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CN1263465C - 结合APP的铜结合位点和/或发挥抑制淀粉样Aβ肽释放作用的铜激动剂 - Google Patents

结合APP的铜结合位点和/或发挥抑制淀粉样Aβ肽释放作用的铜激动剂 Download PDF

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CN1263465C CNB008067325A CN00806732A CN1263465C CN 1263465 C CN1263465 C CN 1263465C CN B008067325 A CNB008067325 A CN B008067325A CN 00806732 A CN00806732 A CN 00806732A CN 1263465 C CN1263465 C CN 1263465C
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Abstract

本发明涉及结合APP的铜结合位点和/或发挥抑制参与阿耳茨海默氏病发生的淀粉样Aβ肽的释放的作用的铜激动剂。本发明还涉及含有所述铜激动剂的药物，或所述铜激动剂在制备预防和/或治疗阿耳茨海默氏病的药物中的应用。本发明还涉及鉴别具有本发明所需作用的铜激动剂的方法。

Description

结合APP的铜结合位点和/或发挥抑制淀粉样Aβ肽 释放作用的铜激动剂
本发明涉及结合淀粉样蛋白前体(APP)的铜结合位点和/或发挥抑制参于阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)发生的淀粉样Aβ肽释放作用的铜激动剂(copper agonists)。本发明还涉及含有这些铜激动剂的药物，以预防和/或治疗阿耳茨海默氏病。最后，本发明涉及鉴别具有本发明所需作用的铜激动剂。
β淀粉样肽(βA4，Aβ)，是老年斑和阿耳茨海默氏病脑血管淀粉样改变的基本成分，其是从较大的完整膜淀粉样蛋白前体(APP)中，依次经β-分泌酶和γ-分泌酶蛋白酶切形成的，APP的主要同种型含有695个(APP695)，751个(APP751)或770个(APP770)氨基酸(Hardy，J.，神经科学趋势20，p154-159(1997))。在Aβ结构域内由α-分泌酶对APP的加工会防止淀粉样改变形成，并导致含有Aβ的17-40/42位残基的p3肽释放(图1)。用α-分泌酶或β-分泌酶切割APP产生可溶的APP片段(sAPPα和sAPPβ)，其代表到达胞外空间的APP胞外域。
尽管未知APP的生理功能，但已知APP呈现与细胞粘着分子和参与伤口愈合的分子相同的特性。这例如包括APP结合硫酸肝素，胶原，层粘连蛋白，蛋白酶，凝集素和金属离子的结合位点。
在先前治疗阿耳茨海默氏病的试验中，通过施用阻断至今未鉴别的β-分泌酶或γ-分泌酶的化合物而阻断淀粉样Aβ肽的形成(Hooper等，生物化学杂志321，p265-279(1997))。然而，抑制这些蛋白酶产生不希望的副作用，因为这些蛋白酶参与不同跨膜蛋白的加工。因此治疗阿耳茨海默氏病和其它形式的痴呆症目前主要集中于改善脑的代谢过程和取代一些缺陷的神经递质，或集中于抑制疾病伴随的炎症过程。然而，这些药物在不同形式的痴呆症之间没有特异性，只针对于在所有痴呆症中均可见到的继发性症状。
因此本发明的技术方案在于提供了用于防止或治疗阿耳茨海默氏病的产品。
上述技术方案通过权利要求限定的实施方案而得到解决。
现已发现APP在两个限定的位置与Zn(II)和Cu(II)特异地相互作用。Cu(II)的结合引起APP的两个半胱氨酸氧化，导致另一个半胱氨酸的形成。此方式中产生的两个电子之一使结合的Cu(II)还原形成Cu(I)。然而，未阐明另一电子的去向。
现已知在哺乳动物细胞中加入Cu(II)的作用是提高α-分泌性代谢途径的APP产物(sAPPα和p3)的释放，及降低β-分泌性代谢途径产物(p3.5和参与阿耳茨海默氏病的Aβ)的释放。因此阿耳茨海默氏病可通过施用作为铜激动剂的化合物而有效及特异性的防止或治疗，铜激动剂即能结合APP的铜结合位点，和/或模仿其生理功能，即能降低或防止淀粉样Aβ肽形成的化合物。由于APP对铜的结合也导致极毒性的Cu(I)离子产生，因此这些具有激动作用的分子包含另一特性，即防止细胞受到因APP结合Cu(II)而产生的损害，因此也能防止由铜和过氧化氢产生的反应形式的氧形成。
因此，本发明的一实施方案涉及一种铜激动剂，其特征在于其结合淀粉样蛋白前体(APP)的铜结合位点，和/或降低或防止淀粉样Aβ肽的释放。
术语“铜激动剂”指能结合APP的铜结合位点，和/或降低或防止淀粉样Aβ肽的释放的任何物质，如无机或有机化合物。优选的铜激动剂是二价金属离子，其在生理高浓度可与铜竞争在APP分子上的结合位点，如20-200mM的Mg(II)，优选100mM的Mg(II)；20-200mM的Ca(II)，优选100mM的Ca(II)；0.05-20mM的Zn(II)，优选100μM的Zn(II)等。另外优选的铜激动剂是寡肽，寡核苷酸，寡糖或核苷酸类似物，其主要通过其三维结构模拟铜并根据钥匙-锁原理而结合铜结合位点。在一优选的实施方案中，寡肽还可含有相应于铜结合位点的序列并因此占据该位点。另外优选的铜激动剂是得自可购买的化学物质文库，或是新化合物(组合化学)或分离自微生物或植物的低分子的天然物质。这些化合物也通过其三维结构而起作用，它们模拟铜的特性和大小且无负面性质。
因此铜激动剂的作用优选基于此物质特异性地及比铜离子亲和性更高地结合APP的铜结合位点，或特异性地结合APP的负责铜结合的序列区并(在空间上)防止在此位置上的进一步的铜结合，或驱使铜离子离开此位置。铜激动剂是竞争性(竞争铜结合位点)，或非竞争性结合配体，其能模仿铜的生理作用。本发明的铜激动剂还可以是不结合铜结合位点但稳定铜APP复合物的特征性APP构象的物质，即其在其它结合位点(除直接的铜结合位点之外的位点)能模拟铜的生理作用。
术语“降低或防止淀粉样Aβ肽释放”是指铜激动剂所具有的足以获得防止或治疗阿耳茨海默氏病的效果的作用。
本领域技术人员通过本领域常用方法能鉴别和生产具有上述铜激动剂作用的物质。在非天然激动剂(如作为文库提供的小的有机化学合成物质)，寡核苷酸，寡肽和核苷酸类似物的情况下，可根据本领域技术人员熟知的常用方法合成。鉴别一物质是否是可能的激动剂可通过亲和层析进行，如用“BIAcore方法”。在此情况下，测试上述化合物的结合APP，尤其结合APP的包含铜结合位点的结构域的情况。之后，在细胞培养系统中测试鉴别的配体对APP加工的作用，如通过用合适的抗体进行竞争分析。另外，本领域技术人员也能通过常用方法，如类似于实施例4和5方法，测试鉴别的激动剂是否为病人所耐受及任选地制备剂量作用曲线。本发明鉴别结合APP的铜结合位点和/或发挥抑制淀粉样Aβ肽释放作用的铜激动剂的方法，特征在于以下步骤：
(a)将APP或其携带铜结合位点的片段，与各种浓度的潜在具有上述作用的化合物接触，
(b)检测Aβ蛋白的减少。
在一优选的实施方案中，此方法特征在于以下步骤：
(a)将APP或其携带铜结合位点的片段，与溶解的或固定化的物质文库或来自微生物和/或植物的低分子物质接触，
(b)当使用溶解的物质文库或液体低分子物质时，用特异于APP或其片段的抗体的从溶液中免疫沉淀铜结合位点/配体复合物；或者当使用固定化物质文库时，通过加入铜盐从铜结合位点/配体复合物中释放配体，
(c)鉴别配体，及
(d)选择通过与APP的铜结合位点或其它位点竞争性或非竞争性结合之后，发挥抑制淀粉样Aβ肽释放的作用的配体，
其中(d)步骤可任选地在(c)步骤之前。
“配体”是指在上述方法中结合APP的铜结合位点或其它位点的任何物质。
上述抗体例如是识别APP的单克隆或多克隆抗血清，并适用于免疫沉淀。它们可购自例如Boehringer Mannheim，Dianova或Sigma公司。可用于检测APP，APP复合物和Aβ40(具有40个氨基酸的Aβ同种型，见图1)或Aβ42(具有42个氨基酸的Aβ同种型，见图1)的其它合适的抗体见于Ida等，生物化学杂志271，p22908-22914(1996)，和Weidemann等，细胞57，p155-162(1989)所述。
随机合成的有机化合物的集合用作物质文库。这些文库可商购(如购自Morphosys，Munich；Analytikon，Berlin)，或可通过化学实验室协作产生(如通过组合化学产生的新化合物)。来自微生物和植物的低分子物质可用BIAcore方法分离。
在溶液中或用固定的APP或APP片段实现所述接触。形成的复合物用抗体从溶液中沉淀出，然后用荧光，放射性或分析方法检测，如质谱，气相层析等。
确定合适的APP片段首先是测试测试物质与完整APP的结合，接着测试与具有与全长分子相同结合特性的逐渐缩短的片段结合的情况。
进行(b)步骤的另一种可能方式是通过亲和层析如BIAcore，即APP分子或其配体是固定在载体表面的。之后，在此表面注射相应的分子，当发生结合时，注射铜盐以再一次解离。此过程可直接通过生物传感方法追踪。
在本发明的鉴别方法的一优选实施方案中，(d)步骤包括将得自(a)至(c)步骤的配体与用APP695稳定转染的哺乳动物细胞温育，并用多克隆或单克隆抗体确定淀粉样Aβ肽的产生。在此情况下，在免疫沉淀之后，用SDS凝胶电泳，ELISA和免疫沉淀Western印迹分析。
或者，可在(d)步骤将得自(a)至(c)步骤的配体施用于表达人淀粉样Aβ肽的转基因小鼠。之后，收集CNS或尾静脉血样品，用单克隆或多克隆抗体确定淀粉样Aβ肽的产生(如Dianova，Boeheringer Mannheim，Sigma公司和自身抗体(Ida等，生物化学杂志271，p22908-22914，1996))。此方法代表鉴别的配体在体内的测试。此程序(包括使用的方法)与上述细胞培养试验非常相似。与检测在细胞培养上清或细胞内形成的APP片段不同的是，在小鼠血清中检测这些片段。检测方法相当于细胞培养试验中的方法。
本发明还涉及含有本发明铜激动剂的药物。这些药物任选的另外含有药物合适的载体。本领域技术人员已知这种药物的合适载体和配方。合适的载体例如是常用的磷酸盐缓冲的盐溶液，水，乳液如油/水乳液，湿润剂，无菌溶液等。药物可口服或非肠道施用。非肠道施用方法包括局部，动脉内，肌内，皮下，髓内，鞘内，心室内，静脉内，腹膜内或鼻内施用。由医生根据各种因素如病人年龄，性别，和/或体重，疾病进程，施用方式等确定合适剂量。
因此，本发明还涉及使用上述铜激动剂生产预防或治疗阿耳茨海默氏病的药物。
本发明通过以下附图得以更详尽的阐述。
图1示出淀粉样蛋白前体(APP770)加工为Aβ，p3.5和p3。
单字母代码；白色字母代表Aβ1-40/42的氨基酸序列。相应于抗体的表位的大约位置用黑线在序列下标示。
图2示出免疫沉淀c-myc标记的APP695
用多克隆c-myc抗体18/47从野生型(a，CHO-K1)的裂解物(myc-APP695)和条件培养基(myc-sAPP695)中，及从铜抗性CHO细胞(b，CHO-CUR3)中进行免疫沉淀。沉淀的样品在移至硝酸纤维素膜之后，用单克隆APP抗体22C11免疫印迹。对照组：培养基(“模拟/s”)和裂解物(“模拟/c”)或“模拟”转染的细胞。
图3示出在普通培养基(CM，含有基础培养基的铜)，或含有 指定铜浓度的培养基中，在存在铜螯合剂浴铜灵(BC)和D青霉 胺(PEN)的情况下温育4小时后，用抗APP(22734/6；用细菌中产 生的APP免疫接种兔而获得的多克隆血清，见图1)或抗Aβ(730； 用合成产生的Aβ40肽免疫接种兔而获得的多克隆血清)从代谢标 记的CUR3细胞的裂解物(a)中免疫沉淀全APP695，及从培养基 (d)中免疫沉淀可溶的APP695(b)，Aβ和p3
sAPP695在较高铜浓度以双联体出现是基于其不同的唾液酸含量。在较低铜浓度出现在Aβ带略上的片段(d)，其推断是由δ-分泌酶和γ-分泌酶切割产生的(见图1)。在此试验中测定的cAPP(空心三角)，sAPP(空心方块)和完整的分泌蛋白(实心方块)的相对数量，以放射性百分率量化，其用在c)中的基础培养基铜浓缩物；在(e)中的Aβ(空心方块)，p3(空心三角)和sAPP(实心方块；示出源自与(c)相同试验的数据以更好地对比)获得。数据相当于三个独立试验的平均值。(e)中“0”μM和“1”μM铜指除去铜(PEN/BC)和在基础培养基(CM；0.8μM)铜的温育条件。
图4示出如图3所定量的，在普通培养基(CM，含有基础培养 基的铜)，或含有指定铜浓度的培养基中，在存在铜螫合剂浴铜灵 (BC)和D青霉胺(PEN)的情况下温育4小时后，用抗APP (22734/6)或抗Aβ(730)从代谢标记的K1细胞的裂解物(a) 中免疫沉淀全APP695，及从培养基(d)中免疫沉淀可溶的APP695 (b)，Aβ和p3
sAPP751/770的内源水平在K1细胞中比在CUR3细胞中高(见图2)，且也受铜浓度影响，并因此而定量。数据是两个独立试验的平均值。在此试验中测定的cAPP(空心圆)，sAPP695(空心方块)，sAPP751/770(空心三角)和完整的分泌蛋白(实心方块)在c)中定量。在(e)中为Aβ(空心方块)，p3(空心三角)和sAPP695(实心方块；源自与(c)相同试验的数据)。(e)中“0”μM和“1”μM指除去铜(PEN/BC)和在基础培养基(CM；0.8μM)铜的温育条件。在较低铜浓度出现电泳位置比Aβ带略上的片段(d)，其是由δ-分泌酶和γ-分泌酶切割产生的(见图1)。
图5示出对免疫沉淀自CHO-K1细胞(a)和CHO-CUR3细胞 (b)的条件培养基中的sAPP695，p3和Aβ的相对水平的定量
sAPP695(实心方块)在K1细胞中在10μM Cu(II)(a)达到最大增加值，在CUR3细胞中在50μM Cu(II)(b)达到最大增加值；随后降低。sAPP水平(空心三角)变化与p3蛋白的变化相比发生的较晚，p3在较低Cu(II)剂量达到最大水平，这主要是由于与sAPP相比其半衰期较长。相反，Aβ水平(实心方块)在两个细胞系中，在低于基础水平的Cu(II)浓度均明显提高。第一个数据点是用基础铜浓度(0.8μM Cu(II))确定的。
以下实施例举例说明本发明。
实施例1：一般方法
细胞系和转染
用c-myc标记的APP695载体(Peraus等，神经科学杂志17，p7714-7724(1997))，或用表达载体(pcDNA3)，通过高效磷酸钙转染法(Chen等，生物技术6，p632-638(1988)转染CHO细胞。将pSP65(Invitrogen公司)N-标记-APP695DNA，用SmaI或EcoRV克隆位点克隆入载体pcDNA3(Invitrogen/ITC Biotechnology，Heidelberg)。通过用多克隆兔抗c-myc抗体(18/47；针对c-myc序列的氨基酸序列EQKLISEEDL产生的；得自Eurogentec，Seraing，Belgium)对APP进行免疫沉淀，和用单克隆小鼠抗体22C11(Boehringer Mannheim)在“ECL”检测系统(Amersham，Braunschweig)中免疫印迹，检测转染效率。将亲代CHO-K1细胞和铜抗性细胞变体CUR3，在“Eagles”培养基(BME)中，在37℃培养，向其中加入2mM L-谷氨酰胺，0.1mM脯氨酸，20mM HEPES和10％胎牛血清(Boehringer Ingelheim)。基础铜浓度为0.8μM。将CUR3细胞在加入200μM铜的培养基中培养。
代谢性标记和免疫沉淀
将培养皿(60mm)中稳定转染的CHO细胞用2ml极限必需培养基(MEM)处理4小时，该MEM不含甲硫氨酸(Sigma公司，Munich)，并补加220μCi的〔35S〕甲硫氨酸(Amersham公司，Braunschweig)和5％N2。收集条件培养基(CM)和细胞并免疫沉淀。通过“BioRad”蛋白分析法(Bradford等，生物化学分析72，p248-254(1976))预先确定蛋白质浓度，或用10％三氯乙酸(TCA)沉淀放射标记的蛋白质，并测定掺入的〔35S〕甲硫氨酸(Beckman LS6000IC)。细胞在提取缓冲液中裂解，此缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，2mM EDTA，2％Triton X-100，2％NP40，10μg/ml亮抑蛋白酶肽。为除去细胞碎片，将裂解物和培养基在13000×g离心10分钟，并将培养基调节为25mM Tris-HCl(pH8.5)，1mM PMSF，10μg/ml抑蛋白酶肽，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，0.5％Triton X-100，和0.5％NP40。将溶解的蛋白质在100mM Tris-HCl(pH7.5)，300mM NaCl和4mM EDTA中以1∶2浓度稀释。将上清在4℃与APP抗体在架空摇床中翻转温育过夜。在一些试验中，所得上清然后用Aβ抗血清分析。用蛋白质A琼脂糖凝胶获得免疫复合物，并如Weidemann等，细胞57，p115-126(1989)所述分析。
抗体和电泳
为检测APP，将抗重组Fd-APP770的多克隆兔抗体以1∶500浓度稀释用于沉淀，此抗体是抗APP770的18-687位氨基酸残基的抗血清22734/6，或是抗APP的18-491位氨基酸残基的抗血清23850/6(图1)。抗血清是根据本领域已知的标准方法在实验室生产的。Aβ，p3.5和β3被多克隆抗体830识别(稀释度1∶50；Aβ，p3.5和β3被类似地沉淀)，该抗体是针对相应于Aβ的1-40位氨基酸残基产生(图1)。Aβ及其衍生物通过10-20％Tris-麦黄酮-聚丙烯酰胺凝胶分离，APP用7％的Tris-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶或用7％Tris-麦黄酮-聚丙烯酰胺凝胶分离。为进行免疫印迹，将细胞提取物和胞外培养基用10％TCA沉淀，用丙酮冲洗并溶解于相样品缓冲液中。在电泳之后，将凝胶进一步处理(如Simons等，神经科学杂志16，p899-908(1996))，并用“Fuji-Bas-PhosphorImager”系统定量。数据为平均值+/-标准差，除非特别指出，它们代表至少两个独立试验的结果。
活性物质的处理和LDH分析
在标记期间，将氯化铜或氯化锌(浓度为5-200μM)加入培养基中。将D(-)-青霉胺(PEN；Sigma)，浴铜灵二磺酸盐(BC；Aldrich)和1，10-非咯啉(PEN；Sigma)加入培养基中，至终浓度为100μM(PEN和BC)或200μM(PEN)。细胞的生存力通过乳酸脱氢酶(LDH)流入培养基(41)的情况而测定。在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中铺满70％单层CHO细胞2和4小时之后，测定LDH流出物作为酶活性(单位/升)。
实施例2：在用编码APP695的cDNA转染的细胞中APP的表达
将亲代CHO-K1细胞系和铜抗性CUR3细胞系，用于研究铜浓度的降低和提高(0-200μM)对APP的作用。CUR3细胞用于研究细胞内铜对APP的作用。与CHO-K1细胞相比，CUR3细胞显示细胞内铜浓度较低，这是由于“Menkes P型ATP酶铜流出泵”(细胞内铜泵/细胞内铜输出系统)浓度提高70倍导致铜流出增加所致。
在用编码具有N末端c-myc表位的APP695(图1)的cDNA转染CHO-K1和CUR3细胞之后，通过用多克隆c-myc抗血清免疫沉淀，接着用单克隆抗体22C11免疫印迹，可易于检测APP表达(图2a，b)。多克隆c-myc抗体免疫沉淀来自细胞裂解物(cAPP695)和条件培养基(sAPP695)的相对分子量为105kDa的c-myc标记的APP695。与预期一致，c-myc-APP695在只用pcDNA3转染的细胞的裂解物或培养基中均检测不到。
实施例3：作为铜浓度增加的函数的Aβ浓度降低
为研究铜离子对APP代谢的调节作用，将用APP695稳定转染的CHO细胞，用35S标记的甲硫氨酸在不同铜浓度下标记4小时，随后用检测APP(22734/6)或检测Aβ和p3(730)的多克隆抗体免疫沉淀，测定APP胞外域，Aβ和p3的分泌。CUR3细胞的细胞裂解物示出一个105kDa的条带，其相当于未成熟的cAPP695全蛋白质(图3a)。条件培养基中释放的APP695衍生物检测为105kDa和97.5kDa的条带(图3b)，它们不同之处在于前者有较高含量的唾液酸。此细胞系示出在整个试验期间未降低生存力。
当用提高浓度的铜温育CUR3细胞时，APP全蛋白质和可溶的APP的浓度也明显提高。与基础培养基相比，在诱导分泌蛋白一般产生之前，在50μM Cu(II)获得最大值的sAPP，达265％(图3c；表1)。由α-分泌酶切割产生的分泌性APP的C末端配体p3的分泌，在培养基中铜浓度提高至20-50μM之间时，达到最大值270％(图3d；表1)。用兔抗血清730对源自APP的Aβ区的放射标记的肽进行免疫沉淀，该抗血清识别Aβ(4.5kDa)，p3.5(3.5kDa)和p3(3kDa)(图1)。当培养基中铜浓度超过50μM时，影响一般蛋白质的代谢，且cAPP的百分率明显较高，达550％(图3c；表1)。与之相比，Aβ浓度非常低，在50μM铜浓度只有基础浓度的20％，在铜浓度高于100μM时，在CUR3细胞中很难检测到Aβ(图3d，e)。p3.5也获得此结果(图3d)，证实p3.5是替代性β-分泌酶代谢的产物。
                                            表1：CHO细胞中APP加工的调制 *
  sAPP695c   APP695   p3   Aβ
  CUR3(50μM Cu(II))CUR3(Cu(I)/Cu(II)去除)K1(10μM Cu(II))K2(Cu(I)/Cu(II)去除)   26577475170   550205295190   27050154171   2010020100
*与标准状态相比提高/降低百分比
实施例4：通过Cu(I)与浴铜灵或Cu(II)与青霉胺复合物的形成刺激Aβ肽产生
进行以下研究以检测cAPP，sAPP和后续的降解产物是否由铜缺乏而调制。为研究Cu(II)是否为APP表达和加工所必需，通过Cu(II)螯合剂D-青霉胺(PEN)除去Cu(II)，通过细胞不透的Cu(I)螯合剂浴铜灵二磺酸除去Cu(I)。示出Aβ和p3.5的产生不受影响，而sAPP和p3的浓度分别降低77％和50％(图3d，e；表1)。这表明Cu(II)诱导的改变基于铜对APP代谢的特异调制。
实施例5：对在CHO-K1细胞中内源表达的含有KPI的同种型APP751/770的研究
研究含有KPI(Kunitz型蛋白酶抑制结构域，其通过可变剪接引入APP751和APP770)的同种型APP751/770在CHO-K1细胞中的内源表达，是通过用多克隆APP抗血清22734，从细胞裂解物和条件培养基中，免疫沉淀用〔35S〕甲硫氨酸标记的蛋白质而进行的(图1；图4a，b)。KPI-APP的分泌相当于c-myc APP695的分泌(图4)。相对分子量为130kDa和105kDa的两个主要条带分别相当于sAPP751/770和sAPP695。后者也可用抗c-myc抗血清沉淀。当CHO-K1细胞与升高浓度的铜温育时，APP水平和p3水平明显提高(APP：用10μM铜使cAPP达到295％，sAPP达到475％，sAPP751/770达到275％，p3达到154％；图4a-e；表1)。同时，Aβ产量明显降低至低于检测限(图4d，e)。在存在铜螯合剂的情况下，sAPP695的分泌为170％(图54b，c)，sAPP751/770的分泌为190％(图4b，c；表1)，p3的分泌为171％(图4d，e；表1)。
另外，对免疫沉淀自CHO-K1细胞(a)和CHO-CUR3细胞(b)的条件培养基的sAPP694，p3和Aβ的相对水平进行定量。结果示于图5。在K1细胞中，sAPP695(实心方块)增加在10μM Cu(II)(a)达到最大值，在CUR3细胞中其在50μM Cu(II)(b)达到最大增加值；之后降低。与p3蛋白在较低Cu(II)剂量达到最大水平相比，sAPP水平(空心三角)变化发生的较晚，这主要是由于与sAPP相比p3的半衰期较长。与之相反，在Cu(II)浓度低于基础水平时，Aβ水平(实心方块)在两个细胞系中均明显提高。第一个数据点是用基础铜浓度(0.8μM Cu(II))确定的。
实施例6：根据对淀粉样Aβ肽释放的抑制作用鉴别APP的铜激动剂
将APP和APLP2(属于APP基因家族类似APP和APLP1的APP同源蛋白)，APPN262(人为产生的C末端缩短形式的APP，由APP的N末端的262个残基组成)，和由C末端依次除去各个结构域而进一步人为产生的APP形式的铜结合肽，APP和APLP2的携带铜结合位点的变体及其片段，与不同浓度的Zn(II)接触。应用的Zn2+浓度为10μM，50μM，100μM和200μM。之后，研究Zn(II)的浓度对Aβ肽释放的抑制作用。为此进行以下试验：
(1)将用人APP695稳定转染CHO细胞，在含有上述浓度Zn(II)(在PBS中10-200μM)的MEM培养基中温育。将CHO细胞与铜离子(在PBS中10-50μM)或不加入任何物质温育作对照。用多克隆和单克隆抗体定量及定性确定Aβ(总量)，Aβ40和Aβ42的产生。如下所述用35S甲硫氨酸的生物合成标记法检测APP，Aβ和p3。将如上所述与各物质温育的稳定转染的CHO细胞，与220μCi的35S甲硫氨酸温育4小时。收获条件培养基和细胞并将溶解的蛋白质用于免疫沉淀。先用BioRad公司的蛋白质检测试剂盒确定蛋白质的浓度，通过闪烁计数确定掺入的放射活性。细胞在提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，2％ tritonX-100，2％NP40，1mM PSMF，10μg/ml抑蛋白酶肽和10μg/ml亮抑蛋白酶肽)中裂解。在13000×g离心10分钟除去细胞碎片，将上清调整为25mM Tris-HCl，pH8.5，1mM PSMF，10μg/ml抑蛋白酶肽和10μg/ml亮抑蛋白酶肽，0.5％triton X-100，0.5％NP40。蛋白质溶液用100mM Tris-HCl，pH7.5，300mM NaCl，和4mM EDTA以1∶2浓度稀释。将上清与上述多克隆APP和Aβ抗体在4℃温育过夜，用蛋白A琼脂糖凝胶分离形成的免疫复合物，并根据Ida等，生物化学杂志271，p22908-22914所述方法分析。
结果表明在50μM Zn(H)浓度，Aβ产生明显降低。Zn(II)浓度高于50μM时，APP在CHO-K1细胞和CUR3细胞中的分泌均较低，Aβ在CUR3细胞中的产量，在50μM Zn(II)浓度时降低60％(K1：20％)，在100μM Zn(II)浓度时降低90％(K1：30％)，在200μM Zn(II)浓度降低99％(K1：60％)。在Ca(II)浓度高于200μM的情况下，Aβ产量无进一步降低，检测限已至此。
(2)从转基因小鼠分离初级神经元，并如(1)所述确定其Aβ产量，此转基因小鼠表达具有人序列的Aβ肽。
(3)将上述浓度的PBS中的Zn(II)经口服，静脉内(i.v.)，腹膜内(i.p.)，皮下(s.c.)，和i.c.应用于转基因小鼠(见(2))，并如(1)所述在CNS和血液(取自尾静脉)中确定Aβ产量。将得自小鼠尾静脉的血清(150-200μL)用PBS缓冲液配成500μL体积，并用5μg单克隆抗体WO-2(Ida等，如前)和20μL的1∶1蛋白G琼脂糖悬浮液，在4℃在架空摇床中温育过夜。然后将所得上清与抗APP的多克隆抗体(22734/6)温育，并如(1)所述分析免疫复合物。通过12％双麦黄酮Novex凝胶，根据生产商的指导分离Aβ免疫复合物，在将蛋白质移至硝酸纤维素滤膜(380mA，4℃，40分钟)之后，根据Ida等的ECL方法，用单克隆抗体WO-2分析相关的分子量范围。结果也表明在50μM Zn(II)浓度，Aβ产量降低。

Claims (7)

1.一种鉴别作为铜激动剂的化合物的方法，所述作为铜激动剂的化合物结合APP的铜结合位点并发挥抑制淀粉样Aβ肽释放的作用，该方法特征在于以下步骤：
(a)将APP或其携带铜结合位点的片段，与各种浓度的潜在具有上述作用的化合物接触，
(b)检测在表达淀粉样Aβ肽的哺乳动物中Aβ蛋白的减少，或者
(a)将APP或其携带铜结合位点的片段，与溶解的或固定化的有机化合物的集合接触，
(b)当使用溶解的有机化合物的集合时，用特异于APP或其片段的抗体从溶液中免疫沉淀竞争性或非竞争性铜结合位点/配体复合物；或者当使用固定化的有机化合物的集合时，通过加入铜盐从铜结合位点/配体复合物中释放配体，
(c)鉴别配体，及
(d)选择在与APP的铜结合位点结合之后，发挥抑制淀粉样Aβ肽释放的作用的配体。
2.权利要求1的方法，其中Aβ蛋白的减少是通过ELISA或免疫沉淀从细胞培养系统中检测的。
3.权利要求1的方法，其中(d)步骤包括将得自(a)至(c)步骤的配体与用APP695稳定转染的哺乳动物细胞温育，并用多克隆或单克隆抗体确定淀粉样Aβ肽的产生。
4.权利要求1的方法，其中(d)步骤包括将得自(a)至(c)步骤的配体施用于表达人淀粉样Aβ肽的转基因哺乳动物中，收集CNS或血液样品，并用多克隆或单克隆抗体确定淀粉样Aβ肽的产生。
5.权利要求1的方法，其中(d)步骤在(c)步骤之前进行。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中在步骤(a)中与APP或其片段结合的所述化合物选自Mg(II)、Ca(II)、寡肽、寡核苷酸和寡糖。
7.由权利要求1至5中任一项的方法鉴别的、作为结合APP的铜结合位点并发挥抑制淀粉样Aβ肽释放的作用的铜激动剂的化合物在制备预防或治疗阿耳茨海默氏病的药物中的应用，其中所述化合物是Zn(II)。
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