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CN1137265C - 一种提高植物氮素同化效率的方法 - Google Patents

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CN1137265C CNB011044322A CN01104432A CN1137265C CN 1137265 C CN1137265 C CN 1137265C CN B011044322 A CNB011044322 A CN B011044322A CN 01104432 A CN01104432 A CN 01104432A CN 1137265 C CN1137265 C CN 1137265C
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Abstract

本发明提供了一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：(a)将真菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。

Description

一种提高植物氮素同化效率的方法
发明领域
本发明涉及一种提高植物氮素同化效率的方法。
背景技术
氮素是植物生长所需的第一大营养元素。目前农业上所施用的氮肥仅有30％-40％被植物吸收利用，大部分都浪费。有一部分转化为硝酸盐流失到土壤中，造成环境污染。转GDH的作物能有效增加植物氮素的吸收，提高氮肥利用率，从而可以节约氮肥的施用量，起经济效益是巨大的。同时，GDH广泛存在于动植物和微生物中，因此转GDH的植物对人和动植物不会产生危害。
现在主要有美国、澳大利亚等国家进行谷氨酸脱氢酶转基因植物的研究(美国专利NO.5955651；5985634；5998700)。它们的谷氨酸脱氢酶基因主要来源于小球藻和大肠杆菌，模式植物为烟草、玉米等经济作物。经研究发现，转谷氨酸脱氢酶基因的植物其氮素利用率有所提高，表现在植物叶片较大且数量较多。转大肠杆菌GDH的植物不同组织的含氮量经测定比对照组多16％左右，同时不同组织中氨基酸含量有所变化。较为显著的是，谷氨酸含量明显较低，而丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等含量增加较大。转GDH基因土豆的淀粉行量较对照组明显增多。但目前为止所使用的谷氨酸脱氢酶的活性多较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高植物氮素同化效率的方法。
本发明提供了一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：(a)将真菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。
在本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶基因可以是辅基NADP谷氨酸脱氢酶基因或辅基NAD谷氨酸脱氢酶基因。
在本发明的方法中，所述的真菌谷氨酸脱氢酶基因可以来自丝状真菌的脉孢霉属真菌，包括中间脉孢霉、好食脉孢霉、粗糙脉孢霉。所述的谷氨酸脱氢酶基因也可以来自酵母真菌，例如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述的谷氨酸脱氢酶基因还可以来自担子菌，例如双孢菇(Agaricus bisporus)。
在本发明的方法中，所述的植物可以是烟草、玉米、棉花或水稻。
在本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自中间脉孢霉Neurospora intermedia(简称Ni)的谷氨酸脱氢酶，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRTALTVASIPERVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEARQSLTSFQHAGHLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENHRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKIYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAQAMHDQGDWWSKN
编码上述的谷氨酸脱氢酶的基因可以具有如下所示的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTTGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACTGCCCTCACCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAATCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCACCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTCACTGGCTTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCTGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGACATCGGTGTTGGTGGCCGTGAGATCGGCTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCCGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGCAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGCCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGATCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCCGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCTCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACCGTTGAGGACATCAACGCCGTTATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCCCTTACCAGCTTCCAGCACGCTGGTCACCTGAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATTGAGGTCTTTGAGAACCACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGATCTACGTCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCTGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTTGCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
本发明的方法中，所述的谷氨酸脱氢酶可以来自好食脉孢霉Neurospora sitophila(简称Ns)，它具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRIALAVASIPERVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAIMAIKEARQSLTTFQHAGHVKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKTYAEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVPQAMHDQGDWWSKN
编码上述的谷氨酸脱氢酶基因可以具有以下的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTCGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACCGCCCTCGCCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAACCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCATCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTTACTGGCCTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGATGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCCGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGATATTGGTGTTGGTGGCCGCGAGATCGGTTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCTGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGTAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGTCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGCTCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCTGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCCCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACTGTTGAGGACATCAACGCCATCATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCTCTTACCACCTTCCAGCACGCTGGCCACGTCAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATCGAGGTCTTTGAGAACAACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGACCTACGCCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCCGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTACCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA
我们将Ni-GDH，Ns-GDH，Nc-GDH三种脉孢霉属基因克隆进大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，纯化的Ni-GDH，Ns-GDH，Nc-GDH进行酶活性测定，发现三种GDH的酶活性高于其他属的脉孢霉。它对氨的亲和力和稳定性都较强。将着三种GDH基因亚克隆到植物表达载体pROKII中，通过农杆菌转化，电激法转化和花粉管通道法转化烟草、玉米、棉花等作物。经PCR、Southern、Northern和酶活性染色鉴定，筛选出P8‘性转化子。将其移至不同氮浓度的培养基中，发现在低氮5mM至更低的氨离子浓度下，表达GDH的烟草都能正常生长，而未转化的对照组的叶片黄化，发育受阻，呈现缺氮症状。测定植物在低氮条件下的含氮总量及未利用氮残留量，发现转真菌GDH植株的含氮量较未转化的高20％以上，氮残留量减少20-30％。测定植株在贫氮土壤中的总氮量，结果较未转化植株高40％左右。同时我们构建了转GDH基因的玉米、水稻、棉花等经济作物，发现其含氮量较末转化作物高20-30％土壤中氮残留量减少20％以上。检测表明，GDH在上述植物中得到了高表达，它加快了谷氨酸的氧化脱氨和α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的还原氨基化作用，使植物中启动了一条新的氮利用途径，从而提高了氨的利用率。高等植物中虽也有GDH，但其对氨的亲合力只有真菌GDH的1/10至1/100，故不能发挥同化氨的作用。真菌GDH使谷氨酸的氧化脱氨伴随着大量ATP的释放和α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的形成，这给植物提供充足的能量和大量参与三羧酸循环的碳水化合物。氮素是植物生长所需的第一大营养元素，目前农业上所施用的氮肥仅有30％-40％为作物吸收利用，大部分都流失，造成环境污染。而转GDH的作物能够有效地提高氮素利用率，从而可以节约氮肥的利用量，减少环境污染，其经济效益是十分巨大。
实施例
实施例1.脉孢霉属真菌、啤酒酵母和双孢菇的培养及其谷氨酸脱氢酶的诱导
1.将三种真菌由固体斜面转于麦芽汁培养基中，250转/分钟摇床培养48小时离心收集菌丝体，转入氨诱导培养基(4％葡萄糖，0.02MNH4AC，0.04MKN05)中诱导3小时，离心收集菌丝体。
2.总RNA的抽提和逆转录——聚合酶链式反(RT-PCR)方法扩增谷氨酸脱氢酶基因：
诱导后的菌丝体经液氮研磨破碎后，采用异硫氰酸胍法抽提总RNA进行逆转录一聚合酶链式反应。
所用引物如下：
引物1：5’GCTCAGAATGTCTAACCTTCCCTCTGAG 3’
引物2：5’GCGAGCTCTAGTCTTGGACCACCAGTCACC 3’
逆转录反应条件是：
65℃  1分钟，
30℃       5分钟，
30℃-65℃  30分钟，
98℃       5分钟，
5℃        5分钟。
聚合酶链式反应条件：
94℃      3分钟，
94℃      1分钟
55℃      1分钟25个循环
72℃      2分钟
72℃      10分钟
3.脉孢霉属谷氨酸脱氢酶(GDH)基因序列测定：
将RT-PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶(GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取3微升(ul)回收产物，加入1ul pGEM-T easy(Strategene，USA)载体，5ul 2xT4连接酶缓冲液，1ul DNA连接酶(Strategene，USA)，4℃酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌DH50a进行菌落筛选。筛选方法采用菌落PCR和酶切鉴定，酶切位点为XbaI、SacI。酶切产生3.0kb和1.4kb两条带者为阳性克隆pT-GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。
4.啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶(GDH)基因序列测定：
将RT-PCR方法扩增的谷氨酸脱氢酶(GDH)基因经琼脂糖凝胶电泳回收。取3微升(ul)回收产物，加入1ul pGEM-T easy(Strategene，USA)载体，5ul 2xT4连接酶缓冲液，1ul DNA连接酶，4℃酶连过夜。次日，将酶连产物转化大肠杆菌DH50a进行菌落筛选。筛选方法采用菌落PCR和酶切鉴定，酶切位点为XbaI、SacI。酶切产生3.0kb和1.4kb两条带者为阳性克隆pT-GDH。挑取阳性克隆，进行序列测定。
5.脉孢霉、啤酒酵母和双孢菇谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达载体pT-GDH经XbaI、SacI酶切，琼脂糖电泳回收得到GDH片段，与经同样酶切的pBluescript载体(Strategene，USA)在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH50a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pBlueGDH。pBlueGDH经ECoRV、SacI酶切，琼脂糖电泳回收得到GDH片段，与经同样EcoRV、SacI酶切的pET30a载体在12℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH50a，经菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆为pETGDH。次日，挑取阳性克隆，转化大肠杆菌BL21(DE3)(CLONTECH，USA)。培养至OD0.4左右，经1mM IPTG诱导4hr，收获菌体。菌体经去离子水洗涤后，超声裂解。离心，上清和沉淀分别进行10％SDS-PAGE电泳。结果证明表达产物以为包涵体形式存在。
6.金属整合亲和层析纯化谷氨酸脱氢酶
配制含8M尿素的MCAC-0溶液中(20mm/L Tris·Cl，pH7.9，0.5mol/L NaCl，10％(v/v)甘油，1mmol几PMSF)。同时配制MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，即在MCAC-0中分别添加0.4mol/L、0.6mol/L，0.8mol/L、1mol/L、2mol/l、5mol/L的咪唑。
将谷氨酸脱氢酶包涵体溶于含8M尿素的MCAC-0溶液中，上样于NTA层析柱中，以20-30ml/h的流速用5ml 8M Urea-MCAC缓冲液洗柱，弃流出液。以分段洗脱的方式依次用5ml下列缓冲液洗柱，8MUrea-MCAC40，8M Urea-MCAC60，8M Urea-MCAC80，8MUrea-MCAC100，8M Urea-MCAC200，8M Urea-MCAC500，分别收集流出液，进行10％SDS-PAGE电泳，银染进行纯度鉴定。收集8M Urea“MCAC200以后的沈脱液，进行透析复性。透析缓冲液分两种，分别为pH8.5和pH7.4的0.1mol/L Tris.HCl，1mM EDTA。
7.谷氨酸脱氢酶活性测定
将透析过夜的复性蛋白离心，收集上清，经280nm紫外检测测定蛋白浓度，浓度(mg/ml)＝A280×0.825。在体系A、体系C中分别测定酶活。体系A测定GDH还原氨基化作用。
2.55ml  0.1MTris.HCl，1mMEDTA，pH7.4
0.1ml   0.1MNH4Cl
0.15ml   0.2M   a-酮戊二酸
0.2ml    0.15％(W/V)NADPH
2ul  复性蛋白，25℃温育10分钟，在25℃恒温下测定体系A在340nm光吸收值的变化。
体系C，测定GDH氧化脱氨作用：
2.8ml  0.16M谷氨酸单钠盐溶于0.1M Tris.HCl，1mM  EDTA，pH
8.5的缓冲液中，0.2ml 0.2％NADP，2ul复性蛋白，37℃温育10分钟后，测定在340mm光吸收值的变化。
活性单位为每分钟还原每一微摩尔NADP+为一单位或每分钟氧化每一微摩尔NADPH为一单位。
结果测定为在体系A中Ni-GDH活性单位为109.92U/mg，在体系C中，为Ni-GDH为72.93U/mg，Ns-GDH在体系A中为95.37U/mg，在体系C中为63013U/mg，Nc-GDH在体系A中为100.25U/mg，在体系C中为65.00U/mg。
8.脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体pROKII从pT-GDH载体上用XbaI、SacI双酶切将GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的pROKII(CLONTECH，USA)载体在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH5a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌LBA4404(CLONTECH，USA)中。
9.啤酒酵母、双孢菇谷氨酸脱氢酶基因亚克隆入植物表达载体pROKII从pT-GDH载体上用XbaI、SacI双酶切将GDH基因片段切下，经琼脂糖电泳回收后，与经同样酶切的pROKII(CLONTECH，USA)载体在4℃酶连过夜。次日转化大肠杆菌DH5a，经菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆pROKII-GDH，挑选阳性克隆转化入农杆菌LBA4404(CLONTECH，USA)中。
10.根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草
(1)烟草无菌苗的培养
将烟草种子表面消毒后培养在无激素的MS培养基(MS盐+15g/L蔗糖+8g/L琼脂)上培养。25-28℃，80uE(m2.S)光照16小时，随着小苗的生长(1-1.5个月以后)，将茎尖切下，转到新的MS培养基生成小植株。
(2)烟草叶盘共培养
含重组质粒的根癌农杆菌接种于5ml含卡那霉素和利福平的培养基中，28℃ 200转/分摇床培养过夜，离心收集菌体。将无菌苗叶片边缘和中脉用手术刀切去，沿中脉垂直方向将叶片切成5-8mm宽的叶条，叶片切割后立即放入农杆菌液中浸泡30-40分钟。用镊子取出共培养的叶片，放到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，叶条移入含共培养培养基(MS无机盐+0.6mg/l 2，4-D+30g/l蔗糖+8g/l琼脂)的平皿中。用膜将平皿封口，以减少水分蒸发和污染。28℃暗培养48hr。
11.转化植株的筛选
将共培养叶片转移到愈伤组织诱导培养基(MS无机盐+0.6mg/l 2，4-D+300mg/l卡那霉素+500mg/l援节青霉素+30g/l蔗糖+8g/l琼脂)上，使转化叶片充分接触培养基有利于营养和激素的吸收，在愈伤组织诱导培养基上培养两周后，将叶片转移到芽培养基(MS无机盐，1mg/L IAA+1mg/L 6-BA+300mg/L卡那霉素+500mg/L羧苄青霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂)上培养。用解剖刀切下小芽转移到生根培养基(MS无机盐+0.4mg/11BA+100mg/l卡那霉素+30g/l蔗糖+8g/l琼脂)上培养。
12.基因枪法转化玉米
将基因枪放置于一较大超净台中，以利于无菌操作。取6ul包被DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液(约0.6ug质粒和0.37ug金属颗粒)点于微粒子载体中心，立即在干燥器中干燥，或在工作台上吹干。将欲转化的靶组织中铺在一个由液体培养基润湿过的1-2层滤纸或含固体培养皿的9cm培养皿中心，抽真空，当真空度达到所需值(660-760mmHg，1mmHg＝133，322Pa)时，进行轰击，约12秒钟打一枪。将轰击后的外植体转入愈伤组织诱导培养基或芽分化培养基，28℃，黑暗或弱光下培养，该培养基中不加入抗生素等筛选压力，过渡培养一般1-2周。过渡培养后的外植体在含适当卡那雷素的培养基上进行选择培养，1个月左右转入继代扩繁培养基中培养。
13.花粉管通道法介导真菌GDH基因转化棉花
含GDH基因的pROKII-GDH载体溶于1×SSC溶液中，选择发育正常的花去雄，套袋隔离，授粉前一天将棉花花丝剪齐，在无菌培养皿中加入一薄层花粉萌发培养基，采集末萌发的新鲜花粉置于培养基中，在30℃条件下培养3分钟左右，每10ml培养基中加入30mm3花粉，当约1/10的花粉已经萌发时，加入1/10体积的DNA溶液小心混匀，与花粉混合后DNA的终浓度为5ug/ml，将DNA与花粉的混合液涂于柱头上，约10mm3处理后的花粉授一个雌穗，授粉后重新套袋隔离至种子成熟。
14.农杆菌介导的真菌GDH基因转化水稻
含重组GDH基因的根癌农杆菌接种于5ml含卡那霉素和利福平液中，28℃200转/分培养过夜，离心收集菌体，将无菌苗切割后立即放入农杆菌液中浸泡30分钟，取出叶片，故到无菌的滤纸上吸去过多的菌液，转入共培养基中培养。28℃暗培养48hr。
15.转真菌GDH基因植物阳性转化子的筛选和鉴定
(1)从植物中抽提DNA方法
取1g植物叶片，加液氮研磨成粉末。加入700以2×CTAB提取液(2％(W/V)CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)，100mmol/l Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/l NaCl)，轻轻摇匀，65℃水浴30分钟，其间不时摇动。加入700ul酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，并轻摇至溶液呈乳化状态，7000转/分离心5分钟。取上清液继续用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2-3次，加2倍体积无水乙醇，混匀于-20℃沉淀过夜。7000转/分离心10分钟，收集核酸沉淀，溶于去离子水中。-20℃贮存备用。
(2)核酸杂交法鉴定阳性转化子
将抽提的植物总DNA酶切过夜，酶切位点为XbaI，SacI，次日进行琼脂糖凝胶电泳。将DNA片段从凝胶电泳中转移至尼龙膜上，紫外照射3分钟使DNA片段固定。将用地高辛(DIG)标记好的探针与尼龙膜上固定的DNA进行杂交，杂交温度68℃，时间20小时。杂交完成后，清洗尼龙膜，和抗地高辛的碱性磷酸酶(anti DIG-AP)反应30分钟，清洗后进行NBT/BCIP显色。
结果，在1400bp左右位置出现一条杂交带，和阳性对照相同，表明GDH基因已经整合入植物基因组中。
16.转化植株的移栽和后代分析
小心移去植株根部的琼脂，将植株转移至含MS无机盐溶液的较大容器里，将盖子打开，使气体扩散几小时，同时加入一些无菌水以补充蒸发的液体，之后把植株移栽到湿润的土壤里。所结种子以核酸杂交和GDH酶活染色测定后代分离，直至获得纯合的转基因品系。
17.凝胶分析和谷氢酸脱氢酶活性染色
在液氨中研磨，提取植株叶片蛋白，进行5％非变性凝胶电泳，120V72小时。将凝胶浸泡在下述染色液中(50mMTrispH9.3，8mg/ml谷氨酸，0.04mg/ml NADP，0.04mg/ml MTT，0.04mg/ml硫酸的吩咳，0.08mg/mlCaCl2)。凝胶在染色液中浸泡后，在含GDH的部位有一条带，表明转化的GDH在植株体内表达出有活性谷氨酸脱氢酶。
18.转基因植株的生长和氮素利用率测试
表达真菌GDH阳性植物收获种子后，进行无菌苗的繁殖(同8(1))。随着小苗的生长，将茎尖切下，转到不同氮含量的MS培养基上。氨的浓度分别为20mM，10mM，5mM，2.5mM，以测试其生长状况。结果，在20mM，10mM的MS培养基上，阳性转化子和对照组后代未显出明显区别。在5mM和2.5mM培养基上，阳性转化子生长状况显著优于对照组，而对照则出现叶片萎黄等缺氮症状。等植物生长1-1.5个月后，将植株清洁干净，烘干，测试干重。结果显示，阳性转化子比对照组干重增加20％左右。同时利用凯氏定氮法，测得转基因植株的含氮率比对照组增加20-30％左右。同时测定生长在MS培养基中植物的氮素利用率，转化植株较未转化植物的氮素利用率提高20-30％左右。

Claims (6)

1.一种提高植物氮素同化效率的方法，包括：(a)将来自中间脉孢霉Neurospora intermedia或来自好食脉孢霉Neurospora sitophila的谷氨酸脱氢酶的基因与一种可在植物中引导外源基因表达的启动子相连，构建嵌合基因：(b)将构建的嵌合基因导入植物细胞中，筛选并培养出被转化的植株。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的植物是烟草、玉米、棉花或水稻。
3.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的来自中间脉孢霉Neurospora intermedia的谷氨酸脱氢酶具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRIALTVASIPERVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEARQSLTSFQHAGHLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENHRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKIYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAQAMHDQGDWWSKN。
4.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的来自中间脉孢霉Neurospora intermedia的谷氨酸脱氢酶的基因具有如下所示的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTTGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACTGCCCTCACCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAATCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCACCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTCACTGGCTTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCTGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGACATCGGTGTTGGTGGCCGTGAGATCGGCTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCCGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGCAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGCCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGATCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCCGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCTCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACCGTTGAGGACATCAACGCCGTTATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCCCTTACCAGCTTCCAGCACGCTGGTCACCTGAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATTGAGGTCTTTGAGAACCACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGATCTACGTCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCTGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTTGCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA。
5.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的来自好食脉孢霉Neurospora sitophila的谷氨酸脱氢酶具有如下所示的氨基酸序列：MSNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRTALAVASIPERVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYMFGAYRKAANRFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKRVALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGIVEDINAIMAIKEARQSLTTFQHAGHVKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNMGCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKLKDIMKNAFFNGLNTAKTYAEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVPQAMHDQGDWWSKN。
6.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的来自好食脉孢霉Neurospora sitophila的谷氨酸脱氢酶基因具有以下的核苷酸序列：ATGTCTAACCTTCCCTCTGAGCCCGAGTTCGAGCAGGCCTACAAGGAGTTGGCCTACACTCTCGAGAACTCCTCCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTACCGCACCGCCCTCGCCGTTGCCTCCATCCCCGAGCGTGTCATTCAGTTCCGTGTTGTCTGGGAGGACGACAACGGCAACGTCCAGGTCAACCGCGGTTACCGTGTCCAGTTCAACTCCGCCCTCGGTCCCTACAAGGGTGGTCTCCGTCTCCATCCCTCCGTCAACCTTTCCATTCTCAAGTTCCTCGGTTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCCCTTACTGGCCTGAGCATGGGTGGTGGCAAGGGTGGTGCCGACTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGATGCTGAGATCCGTCGCTTCTGCTGCGCTTTCATGGCCGAGCTTCACAAGCACATTGGTGCCGATACCGATGTTCCCGCTGGTGATATTGGTGTTGGTGGCCGCGAGATCGGTTACATGTTCGGTGCCTACCGCAAGGCTGCGAACCGTTTCGAGGGTGTCCTTACTGGTAAGGGCCTCTCCTGGGGTGGTTCGCTCATTCGCCCTGAGGCCACTGGTTACGGTCTCGTCTACTACGTCGGCCACATGCTCGAGTACTCTGGCGCCGGCTCCTACGCTGGCAAGCGCGTTGCCCTCTCTGGTTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCCGCCCTCAAGCTCATTGAGCTAGGCGCCACCGTTGTCTCCCTCTCCGACTCCAAGGGTGCCCTTGTCGCCACTGGCGAGTCCGGCATCACTGTTGAGGACATCAACGCCATCATGGCCATCAAGGAGGCCCGTCAGTCTCTTACCACCTTCCAGCACGCTGGCCACGTCAAGTGGATCGAGGGCGCCCGCCCCTGGCTTCACGTTGGCAAGGTTGACATCGCTCTTCCTTGCGCTACCCAGAACGAGGTCTCCAAGGAGGAGGCTGAGGGTCTCCTTGCCGCCGGCTGCAAGTTCGTCGCTGAGGGTTCCAACATGGGCTGCACTCTCGAGGCCATCGAGGTCTTTGAGAACAACCGCAAGGAGAAGAAGGGCGAGGCCGTCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGTGGTGGTGTTGCCGTTTCCGGTCTCGAGATGGCTCAGAACAGCCAGCGCCTCAACTGGACTCAGGCTGAGGTTGACGAGAAGCTCAAGGACATCATGAAGAACGCCTTCTTCAACGGTCTCAACACTGCCAAGACCTACGCCGAGGCTGCTGAGGGCGAGCTTCCTTCCCTCGTTGCCGGCTCCAACATTGCTGGTTTCGTCAAGGTACCCCAGGCCATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTCCAAGAACTAA。
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