CN113801818B - 一种芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌及其应用，芽孢杆菌为短小芽孢杆菌PSB25，保藏编号为CCTCC NO：M2020851，16SrRNA基因序列为：SEQ ID NO:1。短小芽孢杆菌PSB25可以促进玉米植株生长，提高玉米根数、根长、株高、叶片数量和叶面积，抑制植物病原菌，提升植株中磷含量，在提高烟叶磷含量及其植株的生长中具有较好的应用前景。

Description

一种芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种芽孢杆菌及其应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，除可作为卷烟的原料之外，其所含的大量的天然化学物质，如烟碱、蛋白质、茄尼醇、尼古丁，都是优质的化工和医药原料。挖掘适宜烟草栽培的微生物菌剂可有效提高烟叶的产量和品质。磷和作物的光合作用密切相关，在光合作用中形成的化合物过程都有磷参与，蔗糖和淀粉的合成也都有磷参加，烟草中的烟碱及油分等物质的合成也缺少不了磷。因此，烟区土壤中磷、钾元素含量及供应情况对烟草的生长、产量及品质有很大的影响，而有效养分的缺乏严重制约着烟草产业的发展。

磷元素是植物生长所必需的三大营养要素之一，我国有75％的土壤缺磷，特别是北方石灰性土壤，虽然全磷含量很高，均在0.57-0.79g/kg之间，但由于土壤中存在大量的游离碳酸钙，大部分磷以难溶性的磷酸钙盐存在，能被作物吸收利用的有效磷含量很低，土壤中95％的磷为无效形式，大部分与土壤中Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺结合形成难溶性磷酸盐。因此，如何开发和有效利用这部分被土壤固定的磷是目前我国农业生产中急需要解决的问题。

解磷微生物是能将土壤中难溶性化合态磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能类群，在转化土壤难溶性磷、提高土壤中有效磷含量、磷肥利用率及促进作物生长等方面具有显著作用。某些植物根际促生细菌可分泌有机酸溶解难溶性无机磷酸盐，或分泌胞外磷酸酶将难溶性的磷酸脂等有机磷消解，释放出生物有效磷，提高土壤中可溶性磷的含量，促进植物生长。

上述背景技术是为了便于理解本申请，并非是申请本申请之前已向普通公众公开的公知技术。

发明内容

基于上述问题，一方面，本发明提供一种芽孢杆菌，芽孢杆菌菌株可以有效分解有机无机磷，促进植物的生长，抑制植物病原菌。

本申请的芽孢杆菌命名为短小芽孢杆菌PSB25，菌株已于2020年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M2020851。

本申请的短小芽孢杆菌PSB25菌株16S rRNA序列为：SEQ ID NO:1。

本申请的短小芽孢杆菌PSB25微生物学特性为：菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性，具有溶磷、解钾、产IAA的特性，以及具有植物病害生物防治的特性。

一方面，本申请还提供一种菌剂。

一种菌剂，该菌剂含有上述的短小芽孢杆菌PSB25。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，上述的菌剂应用于植物生长或植物繁殖。

一方面，本申请还提供一种肥料。

一种肥料，含有上述的短小芽孢杆菌。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，上述的肥料应用于玉米、水稻、小麦或烟草种植。

一方面，本申请还提供一种植物生长剂。

一种促进植物生长的植物生长剂，含有上述的短小芽孢杆菌PSB25。

一方面，本申请还提供一种药物。

一种药物，含有上述的短小芽孢杆菌PSB25。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，上述的药物应用于植物生长或植物繁殖。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，上述的药物应用于晚疫病菌、青枯菌和稻瘟菌引起的植物病害。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，上述的药物应用于抑制金黄色葡萄球菌。

一方面，本申请还提供一种后代、突变体及衍生物。

一种上述的短小芽孢杆菌PSB25的后代、突变体及衍生物。

一方面，本申请还提供一种上述的短小芽孢杆菌PSB25的制备方法。

一种制备上述的短小芽孢杆菌PSB25的方法，包括以下步骤：

⑴烟草植株选择

采集多株生长良好的烟叶植株烟草根部，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，冷冻保存；

⑵烟草溶磷内生细菌的分离

配置无机磷培养基和有机磷培养基，将烟草根部样品表面灭菌后辗碎，研磨液涂抹于无机磷培养基和有机磷培养基平板上，30℃恒温培养4-5天，选取具有水解圈的菌株进行划线纯化；

⑶将菌株点接于相应的无机磷培养基及有机磷培养基平板上，培养，观察透明圈情况，并测量菌落直径d和透明圈直径D，根据D/d值大小来确定其解磷能力。

在本申请的一个或多个具体的实施方式中，烟草植株选自四川省凉山州普格县普基镇。

发明原理及有益效果：

本申请的短小芽孢杆菌PSB25有机磷溶解量高，有效磷含量为176.56mg/L，解钾量为4.94mg/L，IAA产量为308.84mg/L，能促进植物生长。同时对作物晚疫病菌病菌、枯萎病菌、青枯菌、金黄色葡萄球菌有拮抗效果。该菌株作为作物，尤其是烟的生物制剂材料，无论开发新的生物防治菌剂，或者生长调节剂都具有很好的应用价值。

本申请菌株PSB25可以促进植物的生长，抑制植物病原菌，提高植株的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积。

本申请的PSB25菌株可以促进玉米植株生长，提高玉米根数、根长、株高、叶片数量和叶面积，抑制植物病原菌，提升植株中磷含量，在提高烟叶磷含量及其植株的生长中具有较好的应用前景。

附图说明

图1是部分解磷菌平板解磷效果图；

图2是本发明基于烟草内生菌PSB25 16S rRNA基因的系统发育树图谱；

图3是平板抑菌实验图；

图4是PSB25生化特征图；

图5是PSB25处理玉米植株生长状况图，其中CK为不接种的玉米，25为接种PSB25的玉米。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1短小芽孢杆菌PSB25的分离与鉴定

1.1烟草植株选择

本实施例烟草根部采自四川省凉山州普格县普基镇。随机采集多株生长良好的烟叶植株，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，于冰盒中及时带回实验室，置于4℃冰箱保存。

1.2烟草溶磷内生细菌的分离

配置无机磷培养基和有机磷培养基。将5g冰箱(4℃)保存烟草根系样品表面灭菌后转移至无菌研钵中充分辗碎后，研磨液涂抹于无机磷培养基和有机磷培养基平板上，30℃恒温培养4-5天，选取具有水解圈的菌株(图1，表1)进行划线纯化，具有水解圈的菌株有17株。

进一步将这17株菌株点接于相应的无机磷培养基及有机磷培养基平板上，培养7d，观察水解圈情况，并测量菌落直径(d)和透明圈直径(D)，根据D/d值大小来确定其解磷能力(表1)。

表1 17株分离菌株的编号及其解磷能力初筛

1.3短小芽孢杆菌PSB25的鉴定

从烟草根部分离得到的内生菌PSB25，菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性。琼脂糖凝胶电泳结果显示，该菌株16S rRNA基因扩增片段大小约为1300bp，测得的序列如SEQ ID No.1所示。

系统发育分析显示菌株PSB25与NCBI已收录的短小芽孢杆菌MF062630和MF187639同源性均为100％(图2)，基于该菌的理化性质和16S rRNA基因系统发育树，可以确定该菌为短小芽孢杆菌。

基于以上特征，将菌株PSB25鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus PSB25)。该菌株已于2020年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M2020851。

实施例2内生细菌产吲哚乙酸(IAA)测定

将上述分离得到的17株菌培养到对数期，取菌液50μl于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中(约3mL)中(指每一菌液对应一含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基)，重复3次，28℃140r/min振荡培养1.5天，取50μl于洗净的白瓷板中，加100μL显色剂，25℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基为对照。

将产吲哚乙酸的内生细菌继续在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中培养24-48h后，8000r/min离心5min，取上清液2ml加入4ml Salkowski显色剂，25℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表2。

表2烟草根际可培养内生解磷菌产IAA能力

结果显示，分离的17株烟草内生菌的IAA产量在100mg/L及以上的有4株，其中PSB25菌株IAA产量最高，为308.8mg/L。

实施例3解钾能力测定

对解磷菌株的解钾促生能力测定，结果进行显示17株解磷菌株的解钾效果都很显著(表3)，解钾率均在0.20％～0.29％之间，其中PSB219和154解钾率都在0.25％以上，分别是0.27％和0.29％。

表3解磷菌解钾能力测定

实施例4短小芽孢杆菌PSB25的抗菌活性测定

综合解磷、解钾及产IAA能力试验数据，进一步分析了PSB25的抗菌活性试验。采用平板对峙法测定分离菌株对晚疫病菌、稻瘟病菌的抑菌作用。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株(表4)。通过空白药敏片法测定分离菌株对大肠杆菌、青枯菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用(图3)。

表4烟草根部内生细菌抗病原菌能力

注：HD/CD值介于3-4；++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1–2；-：HD/CD值小于1。

结果显示，PSB25株对晚疫病菌病菌、稻瘟病菌病菌、青枯菌和葡萄球菌均有较好的拮抗效果。

实施例5短小芽孢杆菌PSB25的生化特征测定

进一步测定PSB25在不同发酵条件下的生长情况，结果显示(图4)在所选的碳氮源中，有机碳氮源中短小芽孢杆菌PSB25生长更好，其中最佳的碳氮源分别为玉米粉和蛋白胨。pH5-8范围内均有较好的生长，在NaCl浓度高于7，生长受到抑制，最适生长温度为25℃左右。

实施例6玉米盆栽应用

利用本实验前期从烟草根部分离筛选获得的具有抗病促生功能的内生解磷细菌PSB25活化(LB固体培养基，25℃，培养2d)后接种于LB肉汤培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养36h后，作为种子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养36h使其活菌数达到10亿以上，制成菌悬液备用。

供试玉米种子用0.4％次氯酸钠表面灭菌，然后用无菌水清洗4次除去次氯酸钠，无菌水浸种，30℃温箱培养过夜，后转入灭菌纱布催芽，将长势均一的玉米种子每盆五粒均匀的种在9个花盆中，各装入2kg土壤(有效磷含量7.95mg/kg)，采用浇灌的方式将100ml的PSB25菌剂接种于烟草根部。每一个月重复加一次菌悬液，总共浇灌4次，以无菌水作对照(CK)，放于光照培养室培养至出苗，后转至室外，定期进行浇水管理，45d后收获植株样。测定植株生长情况(如玉米株高、烟草叶片总数、茎粗、鲜重、干重)，结果见图5和表5。

表5

注：其中CK为不接种的玉米。

从图5和表5可以看出，接种PSB25菌剂的烟草与空白对照相比，烟草的植株高度、茎粗、干鲜重、叶片数都出现了一定程度的增加。说明本专利所得短小芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PSB25对玉米植株有明显促生作用。接种PSB25菌剂的烟草植株全磷含量较对照也有所增加，说明本专利所得短小芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PSB25可促进植株磷含量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省烟草公司凉山州公司

<120> 一种芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

TCGTCGCGGC TATAATGCAG TCGAGCGGAC AGAAGGGAGC TTGCTCCCGG ATGTTAGCGG 60

CGGACGGGTG AGTAACACGT GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC 120

GGAGCTAATA CCGGATAGTT CCTTGAACCG CATGGTTCAA GGATGAAAGA CGGTTTCGGC 180

TGTCACTTAC AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG 240

GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC 300

AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC 360

AACGCCGCGT GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA 420

GTGCAAGAGT AACTGCTTGC ACCTTGACGG TACCTAACCA GAAAGCCACG GCTAACTACG 480

TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGTGGC AAGCGTTGTC CGGAATTATT GGGCGTAAAG 540

GGCTCGCAGG CGGTTTCTTA AGTCTGATGT GAAAGCCCCC GGCTCAACCG GGGAGGGTCA 600

TTGGAAACTG GGAAACTTGA GTGCAGAAGA GGAGAGTGGA ATTCCACGTG TAGCGGTGAA 660

ATGCGTAGAG ATGTGGAGGA ACACCAGTGG CGAAGGCGAC TCTCTGGTCT GTAACTGACG 720

CTGAGGAGCG AAAGCGTGGG GAGCGAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA 780

ACGATGAGTG CTAAGTGTTA GGGGGTTTCC GCCCCTTAGT GCTGCAGCTA ACGCATTAAG 840

CACTCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAC TGAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC 900

ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA AGCAACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA 960

CATCCTCTGA CAACCCTAGA GATAGGGCTT TCCCTTCGGG GACAGAGTGA CAGGTGGTGC 1020

ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1080

TTGATCTTAG TTGCCAGCAT TCAGTTGGGC ACTCTAAGGT GACTGCCGGT GACAAACCGG 1140

AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAATCATCAT GCCCCTTATG ACCTGGGCTA CACACGTGCT 1200

ACAATGGACA GAACAAAGGG CTGCGAGACC GCAAGGTTTA GCCAATCCCA CAAATCTGTT 1260

CTCAGTTCGG ATCGCAGTCT GCAACTCGAC TGCGTGAAGC TGGAATCGCT AGTAATCGCG 1320

GATCAGCATG CCGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC ACACCGCCCG TCACACCACG 1380

AGAGTTTGCA ACACCCGAAG TCGGTGAGGT AACCTTTATG AGCCAGCCGC CGAAGTGACA 1440

GAGTCA 1446

Claims (9)

1. 一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）PSB25，保藏编号为CCTCC NO：M2020851。

2. 一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）PSB25。

3.权利要求2所述的菌剂应用于植物生长，所述植物为玉米。

4. 含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）PSB25的肥料。

5.权利要求4所述的肥料应用于玉米种植。

6. 含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）PSB25的促进植物生长的植物生长剂，所述植物为玉米。

7. 含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）PSB25的药物。

8.权利要求7所述的药物应用于植物生长，所述植物为玉米。

9.权利要求7所述的药物应用于晚疫病菌、青枯菌和稻瘟菌引起的植物病害。

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