、WO 98/23735、WO 99/07860，在此引用为参考。融合蛋白不仅可以通过重组技术来生产，也可以通过对应激蛋白(如热休克蛋白)和HBV抗原进行翻译后连接来产生。连接技术已有描述，如Hermanson(BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego，CA，1996)、Lussow等(Eur.J.Immun.21：2297-2302，1991)和Barrios等(Eur.J.Immun.22：1365-1372，1992)。这些连接方法包括使用偶联剂如戊二醛、碳二亚胺和双重氮联苯胺；使用异双功能交联剂如M-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯；或利用应激蛋白和抗原中的半胱氨酸残基(天然存在和/或重组插入的那些残基)来促进分子间二硫键的形成。
任何HBV抗原均适合于包括在本发明的融合蛋白或组合物中。优选的HBV抗原是HBV核心抗原或其片段或衍生物。为了便于检测，对HBV抗原可进行随意修饰使其包含已知的小鼠MHC限制性CTL抗原决定簇，例如小鼠H-2Kb限制性CTL抗原决定簇。一个这样修饰的例子在实施例中进行了描述(例如在HBV adw亚型中，第97位的残基是异亮氨酸，将其用苯丙氨酸取代后就产生了小鼠H-2Kb限制性CTL抗原决定簇)。此外，抗原还可以修饰成包含来自一个以上HBV亚型(例如adw、ayw、adr或ayr)的人HLA抗原决定簇。例如，将图2所示的HBV核心抗原第91位的苏氨酸进行单一氨基酸替代为缬氨酸，就可以复制在adw和adrHBV亚型中发现的已知HLA-A11-限制性CTL抗原决定簇。其它的HBV核心抗原的衍生物包括截短。这样的截短包括移除全部或部分富含精氨酸的C端结构域(HBc的第150-185位氨基酸)，但并不以此为限。适当截短的HBc片段包括仅由HBc的N端前149个氨基酸或前151个氨基酸组成的片段，但并不以此为限。不论在哪种情况下，适当的HBc抗原片段(或任何适当的HBV抗原)应该包括一个或多个B或T细胞抗原决定簇(或一个或多个B细胞抗原决定簇和一个或多个T细胞抗原决定簇)，优选是一个或多个CTL抗原决定簇。此外，HBV核心抗原末端的半胱氨酸可以被移除或用不同的氨基酸替代。对氨基酸序列还可以进行其它修饰。另一个例子是在一个已知的HLA限制性CTL抗原决定簇的锚定残基上进行替代，以增强肽与I型MHC分子的结合亲和性。尽管这些修饰的HBV核心抗原适合于包含在融合蛋白中，但他们也可以单独使用(用佐剂随意配制)以产生针对HBV的免疫应答。
其它适用于本发明的HBV抗原包括HBV核心抗原、HBVe抗原(HbeAg)、x蛋白(HBx)、聚合酶多肽以及HBV包膜蛋白S、M和L及其片段(Seeger和Mason，Microbiol.Mol.Biol.Rev.64：51-68，2000；Ganem和Schneider，Hepadnavirdae：The viruses and their replication.In：Knipe，DM和Howley，PM主编Fields Virology，Philadelphia：LippincottWilliams & Wilkins，2001：2923-2969)。
如上所述，HBV抗原、应激蛋白或两者可以含有一个或多个氨基酸替代(例如保守的氨基酸替代)。这些替代可以发生在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上，但这并不是必须的。“保守的氨基酸替代”是指一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸家族在本领域内已经定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。不论替代是被设计发生在预测的非必需位点上还是随机引入到HBV抗原或应激蛋白编码序列的全部或部分中的(例如通过饱和诱变)，所得到的突变体可分别筛选它们的抗原性和免疫刺激活性，以鉴定出保留了生物活性的突变体。诱变后，所编码的蛋白可以重组表达，蛋白的活性可得以测定。
HBV抗原既可以与应激蛋白的N-端又可以与其C-端融合，可以带也可以不带接头或介入的外源序列。在另一个实施方案中，两个HBV抗原(如此所述，可以是天然存在的或变体)可以同时连接在应激蛋白上(一个在应激蛋白的N-端，另一个在C-端；同时在N-端；或同时在C-端)。此外，一个或多个HBV抗原(天然存在的或其片段或其它变体，来自同一或不同的HBV抗原)可以被连接在应激蛋白的N-端或C-端或两端。如果包括了一个以上的应激蛋白，还可以作出其它的排列，这对于熟悉本领域普通技术人员来说是显而易见的。
应激蛋白和HBV抗原(或其组合，例如一个应激蛋白和两个或多个HBV抗原)可以在它们每一个单独翻译或合成后通过化学结合的方法连接起来。如前所述，这些成分也可以是非共价结合的(如以混合物或更有序的组成方式)。含有与HPV抗原非共价结合的应激蛋白或其免疫刺激性片段的组合物的生产可以参照美国专利6,048,530、6,017,544、6,017,540、6,007,821、5,985,270、5,948,646、5,935,576、5,837,251、5,830,464或5,750,119。也参见美国专利5,997,873、5,961,979、6,030,618、6,139,841、6,156,302、6,168,793和国际公开号WO 97/06821。
此外，在该组合物中可以包含一种以上类型的病毒抗原。例如，除了HBV抗原外，本发明的组合物还可以包括(或编码；任何在此描述的蛋白都可以直接给药或以核酸的方式给药)来自其它病原体的抗原。因此，除了HBV抗原，组合物可以包括(或编码)丙肝病毒抗原、单一疱疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、细胞肥大病毒(CMV)抗原、EB病毒(EBV)抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原、疱疹病毒抗原或其组合。在组合物只含有HBV作为病毒抗原的实施方案中已经描述的变化方式(例如与应激蛋白结合的方法，包含全长、片段或变体蛋白，组分数量及其排列方式的可变性)，同样适用于组合物中存在(或编码)至少一个HBV抗原和至少一个其它病毒抗原的实施方案。
令人吃惊的是，已经发现除去核心抗原C-端富含精氨酸的结构域后产生的多肽能够引发针对核心抗原的免疫应答，特别是细胞和/或CTL免疫应答。核心抗原富含精氨酸的结构域位于核心抗原的第150-183位氨基酸之间(Nassal，J.Virol.66：4107-4116，1992)。适合的核心抗原片段包括缺失了全部或部分这一区域的片段，但并不以此为限。例如，适合的核心抗原片段可以含有前149个或151个氨基酸(或少于149个或151个氨基酸)。
本发明的组合物可以随意添加佐剂。有效的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、SAF、胞壁酰二肽(MDP)、脂多糖(LPS)、脂质A、单磷酸脂A(MPL)、百日咳毒素(PT)、硬脂基酪氨酸、γ-菊粉、RIBI(含有从细菌中提取的三种成分)、Quil-A、皂角甙(QS21)、明矾(氢氧化铝、磷酸铝)、磷酸钙、MF-59、免疫刺激性复合物(ISCOMS)、CpG寡聚核苷酸和细胞因子(Gupta和Siber，Vaccine13：1263-1276，1995；Singh和O’Hagan，Nature Biotechnology 17：1075-1081，1999)，但并不以此为限。
适合的HBV抗原片段或衍生物理想地应包括至少一个B或T细胞抗原决定簇(或两者皆有)。在优选的实施方案中，该片段或衍生物应包含至少一个CTL抗原决定簇。
已经从多种生物体内分离、克隆和表征了多种应激蛋白(Mizzen，Biotherapy 10：173-189，1998)。任何具有免疫刺激性Hsp或其具有免疫刺激性片段都适用于融合多肽和组合物中。例如Hsp70、Hsp60、Hsp20-30(低分子量热休克蛋白)和Hsp10(GroES同源物)都属于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)感染时被宿主免疫应答识别的主要决定簇。此外，卡介苗(BacilleCalmette Guerin)(BCG)，一株牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，它的Hsp65发现是一种有效的免疫刺激剂，如下面的实施例所描述。
用于本发明的应激蛋白和基因家族在本领域已广为人知，包括例如Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBPs、亲环蛋白、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、泛素、钙联接蛋白和蛋白二硫键异构酶。参见例如Macario，Cold Spring HarborLaboratory Res.25：59-70，1995；Parsell等，Rev.Genet.27：437-496，1993；和美国专利5,232,833。
Hsp100-200蛋白的例子包括Grp170(葡萄糖调控蛋白)。Grp170驻留于内质网腔中和前高尔基体隔室内，可能在免疫球蛋白折叠和装配中发挥作用。
Hsp100蛋白的例子包括哺乳动物Hsp110、酵母Hsp104、以及大肠杆菌ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。
Hsp90蛋白的例子包括大肠杆菌HtpG、酵母Hsp83和Hsc83、以及人Hsp90α、Hsp90β和Grp94(小gp96)。Hsp90与通常是细胞调控分子的蛋白组结合，例如甾体激素受体(如糖皮质激素、雌激素、黄体酮和睾酮受体)、转录因子以及在信号转导机制中发挥作用的蛋白激酶。Hsp90蛋白也参与形成包含其它应激蛋白的大的、高丰度的蛋白复合物。
Lon是一种四聚体的ATP依赖性蛋白酶，在大肠杆菌中降解非本源蛋白。
Hsp70蛋白的例子包括哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、细菌或分枝杆菌如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的DnaK(如卡介苗，在此是指Hsp71)、大肠杆菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及BiP和Grp78。Hsp70能够特异性结合ATP和未折叠的多肽和肽，参与蛋白的折叠和去折叠以及蛋白复合物的装配和解装配。
Hsp60蛋白的例子包括分枝杆菌的Hsp65。细菌的Hsp60通常也称为GroEL。Hsp60形成大的同源寡聚复合物，似乎在蛋白折叠中发挥作用。在真核生物的线粒体和叶绿体中也存在Hsp60的同源物。
TF55蛋白的例子包括Tcp1、TriC和热体(thermosome)。这些蛋白通常存在于真核生物和一些古细菌的细胞质中，形成多元环，促进蛋白折叠。它们与Hsp60有弱的同源性。
Hsp40蛋白的例子包括原核生物如大肠杆菌(E.coli)和分枝杆菌的DnaJ、以及HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40作为分子伴侣在蛋白折叠、耐热性、DNA复制和其它细胞活动中发挥作用。
FKBP的例子包括FKBP12、FKBP13、FKBP25和FKBP59、Fpr1和Nep1。这些蛋白通常具有肽酰脯氨酰异构酶活性，可以与免疫抑制剂如FK506和雷帕霉素(rapamycin)相互作用。这些蛋白通常发现在细胞质和内质网中。
亲环蛋白的例子包括亲环蛋白A、B和C。这些蛋白具有肽酰脯氨酰异构酶活性，可以与免疫抑制剂如环孢菌素A相互作用。
Hsp20-30也称为小热休克蛋白。Hsp20-30通常发现在大的同源寡聚复合物或可能在异源寡聚复合物中。一种类型的生物或细胞可以表达几种不同类型的小热休克蛋白。Hsp20-30与细胞骨架结构相互作用，可能在肌动蛋白的聚合和解聚中发挥调控作用。在静息细胞受到刺激或接触到生长因子后，Hsp20-30被快速磷酸化。Hsp20-30的同源物包括α-晶体蛋白。
ClpP是一种大肠杆菌蛋白酶，参与异常蛋白的降解。在叶绿体中发现了ClpP的同源物。ClpP与ClpA形成异源寡聚复合物。
GrpE是一种大肠杆菌的蛋白，大约20kDa，它参与应激损伤的蛋白的拯救以及受损蛋白的降解。GrpE在大肠杆菌的应激基因表达的调控中发挥作用。
Hsp10的例子包括GroES和Cpn10。Hsp10发现于大肠杆菌中以及真核细胞的线粒体和叶绿体中。Hsp10形成一个七元环，与Hsp60寡聚体相结合。Hsp10也参与蛋白折叠。
泛素发现能够与蛋白结合，协助通过ATP依赖性细胞溶胶蛋白酶的蛋白水解作用除去蛋白。
除了全长的应激蛋白，任何具有免疫刺激性片段或衍生物都可用于本发明。免疫刺激性片段或衍生物(例如Hsp的免疫刺激性片段)是能够促进针对抗原的免疫应答的片段或衍生物。该片段或衍生物可以以多种方式促进免疫应答。例如，该片段可以诱导一个本来不会发生的免疫应答或增强一个本来会发生的免疫应答。已经描述了多种免疫刺激性片段。适合的片段包括含有下列部分的片段，但并不以此为限：(a)分枝杆菌Hsp70(特别是结核分枝杆菌Hsp70)的第161-370位氨基酸(Huang等，J.Exp.Med.191：403-408，2000；美国专利申请09/761,534，2001年1月16日提交)；(b)分枝杆菌Hsp70(特别是结核分枝杆菌Hsp70)的ATP酶结构域或肽结合结构域(Young，美国专利申请序列号09/025178，1997年11月25日提交)；(c)鼠Hsc70(Hsp70家族的组成成员)的第280-385位氨基酸(Udono等，Int.Immunol.13：1233-1242，2001)；(d)结核分枝杆菌Hsp70的第359-610位氨基酸(Wand等，Immunity 15：971-983，2001)；(e)来自其它物种的Hsp同源物的(a)到(d)中的相应区段；以及(f)分枝杆菌Hsp65(特别是牛分枝杆菌的Hsp65)的第1-200位氨基酸(Chu等，美国专利申请序列号09/613,303，2000年7月10日提交)。
可用于本发明的应激蛋白可以从任何适当的生物体获得，包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、肠细菌(如大肠杆菌)、分枝杆菌(特别是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和牛分枝杆菌)、酵母、果蝇、脊椎动物(例如鸟类如鸡，或哺乳动物如大鼠、小鼠，或灵长类动物包括人)，但并不以此为限。
为了制备包含融合多肽的治疗(如免疫治疗)组合物，可以在细菌、酵母、植物或植物细胞、或动物或动物细胞中重组生产该多肽。例如，本发明的融合多肽可以通过将带有为融合多肽编码的DNA片段的适当的表达载体转化(转染、转导或侵染)宿主细胞而生产。适当的表达载体包括质粒、病毒粒子和噬菌体。对于昆虫细胞，杆状病毒表达载体是适用的。完整的表达载体或其一部分可以整合到宿主细胞的基因组中。在某些情况下，希望使用可诱导的表达载体，例如LACSWITCH诱导型表达系统(Stratagene；La Jolla，CA)。
分子生物学领域的专业人士都会明白众多表达系统中的任何一种都可用于提供重组融合多肽。明确所用的宿主和载体对本发明来说不是关键。
蛋白和多肽也可以用植物细胞来生产。对于植物细胞，病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒)和质粒表达载体(如Ti质粒)是适用的。这些细胞和载体有广泛的来源(例如美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA；也可参见例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1994)。转化或转染以及选择表达载体的方法依赖于选用的宿主系统。转化和转染的方法描述在例如Ausubel等，同上中。表达载体可以从例如在Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，Supp.1987中所提供的载体中选择。带有表达载体的宿主细胞可以在常规营养培养基中培养，视激活或抑制所选基因、筛选转化子或扩增所选基因的不同需要而调节。
如果合适或有利，编码融合多肽的核酸可以包含一个信号序列以便分泌融合多肽，例如有利于从细胞培养物中分离多肽。为了有效翻译插入的核酸序列，也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。在一些情况下，必须提供外源的翻译控制信号，其中可能包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须与所需的编码序列的阅读框架协调一致，以确保翻译完整的插入序列。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以有广泛的来源，包括天然和合成的。表达的效率可以通过加入适当的转录或翻译增强子元件(例如在Bittner等，Methods in Enzymol.153：516，1987中公开的元件)来增强。此外，基因序列可以根据适当的表达系统中所用的最适密码子进行修饰，或者，也可以对表达宿主进行修饰，使其表达特定的tRNA分子以促进所需基因的表达。
如果融合多肽在正常生理条件下是可溶的，这将会非常有用。本发明中还包括了使用融合蛋白(或其它构型的蛋白，包括共价和非共价的复合物和混合物)的方法，其中应激蛋白(或其免疫刺激性片段)和HBV抗原与无关的第三个蛋白或多肽融合(或结合)，从而产生了至少一个三重的蛋白或蛋白混合物。第三个蛋白可以促进融合物或其它复合物的纯化、检测或溶解，或者可以提供其它一些功能。例如，pUR278表达载体(Ruther等，EMBO J.2：1791，1983)可用于创建lacZ融合蛋白。pGEX载体可用于将外源多肽表达为含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说，这样的融合蛋白是可溶的，并可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，然后在存在游离的谷胱甘肽的条件下洗脱，从而容易地从裂解细胞中得到纯化。pGEX载体被设计成包括了凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便所克隆的靶基因产物可以从GST基团上释放出来。
融合蛋白或共价复合物可以使用能特异性结合融合物或复合物的一部分的抗体进行纯化。或者，所含蛋白的其它性质(例如金属结合)也可用于纯化。例如，Janknecht等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：8972，1981)描述了一个系统可以容易地纯化在人细胞系中表达的非变性的融合蛋白。在这个系统中，将目的基因亚克隆在一个牛痘重组质粒中，以便该基因的可读框翻译后融合由六个组氨酸残基组成的氨基末端标记。将感染有重组的牛痘病毒的细胞的提取物上样到Ni2+氮川乙酸-琼脂糖柱上，组氨酸标记的蛋白可以用含咪唑的缓冲液选择性地洗脱下来。同样的步骤可用于细菌培养物。
或者，第三个蛋白可以是一个免疫球蛋白Fc结构域。这样的融合蛋白可以使用亲和柱容易地纯化。
融合多肽，特别是那些含有短的抗原片段的多肽，也可以用化学合成的方法生产(例如通过在《固相肽类合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)第2版，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中描述的方法)。
一旦分离后，如果需要，融合多肽可以被进一步纯化和/或浓缩，只要进一步的处理不会损害其引发(例如诱导或增强)足够实施本发明方法的免疫应答的能力。在本领域有许多为人熟知的纯化和浓缩的方法(参见例如Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology，Work和Burdon主编，Elsevier，1980)，包括超速离心和/或沉淀(例如用硫酸铵)、微滤(例如通过0.45μm的乙酸纤维素滤膜)、超滤(例如使用大小分级的膜和再循环过滤器)、凝胶过滤(例如填充有Sepharose CL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B或2B、Sephacryl S-400或S-300、Superose 6或Ultrogel A2、A4或A6的柱子，所有都可以从Pharmacia Corp.购得)、快速蛋白液相色谱(FPLC)和高效液相色谱(HPLC)。
本发明组合物中的多肽可以含有多于一个应激蛋白和/或多于一个HBV蛋白的抗原性或免疫刺激性决定簇，或完整蛋白。肽中还可以随意包括其它免疫应答所需的序列。
本发明还包括免疫治疗组合物，它们含有至少一种在此所述的融合多肽，以及可随意添加的可药用载体，例如稀释剂，如盐、磷酸缓冲的盐、或碳酸氢盐溶液(如0.24M NaHCO3)。在组合物中使用的载体的选择是基于给药的方式和途径，以及标准的药物实践。适合的药物载体和稀释剂，以及使用它们的药物必要成分，在Remington的药物学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中有描述。佐剂，例如霍乱毒素、大肠杆菌的热不稳定肠毒素(LT)、脂质体或免疫刺激性复合物(ISCOM)，也可包含于免疫治疗组合物中。
该组合物可以配制成溶液(适合于肌内、皮内或静脉内给药)、悬浮液、栓剂、片剂、颗粒、粉末、胶囊、软膏或乳膏剂。在制备这些组合物时，可以添加一种或多种药物载体。可药用载体或其它添加剂的例子包括溶剂(如水或生理盐水)、溶解剂(如乙醇、聚山梨酸酯、或Cremophor EL)、赋予等渗性的试剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂(例如乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、磷酸氢钙、轻硅酸酐或碳酸钙)、粘合剂(如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素或阿拉伯树胶)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石、硬化油脂)或稳定剂(如乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、大粒凝胶或聚氧乙烯硬化的海狸油)。如果需要，还可以添加甘油、二甲基乙酰胺、乳酸钠、表面活性剂、氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、甲基葡萄糖胺或三氨基甲烷。如果希望组合物能够缓慢释放，可以使用可生物降解的聚合物如聚D，L-丙交酯-共聚-乙交酯或聚乙交酯作为主体基质(参见例如美国专利5,417,986、4,675,381和4,450,150)。如前所述，药物制剂如溶液、片剂、颗粒或胶囊可以与这些成分一起形成。如果这些组合物需要口服，香料和色素也可以添加。
该免疫治疗组合物可以以任何适合的途径给药，例如静脉内、动脉内或局部注射(如腹膜内、胸膜内、皮下或肌内注射)、口服、皮内、舌下、表皮内、鼻内(如吸入)、肺内、或直肠给药。
免疫治疗组合物的施用量依赖于例如特定的应激蛋白/抗原组合物、是否有佐剂与组合物共同给药、共给药佐剂类型、给药的方式和频率、以及所希望的效果(如预防或治疗)，可以由本领域技术人员确定。免疫治疗组合物的给药量对成年人每次剂量来说，一般范围在1μg到100mg之间。优选情况是施用50-10,000μg融合蛋白(如大约100-5000μg，特别是大约500、1000、1500或2000μg)。如果佐剂与免疫治疗成分一起施用，成年人每次剂量通常在1ng到100mg之间。当需要重复给药时，可以由本领域技术人员确定。例如，在使用引发剂量后可以使用一次或多次加强注射，时间间隔以周或月计。在第一次免疫后3到12周可以使用一次加强注射，而在第一次加强注射后3到12周可以使用第二次加强注射，使用同样的制剂或不同的制剂。可从个体中采集血清、PBL或PBMC，以检测该免疫治疗剂引发的针对含在融合蛋白中的HBV抗原的免疫应答。分析针对特异性抗原的抗体或细胞毒性T细胞或分泌细胞因子的细胞的方法，在本领域已是众所周知。如果需要，可以再次使用加强注射。通过改变组合物中的融合多肽的量，可以将免疫方案最适化以引发最强的免疫应答。
当然，多肽(单独或作为融合蛋白的一部分)也可以通过给药核酸，如病毒载体(如逆转录病毒或腺病毒载体)的方式递送。
本发明的免疫治疗剂也可以与一种或多种有抗HBV活性的化合物或组合物(HBV抗病毒剂)结合使用。例如，病人可以首先使用一种HBV抗病毒剂进行治疗以降低HBV感染的严重性(其度量可以根据例如循环系统中的HBe抗原(HBV复制和高滴度病毒血症的标志)的减少或失去、抗HBe抗体的出现、血清HBVDNA的减少或消失或丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的降低)。一旦症状适当减轻，就可以对病人施用本发明的免疫治疗剂。或者，HBV抗病毒剂和免疫治疗剂也可以基本上同时给药(需要记住抗病毒剂和免疫治疗剂可能有不同的给药途径)，或先给药免疫治疗剂，再用抗病毒剂治疗。适合与免疫治疗剂结合使用的抗病毒化合物或组合物包括干扰素-α2b(内含子A，ScheringPlough)、聚乙二醇化的(pegylated)干扰素-α2b以及核苷类似物如拉米夫定[(-)-β-L-3’-硫-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷或3TC](Epivir-HBV，GlaxoWelcome)和病毒唑(RebetronTM，ICN Pharmaceuticals)，但并不以此为限。还有一些其它处于试验阶段的化合物也可能适用，包括：hemtricitabine(2′，3′-双脱氧-5′-氟-3′-硫基胞嘧啶核苷，FTC，coviracil，Triangle Pharmaceuticals)、克莱夫定(clevudine)(2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯糖呋喃糖基尿嘧啶，L-FMAU，Triangle)、阿德福韦(adefovir)(9-(2-膦酰甲基)-腺嘌呤、PMEA、Gilead Sciences)、恩地卡韦(entecavir)(Bristol-Myers Squibb)、(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊烷(DAPD)、β-L-2′，3′-双脱氧-5-氟胞嘧啶(β-L-FddC)、β-L-2′，3′-双脱氢-双脱氧-5-氟胞嘧啶(β-L-Fd4C)和泛昔洛韦(famciclovir)。
可以相信，一个本领域技术人员基于上面公公开的内容和下述的实施例，无需更多的精心研究，就可以充分地使用本发明。下面的实施例仅仅为了说明一个本领域技术人员如何能够分离和使用融合多肽，并不以任何方式限制公开内容的其它部分。所有在此公开内容中引用的出版物在此引作参考。
实施例
实施例1、HBV核心抗原-Hsp融合蛋白的构建
常用的构建融合蛋白的方法和步骤可以参见W/O 94/29459、WO98/23735、WO 99/07860及其引用的参考文献。
为HBV adw亚型编码的基因获自质粒pBR/HBV(购自ATCC，ATCC 45020)。为全长蛋白编码的序列示于图1，全长蛋白的氨基酸序列示于图2。
为全长牛分枝杆菌BCG的Hsp65蛋白编码的基因获自质粒pET65(参见WO 99/07860)。
使用这些起始材料和适当的引物，制备了下述的构建体并克隆到pET28a(Novagen)中用于蛋白生产：
1.1、hisHepCorT(149/87S97F)：其DNA编码截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸)。该构建体也包括含组氨酸标记的N-端20个氨基酸序列。与野生型蛋白相比，该构建体有两个氨基酸改变：第87位的天冬酰胺变为丝氨酸，以及第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸。改变这两个氨基酸是为了重现已知的小鼠CTL抗原决定簇。在截短的蛋白的C-端还添加了一个外源的天冬酰胺残基。该DNA序列示于图3，它编码的氨基酸序列示于图4。
1.2、hisHepCor(97F)Hsp65：其DNA编码一个融合蛋白，包含的全长HBV核心蛋白氨基酸与牛分枝杆菌BCG的Hsp65的N-端融合。该构建体也包括一个含组氨酸标记的N-端20个氨基酸序列以及第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸。在HBV核心蛋白和Hsp65蛋白之间插入了两个附加的残基：一个天冬酰胺和一个缬氨酸。该DNA序列示于图5，它编码的氨基酸序列示于图6。
1.3、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65：其DNA编码一个融合蛋白，包含的HBV核心蛋白第1-149位的氨基酸与牛分枝杆菌BCG的Hsp65的N-端融合。该构建体也包括一个含组氨酸标记的N-端20个氨基酸序列，以及在HBV核心蛋白和Hsp65蛋白之间插入了一个附加的天冬酰胺残基。该DNA序列示于图7，它编码的氨基酸序列示于图8。
1.4、HepCorT(151/97F)Hsp65：其DNA编码一个融合蛋白，包含的HBV核心蛋白第1-151位的氨基酸与牛分枝杆菌BCG的Hsp65的N-端融合(在两个序列之间没有插入额外的氨基酸)。根据野生型序列对HBV核心序列进行了如下修饰：第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸。该DNA序列示于图9，它编码的氨基酸序列示于图10。
1.5、HepCor(97F)Hsp65：其DNA编码一个融合蛋白，包含的全长HBV核心蛋白与牛分枝杆菌BCG的Hsp65的N-端融合(在两个序列之间没有插入额外的氨基酸)。同1.4的构建体一样，HBV核心蛋白第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸。该DNA序列示于图11，它编码的氨基酸序列示于图12。
1.6、HepCorT(151/97F)：其DNA编码一个截短的HBV核心抗原(第1-151位氨基酸)。该构建体除了在第151位氨基酸截短了之外，与图2所示的野生型adw蛋白相比有一个氨基酸变化：第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸以重现已知的小鼠CTL抗原决定簇。
1.7、HepCor(97F)：其DNA编码全长的HBV核心抗原。该构建体与图2所示的野生型adw蛋白相比有一个氨基酸变化：第97位的异亮氨酸变为苯丙氨酸以重现已知的小鼠CTL抗原决定簇。
使用其它的应激蛋白，如结核分枝杆菌的Hsp70，也可以构建其它构建体。
在一些情况下可以对HBc分子进行修饰，在HBc基因产物中引入一个或多个氨基酸替代以重现已知的小鼠特异的CTL抗原决定簇。一个替代是第87位的氨基酸，天冬酰胺被丝氨酸替代。这个替代产生了被H-2Kd(HBc.Kd)限制的小鼠CTL抗原决定簇(87SYVNTNMGL95)(Kuhrober等，Int.Immunol.9：1203-1212，1997)。第二个替代是第97位的氨基酸，异亮氨酸被苯丙氨酸替代。这个替代产生了被H-2Kb(HBc.Kb)限制的鼠CTL抗原决定簇(93MGLKFRQL100)(Kuhober等，J.Immunol.156：3687-3695，1996)。一个编码了20个氨基酸，其中含有6个组氨酸残基(组氨酸标记)的DNA片段被加到一些构建体的N-端以便于纯化。没有这些修饰的融合蛋白很容易制备。
实施例2、蛋白纯化
采用下列缩写：BCG指牛分枝杆菌变体卡介苗；CV指柱体积；ET指内毒素；EU指内毒素单位；IB指一种或多种包含体；MT指结核分枝杆菌；以及PBS指磷酸盐缓冲液。
所有的构建体在15升发酵罐(Braun ED)中培养。在用于蛋白纯化前，细菌细胞糊储存于-70℃。
2.1、hisHepCorT(149/87S97F)的纯化
细胞裂解：大约277克冷冻的细胞糊与800mL裂解缓冲液(30mMTRIS、10mM 2-巯基乙醇、2mM EDTA、0.2mM PMSF、pH8.5)混合。然后加入溶菌酶至200μg/mL，再加入50μL BenzonaseTM。细胞在-70℃冷冻过夜，然后融化1小时，等分样品于50mL离心管中，置于冰上，使用配有0.5英寸尖头的BRANSON Sonifier II型超声破碎器按照设置9进行超声破壁，45秒破碎6次。
在4℃以17000RPM离心(Beckman，Avanti J-30，JA30.50转头)20分钟从而将细胞碎片和IB与上清液分开。每管中的沉淀重悬浮于25mL洗涤缓冲液(30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH8.5)中。4℃以22000RPM离心20分钟后，弃去上清液，加入20mL含8M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、0.2mMPMSF、pH8.5的溶液，4℃保温过夜。20000RPM离心30分钟收获含有溶解的IB的上清液，然后分成两份冷冻于-70℃。
镍螯合层析：将250mL螯合的Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)装入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。树脂用3倍CV的下述每种溶液洗涤：50mM EDTA、Milli-QTM级水、0.5M NaOH、2MNaCI、Milli-QTM级水、70％(v/v)乙醇和Milli-QTM级水。然后，树脂用200mM NiSO4载荷，用Milli-QTM级水洗涤，并用5倍CV的起始缓冲液(6M盐酸胍、30mM TRIS、2mM 2-巯基乙醇、20mM咪唑、pH8.5)平衡。
将一部分样品以5mL/min速度上柱，然后用起始缓冲液以10mL/min速度洗涤直到在280nm处监测的吸收达到基线。为了除去ET，柱子用5倍CV的含6M盐酸胍、30mM TRIS、2mM 2-巯基乙醇、20mM咪唑、2％(v/v)Triton X-100、pH8.5的溶液洗涤。随后柱子用含6M尿素、30mM TRIS、2mM 2-巯基乙醇、20mM咪唑、pH8.5的溶液洗涤，然后用5倍CV梯度为0-500mM咪唑的6M尿素、30mMTRIS、2mM 2-巯基乙醇、20mM咪唑、pH8.5溶液洗脱蛋白，流速5mL/min。
将第二部分样品重复这个层析步骤，并把含有相对纯的蛋白的级分合并。
Source 15Q阴离子交换层析：将60mL Source 15Q树脂(Amersham-Pharmacia)装入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)。树脂用下述溶液以5mL/min的流速洗涤：2倍CV Milli-QTM级水、3倍CV 1MNaOH、3倍CV Milli-QTM级水、2倍CV NaCl、2倍CV Milli-QTM级水、2倍CV 10％(v/v)乙酸和40％(v/v)异丙醇的混合液，、2倍CVMilli-QTM级水，然后用3倍CV的起始缓冲液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH8.5)平衡。
上一步中合并的样品以0.5mL/min流速上柱，然后用起始缓冲液以6mL/min速度洗涤直到在280nm处监测的吸收达到基线。然后柱子用10倍CV含2％(v/v)Triton X-100的起始缓冲液洗涤。用11倍CV梯度为0-600mM NaCl的起始缓冲液洗脱蛋白。
重复这一层析步骤，并将含有相对纯的蛋白的级分合并。
Source 15S阳离子交换层析：将50mL Source 15S树脂(Amersham-Pharmacia)装入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)。树脂用下述溶液以5mL/min的流速洗涤：2倍CV 1M NaOH、3倍CVMilli-QTM级水、2倍CV NaCl、2倍CV Milli-QTM级水、2倍CV 10％(v/v)乙酸和40％(v/v)异丙醇的混合液、2倍CV Milli-QTM级水，然后用3倍CV的起始缓冲液(6M尿素、23mM乙酸钠、10mM 2-巯基乙醇、1mMEDTA、pH4.8)平衡。
上一步中合并的样品以3mL/min流速上柱，然后用起始缓冲液以3mL/min速度洗涤直到在280nm处监测的吸收达到基线。然后用15倍CV梯度为0-1000mM NaCl的起始缓冲液以6mL/min流速将蛋白部分洗脱，剩余部分用含6M盐酸胍、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH8.5的溶液洗脱。
透析和样品配制：然后，合并的样品用下述溶液依次透析：
1、4L的6M尿素、30mM TRIS-HCl pH8.5、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、0.8M精氨酸，4℃过夜。
2、4L的3M尿素、30mM TRIS-HCl pH8.5、2mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、25％(w/v)蔗糖，4℃过夜。
3、2L的30mM TRIS-HCl pH8.5、4.5mM还原型谷胱甘肽、0.SmM氧化型谷胱甘肽、0.8M精氨酸、25％(w/v)蔗糖，4℃过夜。
4、2L的10mM PBS pH7.4、4.5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃过夜。
5、重复步骤4。
假设每一个透析步骤完成时平衡已经达到，各种成分的终浓度是：PBS 10mM、还原型谷胱甘肽4.5mM、氧化型谷胱甘肽0.5mM、精氨酸≤1.48mM、尿素≤0.25mM、蔗糖730mM或25％(w/v)。
2.2、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65的纯化
细胞裂解：将79克冷冻的细胞糊与1000mL裂解缓冲液(30mMTRIS、10mM 2-巯基乙醇、pH7.5)混合。裂解液在-70℃冷冻过夜。然后融化1小时，加入溶菌酶至200μg/mL，细胞温育1小时。加入几种蛋白酶抑制剂的混合液(抑肽酶、亮抑酶肽和抑胃酶肽各40mg/mL)和15μL BenzonaseTM。裂解液置于一个250mL的Rosette细胞冷却池(Fisher)中，使用配有0.5英寸尖头的BRANSON Sonifier II型超声破碎器按照设置7进行超声破壁，60秒破碎6次。
在4℃以23000RPM离心20分钟(Beckman，Avanti J-30，JA30.50转头)从而将细胞碎片和IB与上清液分开。在上清液中加入盐酸胍至浓度为6M，总体积1,400mL。样品分成一份400mL和两份500mL。
镍螯合层析：将187mL螯合的Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)装入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。树脂预先已按照制造商推荐的方法再生，用5倍CV的起始缓冲液(6M盐酸胍、50mM咪唑、30mM TRIS、1mM 2-巯基乙醇、pH7.5)平衡。
将400mL样品以10mL/min速度上柱，然后用起始缓冲液以洗涤直到在280nm处监测的吸收达到基线。为了除去ET，柱子用5倍CV的含6M盐酸胍、30mM TRIS、1mM 2-巯基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH7.5的溶液洗涤。随后柱子用含8M尿素、30mM TRIS、pH8.5的溶液洗涤。接着用梯度为0-500mM咪唑的8M尿素、30mM TRIS、1mM 2-巯基乙醇、pH7.5的溶液洗脱蛋白。
将从上一步得到的两个500mL样品组分重复这个层析步骤。从这三次操作中的获得的级分合并。
Source 30Q阴离子交换层析：将167mL Source 15Q树脂(Amersham-Pharmacia)装入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。树脂用5倍CV下述溶液洗涤以获得再生：2M NaCl、1M NaOH、Milli-QTM级水、40％(v/v)异丙醇、10％(v/v)乙酸和Milli-QTM级水。然后柱子用3倍CV的起始缓冲液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、pH7.5)平衡。
上一步中合并的级分以10mL/min流速上柱，然后用起始缓冲液洗涤直到在214nm、254nm和280nm处监测的吸收达到基线。以6mL/min流速用梯度为0-500mM NaCl的起始缓冲液洗脱蛋白。将含有所需蛋白的级分合并。
陶瓷羟基磷灰石层析：将53mL陶瓷羟基磷灰石树脂装入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)，树脂用3倍CV含1M NaOH和0.5M磷酸钠、pH6.8的溶液再生。柱子然后用含6M尿素、20mM磷酸钠、pH6.8的溶液平衡。
前一柱中合并的级分以5mL/min流速上柱，然后用含6M尿素、20mM磷酸钠、pH6.8的溶液洗涤直到在214nm、254nm和280nm处监测的吸收达到稳定的基线。不纯物结合于柱子上，而hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65则在穿透液中。
透析和样品配制：将上一层析中的穿透液合并(250mL)，用下述溶液依次透析：
1、4L的3M盐酸胍、10mM磷酸钠、0.8M精氨酸、4.5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃过夜。
2、4L的10mM磷酸钠、4.5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃过夜。
3、重复上一步骤。
假设每一个透析步骤完成时平衡已经达到，各种成分的终浓度是：磷酸钠10mM、尿素1.85mM、还原型谷胱甘肽4.5mM、氧化型谷胱甘肽0.5mM、蔗糖730mM或25％(w/v)。
凝胶过滤层析：HiLoad 26/60 Superdex 200(Amersham-Pharmacia)凝胶过滤柱，由制造商预装，用1M NaOH再生，然后用含10mM磷酸钠、4.5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖、pH7.4的溶液平衡。
透析后的样品分成三份(30mL、20mL和20mL)，使用平衡缓冲液分别上柱进行层析，流速1.5或2mL/min，并将含有蛋白的级分合并。
2.3、HepCorT(151/97F)Hsp65的纯化
细胞裂解：将500克冷冻的细胞糊与2500mL裂解缓冲液(30mMTRIS、10mM 2-巯基乙醇、2mM EDTA、0.1mM PMSF、10mg/mL抑肽酶、10mg/mL亮抑酶肽、5mM对氨基苯甲脒、0.2mg/mL溶菌酶、pH7.5)混合，然后在-70℃冷冻至少2小时。
冷冻的细胞悬浮液在37℃融化，置于冰上，进行超声(BransonSonifier 450，3/4英寸尖头)破壁4次，共1分钟。裂解液以15,000g离心，可溶组分在64,000g离心使其澄清，保留可溶性样品。在可溶组分中加入6M尿素后，将其分为三等份。
Source 30Q层析：将190mL Source 15Q树脂(Amersham-Pharmacia)装入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)，柱子再生后用3倍CV的起始缓冲液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH7.5)平衡。
将一份样品上柱。树脂用起始缓冲液洗涤直到在280nm、254nm和214nm处监测的吸收达到基线，然后用5倍CV线性梯度为0-500mM
NaCl的起始缓冲液洗脱蛋白。将含有HepCorT(151/97F)Hsp65的级分合并。
将其它两份样品重复上述层析步骤。所有三部分样品的合并液合在一起，用含6M尿素、25mM乙酸钠、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH5.5的溶液透析。然后将样品分为两部分。
Source 15S层析pH5.5：将50mL Source 15S树脂(Amersham-Pharmacia)装入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)，柱子再生后用S1起始缓冲液(6M尿素、25mM乙酸钠、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH5.5)平衡。
将一份Source 30Q样品上柱，a)用S1起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定，b)用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S1起始缓冲液洗涤，以及c)用S1起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定。最后用18倍CV梯度为0-230mM NaCl洗脱蛋白。残留在柱上的蛋白用1M NaCl清洗步骤除去。
将第二份Source 30Q样品重复上述层析步骤。把含有HepCorT(151/97F)Hsp65的级分合并，用浓乙酸将pH调整到4.8，分成两份。
Source 15S层析pH4.8：将Source 15S柱再生，然后用S2起始缓冲液(6M尿素、25mM乙酸钠、10mM 2-巯基乙醇、1mM EDTA、pH4.8)平衡。
将一份Source 15S样品上柱，a)用S2起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定，b)用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S2起始缓冲液洗涤，以及c)用S2起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定。
用10倍CV线性梯度为0-500mM NaCl的S2起始缓冲液洗脱蛋白。残留在柱上的蛋白用2倍CV 1M NaCl和3倍CV 6M盐酸胍清洗液洗涤步骤除去。将含有HepCorT(151/97F)Hsp65的级分合并。
Source 15S层析pH4.8-除去ET：将上一步合并的级分以S2起始缓冲液中透析，再次上样至Source 15S柱。
将Source 15S柱再生，并用S2起始缓冲液平衡。将一半Source 15S样品上柱，首先用S2起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定，再用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S2起始缓冲液洗涤，然后再用S2起始缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定。
用4倍CV 1M NaCl和3倍CV 6M盐酸胍清洗液将蛋白洗脱。将含有HepCorT(151/97F)Hsp65的级分合并，在DPBS、10％(w/v)蔗糖中分三步透析。
2.4、HepCor(97F)Hsp65的纯化
细胞裂解：将200克冷冻的细胞糊与600mL裂解缓冲液(30mMTRIS、20mM 2-巯基乙醇、5mM EDTA、0.1mM PMSF、0.2mg/mL溶菌酶、pH7.5)混合，然后在4℃搅动大约30分钟。
细胞悬浮液进行超声破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖头，设置9)1分钟，共4次。裂解液在18,500g离心，保留可溶性样品。蛋白溶液在4℃以108,850g离心20分钟使其澄清。
硫酸铵沉淀：在澄清的蛋白溶液中加入硫酸铵至饱和度为25％，10,000g离心收集蛋白。将蛋白沉淀重悬浮于裂解缓冲液中。
乙酸沉淀：将蛋白溶液用1M乙酸仔细调整到pH4.5，然后在4℃搅动20分钟。4℃以10,000g离心10分钟收集蛋白沉淀。将蛋白沉淀重悬浮于Q缓冲液A(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巯基乙醇、5mM EDTA、0.1mM PMSF、pH8.5)中。
Q琼脂糖高效色谱：将含有150mL Q琼脂糖高效树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用3-5倍CV的Q缓冲液A平衡。将样品上柱，收集穿透液。加入2-巯基乙醇至150mM，合并的蛋白在4℃放置1小时。
第二次Q琼脂糖高效色谱：将Q琼脂糖高效柱再生，然后用Q缓冲液A平衡。
将第一次Q琼脂糖快速柱中的穿透液上柱，再次收集穿透液。加入2-巯基乙醇至300mM。加入盐酸胍至6M。然后将蛋白样品在室温放置72小时，然后用0.22μM过滤器过滤。
Superdex 200凝胶过滤层析：将含有1800mL Superdex 200树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/90柱(Amersham-Pharmacia)用2倍CV的GF缓冲液(6M尿素、30mM TRIS、20mM 2-巯基乙醇、2mM EDTA、pH7.5)平衡。
将70mL样品分为10等份。然后分别上柱处理，将含有HepCor(97F)Hsp65的级分合并。
Sephadex 25脱盐凝胶过滤层析：将含有300mL Sephadex 25树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用GF25缓冲液(6M尿素、50mM乙酸、5mM NaOH、1mM EDTA、10mM 2-巯基乙醇、pH4.7)平衡。
将样品分为75mL的部分，然后分别上柱处理。将含有蛋白的级分合并。
SP琼脂糖高效色谱：将275mL SP琼脂糖高效树脂(Amersham-Pharmacia)再生，然后用SP缓冲液A(6M尿素、50mM乙酸、5mMNaOH、1mM EDTA、10mM 2-巯基乙醇、pH4.7)平衡。
上一步获得的合并的样品与树脂混合，于室温在水平摇床上震荡30分钟。然后将浆液装入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)，用2倍CV SP缓冲液A洗涤。然后用15倍CV含2％(v/v)Triton X-100的SP缓冲液A洗涤柱子。用5倍CV SP缓冲液A和2倍CV含1M NaCl的SP缓冲液A洗涤柱子以除去去污剂。最后用含6M尿素、10mMTRIS、pH7.5的溶液将蛋白无梯度洗脱。
铜螯合琼脂糖快速色谱：将含有180mL铜螯合琼脂糖快速树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，用硫酸铜负载，然后用2倍CV Cu缓冲液A(6M盐酸胍、30mM磷酸钠、pH7.0)平衡。
将样品上柱，用3倍CV Cu缓冲液A洗涤，然后用5倍CV含2％(v/v)Triton X-100的Cu缓冲液A洗涤，最后用3倍CV Cu缓冲液A洗涤以除去去污剂。用含300mM咪唑的Cu缓冲液A洗脱蛋白。然后将蛋白在DPBS中分五步进行透析。
2.5、HepCorT(151/97F)的纯化
细胞裂解：将425克冷冻的细胞糊与2.5L冰冷的含10mM EDTA、100mM NaCl、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液混合。细胞悬浮液混合后，以10,500g离心10分钟收集细胞。然后将细胞重悬浮于含有50mM NaCl、1mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、0.2g/mL溶菌酶、pH8.0的溶液中，混合，在冰上放置1小时。
将细胞悬浮液进行超声破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖头，设置8)2分钟，共2次。裂解液以18,500g离心，保留可溶性样品。
硫酸铵沉淀：在可溶性级分中加入硫酸铵至饱和度为25％，10,000g离心40分钟使杂质沉淀。在上清液中继续加入硫酸铵至饱和度为35％。混合30分钟后，10,000g离心30分钟收集沉淀蛋白。将蛋白沉淀重悬浮于含有1mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液中，以76,500g离心20分钟使其澄清。
第二次硫酸铵沉淀：第一次沉淀得到的样品溶解于含有1mMEDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液中，按照上述的同样步骤再处理一遍。
苯基琼脂糖快速色谱：将含有200mL苯基琼脂糖快速树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用含有0.85M硫酸铵、20mM磷酸钠、1mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
在样品中加入含1M磷酸钠、1mM EDTA、1mM BME、pH6.8的溶液直至磷酸钠为10mM，加入硫酸铵至20％饱和度。将一半样品上柱，用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的吸收达到基线。然后将蛋白用300mL溶液进行负线性梯度洗脱，下限溶液为20mM磷酸钠、1mMEDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH6.8。将含有HepCorT(151/97F)的级分合并。
第二次苯基琼脂糖快速层析：将柱子再生，并用含有0.85M硫酸铵、20mM磷酸钠、1mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
从第一次苯基琼脂糖快速柱获得的合并样品用平衡缓冲液稀释到2.5mg蛋白/mL。然后将稀释的样品上柱，用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的基线稳定，然后将蛋白用300mL溶液进行负线性梯度洗脱，下限溶液为20mM磷酸钠、1mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH6.8。
将含有HepCorT(151/97F)的级分合并，加入硫酸铵至35％饱和度，然后以12,000g离心50分钟收集蛋白沉淀。将沉淀蛋白重新溶解在700mL含8M尿素、10mM乙酸钠、30mM乙酸、25mM NaCl、0.5mMEDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液中。
SP琼脂糖快速色谱：将含有180mL SP琼脂糖快速树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含8M尿素、10mM乙酸钠、30mM乙酸、25mM NaCl、0.5mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
将一半样品上柱，用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的吸收达到基线。然后将蛋白用600mL体积进行线性梯度洗脱，从平衡缓冲液洗脱到10mM乙酸钠、30mM乙酸、1M NaCl、5mM 2-巯基乙醇、0.5mMEDTA。最后用6M盐酸胍、50mM TRIS、pH8.5的溶液将柱子洗净。
将另一半样品重复上述步骤，然后将含有HepCorT的级分合并，并用含6M尿素、20mM TRIS、pH8.5、0.5mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.5的溶液透析，最后用含6M尿素、20mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH8.5的溶液透析。
Source 30Q层析：将含有150mL Source 30Q树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用4倍CV的平衡缓冲液(6M尿素、20mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH8.5)平衡。
将三分之一样品上柱，用95％平衡缓冲液和5％洗脱缓冲液(6M尿素、1M NaCl、20mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH8.5)洗涤，然后将蛋白用1L溶液进行线性梯度洗脱，直至100％洗脱缓冲液。
将第二和第三部分样品进行相应处理。将含有HepCorT的级分合并，用含6M尿素、20mM乙酸钠、20mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM2-巯基乙醇、pH8.0的溶液透析。
SP琼脂糖高效色谱：将含有180mL SP琼脂糖高效树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含6M尿素、20mM乙酸钠、20mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
将一半样品上柱，用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的吸收达到基线。
杂质用两种线性梯度洗脱下来，即梯度为0-1M NaCl的平衡缓冲液，然后以线性梯度洗脱至洗脱缓冲液2(6M尿素、40mM乙酸钠、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0)中。柱子用含2％(v/v)Triton X-100的洗脱缓冲液2洗涤，然后用10倍CV的洗脱缓冲液除去去污剂。将蛋白进行线性梯度洗脱，直到含6M尿素、50mMTRIS、0.5mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液。
将另一半样品重复上述步骤，把含有HepCorT(151/9F)的级分合并，蛋白用含5mM磷酸钠、50mM NaCl、3.1mM尿素、20％蔗糖、pH8.5的溶液分两步透析。
2.6、HepCor(97F)的纯化
细胞裂解：将100克冷冻的细胞糊与400mL冰冷的含5mMEDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液混合。细胞悬浮液混合后，加入0.2g/mL溶菌酶，将悬浮液混合，在冰上放置1小时。
细胞悬浮液进行超声破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖头，设置8)2次，共2分钟。然后加入200mL冰冷的含20mM乙酸钠、5mM乙酸、3M硫酸铵的溶液并充分混合。悬浮液超声(Branson Sonifier450，3/4英寸尖头，设置8)破碎3分钟。最后，将裂解液以18,500g离心，保留可溶性样品。
硫酸铵沉淀：可溶性级分用1L的0.85M硫酸铵稀释。按70g/L的量一边混合一边缓慢加入固体硫酸铵。继续混合30分钟后，将悬浮液以18,500g离心60分钟。其后，将沉淀重新悬浮于500mL含1mMEDTA、5mM 2-巯基乙醇的溶液中。按113.4g/L的量一边混合一边缓慢加入硫酸铵；将溶液继续混合30分钟。以76,500g离心20分钟收集蛋白沉淀。
加入含1M磷酸钠、1mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、20％饱和的硫酸铵的溶液重新溶解沉淀，直到磷酸钠终浓度为5mM。
苯基琼脂糖快速色谱：将含有200mL苯基琼脂糖快速树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用含有0.85M硫酸铵、5mM磷酸钠、1mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
将样品上柱，用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的吸收达到基线。然后将蛋白用阶段梯度进行洗脱，直到6M尿素。将含有HepCorT的级分合并，加入硫酸铵到32％饱和度使蛋白沉淀。以12,100g离心50分钟收集蛋白后，将其重新溶解在500mL含8M尿素、5mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH7.5的溶液中。
Source 30Q层析：将含有150mL Source 30Q树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用4倍CV的平衡缓冲液(6M尿素、5mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH7.5)平衡。
将样品上柱，用平衡缓冲液洗涤。用线性梯度从平衡缓冲液到含6M尿素、1M NaCl、5mM TRIS、5mM 2-巯基乙醇、pH7.5的溶液将蛋白洗脱。把含有HepCor(97F)的级分合并，分成三份。
SP琼脂糖高效色谱：将含有190mL SP琼脂糖高效树脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含6M尿素、30mM乙酸钠、10mM乙酸、1mM EDTA、5mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
将一部分样品上柱，用20倍CV含6M尿素、40mM乙酸钠、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH8.0的溶液洗涤。然后为了除去Triton X-100，用10倍CV含6M尿素、40mM乙酸钠、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巯基乙醇、pH8.0的溶液洗涤柱子。
让蛋白以600mL的线性梯度洗脱到含6M尿素、20mM TRIS、1MNaCl、1mM 2-巯基乙醇、0.5mM EDTA、pH8.5的溶液。
将其它两部分样品重复上述步骤，然后将含有HepCor(97F)的级分合并。将蛋白用含40mM乙酸钠、0.05mM DTT、pH6.5的溶液分5步透析。
实施例3、小鼠CTL活性的引发
小鼠：C57BL/6(H-2b)小鼠购自Charles River Laboratories(St.Constant，PQ)。
细胞系：EL4胸腺瘤细胞系(H-2b)来自ATCC，培养在含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco修饰Eagles培养基(DMEM-10)。表达HBc抗原的EL4.HBc.1D7细胞来自Stressgen，是通过用编码全长HBc基因和新霉素抗性标记的质粒转染EL4细胞得到的。全长HBc抗原基因从HBV adw亚型克隆得到，并修饰成编码已知的鼠H-2Kb和H-2Kd限制性CTL抗原决定簇序列(对野生型adw蛋白的两个氨基酸进行了改变：第87位的氨基酸从天冬酰胺变为丝氨酸，以及第97位的氨基酸从异亮氨酸变为苯丙氨酸。这两个改变能够重现已知的小鼠CTL抗原决定簇)。转染的细胞在含有1500μg/mL G418的DMEM-10中筛选，通过有限稀释克隆获得了EL4.HBc.1D7克隆。使用HBc特异性抗体通过Western免疫印迹分析证实了HBc蛋白在该细胞系中的表达。H-2Kb限制性CTL抗原决定簇对I型MHC的呈递通过对该抗原决定簇特异的CTL系的溶胞作用加以证实。FACS分析表明在转染子中有高水平的I型MHC表达，与亲本细胞系相似。
小鼠CTL活性的引发：用缓冲液或2.9nmol下列成分之一免疫(通过在颈背或肩胛间的部位皮下注射)小鼠：HepCorT(151/97F)Hsp65、HepCorT(97F)Hsp65、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65、HepCorT(151/97F)或HepCorT(97F)。在免疫7天后，使用吸入CO2或颈错位的方法无痛处死小鼠，并将脾脏取出。在CTL培养基(RPMI-1640、10％FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50μM 2-ME和45μg/mL庆大霉素)中制备脾细胞的单细胞悬浮液。在存在1μM HBc CTL抗原决定簇肽HBc.93-100.Kb、MGLKFRQL(Kuhober等，J.Immunol.156：3687-95，1996)的情况下通过在37℃/5％CO2下培养，使30×106个活的淋巴细胞重新刺激。用于重新刺激作用的这个合成肽(由Research Genetics，Huntsville，AL合成)含有由H-2Kb限制的鼠CTL抗原决定簇。
效应细胞在7天后收获，与51Cr标记的靶细胞一起共同培养在U形底的96孔微量滴定板中。对照EL4靶细胞是用一个无关的H-2Kb(MUT-1.52-59.Kb)限制性肽(参见图13)预脉冲的细胞。靶细胞是用HBc.93-100.Kb肽(参见图14)预脉冲的EL4细胞或用EL4.HBc.1D7细胞预脉冲的EL4细胞(参见图15)。CTL(100μL)是与5×103或1×104个靶细胞(100μL)以各种各样的效应物∶靶细胞比率(100∶1、33∶1或11∶1)进行培养的。为了确定自发释放标记，在总体积200μL的CTL培养基中培养了同样数量的靶细胞，但不含效应细胞。通过向同样数量的靶细胞中加入100μL Triton X-100(2％v/v水溶液)确定总的释放标记。培养4小时后，微量滴定板以200×g离心5分钟，收集100μL培养的上清液。用闪烁计数器测定释放的放射性。按照下述公式计算校正的溶胞百分数：校正的溶胞百分数(CL)＝100×(CPM测试-CPM自发)/(CPM总-CPM自发)。
细胞因子分析：为了定量测定重新刺激的CTL释放的γ-干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，将效应细胞接种于U形底的96孔微量滴定板中，并与1μM HBc.93-100.Kb肽和靶细胞以效应物∶靶为100∶1、33∶1或11∶1的比率共同培养。培养4小时或24小时后收集上清液，通过三明治酶联免疫吸附分析(ELISA)方法分析INF-γ(图16)或TNF-α(图17)。

Claims (36)

1.一种融合蛋白，其含有(i)热休克蛋白或其免疫刺激部分，以及(ii)乙肝病毒(HBV)核心抗原或其抗原片段，其中所述融合蛋白当施用给个体时，诱导或增强针对HBV核心抗原的免疫应答。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中HBV核心抗原包括SEQ IDNO：2的序列。
3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中融合蛋白缺失HBV核心抗原的C-末端富含精氨酸的结构域。
4.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中融合蛋白含有SEQID NO：2的第1-149位氨基酸。
5.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中融合蛋白含有SEQID NO：2的第1-151位氨基酸。
6.一种融合蛋白，其含有(i)热休克蛋白或其免疫刺激部分，以及(ii)HBV核心抗原SEQ ID NO：2的变体，其中所述变体包括SEQID NO：2中至少一个、不超过25个氨基酸残基被替换的氨基酸序列，以及所述融合蛋白当施用给个体时，诱导或增强针对HBV核心抗原的免疫应答。
7.权利要求6的融合蛋白，其中SEQ ID NO：2的1-10个氨基酸残基被替换。
8.权利要求6的融合蛋白，其中SEQ ID NO：2的1-5个氨基酸残基被替换。
9.权利要求6的融合蛋白，其中SEQ ID NO：2的1-2个氨基酸残基被替换。
10.权利要求6-9任一项所述的融合蛋白，其中所述变体含有SEQID NO：2中至少第97位的异亮氨酸残基被替换的氨基酸序列。
11.权利要求10所述的融合蛋白，其中第97位的异亮氨酸残基被保守性氨基酸残基替换。
12.权利要求10所述的融合蛋白，其中第97位的异亮氨酸残基被苯丙氨酸替换。
13.权利要求6-9任一项所述的融合蛋白，其中第91位的苏氨酸残基被替换。
14.权利要求13所述的融合蛋白，其中第91位的苏氨酸残基被保守性氨基酸残基替换。
15.权利要求13所述的融合蛋白，其中第91位的苏氨酸残基被缬氨酸替换。
16.权利要求6-9任一项所述的融合蛋白，其中第87位的天冬酰胺被替换。
17.权利要求16的融合蛋白，其中第87位的天冬酰胺被保守性氨基酸残基替换。
18.权利要求16的融合蛋白，其中第87位的天冬酰胺被丝氨酸替换。
19.权利要求1-18任一项所述的融合蛋白，其中热休克蛋白选自Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100-200和Hsp100。
20.权利要求1-19任一项所述的融合蛋白，其中热休克蛋白是分支杆菌热休克蛋白。
21.权利要求20所述的融合蛋白，其中分支杆菌热休克蛋白是牛分枝杆菌(M.bovis)BCG热休克蛋白。
22.权利要求21所述的融合蛋白，其中牛分支杆菌BCG热休克蛋白是牛分枝杆菌(M.bovis)BCG的hsp65。
23.权利要求1-22任一项所述的融合蛋白，其中热休克蛋白是全长热休克蛋白。
24.权利要求1-23任一项所述的融合蛋白，其中HBV核心抗原为全长HBV蛋白。
25.一种融合蛋白，其含有SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：10，或SEQ ID NO：12的序列。
26.一种药物组合物，其含有权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白和可药用载体或赋形剂。
27.一种分离的核酸，其包含的序列编码权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白。
28.一种分离的核酸，其含有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9，或SEQ ID NO：11的序列。
29.一种表达载体，其含有权利要求27或28所述的核酸。
30.一种逆转录病毒载体，其含有权利要求27或28所述的核酸。
31.一种细胞，其含有权利要求29所述的表达载体。
32.一种制备权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白的方法，该方法包括：
(a)提供权利要求31所述的细胞，以及
(b)在允许核酸表达的条件下培养该细胞。
33.权利要求1-25任一项所述的融合蛋白在制备用于诱导或增强个体针对HBV核心抗原的免疫应答的药物中的应用。
34.权利要求26所述的药物组合物在制备用于诱导或增强个体针对HBV核心抗原的免疫应答的药物中的应用。
35.权利要求29所述的表达载体在制备用于诱导或增强个体针对HBV核心抗原的免疫应答的药物中的应用。
36.权利要求30所述的逆转录病毒载体在制备用于诱导或增强个体针对HBV核心抗原的免疫应答的药物中的应用。
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