CN100569938C - 能产白藜芦醇的枝孢霉属内生真菌 - Google Patents

Abstract

本发明从爬山虎(Parthenocissi Tricuspidatae)内生真菌中克隆了芪合酶基因(sts)，它与爬山虎中sts基因的编码序列相似性为95.25%，经18SrDNA序列鉴定该真菌属枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)。高效液相色谱和质谱分析表明，该菌在离体培养下也能合成白藜芦醇。对内生真菌sts基因的非编码部分(5端调控区及内含子)的分析表明：它与植物中sts基因的调控元件有很大区别。向内生菌导入外源基因(如VHb、ipt和iaaM等)可促进内生菌生长。这为通过发酵培养此真菌来大规模生产白藜芦醇开辟了一条新的途径，也为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用来提高白藜芦醇产量提供新的方法。

Description

能产白藜芦醇的枝孢霉属内生真菌

一、技术领域：

本发明涉及从爬山虎的内生真菌中分离到一个枝孢霉属真菌-Cladosporium caulis，该真菌含有编码区为1179bp的白藜芦醇合成途径中关键的芪合酶基因(sts基因)。本发明还利用基因工程技术对该菌进行了遗传改良，使得该菌在氧受限制的条件下的代谢和生长速度比非转基因菌有明显提高。本发明属生物工程技术领域。

二、背景技术：

白藜芦醇(Resveratrol，Res)属芪类化合物，化学名为3，4’，5-三羟基-1，2-二苯乙烯(3，4’，5-trihydrolystilbene)，分子式为C₁₄H₁₂O₃，相对分子量为228.25，具有顺、反两种结构，反式结构更为稳定。白藜芦醇常与葡萄糖结合以苷的形式存在，少量以游离态的形式广泛存在于葡萄、虎杖、藜芦、决明子和花生等天然植物或果实当中，到目前为止至少已在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇。

白藜芦醇是植物的次生代谢产物，它与黄酮类化合物、呋喃香豆素等多酚类物质一道，都经由苯丙氨酸途径由香豆酸等前体在不同酶的催化作用下转化而来。其中，白藜芦醇是由芪合酶(Stilbene synthase，STS)催化底物丙二酰-CoA和苯丙酰-CoA合成。另外，研究还发现，芪合酶(STS)催化的反应与查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)催化的反应很相似，都催化香豆酰辅酶A与三个分子的丙二酰辅酶A的缩合反应，只不过前者释放四个CO₂分子，而后者释放三个，从而形成了不同的苯环结构，得到不同的产物(白藜芦醇及柚皮素查耳酮)。而STS与CHS的蛋白质相似性也达到约70％(Goodwin等，2000)。

芪合酶基因的植物很多只有在对不良环境的保护性反应(如机械损伤、紫外线照射、环境胁迫等)时，才能激发该基因的转录并转译为芪合酶，进而瞬时合成白藜芦醇。同时，白藜芦醇仅存在于少数可食食物中(如葡萄属、落花生属)，且含量甚低，而且受品种、生长条件等影响很大。另外，绝大多数植物虽含有芪合酶作用的底物，但缺少芪合酶基因。

目前商业用白藜芦醇主要以含量相对较高的葡萄皮、葡萄籽和虎杖为原料，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等作为提取溶剂，用高效液相色谱、硅胶柱层析等方法分离纯化得到高含量的白藜芦醇，但天然的植物中存在的白藜芦醇毕竟是微量的，并且提取步骤繁多、提取物成分复杂，必须经过分离纯化才能得到成品，因此该技术面临着资源有限和生产能力小等问题。而化学合成过程中的催化剂和反应试剂对环境和人体的危害性则大大限制其应用。因此，新辟高效的生产途径，解决日益增高的消费需求问题变得十分迫切。

现在主要的研究集中在生物合成白藜芦醇研究上：利用基因工程技术，控制、改良白藜芦醇的生物合成途径来获得其高产植物株系、利用诱变途径选育高产细胞株等方面。但迄今为止，离规模化的工业生产要求还很远。

内生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某段时期或全部阶段生活在植物组织内，对植物组织没有明显引起病害症状的一类真菌。近年来，国内外从多种药用植物内生真菌中筛选出各种生理活性物质陆续见有报道，内生真菌产生的生物活性物质存在极大的多样性(如：抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗虫等物质)，表明植物内生真菌能够产生结构新颖、功能特殊的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源，它们在医药、工业、农业等领域具有重要的应用前景。

本发明从爬山虎(Caulis Parthenocissi Tricuspidatae)的内生真菌中克隆得到了白藜芦醇合成的关键酶基因-芪合酶基因(sts)，该基因与爬山虎中sts基因的核酸序列相似性为95.25％，氨基酸序列相似性为97.45％，经rDNA的18S序列比对鉴定，该菌为枝孢霉属(Cladosporium sp.)。HPLC和质谱(ESI-MS)分析表明，该菌在离体培养下也能合成与其宿主植物一样的次生代谢物——白藜芦醇。此外，这为通过离体大规模发酵来生产白藜芦醇提供了一条新的途径，也为通过促进内生真菌的生长，及真菌与宿主植物的相互作用提高白藜芦醇含量提供新的方法。

三、发明内容：

本发明涉及从爬山虎的内生真菌中分离到一个枝孢霉属真菌-Cladosporium caulis，该真菌含有编码区为1179bp的白藜芦醇合成途径中关键的芪合酶基因(sts基因)。高效液相色谱法(HPLC)和质谱(ESI-MS)分析表明在离体培养的条件下该真菌也能合成白藜芦醇。之后我们将LeGDP/VHb基因和LeGDP/ipt基因，以及LeGDP/iaaM基因转化该菌株进行基因工程改良，结果发现携带LeGDP/VHb的真菌比非转基因的对照菌在氧受限的条件下的代谢速度和生长量有明显增加，而LeGDP/ipt基因和LeGDP/iaaM基因则加快了真菌生长速度。本发明同时提供了克隆爬山虎内生菌sts基因的相关资料，发现它与宿主植物的sts基因有很高同源性。但在真菌和植物中该基因的调控系统差别颇大。此外，本发明还提出了利用内生真菌提高白藜芦醇产量的方法，包括真菌发酵的方法和利用真菌促进宿主产生白藜芦醇的方法。

1、爬山虎内生真菌的分离鉴定

采集新鲜的爬山虎茎段，按常规无菌操作进行表面消毒后取其韧皮部转接到PDA平板培养基上，28℃培养3-7天，挑取组织块周围长出的单个菌落的菌丝接到CYM斜面培养基上纯化保存。

2、从爬山虎内生真菌中克隆芪合酶(sts)基因

利用已知的爬山虎(Caulis Parthenocissi Tricuspidatae)中芪合酶基因的相似性区域，我们设计了包括sts基因起始密码和终止密码的的一对引物，分别是STSFP和STSRP。利用Plant genome DNA Reagent试剂提取爬山虎内生真菌的DNA，用PCR方法扩增得到1228bp左右的特异片断，连接到pMD-18载体上并进行测序，表明该基因的完整编码区为1179bp(12bp～1192bp)，编码392个氨基酸。将测序结果与其他的序列进行相似性比较，发现爬山虎内生真菌中的sts基因与其宿主中相应基因有95.25％的相似性，翻译成氨基酸序列后进行相似性比较，两者的相似性亦有97.45％。在sts的氨基酸序列中包含芪合酶的特异氨基酸残基片段IPNSAGAIAGN，以及表明芪合酶家族特性的信号序列GVLFGFGPGLT。另外，爬山虎内生真菌的芪合酶编码区中也存在第164位的半胱氨酸(Cys¹⁶⁴)活性中心。

该sts基因的完整编码区为：

1    ATGGCTTCAG TTGAGGAATT TAGAATCGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC CACCATCCTA

61   GCCATTGGCA CTGCTACTCC AGACAACTGC GTCTACCAGT CTGATTACGC TGATTTCTAT

121  TTCAGAGTCA CAAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA TCGCATATGT

181  GAGAAATCAA TGATCAAGAA GCGTTATATT CATTTGACTG AAAAGATGCT TGAGGAGCAC

241  CCAAACATTG GTGCTTATAT GGCTCCATCT CTTAACATAC GCCAAGAGAT TATCACTGCC

301  GAGGTACCCA AGCTTGGTAA AGAAGCAGCA TTGAAGGCTC TAAAAGAGTG GGGCCAACCC

361  AAGTCCAAGA TCACCCATCT TGTATTTTGT ACAACCTCCG GTGTAGAAAT GCCTGGTGCA

421  GATTACAAAC TCGCTAATCT CTTAGGGCTT GAAACATCGG TCAGAAGAGT GATGTTGTAC

481  CATCAAGGGT GCTATGCAGG TGGAACTGTC CTCCGAACTG CTAAGGATCT TGCAGAGAAT

541  AATGCAGGAG CACGAGTTCT TGTGGTGTGC TCTGAGATCA CTGTTGTCAC ATTCCGTGGA

601  CCTTCCGAAA CTGCTTTGGA CTCTTTAGTT GGCCAAGCCC TTTTTGGTGA TGGGTCTGCA

661  GCTGTGATCG TTGGATCAGA TCCAGATATC TCGATTGAAC AACCACTTTT TCAACTCGTC

721  TCAGCAGCCC AAACATTTAT TCCTAATTCA GCAGGTGCCA TTGCCGGGAA CTTACGTGAG

781  GTGGGACTCA CATTTCATTT GTGGCCCAAT GTGCCAACTT TAATTTCTGA GAACATAGAG

841  AAATGCTTGA CTCAGGCTTT TGACCCACTT GGTATTAGCG ATTGGAACTC GTTATTTTGG

901   ATTGCTCACC CAGGTGGCCC TGCAATTCTT GATGCGGTTG AAGCAAAACT CAATTTAGAC

961   AAAAAGAAAC TTGAAGCAAC GAGCCATGTG TTAAGTGAGT ATGGCAACAT GTCAAGTGCA

1021  TGTGTGTTGT TTATTTTGGA TGAGATGAGA AAGAAATCAC TTAAGGGGGA GAAGGCCACC

1081  ACAGGTGAAG GATTGGATTG GGGAGTATTA TTTGGCTTTG GACCAGGCTT GACTATTGAG

1141  ACTGTTGTGT TGCATAGCAT TCCTATGGTT ACAAATTAA

3、内生真菌中sts基因5’端调控序列的克隆

应用一种基于5’RACE技术的染色体步行技术，从爬山虎及其内生真菌的基因组DNA中克隆了sts基因的5’端调控序列。其做法是在已知的sts基因5’端280bp左右设计引物GSP1，180bp左右处设计引物GSP2；第一步先用GSP1做单引物线性扩增，用1/10体积的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，检测无特异条带后进行第二步，即用dCTP给上步的PCR产物加尾；第三步则用GSP2和AAP作引物进行巢式PCR，其电泳结果应该是均匀的smear状，切下大于500bp的胶回收、连接并转化DH5a；第四步是转化子的筛选：用GSP2和AAP作引物(同时用AAP和GSP2分别作单引物对照)筛选，挑取较大的且无单引物扩增的样品进行测序。该sts基因的部分5’调控区为：

1    ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA

61   TTGATGTGAT ACTCCAAGAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG

121  ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT

181  CACTTCATCA AAAGGACAGT AGGAAAGGAA GGTGGCACCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT

241  AAAGGAAAGG CTATCGTTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA

301  CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT

361  TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCCGACG

421  GATCCTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA

481  TTTACAATAA CAATGGACTG TCTAGAGGAT CCGCC

4、爬山虎sts基因内含子的克隆

根据爬山虎sts基因序列设计克隆内含子的引物：

STS-E(上游)：5’-CAC TAA GAG CGA GCA CAT GAC TGAG-3’

STS-E(下游)：5’-ACG AGT TCC AAT CGC TAA TAC CAAG-3’

从爬山虎基因组DNA中，我们克隆到了其sts基因361bp的内含子，其序列为：

1    TCTAATTTTA ACATCCTTTG CGTGCATATA ATTGTGTATA CATATGATAA AGCTTTTAGA

61   TTCACCTCAG AGTACCGAAA CATCTTTTTC AAGCTTTCTG TGTACTCATT TTTAAATTAA

121  TACAATGCAT CCGTGACTGA TGCTCAGAGC AGGTGCTCTT TCAATCATAC GGTATAAAGC

181  CTGGGGTCAT ATCATTAATG TAATAAGTAA TAAGAACAAG CTTTTATATT CTATTAAGAT

241  GAATCATTTT ATACTCACTG GAACAACAAA AACTATATAC ATATTATTGA GTACTACTTG

301  TGTTTTACTT GCAATGCCTT GAGCTCACAT ATTACTGTTT TTTAATTCTT ATACAGGTGA

361  C

5、内生真菌合成白藜芦醇的测定

将上述得到的菌株与爬山虎叶片、对照菌株(不含sts基因的菌株)用液体CYM培养基培养10天，取出压干，再置低温烘箱中烘烤(40-55℃)过夜。用研棒将其研成细碎粉末，无水甲醇(1∶40，w/v)过夜浸提，抽滤后的液体再40℃旋转蒸干，残留物溶于5mL水及10mL乙酸乙酯中。充分混匀并分层后，有机相蒸干，重溶于0.5mL丙酮中。定量点样于活化的硅胶板Silufol(UV 254)，板依次用氯仿∶甲醇(25∶1)展层三次。干燥后，在紫外灯下对照标准样品Rf值确定白藜芦醇在板上的位置，刮取含有白藜芦醇的硅胶，再用甲醇溶解硅胶回收白藜芦醇。抽滤后提取液于40℃真空蒸干，重悬于乙睛。所有操作过程均在严格避光条件下进行，以防止白藜芦醇的氧化或分解。

HPLC(高效液相色谱)和质谱(ESI-MS)的分析结果表明：爬山虎的内生真菌能产生和宿主植物一样的次生代谢物——白藜芦醇。

6、分离出的内生真菌的生物学分类

我们以真菌的18SrDNA序列结合其形态特征将其分类。参考Wattier(2000)对红藻(Rhodophyta)总DNA的提取方法，提取真菌的总DNA，并进行rDNA的18S序列鉴定。

该18S rDNA片段的序列为：

1    TTAGCGAAAC TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA

61   CATGGATAAC CGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC TTCGGAAGGG

121  GTGTATTTAT TAGATAAAAA ACCAATGCCC TTCGGGGCTC CTTGGTGAAT CATAATAACT

181  TAACGAATCG CATGGCCCTG CGCCGGCGAT GGTTCATTCA AATTTCTGCC CTATCAACTT

241  TCGATGGTAG GATAGTGGCC TACCATGGTA TCAACGGGTA ACGGGGAATT AGGGTTCGAC

301  TCCGGGGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC ACATCCAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT

361  TACCCAATCC CGACACGGGG AGGTAGTGAC AATAAATACT GATACAGGGC TCTTTTGGGT

421  CTTGTAATTG GAATGAGTAC AATTTAAATC CCTTAACGAG GAACAATTGG AGGGCAAGTC

481  TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT GTTGCAGTTA

541  GAAAGCTCGT AGTTGAACCT TGGGCCTGGC TGGCCGGTCC GCCTCACCGC GTGTACTGGT

601  CCGGCCGGGC CTTTCCTTCT GGGGAACCTC ATGCCCTTCA CTGGGCGTGC TGGGGAACCA

661  GGACTTTTAC TTTGAAAAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAGGC CTTTGCTCGA ATACATTAGC

721  ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTGTGGTTCT ATTTTGTTGG TCTCTAGGAC CGCCGTAATG

781  ATTAATAGGG ATAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAAGCGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTG

841  CTTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGA AT

鉴定结果这株能产白藜芦醇的真菌属于子囊菌门(Ascomycota)、座囊菌纲(Dothideomycetes et.)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、属(Cladosporium sp.)。

7、分离出的枝孢霉菌的基因工程改良

在本发明的一个实施方案中，我们将透明颤菌血红蛋白基因导入多种共生真菌的细胞中如桉树的浅黄根须腹菌(Rhizopogen luteolus)。提高了这些真菌在低氧条件下的生长速度。从牛粪中分离到的透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白提高了限氧条件下细胞内有效氧浓度，因而改变了终端氧化酶的相对活性，促进了细胞中氧传递效率。从而促进好氧呼吸的效率和生长。在真菌中应用使我们采用的启动子是来自香菇的三磷酸甘油醛脱氢酶LeGDP启动子。构建了适于在真菌中表达的质粒。接助于电激法，或PEG法，或农杆菌介导的方法将LeGDP驱动下的VHb基因转入了真菌。这些共生真菌(内共生和外共生的真菌)，在非共生的条件下依然可以生长，在人工控制的条件下，更便于研究它们的代谢特点。发现携带LeGDP/VHb的真菌比非转基因的对照菌在氧受限的条件下明显增加了代谢速度和生长量。

我们曾经利用遗传改良的根际微生物，来改善植物的生长发育。这种共生的根际微生物与植物有更为密切的关系。它对植物的营养状态的改良和抗逆性的提高已成为共识。内生菌的遗传改良将有利于建立它与宿主植物之间的关系。在本发明的一个类似的实施方案中，我们将一种生长激素类的基因，即异戊烯基转移酶基因(isopentanyl transferase，ipt)和生长素合成的关键基因LeGDP/iaaM基因导入真菌。所用启动子也是LeGDP，结果表明LeGDP/ipt基因转化的真菌在培养条件下，加快了真菌生长速度。iaaM是植物生长素基因，LeGDP/iaaM同样可以促进内生菌的生长。总之可以在获得内生菌的基础上可以进行内生菌的遗传改良。

本发明的有益效果：我们在葡萄科植物爬山虎中分离出了能产生白藜芦醇的内生真菌，该真菌为枝孢霉属，由于含有白藜芦醇合成途径的芪合酶，因此在离体培养条件下该真菌能够产生白藜芦醇。本发明的创新点在于此前还没有人发现葡萄科的内生真菌在离体培养条件下能够产生白藜芦醇，而白藜芦醇仅存在于少数植物中并且含量很低，因而要大规模生产白藜芦醇很困难。我们分离的这种内生真菌不仅在离体条件下能产生白藜芦醇，而且我们还从分子生物学的角度证实了正是由于该真菌含有的芪合酶基因sts使得它能够产生白藜芦醇，通过对这种真菌的大规模发酵培养能够为白藜芦醇的生产开辟一条新的途径，而且也为通过这种内生真菌的遗传改良(例如：导入在低氧条件下促进其生长的VHb基因以及促进细胞分裂和生长的ipt基因和iaaM基因)，从而使得内生真菌在与宿主植物的相互作用中促进植物产生更多的白藜芦醇。

四、附图简要说明：

图1爬山虎中分离真菌的平板图

红色圆圈标记的为本发明的目的菌株

图2从内生真菌中扩增的sts基因的电泳图

图中我们的目的条带扩增条带大小为760bb，电泳带从左到右编号依次为M，1，2，3，4，5，6，7，8，+，-。M表示分子标记Marker，+为正对照，-为负对照，1-8为不同的爬山虎内生真菌的基因组DNA。箭头标记的为本发明的目的菌中扩增出的条带。

图3内生真菌中白藜芦醇的HPLC测定图

HPLC的条件如下：

  HPLC：Agela Bonchrom-C18，4.6＊150mm，5um

   mobilephase：ACN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65

   flow rate：0.6mL/min

   Detection wavelength＝306nm

图4内生真菌中白藜芦醇的质谱(ESI-MS)图

  ESI-MS条件如下：

    HPLC：Agela Bonchrom-C18，4.6＊150mm，5um

     mobilephase：ACN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65

     flow rate：0.6mL/min

     Detection wavelength＝306nm

     MS：negative mode

     nebulizer：50psi

     dry gas：8L/min

     dry temperature：325du

     scan range：150-250

     skimmer：-40v，Cap Exit：-92.7v

     high voltage：4000v

其中(1)图为白藜芦醇成品(纯度99.99％，购自sigma公司，分子量为228.3)，(2)图为样品分子量，(3)图中箭头标记的为样品峰

图5是表示真菌表达载体LeGDP/VHb的构建流程的示图

图6是表示真菌表达载体LeGDP/ipt的构建流程的示图

图7是表示真菌表达载体LeGDP/iaaM的构建流程的示图

图8转基因和未转基因菌株生长对比图

LeGPD/ipt基因转化的真菌比未转化的对照组相比在相同时间和同样条件下有更大的生长量。

其中CK为未转基因对照，1-5为转基因株系

图9接种于50mlCYM液体培养基的转基因和未转基因菌株生长量对比图

携带LeGPD/iaaM基因的真菌加快了生长速度。左图为未转基因的对照；中、右分别为转基因的两个株系，它们的生长明显加快

图10是转LeGPD/VHb基因的真菌在限氧条件下的生长情况图

图中1为未转基因的对照；2-4为转LeGPD/VHb基因的菌株。

五、具体实施方式：

所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆：实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自TaKaLa公司，Promega公司。

实施例1：爬山虎中内生真菌的分离

将刚采集的爬山虎茎段，用自来水冲洗干净，沥干水分，剪成2cm左右的小段，然后按常规无菌操作进行如下表面消毒：75％酒精浸泡1分钟，0.1％升汞浸泡30分钟，取其韧皮部，接于PDA平板上培养，将接种后4-7天长出的真菌用接种针挑取菌丝转接到CYM斜面培养基上纯化，存于4℃备用。

将分离到的内生真菌进一步用设计好的芪合酶引物(见实施例2)确定是否含有芪合酶基因。

实施例2：爬山虎内生真菌中芪合酶(sts)基因的克隆

参考爬山虎中芪合酶基因(sts)设计如下引物(由上海生物工程公司合成)：

STS1(上游引物)：5’＞CGG GAT CCG CCA TGG CTT CAG TTG AGA AAT TTA G＜3’，

含BamHI位点

STS2(下游引物)：5’＞GTG AGC TCG AAG GGT AAA CCA TTC TCT TTT AT＜3’，

含SacI位点

以内生真菌的基因组为模板，在50μl的PCR反应体系中加入：DNA模板2μl，10×PCR buffer(MgCl₂)5ul，2.5mM dNTP mix 4ul，引物(10uM)各2.5ul，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，ddH₂O 34ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，10℃保温1min。将PCR产物跑琼脂糖回收胶，结果目的条带与正对照一致，将目的条带回收，与pMD-18载体连接并测序。

真菌基因组DNA的小量制备：

提取缓冲液：含68mlTEN缓冲液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1M Tris-HCl，PH 8.0；室温存放)、6.8ml 20％SDS和125ul蛋白酶K母液(20mg/ml，溶于双蒸水，-20℃保存)；随用随配。

(1)将真菌菌丝接种于CYM液体培养基中，28℃培养5天，取0.1g(湿重)菌丝置于1.5ml的Effendorf管中，液氮冷冻数秒，用与Effendorf管配套的玻璃研棒将菌丝充分研碎，置冰上，待所有样品都研磨完后各加入1ml提取缓冲液，剧烈混匀；

(2)37℃摇床(200rpm)中温浴30min；

(3)4℃，12,000rpm离心15min，转移上清，冰浴30min；

(4)4℃，12,000rpm离心15min，转移上清，用CI抽提蛋白1-2次；

(5)加入600ul于-20℃预冷的异丙醇，4℃，12,000rpm离心15min，弃上清；

(6)沉淀用70％乙醇洗涤，置室温中晾干；

(7)每管加入20-40ul双蒸水溶解。

细菌质粒DNA的制备：

(1)挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取1.5ml菌液于离心管中，10,000rpm离心30秒；

(3)菌体沉淀重悬于100ul溶液I(50mM蔗糖，20mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，振荡混匀并静置数分钟；

(4)加入新鲜配置的200ul溶液II(0.2N NaCl，1％SDS)，轻弹混匀，冰上放置3分钟；

(5)加入预冷的150ul溶液III(60ml 5M KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml无菌水)，轻弹混匀，冰上放置5分钟；

(6)12,000rpm离心5分钟；

(7)取上清液，加入1倍体积的异丙醇，混匀后在冰上放置10分钟；

(8)12,000rpm离心5分钟，弃去上清后稍微晾干，使之溶于200ul无菌水；

(9)加入100ul7.5M醋酸铵，轻轻混匀后在冰上放置10分钟；于12,000rpm离心5分钟；

(10)取上清液，加入两倍体积无水乙醇后，于冰上或-20℃放置20分钟，12,000rpm离心15分钟；

(11)沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于TE缓冲溶液(10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))中。

DNA片段的回收(TIANGEN公司凝胶回收试剂盒)：

(1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段(体积不要超过100ul)置于小离心管；

(2)加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴10分钟，其间轻摇小离心管数次使胶完全溶化；

(3)将上一步所得到的溶液加入到吸附柱CA1或CA2中，12000rpm离心1min；；

(4)倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(5)向吸附柱中加700ul漂洗液PW，12000rpm离心1min；

(6)倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(7)向吸附柱中加500ul漂洗液PW，12000rpm离心1min；

(8)倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量出去漂洗液；

(9)将吸附柱放于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验；

(10)将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟；

(11)12000rpm离心1min，将离心得到的溶液重新加回到吸附柱中，重复10步骤。

连接：

6ul反应体系中加入上述回收的DNA溶液2.4ul、pMD-18载体0.6ul、Solution I 3ul，16℃放置4小时左右。

大肠杆菌感受态细胞的制备：

(1)挑取E.coli DH5α单菌落接种于100ml液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.4；

(2)冰浴10分钟，分装于无菌离心管中，4℃，4,000rpm离心5分钟收集细胞；

(3)重悬于600ul冰预冷的0.1M CaCl₂中，冰浴30分钟；

(4)4℃，4,000g离心10分钟收集细胞。用100ul预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，待用。

感受态细胞的转化：

(1)取100ul感受态细胞加5ul连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；

(2)于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1-2分钟；

(3)加200ul LB液体培养基，37℃振荡培养45分钟至1小时；

(4)均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

重组质粒的筛选与鉴定：

a.挑取单菌落，用800ul附加氨苄青霉素的LB液体培养基培养4-6小时；

b.PCR检测：挑取单菌落于含适当抗生素的3ml LB液体培养基中，37℃培养过夜提取质粒DNA。以质粒DNA为模板，用特定引物在适当条件下做PCR扩增反应，电泳检测是否有目的条带；

c.酶切鉴定：阳性克隆再用适当限制性内切酶进行酶切以进一步判断是否为阳性克隆。

实施例3：真菌的18S鉴定

根据真核生物rDNA的18S保守序列设计如下引物：

18S上游：5’-AGCGAAACTG CGAATGGC-3’；

18S下游：5’-CATCCTTGGC AAATGCTTTC-3’；

在50μl的PCR反应体系中加入：DNA模板2μl，10×PCR buffer(MgCl₂)5ul，2.5mMdNTP mix 4ul，引物(10uM)各2.5ul，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，ddH₂O 34ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min，10℃保温1min。将PCR产物跑琼脂糖回收胶，将目的条带切下回收，与pMD-18载体连接并测序。

将测序结果进行BLAST比对，并确定该内生真菌为：子囊菌门(Ascomycota)、座囊菌纲(Dothideomycetes et.)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、枝孢霉属(Cladosporium sp.)。

实施例4：爬山虎及其内生真菌sts基因5’端调控序列的克隆

本实验涉及的引物：

GSP1：5’-CTTGGCGTATGTTAAGAGATGGAGC-3’

GSP2：5’-CGCTTCTTGATCATTGATTTCTC-3’

AAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’

AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

基于5’RACE技术的染色体步行

(1)单引物PCR线性扩增：用TIANGEN公司的植物基因组提取试剂盒提取爬山虎基因组DNA，以它及其内生真菌DNA为模板，用GSP1引物进行单引物PCR扩增。40μl的PCR反应混合液中含有：4.0μl 10×PCR buffer，5.0μl 2.5mM dNTPmixture，4.0μg DNA模板，2.0μl 10mM GSP1，25.0μl ddH₂O。PCR条件如下：94℃预变性7min后加2.5U的EX TaqE(TaKaRa)；然后按以下条件进行25个循环：94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸80s。循环结束后不再进行附加的72℃延伸而直接终止反应。取5μlPCR产物走1％琼脂糖凝胶电泳，确证无非特异的扩增条带后，把余下的PCR产物按照基本实验方法过柱回收。

(2)单链DNA的加尾：在0.5ml离心管中加入以下成分：5.0μl 5×tailing buffer；2.5μl2mM dCTP；16.5μl ssDNA sample；24.0μl ddH₂O。然后进行以下操作：94℃3min，置于冰上1min，离心；加入1μl TdT，混匀，37℃10分钟；65℃加热10min，离心，冰浴保存。

(3)巢式PCR扩增、克隆及测序：在冰上，向0.2ml离心管中加入以下成分：5μl10×PCR buffer；5.0μl 2.5mM dNTP；2.0μl 10μM GSP2；2.0μl 10μM AAP；5.0μldC-tailed ssDNA；31.0μl ddH₂O；PCR条件如下：94℃预变性5min后加2.5U的EXTaqE(TaKaRa)；然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束72℃10min终止反应。PCR产物走1％琼脂糖凝胶电泳检测，把500bp-2,000bp区间的smear胶切下，用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒回收。回收的PCR产物与pMD-18载体连接，转化DH5α；选取3～4个含有较长插入片段的阳性克隆进行测序。

实施例5：爬山虎内生真菌产白藜芦醇的HPLC检测

(1)将上述得到的菌株与爬山虎叶片、对照菌株(不含sts基因的菌株)用液体CYM培养基培养10天，取出压干，再置低温烘箱中烘烤(40-55℃)过夜；

(2)用研棒将其研成细碎粉末，无水甲醇(1∶40，w/v)过夜浸提，抽滤后的液体再40℃旋转蒸干，残留物溶于5mL水及10mL乙酸乙酯中；

(3)充分混匀并分层后，有机相蒸干，重溶于0.5mL丙酮中；

(4)定量点样于活化的硅胶板Silufol(UV 254)，板依次用氯仿∶甲醇(25∶1)展层三次；

(5)干燥后，在紫外灯下对照标准样品Rf值确定白藜芦醇在板上的位置，刮取含有白藜芦醇的硅胶，再用甲醇溶解硅胶回收白藜芦醇；

(6)抽滤后提取液于40℃真空蒸干，重悬于乙睛。

*所有操作过程均在严格避光条件下进行，以防止白藜芦醇的氧化或分解。

(7)HPLC分析：适当稀释的薄层层析后的提取液用于上样，在HPCHEM高效液相色谱仪上用Nucleosil C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μ)，以乙睛-水溶液(35∶65)为流动相，流速0.6mL/min，在306nm波长下进行检测。

HPLC分析结果表明：在306nm波长处，样品在7min左右处出现与标准样品一样的波峰。

实施例6：爬山虎内生真菌产白藜芦醇的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析

ESI-MS条件为：HPLC：Agela Bonchrom-C18，

                    4.6＊150mm，

                    5um；

              Mobilephase：CAN∶H2O(5mmol ammonium formate)＝35∶65，

              flow rate：0.6mL/min，

              Detection wavelength＝306nm。

              MS：

              negative mode，

              nebulizer：50psi，

              dry gas：8L/min，

              dry temperature：325du，

              scan range：150-250，

              skimmer：-40v，Cap Exit：-92.7v，

              high voltage：4000v。

结果如附图4，在7.9min时，样品与标准样品出现同样的波峰，且样品的分子量为226.3，因此，我们可以认为此物质为我们所需要确定的即白藜芦醇。

实施例7：真菌表达载体LeGDP/VHb的构建

用BamH I+Sac I切下pT-PV上约0.5kb大小的vhb片段代替Pl221载体的GUS位置，得到重组质粒pLvhb；再从p301-bG1质粒中用Spe I切下约5.5kb大小的Tnos-GUS-pLeGPD-bar-P1L-LB片段，将此片段插入到pLvhb的Not I位点间，从而得到LeGDP/VHb表达载体。

其中，pT-PV和p301-bG1载体由北京大学蛋白质基因工程重点实验室构建保存，所涉及的酶是购自promega公司。

实施例8：真菌表达载体LeGDP/ipt的构建

在pBI321b的Nco I及SacI位点之间再引入从pT-ipt上切下的0.7kb的ipt片段，得到约8.5kb的中间载体pBI321b-ipt。最后用Hind III+Nco I从载体pL321b中把1.3kb的PLeGPD片段切下来代替pBI321b-ipt载体中Hind III和Nco I间的P35S-35S片段，得到pL321b-ipt即LeGDP/ipt表达载体。

其中，pBI321b和pT-ipt载体由北京大学蛋白质基因工程重点实验室构建保存，所涉及的酶是购自promega公司。

实施例9：真菌表达载体LeGDP/iaaM的构建

将pL321b-ipt载体上的ipt片段用从PGEMRT-iaam载体上用Not I和Hind III切下0.6kb的iaam片段代替，即可得到pL321b-ipt载体。

其中，PGEMRT-iaam载体和pL321b-ipt载体是有由北京大学蛋白质基因工程重点实验室构建保存，所涉及的酶是购自promega公司。

实施例10：爬山虎内生真菌的基因工程改良

真菌的培养

将真菌接种于CYM固体培养基，26℃培养5天；将活化好的菌种接种于装有玻璃珠及100mL液体CYM培养基的500mL锥形瓶中，26℃静止培养4～5d天，每天摇瓶1～2次以打散菌丝。

待转化质粒的大量制备与纯化

(1)将待转化质粒的菌种接种于带氨苄抗性的100mL液体LB培养基中，37℃摇床中培养至对数生长期；

(2)菌体离心收集于50mL离心管中，加8mL溶液I将菌体完全悬起，振荡混匀；

(3)加入新配制的溶液II 8mL，充分混匀，室温放置至溶液较清；

(4)加入8mL溶液III，混匀，室温放置10min，12000rpm离心5min；

(5)上清中加入16mL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，DNA沉淀用1.2mL双蒸水溶解后平均分装于2个Effendorf管中进行纯化；

(6)每个Eppendorf管中分别加入300μl 7.5M NH4Ac，混匀，-20℃放置10-20min；12000rpm离心5min，取上清，等体积CI抽提后加入600μl异丙醇，12000rpm离心5min；

(7)两管沉淀合在一起，用250μl双蒸水溶解，加入250μl 5M LiCl(预冷)，-20℃放置10min，12000rpm离心5min；

(8)取上清，加入1mL预冷乙醇，混匀，12000rpm离心5min；

(9)沉淀用300μl双蒸水溶解后加入300μl PEG溶液(13％PEG8000，1.6MNaCl)，混匀，12000rpm离心10min；

(10)沉淀用300μl双蒸水溶解后加入150μl 7.5M NH4AC，-20℃放置10min，12000rpm离心10min；

(11)取上清，加入1mL无水乙醇，12000rpm离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤后真空抽于，加入50μl无菌双蒸水溶解；

(12)用琼脂糖凝胶电泳检测质粒的含量，将质粒浓度调整至1μg/μl(注意无菌操作)，-20℃保存备用。

真菌原生质体的制备(无菌操作)

(1)将100mL菌丝培养物用4层纱布过滤，用无菌水冲洗2-3遍，再用吸水纸吸干菌丝；

(2)将菌丝转移至15-mL塑料螺口离心管中，加入1mL溶壁酶酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH5.6；液氮冻融灭菌后分装于Eppendorf管中，-20℃保存)，充分混匀后置30℃水浴中酶解，每隔15min将离心管颠倒几次以促进原生质体的释放；

(3)在显微镜下观察有大量原生质体释放时结束酶解反应，加入2mL0.6M甘露醇，混匀倒入装有0.5cm脱脂棉柱的10mL注射器内过滤，滤液收集于1.5mL Eppendorf管中；

(4)4000rpm离心5min，弃上清，用1mL 0.6M甘露醇离心洗涤2次，将纯化的原生质体悬浮于100μl 0.6M甘露醇中。

真菌原生质体的转化和再生

(1)将1mL电击缓冲液(0.6M甘露醇，10mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)加入纯化的原生质体(107-108)中，4000rpm离心5min，弃上清；

(2)将原生质体重悬于200μl电击缓冲液中，加入10μg待转化质粒DNA，混匀后转入电击杯，冰浴10min；

(3)在电压1000v、电容25μF、电阻400Ω的条件下施加一次电脉冲，冰浴10min；

(4)加入5mL CYM选择性再生培养基(含0.6M甘露醇，20μg/mL除草剂，1％低熔点琼脂糖；熔化后保持37～40℃)，混匀，倒入用30mL CYM选择性再生培养基(含1％琼脂糖)铺好的平板上，待上层培养基完全凝固后，将平板用封口膜封好置26℃培养；

(5)平板于26℃培养5-7天后，即可见到转化子菌落的再生。

转基因真菌的鉴定

(1)真菌的基因组DNA提取参考实施例2中真菌基因组DNA的小量制备。

(2)转基因真菌的PCR鉴定：以真菌的基因组DNA为模板，用PCR扩增VHb、ipt和iaaM的方法筛选阳性植株。

(3)转基因真菌的southren检测是用地高辛标记，具体方法请参考分子克隆实验指南第三版487-509页。

(4)转基因真菌的northern检测是用地高辛标记，具体方法请参考分子克隆实验指南第三版532-552页。

表1真菌PDA培养基配方

*马铃薯提取液：称取马铃薯200克，洗净、去皮、破碎，加入1000ml水，煮沸半小时，用纱布滤去渣滓即可。

表2真菌CYM固体培养基配方

表3真菌CYM液体培养基配方

六、序列表

<110>林忠平

<120>能产白藜芦醇的枝孢霉属(Cladosporium sp.)内生真菌

<151>2006-10-24

<160>1

<210>1

<211>1179

<212>DNA

<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1179)

<400>1

ATGGCTTCAG TTGAGGAATT TAGAATCGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC CACCATCCTA    60

GCCATTGGCA CTGCTACTCC AGACAACTGC GTCTACCAGT CTGATTACGC TGATTTCTAT    120

TTCAGAGTCA CAAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA TCGCATATGT    180

GAGAAATCAA TGATCAAGAA GCGTTATATT CATTTGACTG AAAAGATGCT TGAGGAGCAC    240

CCAAACATTG GTGCTTATAT GGCTCCATCT CTTAACATAC GCCAAGAGAT TATCACTGCC    300

GAGGTACCCA AGCTTGGTAA AGAAGCAGCA TTGAAGGCTC TAAAAGAGTG GGGCCAACCC    360

AAGTCCAAGA TCACCCATCT TGTATTTTGT ACAACCTCCG GTGTAGAAAT GCCTGGTGCA    420

GATTACAAAC TCGCTAATCT CTTAGGGCTT GAAACATCGG TCAGAAGAGT GATGTTGTAC    480

CATCAAGGGT GCTATGCAGG TGGAACTGTC CTCCGAACTG CTAAGGATCT TGCAGAGAAT    540

AATGCAGGAG CACGAGTTCT TGTGGTGTGC TCTGAGATCA CTGTTGTCAC ATTCCGTGGA    600

CCTTCCGAAA CTGCTTTGGA CTCTTTAGTT GGCCAAGCCC TTTTTGGTGA TGGGTCTGCA    660

GCTGTGATCG TTGGATCAGA TCCAGATATC TCGATTGAAC AACCACTTTT TCAACTCGTC    720

TCAGCAGCCC AAACATTTAT TCCTAATTCA GCAGGTGCCA TTGCCGGGAA CTTACGTGAG    780

GTGGGACTCA CATTTCATTT GTGGCCCAAT GTGCCAACTT TAATTTCTGA GAACATAGAG    840

AAATGCTTGA CTCAGGCTTT TGACCCACTT GGTATTAGCG ATTGGAACTC GTTATTTTGG    900

ATTGCTCACC CAGGTGGCCC TGCAATTCTT GATGCGGTTG AAGCAAAACT CAATTTAGAC    960

AAAAAGAAAC TTGAAGCAAC GAGCCATGTG TTAAGTGAGT ATGGCAACAT GTCAAGTGCA    1020

TGTGTGTTGT TTATTTTGGA TGAGATGAGA AAGAAATCAC TTAAGGGGGA GAAGGCCACC    1080

ACAGGTGAAG GATTGGATTG GGGAGTATTA TTTGGCTTTG GACCAGGCTT GACTATTGAG    1140

ACTGTTGTGT TGCATAGCAT TCCTATGGTT ACAAATTAA                           1179

<110>林忠平

<120>能产白藜芦醇的枝孢霉属(Cladosporium sp.)内生真菌

<151>2006-10-24

<160>1

<210>1

<211>882

<212>DNA

<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(882)

<400>1

TTAGCGAAAC TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA  60

CATGGATAAC CGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC TTCGGAAGGG  120

GTGTATTTAT TAGATAAAAA ACCAATGCCC TTCGGGGCTC CTTGGTGAAT CATAATAACT  180

TAACGAATCG CATGGCCCTG CGCCGGCGAT GGTTCATTCA AATTTCTGCC CTATCAACTT  240

TCGATGGTAG GATAGTGGCC TACCATGGTA TCAACGGGTA ACGGGGAATT AGGGTTCGAC  300

TCCGGGGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC ACATCCAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT  360

TACCCAATCC CGACACGGGG AGGTAGTGAC AATAAATACT GATACAGGGC TCTTTTGGGT  420

CTTGTAATTG GAATGAGTAC AATTTAAATC CCTTAACGAG GAACAATTGG AGGGCAAGTC  480

TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT GTTGCAGTTA  540

GAAAGCTCGT AGTTGAACCT TGGGCCTGGC TGGCCGGTCC GCCTCACCGC GTGTACTGGT  600

CCGGCCGGGC CTTTCCTTCT GGGGAACCTC ATGCCCTTCA CTGGGCGTGC TGGGGAACCA  660

GGACTTTTAC TTTGAAAAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAGGC CTTTGCTCGA ATACATTAGC  720

ATGGAATAAT AGAATAGGAC GTGTGGTTCT ATTTTGTTGG TCTCTAGGAC CGCCGTAATG  780

ATTAATAGGG ATAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAAGCGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTG  840

CTTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGA AT                     882

<110>林忠平

<120>能产白藜芦醇的枝孢霉属(Cladosporium sp.)内生真菌

<151>2006-10-24

<160>1

<210>1

<211>515

<212>DNA

<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)

<220>

<221>promoter

<222>(1)...(515)

<400>1

ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA  60

TTGATGTGAT ACTCCAAGAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG  120

ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT  180

CACTTCATCA AAAGGACAGT AGGAAAGGAA GGTGGCACCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT  240

AAAGGAAAGG CTATCGTTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA  300

CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT  360

TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCCGACG  420

GATCCTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA  480

TTTACAATAA CAATGGACTG TCTAGAGGAT CCGCC                             515

<110>林忠平

<120>能产白藜芦醇的枝孢霉属(Cladosporium sp.)内生真菌

<151>2006-10-24

<160>1

<210>1

<211>361

<212>DNA

<213>爬山虎枝孢霉(Cladosporium caulis)

<220>

<221>intron

<222>(1)...(361)

<400>1

TCTAATTTTA ACATCCTTTG CGTGCATATA ATTGTGTATA CATATGATAA AGCTTTTAGA    60

TTCACCTCAG AGTACCGAAA CATCTTTTTC AAGCTTTCTG TGTACTCATT TTTAAATTAA    120

TACAATGCAT CCGTGACTGA TGCTCAGAGC AGGTGCTCTT TCAATCATAC GGTATAAAGC    180

CTGGGGTCAT ATCATTAATG TAATAAGTAA TAAGAACAAG CTTTTATATT CTATTAAGAT    240

GAATCATTTT ATACTCACTG GAACAACAAA AACTATATAC ATATTATTGA GTACTACTTG    300

TGTTTTACTT GCAATGCCTT GAGCTCACAT ATTACTGTTT TTTAATTCTT ATACAGGTGA    360

C                                                                    361

七、专利菌种说明：

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该真菌分类名称为枝孢霉菌(Cladosporium sp.)，保藏代号为PSHEn，保藏编号为CGMCC No.1835，保藏日期为2006年10月12日。

总之，我们在葡萄科植物爬山虎中分离出了能产生白藜芦醇的内生真菌，该真菌为枝孢霉属，由于含有白藜芦醇合成途径的芪合酶，因此在离体培养条件下该真菌能够产生白藜芦醇。我们利用高效液相色谱(HPLC)和质谱(ESI-MS)分析技术检测了其产白藜芦醇的含量，通过实验证实了离体培养的该内生真菌也能产生产白藜芦醇，并将LeGDP/VHb基因和LeGDP/ipt基因，以及LeGDP/iaaM基因转化该菌株进行基因工程改良，结果在氧受限的条件下明显提高了真菌的代谢速度和生长量。这为通过发酵培养此真菌来大规模生产白藜芦醇开辟了一条新的途径，也为通过改进内生真菌与宿主植物的相互作用来提高白藜芦醇产量提供新的方法。

Claims (6)

1、从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，为枝孢霉属真菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号CGMCC No.1835。

2、根据权利要求1所述的从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，其特征在于18S rDNA片段882bp，如SEQ ID NO：2所示。

3、根据权利要求1所述的从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，其特征在于所述内生真菌含有能产生白藜芦醇的芪合酶基因，所述芪合酶基因完整编码区为1179bp，如SEQ ID NO：1所示。

4、根据权利要求3所述的从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，其特征在于所述芪合酶基因的5’调控区的部分序列515bp，如SEQ ID NO：3所示。

5、根据权利要求1所述的从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，其特征在于所述内生真菌的产物为具有药用和保健功能的白藜芦醇。

6、根据权利要求1所述的从爬山虎中分离出的一株能产生白藜芦醇的内生真菌，其特征在于所述内生真菌发酵后的产物为具有药用和保健功能的白藜芦醇。

Images