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CN119162055A - 一株副地衣芽孢杆菌nj102及其应用 - Google Patents

一株副地衣芽孢杆菌nj102及其应用 Download PDF

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CN119162055A
CN119162055A CN202411584329.7A CN202411584329A CN119162055A CN 119162055 A CN119162055 A CN 119162055A CN 202411584329 A CN202411584329 A CN 202411584329A CN 119162055 A CN119162055 A CN 119162055A
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bacillus
bacterial
strain
application
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CN202411584329.7A
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高学文
梁晓丽
伍辉军
顾沁
龙菊英
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Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一株副地衣芽孢杆菌NJ102及其应用，属于微生物技术领域。本发明的副地衣芽孢杆菌NJ102具有耐低温、耐盐碱的能力，可以忍耐10℃的低温，含盐量为17％的盐胁迫以及pH为12.5的强碱胁迫。同时，对青枯雷尔氏菌、立枯丝核菌和辣椒疫霉有较好的抑制效果，能够有效防治番茄青枯病、根腐病和果腐病。本发明的副地衣芽孢杆菌还具有较强的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶以及IAA的能力，并且对番茄有较好的促生效果，在生物农药方面具有极大的应用潜力。

Description

一株副地衣芽孢杆菌NJ102及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株副地衣芽孢杆菌NJ102及其应用。
背景技术
众所周知，传统的化学农药存在安全性低、残留量大，毒素难以降解等问题，不合理的使用往往会造成水体、土壤、大气污染和农产品中有毒物质残留，严重危及生态系统和人类健康，已成为制约人类环境治理、健康生存、农业稳步增长和可持续发展的重要因素。目前，世界各国均重视开发安全性高、残留量低、无公害、生物活性高、选择性强的生物农药，以替代目前广泛使用的化学农药或减少化学农药的使用量。
目前，新鉴定的未知微生物大多分离于普通生境，新菌种类日渐减少。由于南极的地理环境具有独特的地质及气候特征，形成低温、高盐、强辐射等自然环境，造就了极地微生物在基因组成、酶学特性以及代谢调控等方面独特的分子生物学机制与生理生化特性，是世界上结构新颖、功能独特的化学物质的发源地。极地微生物在生物农药应用上具有极大的潜力。因此从极地微生物中发现不同种类的菌株应用于植物病害的生物防治，对极地微生物资源的开发利用具有重要的意义。但从南极分离出来的耐低温、耐盐碱的多功能生防菌株未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株副地衣芽孢杆菌NJ102及其应用，所述副地衣芽孢杆菌NJ102分离于南极长城站地震台附近的企鹅聚居地土壤中，能够耐低温、耐盐碱，并且能够抑制多种病原菌和番茄病害，解决了现有技术中从普通生境中分离出来的菌株功能单一的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株副地衣芽孢杆菌NJ102，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.31983，保藏日期为2024年9月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了所述副地衣芽孢杆菌NJ102的菌液的制备方法，将所述副地衣芽孢杆菌NJ102接种至发酵培养基中进行发酵培养，得所述菌液。
优选的，所述发酵培养的温度为28～32℃，所述发酵培养的转速为180～220rpm，所述发酵培养的时间为22～26h。
本发明还提供了所述副地衣芽孢杆菌NJ102在如下(1)～(6)中的全部或部分中的应用：
(1)在抑制病原卵菌、病原细菌和病原真菌中的应用；
(2)在抑制番茄病害中的应用；
(3)在重度盐碱地中促进番茄生长中的应用；
(4)在分解蛋白质、纤维素或淀粉中的应用；
(5)在制备重度盐碱地土壤上番茄生长促进剂中的应用；
(6)在制备分解蛋白质、纤维素或淀粉的菌剂中的应用。
优选的，所述病原卵菌包括辣椒疫霉；所述病原细菌包括青枯雷尔氏菌和丁香假单胞菌；所述病原真菌包括灰葡萄孢、立枯丝核菌和茄镰刀菌。
优选的，所述番茄病害包括青枯病、根腐病和果腐病。
优选的，所述微生物菌剂包含权利要求1所述菌株的菌悬液。
优选的，所述菌悬液中的芽孢浓度为1～9×107CFU/mL。
本发明还提供了一种在重度盐碱地中促进番茄生长的方法，用所述的菌剂对番茄植株进行灌根处理。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明的副地衣芽孢杆菌NJ102具有耐低温、耐盐碱的能力，可以忍耐10℃的低温，含盐量为17％的盐胁迫以及pH为12.5的强碱胁迫。同时，对青枯雷尔氏菌、立枯丝核菌和辣椒疫霉有较好的抑制效果，能够有效防治番茄青枯病、根腐病和果腐病。本发明的副地衣芽孢杆菌还具有较强的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的能力，同时还能产生IAA，对番茄有较好的促生效果。本发明的副地衣芽孢杆菌NJ102具有耐低温、耐盐碱、防治多种病原菌、产多种酶的能力，并且对番茄有较好的促生效果，在生物农药方面具有极大的应用潜力。
附图说明
图1为副地衣芽孢杆菌NJ102的系统进化树。
图2为副地衣芽孢杆菌NJ102对病原菌的抑制效果图，其中A为青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、B为丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、C为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、D为辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、E为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
图3为副地衣芽孢杆菌NJ102耐低温胁迫能力测定结果图，其中，左边为菌株在10℃的生长情况图；右边为菌株在7℃的生长情况图。
图4为副地衣芽孢杆菌NJ102耐盐胁迫能力测定结果图，其中，A-C分别为副地衣芽孢杆菌NJ102与模式菌株FZB42、168、DMW1耐盐(11％、15％、17％)平板表型结果图。
图5为副地衣芽孢杆菌NJ102耐碱胁迫能力测定，其中，A-F：副地衣芽孢杆菌NJ102、FZB42、168、DMW1耐碱(pH＝8、9、10、11、12、12.5)平板表型结果图。
图6为副地衣芽孢杆菌NJ102次级代谢产物的HPLC-MS鉴定结果图。
图7为副地衣芽孢杆菌NJ102次级代谢产物粗提物抑菌效果图，其中，A为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、B为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、C为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、D为辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、E为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
图8为副地衣芽孢杆菌NJ102产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶以及吲哚乙酸(IAA)的检测结果图，其中，A为蛋白酶、B为纤维素酶、C为淀粉酶、D为吲哚乙酸。
图9为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株上青枯侵染的防病效果图。
图10为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株上辣椒疫霉(P.capsici)侵染的防病效果图。
图11为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实辣椒疫霉(P.capsici)侵染的防病效果图。
图12为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实茄镰刀菌(F.solani)侵染的防病效果图。
图13为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄种子萌发的促进作用效果图。
图14为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株生长的影响图，其中，A为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄株高和根长的影响；B-I分别为副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄的株高、根长、叶绿素含量的产生、茎粗、地上部分鲜重、地上部分干重、根鲜重及根干重的统计图。
图15为盐胁迫环境下副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株生长的影响，其中，A为副地衣芽孢杆菌NJ102在盐胁迫环境下对番茄株高和根长的影响；B-I为副地衣芽孢杆菌NJ102在盐胁迫环境下对番茄的株高、根长、叶绿素含量的产生、茎粗、地上部分鲜重、地上部分干重、根鲜重及根干重的统计图。
生物保藏说明
本发明提供的副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)NJ102，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31983，保藏日期为2024年9月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1.基于核心基因组的副地衣孢杆菌NJ102的分类地位分析
将NJ102菌株接种于液体LB培养基，在200rpm，37℃摇培12小时，离心收集菌体，选用细菌提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)提取基因组DNA，后用正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.3)和反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.4)，对16SrDNA基因进行PCR扩增，PCR条件为：95℃，5min；95℃，15s；56℃，1min；72℃，1min；32cycle；72℃，10min，4℃保存。凝胶电泳观察16SrRNA片段扩增情况后以PCR原液送测序。16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
16SrDNA基因序列:
CAGCATGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACCGATCGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATTATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAGGGG(SEQ ID No.1)。
gyrB基因的PCR扩增和序列测定
正向引物gyrB-F:
5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’
(SEQ ID No.5)；
反向引物gyrB-R:
5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’
(SEQ ID No.6)，gyrB基因PCR反应条件同上。gyrB部分基因序列长度约为1186bp，其结果如序列表SEQ ID No.2所示。
gyrB基因序列:
ACCCGGTAAGCGGATTTAAGTTTCAGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGCTTCTGTTGTTAACGCCCTTTCAACCGAGCTCGATGTAACGGTTTACAGAGATGGAAAAGTCCATTATCAGGAATTTGAACGGGGCGTTCCGAAAGCTGATCTGAAAGTCATCGGAGAGACGGAAGTGACGGGAACGACCACTCACTTCAAGCCTGATCCGGAAATATTCACGGAAACGACTGAATACGACTATGATACACTTGCCACTCGTGTCCGGGAGCTCGCTTTCTTGACAAAAGGCGTCAAAATCACGATCGAAGATAAACGAGATGGAAAAGAACGCAAGAATGAATACTGCTATGAAGGCGGTATTAAAAGCTATGTTGAACATTTGAACCGTTCGCGGGAAGTTGTTCATGAAGAGCCGGTCTACATTGAAGGATCCAAAGACGGCATTACCGTCGAGGTGGCGCTTCAATACAACGACAGCTATACCAGCAACATTTATTCATTTGCCAACAACATTCATACGTATGAAGGCGGAACGCATGAAGCCGGCTTTAAGACCGGTTTGACGAGGGTCATCAATGATTACGCGAGAAGGAACGGCGTATTCAAAGAAAGCGATCCAAACTTAAGCGGGGAAGACGTCCGAGAAGGGTTGACAGCGATCATTTCAATCAAGCACCCGGATCCTCAATTTGAAGGTCAGACGAAAACAAAGCTTGGCAACTCAGAAGCGCGTACGATAACAGATGCGCTATTTTCAGAAGCGCTCGAAAAATTTCTGCTTGAAAACCCGGATTCAGCGAAAAAAATCGTTGAAAAAGGGGTTATGGCTGCCAGAGCACGAATGGCTGCAAAGAAAGCGCGCGAATTGACGCGCAGAAAAAGCGCCCTTGAAGTGTCAAATCTGCCAGGGAAACTGGCTGACTGTTCTTCTAAAGACCCGACGATTTCCGAACTTTACATCGTTGAGGGTGACTCTGCGGGCGGATCGGCAAAACAGGGCCGCGATCGTCATTTCCAAGCCATTTTGCCTTTGAGAGGGAAAATCTTGAACGTCGAAAAAGCACGCCTGGACAAAATTTTGTCCAACAATGAGGTTCGTTCTATGATCACCGCACTTGGCACCGGAATCGGGGAAGATTTCAATCTTGAAAAAGCCCGCTACCCAGTGTCAGTCGGTAGCATCCAG(SEQ ID No.2)。
16S rDNA和gyrB鉴定结果显示，菌株NJ102属于副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis)。其次，根据NJ102的基因组序列，基于所有样本的31个看家基因，选择在种属水平上最接近的19株菌，通过MEGA6.0软件选择法构建系统进化树。结果发现，菌株NJ102与副地衣芽胞杆菌之间的进化距离最为相近。以上结果表明，南极菌株NJ102属于副地衣芽胞杆菌。
实施例2副地衣芽孢杆菌NJ102的抑菌能力测定
对副地衣芽孢杆菌NJ102的抑菌能力进行初步测定，挑选几个具有代表性的病原细菌、病原真菌，其中，病原细菌包括：青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、病原真菌包括：灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)。
副地衣芽孢杆菌NJ102对病原细菌的抑菌能力测定：首先活化病原细菌。挑取病原细菌的单菌落至20mL相应的培养液内，30℃、200rpm过夜培养。加热LB或NA固体培养基，晾凉至与人体体温一致时，将菌液按1％的添加量加至培养基中，充分混匀后倒含菌板。在凝固的含菌板上距离中心位置2.5cm处滴加5μL副地衣芽孢杆菌NJ102的菌液(OD600＝2.0)，LB培养液作为对照处理，充分晾干后倒置于30℃恒温培养箱中，24h后观察抑菌效果，测量透明抑菌圈的直径。
副地衣芽孢杆菌NJ102对病原真菌的抑菌能力测定：从原始的病原真菌的培养板上，用直径约为0.5cm的无菌打孔器在菌落最外缘打取一定数量的菌饼，然后将菌饼(含有菌丝的一面)转接在新的PDA培养板的正中央，于适宜温度的培养箱内培养10-18h，待菌饼周围长出新的菌丝即可备用。之后在离菌饼相同距离的位置放置灭菌滤纸片，在滤纸片的中央滴加5μL副地衣芽孢杆菌NJ102的菌液(OD600＝2.0)，LB培养液作空白对照，吹干后放回25℃培养箱，48h后观察抑菌效果，结果如图2所示。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102对多种植物病原真菌、细菌有较好的拮抗效果，其中，对青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的抑制效果最好。
实施例3副地衣芽孢杆菌NJ102的耐低温、耐盐、耐碱能力测定
南极为极地冻土环境，在其环境存活下来并能够正常生长繁殖的芽胞杆菌可能具有较强的抗逆境胁迫能力，因此，对副地衣芽孢杆菌NJ102进行耐受逆境能力测定。
1.耐受低温胁迫能力测定
模拟不同的低温胁迫(温度梯度：10℃、7℃)，测定副地衣芽孢杆菌NJ102、模式菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)FZB42和贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DMW1抵抗低温胁迫的能力。将副地衣芽孢杆菌NJ102和模式菌168、FZB42和DMW1分别接种于LB液体培养基中，200r/min、37℃培养24h。待菌液浓度为OD600＝2.0时，转接5μL菌液滴加于LB固体培养基上，分别于10℃、7℃培养箱中生长5d，并观察供试菌株在不同温度下的生长情况，生物学重复3次，结果如图3所示。实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102可以在最低温度为10℃生长，而模式菌株FZB42、168和DMW1几乎不能生长。对于能够在4℃或者10℃环境下生长的芽胞杆菌，称之为低温适生芽胞杆菌。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102具有良好的耐低温能力，属于低温适生芽胞杆菌。
2.耐受盐胁迫能力测定
模拟不同的盐胁迫(盐梯度：11％、15％、17％NaCl浓度)，测定副地衣芽孢杆菌NJ102、模式菌株168、FZB42和DMW1抵抗盐胁迫的能力。挑取供试菌株的单菌落至LB液体培养基中，置于37℃、200r/min摇床过夜培养24h，待菌液浓度为OD600＝2.0时，转接5μL菌液至不同盐梯度(11％、15％、17％)的LB固体培养基中，后将培养基放入37℃培养箱中，5d后观察不同盐梯度下，各菌株的菌落生长状况，生物学重复3次，结果如图4所示。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102能够在含盐量为17％的盐胁迫条件下生长，而模式菌株FZB42只能耐受11％NaCl的盐胁迫，其耐盐胁迫的能力均高于模式菌株FZB42。
3.耐受碱胁迫能力测定
模拟不同的碱胁迫(pH梯度：8、9、10、11、12、12.5)，分别测定副地衣芽孢杆菌NJ102、模式菌株168、FZB42和DMW1抵抗碱胁迫的能力。挑取供试菌株的单菌落至LB液体培养基中，置于37℃、200r/min摇床过夜培养24h，待菌液浓度为OD600＝2.0时，转接5μL菌液至不同碱梯度(pH为8、9、10、11、12、12.5)的LB固体培养基中，后将培养基放入37℃培养箱中，5d后观察不同盐梯度下，各菌株的菌落生长状况，生物学重复3次，结果如图5所示。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102能够在pH为12.5的强碱胁迫条件下生长，其耐碱胁迫的能力均高于模式菌株FZB42。
实施例4副地衣芽孢杆菌NJ102次级代谢产物的提取、鉴定及活性测定
1.副地衣芽孢杆菌NJ102次级代谢产物的提取与鉴定
在LB固体培养基上活化副地衣芽孢杆菌NJ102，置于37℃培养箱中直至长出单菌落；挑取NJ102单菌落至20mLLB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；次日，按1％的比例转接五个副地衣芽孢杆菌NJ102菌液至200mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养24h；在NJ102菌液中各加入5mL树脂(XAD-16N)，继续震荡培养24h；次日，将菌液于8000rpm离心10min，收集菌体；用30mL甲醇溶解菌体，随后将菌悬液继续置于37℃，200rpm震荡培养4h，将菌悬液于8000rpm离心10min，收集上清并用滤纸过滤，利用旋转蒸发仪将浓缩上清液至2mL，随后利用0.22μm的有机滤器过滤粗提物，利用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)进行鉴定检测脂肽类物质的产生情况结果如图6所示。从鉴定结果可以看出，NJ102的次级代谢产物中含伊枯草菌素(iturin)和表面活性素(surfactin)。
2.副地衣芽孢杆菌NJ102次级代谢产物的抑菌能力测定
用副地衣芽孢杆菌NJ102产生的次级代谢产物粗提物对(A)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、(B)丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、(C)灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、(D)辣椒疫霉(Phytophthora capsici)及(E)立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)进行平板对峙实验，从原始的病原真菌的培养板上，用直径约为0.5cm的无菌打孔器在菌落最外缘打取一定数量的菌饼，然后将菌饼(含有菌丝的一面)转接在新的PDA培养板的正中央，于适宜温度的培养箱内培养10-18h，待菌饼周围长出新的菌丝即可备用。之后在离菌饼相同距离的位置，用直径0.5cm无菌打孔器打孔，在孔中央滴加50μL的副地衣芽孢杆菌NJ102的次生代谢产物，甲醇溶液作对照，吹干后放回培养箱，48h后观察抑菌效果，结果如图7所示。
平板对峙实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102的次生代谢产物对多种植物病原真菌、细菌有较好的拮抗效果，其中，对青枯雷尔氏菌(R.solanacearum)、立枯丝核菌(R.solani)和灰葡萄孢菌(B.cinerea)的抑制效果最佳。
3.副地衣芽孢杆菌NJ102产胞外水解酶的能力测定
通过平板测定法检测副地衣芽孢杆菌NJ102产胞外水解酶的能力，在脱脂牛奶琼脂板上进行副地衣芽孢杆菌NJ102产蛋白酶的定性检测：在含脱脂奶粉的琼脂培养基(20g脱脂奶粉、20g琼脂，pH＝7.0，115℃灭菌10min)中测定副地衣芽孢杆菌NJ102是否具有产蛋白酶的能力。挑取副地衣芽孢杆菌NJ102单菌落至LB液体培养基中，于37℃、200r/min，过夜培养12h；在培养基上滴加5μL(OD600＝1.0)的菌悬液，置于37℃恒温培养箱中培养，24-96h后观察菌落周围是否有透明圈形成。
利用CMC-Na培养基测定副地衣芽孢杆菌NJ102产纤维素酶能力：挑取副地衣芽孢杆菌NJ102单菌落至LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下过夜培养12h。在CMC-Na培养基平板上，呈“十”字形分别放置直径为4mm的灭菌滤纸圆片；吸取5μL菌悬液(OD600＝1.0)，接种于滤纸片中央，将平板封口，置于37℃恒温培养箱中培养；2d后，取出培养皿，注入革兰氏碘染液至淹没平板表面，静置4min后倒去染液，观测菌落周围是否形成透明圈，若菌体周围出现透明水解圈则说明该菌株能产生相应的酶，如果没有透明水解圈出现则说明不能产生该类酶。
淀粉琼脂培养基检测副地衣芽孢杆菌NJ102产淀粉酶的活性：挑取副地衣芽孢杆菌NJ102的菌落至LB液体培养基中，于37℃，200r/min，过夜培养12h，滴加5μL菌悬液(OD600＝1.0)至含淀粉的培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养；2d后，取出培养皿，注入革兰氏碘染液，淹没平板表面，静置4min后倒去染液，观测并记录实验结果，结果如图8所示。
结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102能够在CMC-Na培养基产生较大的透明水解圈，这说明其有很强的产纤维素酶能力。
4.副地衣芽孢杆菌NJ102产IAA能力测定
Salkowski比色液配制：称取0.81g的FeCl3溶于10mL的ddH2O中，使其充分溶解并混合均匀，作为0.5mol/L的母液备用。配制35％浓度的高氯酸溶液，然后按照1：50的比例加入0.5mol/L的FeCl3母液，混合均匀备用。
副地衣芽孢杆菌NJ102产吲哚乙酸(IAA)能力测定：首先用LB培养基在37℃，180rpm条件下摇菌，得到菌株母液。然后按照1％的含量将母液转接到含有100mg/L色氨酸的LB液体培养基中，于37℃，180rpm培养24h后取1mL菌液12000rpm离心取上清。向上清中加入等体积的Salkowski比色液，混合均匀后，在黑暗环境下反应30min，如若溶液变成红色则说明该菌能够产生IAA。以同等体积含100mg/L色氨酸的LB液体作为空白对照，结果如图8中的D所示。
结果显示，副地衣芽孢杆菌NJ102能够产生IAA，并且菌株NJ102产IAA能力强于模式菌FZB42，说明其在促进植物生长发育方面具有较大的潜力，有开发成生防制剂的潜能。
实施例5副地衣芽孢杆菌NJ102防治番茄病害能力测定
1.副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄青枯病的防治能力测定
将灭好菌的育苗基质装至50穴育秧盘，每穴放1颗生长状态相近番茄种子，以镊子使其根部朝下种植进土壤中，上覆薄土。28℃培养两周后，在秧盘每穴中保留生长一致的番茄幼苗各一株，使用350mL塑料杯进行移栽。28℃温室培养1个月后，选取生长状态相近的番茄幼苗开展防病实验。在LB固体培养基上活化副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42。用无菌牙签挑取单菌落置于20mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜摇培。次日，以1％进行转接，培养4-5h后，将菌液OD600调至0.5(107CFU/mL)备用。对番茄幼苗进行灌根处理，每个处理12株番茄幼苗，每个番茄幼苗灌10mL副地衣芽孢杆菌NJ102菌液，无菌水灌根作为对照，将番茄幼苗置于30℃温室中。7d后再次进行相同的灌根处理，同时进行伤根处理，每株番茄幼苗灌入10mL的OD600＝0.1的青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)菌液。5天后，观察番茄植株的发病情况，观察记录植株的发病情况并计算发病率，结果如图9和表1所示。
发病率(％)＝(发病株数/总株数)×100％
病害分级调查标准：
0:无萎蔫；
1:1％-25％叶面积萎蔫；
2:26％-50％叶面积萎蔫；
3:51％-75％叶面积萎蔫；
4:76％-100％叶面积萎蔫或死亡。
病情指数(％)＝[∑(病级数值×该病级植株数)/(最高级数×调查植株数)]×100。
防治效果＝(空白对照病情指数－处理病情指数)/空白对照病情指数x100％。
表1副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄青枯病的防治效果
注∶每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)
实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102番茄植株后均降低了番茄青枯病的发病率，其中，菌株NJ102处理的番茄发病率显著降低，为66.67％，比空白对照组降低了16.66％；菌株NJ102处理的番茄病情指数显著降低，NJ102番茄青枯病的防治效果为48.32％。
2.副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄根腐病的防治能力测定
将灭好菌的育苗基质装至50穴育秧盘，每穴放1颗生长状态相近番茄种子，以镊子使其根部朝下种植进土壤中，上覆薄土。25℃培养两周后，在秧盘每穴中保留生长一致的番茄幼苗各一株，使用350mL塑料杯进行移栽。25℃温室培养1个月后，选取生长状态相近的番茄幼苗开展防病实验。在LB固体培养基上活化副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42。用无菌牙签挑取单菌落置于20mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜摇培。次日，以1％进行转接，培养4-5h后，将菌液OD600调至0.5(107CFU/mL)备用。对番茄幼苗进行灌根处理，每个处理12株番茄幼苗，每个番茄幼苗灌10mL副地衣芽孢杆菌NJ102菌液，无菌水灌根作为对照。7d后再次进行相同的灌根处理，同时进行伤根处理，在每株番茄幼苗根际处接4个辣椒疫霉(Phytophthora capsici)菌碟，用辣椒疫霉病原菌进行侵染。5天后，观察番茄植株的发病情况，观察记录植株的发病情况并计算发病率，结果如图10和表2所示。
病害分级调查标准：
0:无萎蔫；
1:1％-25％叶面积萎蔫；
2:26％-50％叶面积萎蔫；
3:51％-75％叶面积萎蔫；
4:76％-100％叶面积萎蔫或死亡。
病情指数(％)＝[∑(病级数值×该病级植株数)/(最高级数×调查植株数)]×100。
防治效果＝(空白对照病情指数－处理病情指数)/空白对照病情指数×100％。
表2副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄根腐病的防治效果
注∶每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)
实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102处理番茄植株后均降低了番茄根腐病的发病率，副地衣芽孢杆菌NJ102处理的番茄发病率最低，为66.67％，比空白对照组降低了13.88％。副地衣芽孢杆菌NJ102处理的番茄根腐病病情指数显著降低，对番茄根腐病的防治效果最好，达到了40.75％。
3.副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实上辣椒疫霉的防病能力测定
在LB固体培养基上活化副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42。用无菌牙签挑取单菌落置于20mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜摇培。次日，以1％进行转接，培养4-5h后，将菌液OD600调至0.5(5×107CFU/mL)备用。在PDA平板上将保存的辣椒疫霉(Phytophthora capsici)进行活化，用枪头打取获得菌碟备用。利用75％无水乙醇对大小基本一致的番茄果实进行表面消毒处理。将消毒后的番茄果实倒置放在不同处理液中浸泡30min后取出，正置于有孔托盘中(底部有一层无菌水的托盘中)，自然晾干番茄表面的不同处理液，用无菌注射器在番茄果实顶部轻轻扎出1个孔隙，将打取的P.capsici菌碟紧密贴合番茄果实孔隙处，用脱脂棉包裹菌碟进行保水处理。用保鲜膜包裹，置于25℃温室中，4天后观察番茄果实发病情况并进行病害等级调查，病害分级调查标准如表3所示，结果如图11和表4所示。
表3辣椒疫霉病害分级调查标准
病情指数(％)＝[∑(病级数值×该病级植株数)/(最高级数×调查植株数)]×100。
防治效果＝(空白对照病情指数－处理病情指数)/空白对照病情指数×100％。
表4副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实上辣椒疫霉的防治效果
注∶每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)
实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102处理番茄植株后均抑制了P.capsici在番茄果实上的发病，菌株NJ102处理的番茄果实病情指数显著降低，其中，NJ102对番茄青枯病的防治效果达到了52.94％，高于模式菌株FZB42的防治效果。
4.副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实上茄镰刀菌(果腐病)防病能力测定
在LB固体培养基上活化副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42。用无菌牙签挑取单菌落置于20mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜摇培。次日，以1％进行转接，培养4-5h后，将菌液OD600调至0.5(5×107CFU/mL)备用。在PDA平板上将保存的茄镰刀菌(Fusariumsolani)进行活化，用枪头打取获得菌碟备用。用75％无水乙醇对大小基本一致的番茄果实进行表面消毒处理。将消毒后的番茄果实倒置放在不同处理液中浸泡30min后取出，正置于有孔托盘中(底部有一层无菌水的托盘中)，自然晾干番茄表面的不同处理液，用无菌注射器在番茄果实顶部轻轻扎出1个孔隙，将打取的F.solani菌碟紧密贴合番茄果实孔隙处，用脱脂棉包裹菌碟进行保水。用保鲜膜包裹果实，置于25℃温室中，观察后续发病情况。计算F.solani在番茄果实上的发病面积，结果如图12和表5所示。
表5副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄果实上果腐病的防治效果
注∶每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)
实验结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102处理番茄植株后均抑制F.solani在番茄果实上的发病，菌株NJ102处理的番茄果实病情指数显著降低，其中，NJ102对番茄果腐病的防治效果达到了51.63％，高于模式菌株FZB42的防治效果。
实施例6副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄促生效果探究
1.副地衣芽孢杆菌NJ102菌液对番茄种子萌发的影响
番茄种子处理：选取健康饱满、大小一致的番茄种子，先用30％次氯酸钠溶液浸泡2min，后用75％酒精溶液浸泡30s，之后用无菌水冲洗5次，吸取50μL冲洗液加入PDA固体培养基和LB固体培养基上，无菌涂布棒涂匀，25℃恒温培养24h，若无菌落出现，说明种子处理完毕。
取副地衣芽孢杆菌NJ102菌液进行2次水洗处理，洗去菌株自身产生的次级代谢产物，后进行稀释处理，得到终浓度为107CFU/mL的副地衣芽孢杆菌NJ102菌悬液。将消毒处理好的番茄种子置于种子萌发袋中，在种子萌发袋中注入25mL副地衣芽孢杆菌NJ102菌液。将种子萌发袋放置在25℃温室中，7d后收样，测量番茄幼苗根长及芽长，结果如图13所示。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄种子根长、芽长均具有一定的促生效果，其中，对番茄根长的促进效果促生率为32.27％；对番茄芽长促生率分27.55％；且对番茄生长的促生率高于模式菌株FZB42，说明副地衣芽孢杆菌NJ102具有良好的促进番茄种子萌发的效果。
2.副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株促生效果的测定
番茄种子消毒催芽：挑取完整且饱满的种子，用30％的次氯酸钠溶液浸种120s后，用75％的乙醇浸种30s，然后用ddH2O反复冲清洗5次，直至番茄种子表面无刺激性气味残留；将无菌滤纸片铺在9cm已灭菌的玻璃培养皿中，用移液枪加入适量的无菌水，使得皿内的滤纸被水完全浸湿；用无菌镊子夹取番茄种子放置在滤纸上，该过程注意种子之间要有一定的距离，以便其发芽；玻璃皿密封好后放于25℃温室，避光培养3-5天，待其长出胚根便可移栽至1/2MS。
番茄苗的种植：将黑土过筛后与蛭石按照1：1的比例混合均匀后，121℃，20min高温高压灭菌2次后备用；使用直径约2-3cm的打孔器在一次性塑料杯中央打孔，然后加入80％的黑土与蛭石的混合物，用镊子夹取已经长出胚根的番茄种子，根朝下栽入土中，于上层再覆一层土后，将一次性塑料杯置于托盘内，盘内加入适量的水，置于28℃温室培养20天左右。
副地衣芽孢杆菌NJ102发酵液灌根处理：待番茄苗破土展叶后，挑取长势一致的植株，用无菌水将副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42菌株的种子液稀释到107CFU/mL，向每个番茄根部注入50mL终浓度为107CFU/mL的菌悬液，无菌水作为空白对照，培养20天后统计促生数据，结果如图14所示。结果表明，副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株的生长均具有良好的促进效果。其中，菌株NJ102对番茄根长、地上部分鲜重、干重的促进效果最好，促生率高达50.84％、40.08％和43.75％；菌株NJ102对番茄叶绿素的产生、根的鲜重、干重都具有良好的促进效果，促进率分别为28.86％、43.75％和72.73％；且这株菌对番茄生长的促生率均和模式菌株FZB42相似，说明副地衣芽孢杆菌NJ102具有良好的促生效果，具备一定的开发潜力。
实施例7.盐胁迫下副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄植株促生效果探究
番茄种子消毒催芽：挑取完整且饱满的种子，用30％的次氯酸钠溶液消毒3mins，用75％的乙醇消毒45s，然后用无菌水清洗4次，直至番茄种子表面无刺激性气味残留；将无菌滤纸片铺在9cm已灭菌的玻璃培养皿中，用移液枪加入适量的无菌水，使得皿内的滤纸被水完全浸湿；用无菌镊子夹取番茄种子放置在滤纸上，该过程注意种子之间要有一定的距离，以便其发芽；玻璃皿密封好后放于25℃温室，避光培养3-5天，待其长出胚根便可移栽至一次性塑料杯中。
番茄苗的种植：将黑土过筛后与蛭石按照1：1的比例混合均匀后，121℃，20mins高温高压灭菌2次后备用；使用直径约2-3cm的打孔器在一次性塑料杯中央打孔，然后加入灭过菌的黑土与蛭石的混合物，用镊子夹取已经长出胚根的番茄种子，根朝下栽入土中，于上层再覆一层土后，将一次性塑料杯置于托盘内，盘内加入适量的水，置于25℃温室培养20天左右。
副地衣芽孢杆菌NJ102发酵液灌根处理：待番茄苗破土展叶后，挑取长势一致的植株，用无菌水将副地衣芽孢杆菌NJ102以及模式菌FZB42菌株的种子液稀释到107CFU/mL，向每个番茄根部注入50mL终浓度为107CFU/mL的菌悬液，无菌水作为空白对照。灌菌处理2d后开始盐胁迫处理，在每个处理的托盘中加入含有200mM NaCl溶液，每三天浇一次盐溶液，培养30天后统计促生数据，结果如图15所示。实验结果表明，盐胁迫环境中副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄的生长均具有良好的促进效果。其中，NJ102对番茄根长、叶绿素含量的产生以及地上部分鲜重、干重和地下部分鲜重、干重均具有良好的促进作用，促进率分别为90.41％、54.23％、191.73％、257.14％以及191.25％、85.27％，且副地衣芽孢杆菌NJ102对番茄生长的促生率均不低于模式菌株FZB42，说明这株菌在盐胁迫环境下仍具有良好的促生效果，具备一定的开发潜力。
由以上实施例可知，本发明提供了一株副地衣芽孢杆菌NJ102及其应用。本发明的副地衣芽孢杆菌NJ102具有耐低温、耐盐碱的能力，并且能够有效防治番茄青枯病、根腐病和果腐病，对番茄有很好的促生效果，在生物农药方面具有极大的应用潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株副地衣芽孢杆菌NJ102，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31983，保藏日期为2024年09月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述副地衣芽孢杆菌NJ102的菌液的制备方法，其特征在于，将所述副地衣芽孢杆菌NJ102接种至发酵培养基中进行发酵培养，得所述菌液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～32℃，所述发酵培养的转速为180～220rpm，所述发酵培养的时间为22～26h。
4.权利要求1所述副地衣芽孢杆菌NJ102在如下(1)～(6)中的全部或部分中的应用：
(1)在抑制病原卵菌、病原细菌和病原真菌中的应用；
(2)在抑制番茄病害中的应用；
(3)在重度盐碱地中促进番茄生长中的应用；
(4)在分解蛋白质、纤维素或淀粉中的应用；
(5)在制备重度盐碱地土壤上番茄生长促进剂中的应用；
(6)在制备分解蛋白质、纤维素或淀粉的菌剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原卵菌包括辣椒疫霉；所述病原细菌包括青枯雷尔氏菌和丁香假单胞菌；所述病原真菌包括灰葡萄孢、立枯丝核菌和茄镰刀菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述番茄病害包括青枯病、根腐病和果腐病。
7.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述副地衣芽孢杆菌NJ102的菌悬液。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌悬液中的芽孢浓度为1～9×107CFU/mL。
9.一种在重度盐碱地中促进番茄生长的方法，其特征在于，用权利要求7或8所述的微生物菌剂对番茄植株进行灌根处理。
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CN120230671A (zh) * 2025-03-26 2025-07-01 河北省科学院生物研究所 一种番茄栽培用复合微生物菌剂及基质

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