CN101007168B - 一种sars疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SARS疫苗及其制备方法。该SARS疫苗是以杆状病毒为载体，在其表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒。其制备方法包括以下步骤：1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；2)将SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，得到重组杆状病毒基因组质粒；3)将重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。本发明的疫苗具有以下优点：1)安全性高；2)免疫保护效果好；3)制备方法简单，易于大规模生产。本发明在SARS防治领域具有较高的实际应用价值。

Description

一种SARS疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及病毒病的疫苗及其制备方法，特别是涉及一种SARS疫苗及其制备方法。

背景技术

严重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)又称非典型性肺炎，是一种急性呼吸道传染病，2003年曾在全球范围内大流行。目前已经确认该病由一种变异的冠状病毒引起，世界卫生组织将其命名为SARS冠状病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。目前尚无针对SARS病毒的特效药，因此尽快研制出有效的病毒疫苗十分必要。传统的病毒疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗制备简单，但是对于SARS-Cov这样的高致病性病毒而言，在灭活苗的生产和使用过程中都存在着很高的安全隐患；弱毒疫苗相对安全，但是研制周期长，难以应急。活载体疫苗是近年来基因工程疫苗研究的热点之一，其特点是采用非致病型微生物(如痘病毒、腺病毒)作为载体构建含有病毒蛋白抗原的重组体。活载体疫苗的突出优点在于：(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，引起良好的免疫效果；(2)可同时构成多价以及多联疫苗；(3)疫苗用量少，免疫保护时间长，不需添加佐剂。

S蛋白是SARS冠状病毒表面的一个重要蛋白，为一跨膜糖蛋白，由1255个氨基酸残基组成，包括一个N端的信号肽(自氨基端第1-11位)，一个大的胞外区(自氨基端第12-1190位)和一个较短的跨膜区及胞内区(自氨基端第1191-1255位)。S蛋白能够与细胞受体结合，在病毒侵染细胞过程中起重要作用；此外，S蛋白以三聚体的形式突出于病毒表面，也是主要的抗原决定位点。S蛋白基因的核苷酸序列在NCBI数据库中的序列号为：DQ231462。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防严重急性呼吸道症候群(SARS)的疫苗。

本发明所提供的SARS疫苗，是在表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒；所述SARS冠状病毒S蛋白囊膜表面结构域具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

其中作为载体的杆状病毒可以是任一的杆状病毒。

本发明的第二个目的是提供一种上述SARS疫苗的制备方法。

本发明所提供的SARS疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；所述展示载体中自5’至3’端顺次连接有杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽(gp64 SP)编码序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区(S ectodomain)编码序列，gp64蛋白或水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)的跨膜区和胞内区的编码序列；

2)将步骤1)构建的SARS冠状病毒S胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，通过同源重组得到重组杆状病毒基因组质粒；

3)将步骤2)获得的重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的出芽型SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。

在上述制备方法中，所述步骤1)中杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列，gp64蛋白的跨膜区和胞内区具有序列表中SEQ ID№：4的氨基酸残基序列，水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区具有序列表中SEQ ID、№：5的氨基酸残基序列；用于构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体的出发载体可为pFastBac DUAL、pFastBac I等，优选为pFastBacDUAL；以pFastBac DUAL为出发载体，构建的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体为S-gp64-DUAL或S-vsvG-DUAL。

步骤2)中含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞为E.coliDH10Bac，优选为E.coli DH10Bac；将S-gp64 DUAL转染E.coli DH10Bac后得到的重组杆状病毒基因组质粒为S-gp64-Bacmid；将S-vsvG-DUAL转染E.coliDH10Bac后得到的重组杆状病毒基因组质粒为S-vsvG-Bacmid。

步骤3)中可用于转染的昆虫动物细胞为sf9细胞或sf21等，优选为sf9细胞。

上述制备方法适用于包括AcMNPV和家蚕NPV在内的所有使用重组杆状病毒表面展示技术制备的SARS疫苗。

本发明提供了一种SARS疫苗及其制备方法。该SARS疫苗是以杆状病毒(Baculovirus)作为载体，利用杆状病毒表面展示技术构建的以SARS-CoV S蛋白胞外区为抗原的重组杆状病毒。具体来讲，本发明疫苗的构建原理是，将SARS-CoV的S蛋白胞外区的N端融合杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽，C端融合gp64(或水疱性口炎病毒的G蛋白，VSV-G)的跨膜区和胞内区，该重组蛋白在昆虫细胞内表达后被分选到细胞膜上，最后被包装于出芽型的杆状病毒的囊膜表面，从而达到表面展示的目的。本发明的疫苗具有以下优点：1)安全性高，杆状病毒本身为一种昆虫病毒，在哺乳动物细胞中无法复制，对哺乳动物没有任何毒性且不具备潜在的危险性；2)免疫保护效果好，由于杆状病毒本身的免疫特性，该活载体疫苗能够同时引起机体的体液免疫系统和细胞免疫系统，体液免疫系统能够产生对重组于杆状病毒表面的SARS-CoV S蛋白产生特异性的中和抗体，产生的中和抗体不仅能和血液中的病毒粒子结合，还可以阻断病毒和受体的结合从而阻断病毒进入细胞，细胞免疫系统则可以消除已被病毒感染的细胞，此外，利用杆状病毒表面展示技术可将外源蛋白完整的展示于重组杆状病毒表面，并能极大程度地维持外源蛋白的天然构象，从而使外源蛋白具有良好的免疫原性，有效的引起免疫反应，实验证明，将本发明的SARS-CoV S蛋白的重组杆状病毒免疫小鼠后，可在小鼠血清中检测到针对S蛋白的中和抗体的产生，对病毒感染具有较好的抑制效果；3)制备方法简单，易于大规模生产。基于上述优点，本发明在医学，特别是SARS的防治领域具有较高的实际应用价值。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为SARS疫苗制备方法的流程图

图2为S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL的物理图谱

图3为S-gp64及S-vsvG重组病毒分别感染Sf9细胞38小时、48小时后表达的S蛋白的Western blot检测结果

图4为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白利gp64蛋白的Western blot检测结果

图5为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒的S蛋白免疫荧光检测结果

图6为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒的免疫电镜检测结果

图7为S-gp64及S-vsvG重组病毒对低浓度假病毒感染小鼠的免疫和中和活性测试结果

图8为S-gp64及S-vsvG重组病毒对高浓度假病毒感染小鼠的免疫和中和活性测试结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度均为质量百分浓度，所用引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

实施例1、SARS疫苗的制备

采用Invitrogen公司的Bac-to-Bac体外转座系统(货号：10359-016，10608-016)并按照说明书构建本发明的SARS疫苗，制备方法的流程图如图1所示，具体方法包括以下步骤：

一、SARS冠状病毒S蛋白胞外区cDNA的亚克隆

根据SARS冠状病毒S蛋白基因的cDNA全长序列(序列表中的SEQ ID №：1)设计引物，PCR扩增S蛋白胞外区cDNA片段，引物序列如下：

Fs-12：5’-ggg

agtggtagtgaccttgacc-3’(方框内碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)

Rs-1190：5’-attggg

gttgctcatattttcccaattc-3’(方框内碱基为限制性内切酶Not I识别位点)

以含SARS冠状病毒S蛋白基因的cDNA全长序列的质粒为模板，在引物Fs-12和Rs-1190的引导下，使用高保真Pyrobest酶(TaKaRa公司)用常规PCR方法扩增SARS冠状病毒S蛋白胞外区基因的cDNA片段，经琼脂糖电泳纯化和回收后的cDNA片段待用。

二、构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体

以Bac-to-Bac体外转座系统中的供体质粒pFastBac DUAL为载体，构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体。具体方法为：首先，将杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽(gp64 SP)的编码序列(gp64 SP是gp64蛋白自氨基端第1-34位氨基酸残基，具有系列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列)用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切后，与经BamH I酶切的载体pFastbac DUAL连接，将其引入pFastbac DUAL的BamHI位点；然后，将gp64蛋白和水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)的跨膜区和胞内区(gp64 TM+CTD是gp64蛋白自氨基端第471-512位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列；VSV-G TM+CTD是VSV-G蛋白自氨基端第441-511位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列位氨基酸)的编码序列用限制性内切酶Pst I和Hind III酶切后，分别与经Pst I和Hind III酶切的上述连有gp64信号肽编码序列的线性载体连接，将其引入相应位点；最后，将步骤一得到的的SARS冠状病毒S蛋白胞外区(S ectodomain)的cDNA片段用限制性内切酶BamH I和Not I酶切后，与经BamH I和Not I酶切的上述连有gp64信号肽和gp64 TM+CTD(或VSV-G TM+CTD)编码序列的线性载体连接，得到两种SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体，分别命名为S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL，其物理图谱和插入序列位置如图2所示。

三、SARS冠状病毒S蛋白胞外区重组杆状病毒的获得

将步骤二构建的S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL供体质粒分别用热激法转入E.coliDH10Bac感受态细胞(Invitrogen)中进行同源重组，重组后得到两种杆状病毒基因组质粒，分别命名为S-gp64-Bacmid和S-vsvG-Bacmid，经纯化后再将上述两种杆状病毒基因组质粒分别通过脂质体介导法转染Sf9细胞，72小时后收集转染细胞上清，上清内即含有出芽型的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子，分别命名为S-gp64和S-vsvG。将上述收集的感染细胞上清5000g，10分钟低速离心去除细胞碎片(沉淀)，再4℃、100,000g超速离心2小时，得到粗提的纯化病毒(沉淀)。用1/100离心前体积的PBS悬浮沉淀，并进行蔗糖密度梯度离心，取出病毒条带，经透析后即可作为用于人体免疫的SARS疫苗。

实施例2、S-gp64及S-vsvG重组病毒表面S蛋白的鉴定

一、Western blot及免疫荧光鉴定结果

将实施例1获得的S-gp64及S-vsv6重组病毒分别感染Sf9细胞后，通过Westernblot及免疫荧光的方法对Sf9细胞中表达的S蛋白和纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒进行初步检测，以野生型杆状病毒为对照。感染后38小时、48小时后Sf9细胞中表达的S蛋白的Western blot检测结果如图3所示(wt Bac为野生型杆状病毒)，在感染后38小时、48小时后的Sf9细胞中均可检测到约175KDa的S蛋白条带，且感染后48小时后S蛋白的表达量显著提高。纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白和gp64蛋白的Western blot检测结果如图4所示(A为S蛋白检测结果，B为gp64蛋白检测结果；wt Bac为野生型杆状病毒)，结果仅在纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒中检测到S蛋白，而在纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒均可检测到约64KDa的gp64蛋白。分别感染有S-gp64、S-vsvG重组病毒的Sf9细胞的免疫荧光检测结果如图5所示(Sf9细胞为对照)，S蛋白分布于Sf9转染细胞的质膜上。

二、免疫电镜鉴定结果

在免疫电镜下对纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白进行鉴定，鉴定结果如图6所示，胶体金颗粒分布于重组病毒表面，在S-gp64中分布于病毒的一端(a中的黑箭头)，而在S-vsvG中则分布于整个病毒表面(b中的黑箭头)和类似膜(b中的白箭头)的结构中，而在野生型杆状病毒(c)和仅用胶体金二抗标记的S-gp64病毒中(d)则没有特异性的胶体金颗粒分布。

上述鉴定结果表明S-gp64及S-vsvG重组病毒表面正确展示有S蛋白。

实施例3、S-gp64及S-vsvG重组病毒的小鼠免疫和中和活性测试

分别取0.1mL纯化的S-gp64及S-vsvG重组病毒皮下注射6周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后的第11天以相同剂量加强免疫一次，第25天检测小鼠血清中中和抗体的活性，中和活性是通过测定小鼠抗血清对一种S蛋白-HIV假病毒的感染抑制效果来测定的，以野生型杆状病毒免疫的鼠血清为阴性对照(wt Bac)，其对假病毒感染没有抑制作用；以SARS康复患者的血清为阳性对照(Positive，实验中稀释度为1∶200-3200)，其对假病毒感染具有明显的抑制作用。低浓度假病毒感染(病毒感染浓度为0.2ng/孔)的中和活性检测结果如图7所示(A为S-gp64实验组，B为S-vsvG实验组)，高浓度假病毒感染(病毒感染浓度为10ng/孔)的中和活性检测结果如图8所示(A为S-gp64实验组，B为S-vsvG实验组)，在1∶20稀释度水平下，所有重组病毒免疫抗血清都可抑制约80％的假病毒感染，表明其含有针对S蛋白的中和抗体，具有很高的中和活性，而在1∶80至1∶160稀释度水平下，重组病毒免疫抗血清的抑制能力下降至50％。上述中和活性测试结果表明本发明的重组S蛋白的杆状病毒能够有效地引起中和抗体的产生，是一种有效的针对SARS-CoV的候选疫苗。

序列表

<160>5

<210>1

<211>3768

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus，Coronaviridae)

<400>1

atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc    60

acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt    120

tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt    180

ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc    240

atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt    300

tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct    360

actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt    420

tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact    480

ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa    540

cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat    600

caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt    660

aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct    720

gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact    780

acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa    840

aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac    900

cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca    960

aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg    1020

gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt    1080

ttttcaacct ttaagtgtta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc    1140

aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga    1200

caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc    1260

cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat    1320

aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc    1380

tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat    1440

tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct    1500

tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt    1560

aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct    1620

tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat    1680

tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgctc ttttgggggt    1740

gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat    1800

gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc    1860

atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag    1920

catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac    1980

catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct    2040

ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt    2100

tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt    2160

aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc    2220

ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca    2280

cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt    2340

ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt    2400

gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc    2460

gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt    2520

acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt    2580

agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt    2640

gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag    2700

aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt    2760

acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca    2820

ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat    2880

gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca    2940

ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc    3000

agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa    3060

agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat    3120

ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg    3180

ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat    3240

ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac  3300

aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat  3360

gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat  3420

catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac  3480

attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt  3540

gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc  3600

ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact  3660

agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag  3720

gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa               3768

<210>2

<211>1179

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus，Coronaviridae)

<400>2

Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala

1               5                   10                  15

Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro

            20                  25                  30

Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe

        35                  40                  45

Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr

    50                  55                  60

Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala

65                  70                  75                  80

Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met

                85                  90                  95

Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val

            100                 105                 110

Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala

        115                 120                 125

Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn

    130                 135                 140

Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp

145                 150                 155                 160

Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe

                165                 170                 175

Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile

            180                 185                 190

Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile

        195                 200                 205

Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu

    210                 215                 220

Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala

225                 230                 235                 240

Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp

                245                 250                 255

Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu

            260                 265                 270

Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile

        275                 280                 285

Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg

    290                 295                 300

Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala

305                 310                 315                 320

Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn

                325                 330                 335

Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr

            340                 345                 350

Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe

        355                 360                 365

Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg

    370                 375                 380

Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys

385                 390                 395                 400

Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn

                405                 410                 415

Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu

            420                 425                 430

Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro

        435                 440                 445

Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr

    450                 455                 460

Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr

465                 470                 475                 480

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro

                485                 490                 495

Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln

            500                 505                 510

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr

        515                 520                 525

Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val

    530                 535                 540

Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu

545                 550                 555                 560

Asp Ile Ser Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly

                565                 570                 575

Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys

            580                 585                 590

Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp

        595                 600                 605

Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys

    610                 615                 620

Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro

625                 630                 635                 640

Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg

                645                 650                 655

Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala

            660                 665                 670

Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn

        675                 680                 685

Phe Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys

    690                 695                 700

Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys

705                 710                 715                 720

Ala Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg

                725                 730                 735

Ala Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val

            740                 745                 750

Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe

        755                 760                 765

Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr

    770                 775                 780

Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala

785                 790                 795                 800

Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn

                805                 810                 815

Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu

            820                 825                 830

Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu

        835                 840                 845

Val Ser Gly Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala

    850                 855                 860

Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile

865                 870                 875                 880

Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn

                885                 890                 895

Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr

            900                 905                 910

Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

        915                 920                 925

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile

    930                 935                 940

Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala

945                 950                 955                 960

Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln

                965                 970                 975

Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser

            980                 985                 990

Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser

        995                 1000                1005

Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe

    1010                1015                1020

Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr

    1025                1030                1035

Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys

    1040                1045                1050

His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe

    1055                1060                1065

Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro

    1070                1075                1080

Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp

    1085                1090                1095

Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln

    1100                1105                1110

Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys

    1115                1120                1125

Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

    1130                1135                1140

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn

    1145                1150                1155

Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu

    1160                1165                1170

Leu Gly Lys Tyr Glu Gln

    1175

<210>3

<211>34

<212>PRT

<213>杆状病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV，

Baculoviridae)

<400>3

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1               5                   10                  15

Ser Ala Phe Ala Ala Glu His Cys Asn Ala Gln Met Lys Thr Gly Pro

            20                  25                  30

Tyr Lys

<210>4

<211>42

<212>PRT

<213>杆状病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV，

Baculoviridae)

<400>4

Met Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly

1               5                   10                  15

His Val Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr

            20                  25                  30

Cys Met Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr

      35         40

<210>5

<211>71

<212>PRT

<213>水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，Rhabdoviridae)

<400>5

Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly

1               5                   10                  15

Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile

            20                  25                  30

Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu

        35                  40                  45

Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln IIe Tyr Thr Asp Ile

    50                  55                  60

Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

65                  70

Claims (6)

1.一种SARS疫苗，是在表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒；所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：2。

2.一种权利要求1所述的SARS疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；所述展示载体中自5’至3’端顺次连接有杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽编码序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区编码序列，gp64蛋白或水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列；所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2；

2)将步骤1)构建的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，得到重组杆状病毒基因组质粒；

3)将步骤2)获得的重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的出芽型SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。

3.根据权利要求2所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：3，gp64蛋白的跨膜区和胞内区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №4，水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：5。

4.根据权利要求2或3所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体为S-gp64-DUAL或S-vsvG-DUAL。

5.根据权利要求4所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述重组杆状病毒基因组质粒为S-gp64-Bacmid或S-vsvG-Bacmid。

6.根据权利要求2或3所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中用于转染的昆虫细胞为sf9细胞或sf21细胞。

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