CN113456810A

CN113456810A - 一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113456810A
Application number: CN202010237511.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Hangzhou Xing'ao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xing'ao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-10-01
Also published as: WO2021196808A1

Abstract

一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用。本发明属于生物医药技术领域，具体发明了一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗：(1)由重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体与免疫激动剂构成的仿病毒颗粒疫苗，免疫激动剂包封于重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体中；或(2)由新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体与跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂构成的仿病毒颗粒疫苗，跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂为将免疫激动剂包封于跨膜肽偶联脂质体中制得；并且公布了其制备方法及在制备抗冠状病毒药物中的应用。该抗新冠病毒疫苗可显著诱导体液免疫和保护性细胞免疫，激发黏膜免疫、调节机体免疫稳态，增强体内免疫抗病毒功能，显著诱发抗新冠病毒的特异免疫功能，有效抑制冠状病毒肺炎。因此，该新型疫苗在制备预防和/或治疗新冠病毒肺炎临床药物中有广阔的应用前景。

Description

一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型抗新型冠状病毒治疗性疫苗及其制备方法和在制备抗冠状病毒药物中的应用。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肺肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病并没有特异治疗方法。新冠肺炎疫情发生以来，从医护人员、专家学者到普罗大众，最关注的焦点之一，就是可能对新冠肺炎有效的疗法与药物。目前，尚无新型冠状病毒肺炎 (COVID-19)的特效治疗药物，也未发现明确疗效的预防性药物，多种可能有效药物的临床试验正在迅速开展。新冠病毒与SARS和MERS同源性达到85％，考虑不同病毒可能有共同的靶点，因此，在没有特效药的情况下，探索老药新用成为相对较快速的策略。

抗新冠病毒的疫苗研发已经成为世界范围热点领域，目前研发的疫苗种类有多种，包括重组DNA疫苗、RNA疫苗、蛋白疫苗等。中国、美国、德国领先开展了疫苗临床实验，中国最先在临床应用的新冠病毒疫苗是重组DNA疫苗，美国临床研究的是RNA疫苗，全部都是应用于健康人的预防性抗病毒疫苗。上述疫苗仍处于研发、审批程序中。

天然病菌或病毒感染或其疫苗都可引起广泛的免疫，除了诱发体液免疫外，还会诱导肺部驻留记忆T细胞(TRM细胞)免疫。“复制性”疫苗的安全性和免疫原性之间必须达到微妙的平衡，并且其仅适用于某些人群。相比之下，“非复制性”肺炎病毒疫苗在呼吸道中诱导较差的T细胞免疫，并且需要有效的粘膜佐剂来克服呼吸道粘膜的免疫调节机制。然而，尽管进行了数十年的研究，仍然缺乏有效的粘膜佐剂。I型干扰素(IFN-Is)是针对病毒感染的保护性免疫的主要免疫介质，并且可以通过肺泡上皮细胞(AECs)以及免疫细胞的肺炎病毒感染而强烈诱导。因此，这两种细胞类型中的干扰素基因刺激因子(STING)可能会由病毒感染或复制疫苗诱导的免疫应答而被激活。然而，由于肺上皮细胞外形成了强大的屏障来阻止纳米颗粒和亲水性分子进入，在不破坏肺表面活性(PS)层完整性的情况下，将STING激动剂递送到AEC的胞质溶胶中仍然是一个巨大的挑战。

在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导内源强有力的免疫应答。内质网(ER)受体蛋白(STING)对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-I的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。STING是内质网的跨膜蛋白，内质网上具有一种ENPP1的水解酶。ENPP1 水解酶具有相当宽的底物特异性，包括ATP和NAD⁺，实验显示2'3'-cGAMP也是ENPP1 的底物。如何增加免疫激动剂的有效代谢时间，快速抵达肺部细胞是对科学家的艰巨挑战。

疫苗的主要作用在于预防疾病。针对正常的人体和动物体而言，疫苗的作用在于增强机体的防病和抗病能力，起到预防疾病的目的；对于患有某种疾病或者病患的人体和动物体而言，治疗性疫苗的作用要诱导机体产生针对特定致病因素的反应，达到消除病灶，治疗疾病或者病患的目的。因此，亟待开发新型抗新冠病毒治疗性疫苗，通过影响机体的免疫系统达到预防和/或治疗新冠病毒炎症的目的。

发明内容

本发明提供了一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法。该抗新冠病毒治疗性疫苗可显著诱发抗新冠病毒的特异免疫功能，有效抑制病毒性炎症，激发黏膜免疫、调节机体免疫稳态，增强体内免疫抗病毒功能。

一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗，所述疫苗为

(1).由重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体与免疫激动剂构成的仿病毒颗粒疫苗，所述免疫激动剂包封于重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体中；或

(2).由新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体与跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂构成的仿病毒颗粒疫苗，所述跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂为将所述免疫激动剂包封于跨膜肽偶联脂质体中制得；

免疫激动剂为天然免疫通路(cGAS-STING-cGAMP-IRF3通路)STING的激动剂或其过渡金属配合物，STING的激动剂为环二核苷酸2’3’-cGAMP或其衍生物；

重组新冠病毒抗原S蛋白为COVID-19病毒S蛋白或COVID-19病毒S蛋白的结构域衍生物；

跨膜肽为膜靶向肽或靶向膜囊泡关联蛋白；

新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体为：重组有COVID-19病毒S蛋白基因或COVID-19病毒S蛋白的结构域基因，并且缺失腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体。

优选地，COVID-19病毒S蛋白的结构域衍生物包括但不限于RBD、RBD-SD1或 RBD-SD1SD2。

优选地，膜靶向肽为单纯疱疹病毒糖蛋白的一段跨膜肽gH625，氨基酸序列为HGLASTLTRWAHYNALIRAFGGG，SEQ ID NO:1；

靶向膜囊泡关联蛋白的纳米抗体为anti-PV1 Nb,氨基酸序列为QVQLQQSGAE LVKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMYWVKQPPGQGLELIGEINPTNGDVNFNEMFKSK ATLTVDTSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTSIHYWGQGTLVTVSAGSG，SEQ ID NO:2。

优选地，STING的激动剂的过渡金属配合物制备方法为：过渡金属离子金属盐与STING的激动剂在水/醇混合溶剂中加热回流搅拌，静置过夜，过滤，产物经离子交换柱纯化制得。

上述新型抗新冠病毒治疗性疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)对重组新冠病毒抗原S蛋白进行巯基化；

(2)巯基化重组新冠病毒抗原S蛋白与脂质体化学键融合，并且包封免疫激动剂。

(1)对膜靶向肽或靶向膜囊泡关联蛋白的纳米抗体进行巯基化，得到巯基化跨膜肽；

(2)巯基化跨膜肽与脂质体化学键融合，包封免疫激动剂，得到跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂；

(3)跨膜肽偶联脂质体包封免疫激动剂与新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体混合。

上述新型抗新冠病毒治疗性疫苗在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病药物中的应用。

优选地，冠状病毒感染疾病包括但不限于人或动物感染冠状病毒引起的病毒性肺炎、病毒性肾炎、病毒性脑炎、病毒性肠炎或病毒性肝炎。

优选地，疫苗可单独制备成不同规格的单位制剂或通过药学上可接受的载体制备成药物制剂。

优选地，预防和/或治疗冠状病毒感染疾病药物包括静脉注射制剂、鼻腔滴注制剂、静脉滴注制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或口服制剂；口服制剂包括但不限于胶囊、片剂或颗粒剂。

本发明综合研究优化天然免疫激动剂、跨膜肽、脂质体的作用和优点，优化组成一种新型复合物，其能避免免疫激动剂体内过快降解，能快速靶向肺部免疫细胞，肺部上皮细胞，抑制病毒性炎症。

本发明研究表明，新型抗新冠病毒治疗性疫苗在预防和治疗冠状病毒药物中有潜在应用前景，可用于预防和治疗多种冠状病毒感染疾病包括新冠病毒性肺炎等病毒性炎症。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：新型抗新冠病毒治疗性疫苗的制备

(1)免疫激动剂的制备

免疫激动剂环二核苷酸2’3’-cGAMP，按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化 cGMP-AMP二核苷酸合成酶催化合成，纯度在98％以上。

环二核苷酸2’3’-cGAMP金属配合物([M(cGAMP)],M＝Zn,Mn,等过渡金属离子)由过渡金属离子金属盐(MnCl₂·4H₂O/或ZnCl₂,1mmol)与环二核苷酸2’3’-cGAMP(1mmol)在水/醇混合溶剂中加热回流搅拌反应6小时条件下生成，静置过夜，过滤，然后产物经离子交换柱纯化，得到纯的免疫激动剂金属配合物。环二核苷酸2’3’-cGAMP金属配合物经过金属含量分析和元素分析验证。

MncGAMP：化学式MnC₂₀H₂₂N₁₀O₁₃P₂,分子量727，元素分析百分含量(理论值)(％)：C,32.65(33.01)；H,2.98(3.03)；N,18.86(19.26)；Mn,7.21(7.56)。

ZncGAMP：化学式ZnC₂₀H₂₂N₁₀O₁₃P₂，分子量737，元素分析百分含量(理论值)(％)：C,32.28(32.56)；H,2.69(2.98)；N,18.68(18.99)；Zn,8.46(8.82)。

(2)重组新冠病毒抗原S蛋白(或膜靶向肽，或靶向膜囊泡关联蛋白纳米抗体)的制备

COVID-19病毒S蛋白(Spike protein，刺突蛋白)RBD结构域(S蛋白第319-541氨基酸序列结构域)按文献(Jun Lan et al.,Crystal structure ofthe 2019-nCoV spikereceptor-binding domain bound with the ACE2 receptor,BioRxiu,doi:https:// doi.org/10.1101/2020.02.19.956235)方法制备。

COVID-19病毒S蛋白或其RBD－SD1结构域(S蛋白第319-591氨基酸序列结构域)或RBD-SD1SD2结构域(S蛋白第319-732氨基酸序列结构域)按以上方法制备，用S蛋白基因或RBD－SD1结构域基因或RBD-SD1SD2结构域基因替换RBD结构域基因，表达纯化方法相同。

跨膜肽gH625含有23个氨基酸残基(H₂N-HGLASTLTRWAHYNALIRAFGGG-CONH₂)，分子量是2461Da，由生物技术公司固相合成。

靶向膜囊泡关联蛋白的纳米抗体(Anti-PV1Nb)基因表达载体质粒由上海生物基因公司合成制备，表达载体质粒采用pET-22b(+)，携带Amp+抗性，蛋白序列末端标记6His-tag 帮助纯化，用大肠杆菌高效表达体系，蛋白纯化方法用亲和柱NiNTA纯化，纯度达98％。冻干粉于超低温冰箱保存备用。

(3)新型疫苗I(VFI)的制备

首先，对COVID-19病毒S蛋白RBD-SD1结构域进行末端巯基化(加入EDTA溶液使EDTA终浓度为5mM，搅动下滴加巯基化试剂(Traut’s reagent，购于Sigma公司)，水浴中搅动后，避光孵育1小时，用脱盐柱除去过量巯基化试剂)。

用Ellman方法测定RBD-SD1蛋白上的巯基，验证RBD-SD1巯基化成功。

将脂质体材料(包括卵磷脂、胆固醇、1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-马来酰亚胺-聚乙二醇2000，按摩尔比例57:38:4:1混合)，溶解于甲醇：氯仿(1:9(v/v))溶剂中，在40℃水浴中真空旋干成膜；在65℃水浴中加入250mM(NH₄)₂SO₄水化成空白脂质体。用脂质体挤出器，经过200nm聚碳酸酯微孔滤膜挤出制备成均匀单室空白脂质体。

向单室空白脂质体中加入MncGAMP溶液，60℃孵育1h，加入末端巯基化的RBD-SD1(1mg空白脂质体:20μgRBD-SD1)，室温避光孵育过夜。用30kD的浓缩管，4000rpm，4℃除去未包封免疫激动剂和未连接RBD-SD1。

用TEM电镜检测所得到的复合物，双层圆形囊泡，形态良好，脂质体直径约为～185nm， Zeta电位～－23mV。免疫激动剂包封率为75％，4℃冷藏条件下稳定，使用2.5％海藻糖溶液制成冻干粉冷藏保存。

上述方法适用于其他免疫激动剂、其他重组新冠病毒抗原S蛋白各种组合的替换使用。

(4)跨膜肽(gH625或Anti-PV1Nb)偶联脂质体包封免疫激动剂的制备

按以上(3)的制备方法，用跨膜肽gH625或Anti-PV1Nb替换RBD-SD1蛋白，首先，对跨膜肽进行末端巯基化(在跨膜肽溶液中加入EDTA溶液使EDTA终浓度为5mM，搅动下滴加巯基化试剂Traut’s reagent，水浴中搅动后，避光孵育1小时；用脱盐柱除去过量巯基化试剂)。

用Ellman方法测定跨膜肽上的巯基，验证跨膜肽巯基化成功。

将脂质体材料(包括卵磷脂、胆固醇、1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-马来酰亚胺-聚乙二醇2000)，溶解于甲醇/氯仿混合溶剂中，在水浴中真空旋转蒸发干成膜，然后加入(NH₄)₂SO₄水化制成空白脂质体。用脂质体挤出器，经过200nm聚碳酸酯微孔滤膜挤出制备成均匀单室空白脂质体。

向单室空白脂质体中加入免疫激动剂溶液，60℃孵育1h，加入末端巯基化的跨膜肽(1mg 空白脂质体:20μg gH625或Anti-PV1Nb)，室温避光孵育过夜。用30kD的浓缩管，4000rpm，4℃除去未包封免疫激动剂药物和未连接跨膜肽gH625或Anti-PV1Nb。

用TEM电镜检测所得到的复合物(gH625偶联脂质体包封MncGAMP，免疫激动剂为MncGAMP，跨膜肽为gH625)，双层圆形囊泡，形态良好，脂质体直径约为～175nm，Zeta 电位～－22mV。免疫激动剂包封率为78％，4℃冷藏条件下稳定，使用3％海藻糖溶液制成冻干粉冷藏保存。

(5)新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体的制备

新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体由生物医药科技公司外包服务完成，采用缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体进行构建:

将目的基因(COVID-19病毒S蛋白基因或COVID-19病毒S蛋白的结构域基因)插入腺病毒穿梭质粒(缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体质粒)中，将确定正确的重组腺病毒穿梭质粒和骨架质粒(缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区)共转染，在293A细胞中进行包装，经过腺病毒扩增和CsCl纯化，然后对包装出的重组RBD－SD1腺病毒载体进行质检。质检包括对终产品病毒基因进行PCR和WB以确认目的基因的存在。

(6)新型疫苗II(VFII)

将gH625偶联脂质体包封MncGAMP与重组RBD－SD1腺病毒载体混合组成(200μgMncGAMP：重组RBD－SD1腺病毒载体1×10⁸腺病毒粒子)。最后将使用3％海藻糖溶液将此混合物制成冻干粉冷藏保存。

(7)新型疫苗III(VFIII)

新型疫苗III(VFIII)的制备方法同新型疫苗I(VFI)的制备，只是用ZncGAMP替换MncGAMP，其它方法步骤相同。用TEM电镜检测所得到的VFIII，双层圆形囊泡，形态良好，脂质体直径约为～187nm，Zeta电位～－24mV。免疫激动剂包封率为76％，4℃冷藏条件下稳定，使用2.5％海藻糖溶液制成冻干粉冷藏保存。

(8)新型疫苗IV(VFIV)

新型疫苗IV(VFIV)的制备方法同新型疫苗I(VFI)的制备，只是用cGAMP替换MncGAMP,抗原S蛋白结构域RBD替换抗原S蛋白结构域RBD-SD1，其它方法步骤相同。

用TEM电镜检测所得到的VFIV，双层圆形囊泡，形态良好，脂质体直径约为～184nm，Zeta电位～－23mV。免疫激动剂包封率为73％，4℃冷藏条件下稳定，使用2.5％海藻糖溶液制成冻干粉冷藏保存。

(9)制得的新型抗新冠病毒治疗性疫苗

新型疫苗I(VFI)，[抗原S蛋白结构域RBD-SD1偶联脂质体包封MncGAMP]

新型疫苗II(VFII)，[(gH625偶联脂质体包封MncGAMP)含重组RBD－SD1腺病毒载体]

新疫苗III(VFIII) [抗原S蛋白结构域RBD-SD1偶联脂质体包封ZncGAMP]

新疫苗III(VFIV) [抗原S蛋白结构域RBD偶联脂质体包封cGAMP]

免疫激动剂复合物I(FI)，[gH625偶联脂质体包封cGAMP](按步骤(4)制备)

免疫激动剂复合物II(FII)，[gH625偶联脂质体包封MncGAMP](按步骤(4)制备)

实施例2.新型抗新冠病毒治疗性疫苗特异免疫功能研究

实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，体重20－22g，6-8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005]。所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为 SPF级。

小鼠免疫：小鼠分组：每10只一组，共9组，分别为，A：VFI；B:VFII；C:VFIII； D：VFIV；E:FI；F：FII；G：RBD-SD1；H:RBD；I:PBS空白。

给药方式：鼻腔滴注。

给药剂量：

新型疫苗I(VFI)，(10mg/kg MncGAMP，100μg RBD-SD1)

新型疫苗II(VFII)，(10mg/kg MncGAMP+重组RBD－SD1腺病毒载体10⁸)

新型疫苗III(VFIII)，(10mg/kgZncGAMP，100μgRBD-SD1)

新型疫苗IV(VFIV)，(10mg/kg cGAMP，100μgRBD)

免疫激动剂复合物I(FI)，(10mg/kg cGAMP)

免疫激动剂复合物II(FII)，(10mg/kg MncGAMP)

抗原S蛋白结构域RBD-SD1 (100μg)

抗原S蛋白结构域RBD (100μg)

使小鼠处于麻醉状态，将小鼠以背卧姿势固定，并慢慢地分别将各组药溶液悬液通过小鼠鼻孔内壁逐滴滴入，滴入体积为60μL(每个鼻孔30μL)。将小鼠轻轻从工作台拿下，并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高，以保证小鼠顺畅的呼吸。待小鼠苏醒后，放回鼠笼。分别在第1，7，14天各给药一次，在第21天获得小鼠肺灌洗液和取血样。用ELISA 法测定免疫激动剂复合物及疫苗复合物诱导产生抗体的效价。

小鼠肺泡灌洗液获得方法：

取等体积PBS沿小鼠气管注射后吸出，反复几次，获得肺泡灌洗液。收集的血清，于－ 80℃保存。

实验结果见表1。测定结果显示，新型疫苗(VFI、VFII、VFIII、VFIV)及免疫激动剂脂质体复合物(FI、FII)均能显著剂或诱发免疫应答，新型疫苗(VFI、VFII、VFIII、VFIV) 的效果显著高于免疫激动剂复合物(FI、FII)及单独重组S蛋白结构域RBD-SD1/RBD。

表1.新型抗新冠病毒疫苗特异免疫功能效价

实施例3新型抗新冠病毒治疗性疫苗诱发保护性特异细胞免疫研究

小鼠饲养、给药等见实施例2。同型对照流式抗体购自eBiosciences,抗体磁株购于 MilitenyBiotech,流式细胞仪购于BD公司。三次给药免疫21天后取小鼠脾脏、肺组织，分别研磨捣碎，过40微米孔脱过滤细胞，1000rpm离心10分钟，分离未被裂解的免疫细胞，用抗体磁株分离DC(CD40\CD80\CD86\MHCII)、T(CD8+)细胞，加入对应的FAC抗体(用 FACS缓冲液稀释)，同型对照抗体作为阴性对照，抗体加入后孵育1小时后离心，用PBS 清洗，用流式细胞仪分析样品，分选合适的细胞，测定选定细胞的荧光强度(MFI)，流式结果见表2。流式细胞测定结果显示，新型疫苗(VFI、VFII、VFIII、VFIV)及免疫激动剂复合物(FI、FII)均能显著活化树突状细胞DC和T细胞，新型疫苗(VFI、VFII、VFIII、 VFIV)的效果显著高于免疫激动剂复合物(FI、FII)及抗原S蛋白结构域RBD-SD1/RBD。

表2.新型抗新冠病毒疫苗诱发保护性细胞免疫效果

实施例4.新型抗新冠病毒治疗性疫苗对小鼠冠状病毒性肺炎的抑制作用

实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，体重20－22g，6-8周龄，SPF级，来源于AmericanAnimals Inc.，所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。

动物分组：将60只小鼠随机分为10组(n＝6)，具体分组为：A组，正常对照组；B 组，肺炎模型组；C组，免疫激动剂复合物，FI组；D组，免疫激动剂复合物，FII组；E 组，新型疫苗VFI组；F组，新型疫苗VFII组；G组，新型疫苗VFIII组；H组，新型疫苗VFIV组；I组，抗原S蛋白结构域RBD－SD1组；J组，抗原S蛋白结构域RBD组。

肺炎病毒模型小鼠建立：

病毒株：适合在实验室使用的病毒株购于美国ATCC公司：冠状病毒(ATCC VR－841)，该研究中病毒实验操作委托美国American Animals Inc.病毒实验室完成。

鼻内滴注：使小鼠处于足够深的麻醉状态，将小鼠以背卧姿势固定，并慢慢地将VR－841病毒悬液通过小鼠鼻孔内壁逐滴滴入，为保证最大的肺部感染效率，滴入体积为60μL (每个鼻孔30μL)。将小鼠轻轻从工作台拿下，并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高，以保证小鼠顺畅的呼吸。待小鼠苏醒后，放回鼠笼。分别对C、D、E、F、G、H、I、J组小鼠在第2，8，15天各给药一次，慢慢地分别将各组药溶液悬液通过小鼠鼻孔内壁逐滴滴入，在第21天获得小鼠肺灌洗液和取血样。用ELISA法测定免疫激动剂复合物及疫苗复合物诱导产生保护性细胞免疫效价。

给药方式：鼻腔滴注；

给药剂量：

新型疫苗I(VFI)，(10mg/kg MncGAMP，100μg RBD-SD1)

新型疫苗II(VFII)，(10mg/kg MncGAMP+重组RBD－SD1腺病毒载体10⁸)

新型疫苗III(VFIII)，(10mg/kg ZncGAMP，100μg RBD-SD1)

新型疫苗IV(VFIV)，(10mg/kg cGAMP，100μg RBD)

免疫激动剂复合物I(FI)，(10mg/kg cGAMP)

免疫激动剂复合物II(FII)，(10mg/kg MncGAMP)

抗原S蛋白结构域RBD-SD1 (100μg)

抗原S蛋白结构域RBD (100μg)

小鼠肺泡灌洗液获得方法：取等体积PBS沿小鼠气管注射后吸出，反复几次，获得肺泡灌洗液。收集的血清，于－80℃保存。采用ELISA法，按试剂盒说明书检测TNF-alpha、IL-1beta 浓度。终止反应后，将酶标板放入酶标仪槽内，选择450nm波长检测，确定标准品和空白对照区域，检测相应的光密度值，然后绘制标准曲线并计算相应的浓度。在小鼠肺炎模型中，促炎性细胞因子IL-1beta和TNF-alpha在血清和肺泡灌洗液中的含量都显著上升，新型疫苗和免疫激动剂复合物给药后均不同程度地降低了两者的含量。新型疫苗(VFI、VFII、VFIII、 VFIV)的效果显著高于免疫激动剂复合物(FI、FII)及抗原S蛋白结构域RBD－SD1或RBD。不同药物显示抑制小鼠肺炎作用的结果见表3。

表3.新型抗新冠病毒疫苗对小鼠肺炎的治疗作用

实验结果表明，新型抗新冠病毒疫苗(VFI、VFII、VFIII、VFIV)和免疫激动剂脂质体复合物(FI、FII)均能不同程度地抑制小鼠肺炎促炎细胞因子，对小鼠病毒性肺炎炎症有明显的治疗作用。结果显示，新型抗新冠病毒疫苗(VFI、VFII、VFIII、VFIV)的抗小鼠肺炎的作用显著优于免疫激动剂脂质体复合物(FI、FII)及病毒抗原蛋白结构域RBD－SD1和 RBD。该类新型抗新冠病毒疫苗具有抗小鼠冠状病毒肺炎的作用。

实施例5新型抗新冠病毒治疗性疫苗的急性毒性研究

实验材料

ICR小鼠40只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK (沪)2007-0005])，雌雄各半，体重20～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。

实验方法

ICR小鼠按体重分别腹腔注射1g/kg的新型抗新冠病毒治疗性疫苗(VFI、VFII、VFIII、 VFIV)(PBS缓冲液配制)，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠腹腔注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

实验结果

上述急性毒性实验结果表明，腹腔注射给药最大耐受量MTD不低于1g/Kg，说明两种新型抗新冠病毒治疗性疫苗的急性毒性低。

序列表

<110> 杭州星鳌生物科技有限公司

<120> 一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu

1 5 10 15

Ile Arg Ala Phe Gly Gly Gly

20

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Ile His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105 110

Gly Ser Gly

115

Claims

1.一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗，其特征在于，所述疫苗为

(1).由重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体与免疫激动剂构成的仿病毒颗粒疫苗，所述免疫激动剂包封于重组新冠病毒抗原S蛋白偶联脂质体中；

或

所述免疫激动剂为STING的激动剂或其过渡金属配合物，所述STING的激动剂为环二核苷酸2’3’-cGAMP或其衍生物；

所述重组新冠病毒抗原S蛋白为COVID-19病毒S蛋白或COVID-19病毒S蛋白的结构域衍生物；

所述跨膜肽为膜靶向肽或靶向膜囊泡关联蛋白；

所述新冠病毒抗原S蛋白基因重组腺病毒载体为：重组有COVID-19病毒S蛋白基因或COVID-19病毒S蛋白的结构域基因，并且缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体。

2.根据权利要求1所述的一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗，其特征在于，

所述COVID-19病毒S蛋白的结构域衍生物包括但不限于RBD、RBD-SD1或RBD-SD1SD2。

3.根据权利要求1所述的一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗，其特征在于，

所述膜靶向肽为单纯疱疹病毒糖蛋白的一段跨膜肽gH625，氨基酸序列为HGLASTLTRWAHYNALIRAFGGG，SEQ ID NO:1；

所述靶向膜囊泡关联蛋白的纳米抗体为anti-PV1 Nb，氨基酸序列为QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMYWVKQPPGQGLELIGEINPTNGDVNFNEMFKSKATLTVDTSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTSIHYWGQGTLVTVSAGSG，SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1所述的一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对重组新冠病毒抗原S蛋白进行巯基化，得到巯基化重组新冠病毒抗原S蛋白；

5.根据权利要求1所述的一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求1所述的新型抗新冠病毒治疗性疫苗在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒感染疾病包括但不限于人或动物感染冠状病毒引起的病毒性肺炎、病毒性肾炎、病毒性脑炎、病毒性肠炎或病毒性肝炎。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗可单独制备成不同规格的单位制剂或通过药学上可接受的载体制备成药物制剂。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗冠状病毒感染疾病药物包括静脉注射制剂、鼻腔滴注制剂、静脉滴注制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或口服制剂；所述口服制剂包括但不限于胶囊、片剂或颗粒剂。