CN112996810B

CN112996810B - 针对cd20和cd3的双特异性抗体及其用途

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Publication number: CN112996810B
Application number: CN201980071461.9A
Authority: CN
Inventors: 李强; 贾世香; 马心鲁; 崔雪原; 张玉华; 陈思
Original assignee: Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: KR20210089697A; EP3875489A4; CA3118397A1; CN112996817B; US20220002431A1; EP3875479A4; CA3118238C; CN112996817A; AU2019370758A1; JP7308560B2; CN112955461A; AU2019370758B2; US12466886B2; CN111138547A; CN112996810A; CN111138542B; CN111138546B; WO2020088403A1; JP2022512997A; CN112996807A

Abstract

一种双特异性抗体，特异性结合免疫细胞的表面抗原CD3和肿瘤细胞表面的CD20抗原，并能够以高亲和力与人CD3结合并诱导T细胞增殖，介导肿瘤细胞杀伤作用。该双特异性抗体在体外测试可用于介导T细胞特异杀伤靶细胞，其构建方法简单，避免了异源双特异性抗体两组轻链与重链错配的可能性，从而降低了抗体纯化的难度，得到的抗体亲和力高，引起的细胞因子副作用小，安全性高。

Description

针对CD20和CD3的双特异性抗体及其用途

相关申请

本申请要求2018年11月1日提交的中国专利申请CN 201811294887.4的优先权。以上所引用的优先权申请的内容全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种针对CD20和CD3的双特异性抗体，以及所述抗体的用途，特别是其在治疗肿瘤中的用途。

背景技术

在细胞免疫过程中，T淋巴细胞扮演着重要的角色。T细胞所介导的细胞免疫主要是通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)特异识别细胞表面由主要组织相容性复合物(MHC)所递呈的抗原肽，进而激活T细胞胞内信号，对该靶细胞进行特异杀伤。这对及时清除体内病变的细胞及预防肿瘤的发生起着至关重要的作用。由于多数肿瘤细胞表面的MHC的表达下调甚至缺失，使其能够逃逸免疫杀伤，从而发生肿瘤。

T细胞结合双特异性抗体(T cell-engaging bispecific antibodies，TCBs)代表了一种非常有效的将激活的细胞毒性T细胞重定向到肿瘤的方式。CD3作为T细胞受体的一部分，表达于成熟T细胞，能够转导TCR识别抗原所产生的活化信号。TCBs能够同时结合表面肿瘤抗原和T细胞受体的CD3ε亚基，在T细胞和肿瘤细胞之间建立一个物理连接，从而有效的激活静息状态的T细胞杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的效果(Smits N C,Sentman C L,Journal of Clinical Oncology,2016:JCO649970)。因为T细胞双特异性抗体不依赖于传统的MHC抗原提呈及共刺激分子的双重激活信号来活化T细胞，它们消除了对肿瘤特异性免疫的需要，并克服了肿瘤微环境中T细胞的功能障碍。

近年来，为了解决将两个不同的半抗体进行正确装配问题，科学家们设计开发了多种结构的双特异性抗体。总体归结起来有两大类，一类双特异性抗体不含Fc区，包括BiTE、DART、TrandAbs、bi-Nanobody等。这类结构双抗优点是分子量小，可以在原核细胞中表达，不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体Fc段，分子量较低，导致其半衰期较短，且这种形式的双抗极易聚合、稳定性差且表达量低，因而临床应用受到一定限制。另一类双特异性抗体保留Fc结构域，例如Triomabs、kih IgG、Cross-mab、orthoFab IgG、DVDIgG、IgG scFv、scFv₂-Fc等构型。此类双抗形成IgG样结构，分子结构较大，并且由FcRn介导的细胞内吞和再循环过程，使其具有更长的半衰期；同时保留了Fc介导的部分或全部效应子功能，如抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞吞噬(ADCP)。然而这类双抗也不能完全杜绝错配产物的生成，而任何错配分子的残留级分都很难从产物中分离，并且这种方法需要针对两个抗体序列进行大量的突变等基因工程改造，无法达到简单、通用的目的。

CD20分子是一种非糖基化的Ⅲ型跨膜蛋白，主要参与调解B淋巴细胞的增殖与分化，作为人体免疫系统B细胞表面标志性抗原，仅存在于前B细胞和成熟B细胞的表面，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。因此，CD20可作为B细胞肿瘤和自身免疫性疾病研究的靶点。目前已有多种CD20单克隆抗体药物上市，用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋白细胞白血病(CLL)和类风湿关节炎等，效果良好，其作用机制主要有补体依赖性细胞毒性反应、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用以及提高细胞对细胞毒作用的敏感性，杀死表达CD20的肿瘤细胞。虽然抗CD20肿瘤靶向策略在临床应用中已显现出很大的潜力，但并非所有的患者皆对抗CD20治疗有响应，且某些患者显示对抗CD20治疗发生抗性(例如，对利妥昔单抗具有抗性)。因此，靶向CD20和CD3的双特异性抗体能够增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，可用于CD20抗原阳性的B细胞恶性肿瘤的治疗，包括非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等，在肿瘤的免疫治疗领域具有广阔的应用前景。

因此，本发明旨在开发一种在产品半衰期、稳定性、安全性和可生产性方面具有改善性能的CD20双特异性分子。

发明内容

本发明目的是提供一种靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤抗原CD20的四价同源二聚体型双特异性抗体分子，这种双特异性抗体在体内能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，但对低表达CD20的正常细胞的非特异性杀伤作用显著降低，同时具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用，且其理化和体内稳定性都显著提高。

具体的，本发明的第一个方面，公开了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤抗原CD20的第一单链Fv、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。

其中，所述第一单链Fv针对肿瘤相关抗原CD20具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L1)连接，所述VH、L1和VL以VH-L1-VL或VL-L1-VH的顺序排列，且所述连接肽L1的氨基酸序列为(GGGGX)_n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；

例如，本发明表6-1中示例性的例举了一些优选的针对肿瘤相关抗原的第一单链Fv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列。

本发明的一优选实施例中，所述连接肽L1的氨基酸序列为(GGGGS)3，在其他优选实施例方案中，所述连接肽L1的氨基酸序列还包括(GGGGS)1或(GGGGS)2或(GGGGS)4或(GGGGS)5或(GGGGA)1或(GGGGA)2或(GGGGA)3或(GGGGA)4或(GGGGA)5。

优选的，所述的第一单链Fv，其选自下组：

(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：1、2和3所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：4、5和6所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：7、8和9所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：10、11和12所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：13、14和15所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：16、17和18所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：19、20和21所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：22、23和24所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

更优选的，所述第一单链Fv，其选自下组：

(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(iv)VH结构域包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

其中，连接本发明所述第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成。

进一步地，所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。更优地，所述柔性肽包含G和S残基。最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为G_xS_y(GGGGS)_z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。例如，在一优选实施例中，所述柔性肽的氨基酸序列为G₂(GGGGS)₃。

进一步地，所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：33所示)或其截短的片段(以下统称为CTP)。优选地，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：33N端的10个氨基酸，即SSSSKAPPPS(CTP¹)；或所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：33C端的14个氨基酸，即SRLPGPSDTPILPQ(CTP²)；又如，另一实施例中，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：33N端的16个氨基酸，即SSSSKAPPPSLPSPSR(CTP³)；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性肽包含28个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第118位，终止于第145位，即SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(CTP⁴)。

例如，本发明表3中示例性的例举了一些优选的连接第一和第二单链Fv的连接肽L2的氨基酸序列。

在本发明的一优选实施例中，所述连接肽L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示，其柔性肽的氨基酸组成为G₂(GGGGS)₃，和其刚性肽的氨基酸组成为SSSSKAPPPS(即CTP¹)。

其中，第二单链Fv针对免疫效应细胞抗原CD3具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L3)连接，所述VH、L3和VL以VH-L3-VL或VL-L3-VH的顺序排列，且所述连接肽L3的氨基酸序列为(GGGGX)_n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；

优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv在体外FACS结合分析测定中以大于50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM的EC₅₀值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。在本发明的一优选实施例中，所述双特异性抗体以132.3nM的EC₅₀值与效应细胞特异性结合。

例如，本发明表2中示例性的例举了一些优选的抗-CD3 scFv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列。

优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：34、35和36所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：37、38和39所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：40、41和42所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：43、44和45所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

更优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

更优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

本发明的一优选实施例中，所述连接肽L3的氨基酸序列为(GGGGS)3，在其他优选实施例方案中，所述连接肽L3的氨基酸序列还包括(GGGGS)1或(GGGGS)2或(GGGGS)4或(GGGGS)5或(GGGGA)1或(GGGGA)2或(GGGGA)3或(GGGGA)4或(GGGGA)5。

其中，本发明所述Fc片段直接或通过连接肽L4与第二单链Fv相连，且所述连接肽L4包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；较优地地，所述连接肽L4选自Gly(G)和Ser(S)；更优选地，所述连接肽L4组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。本发明的一优选实施例中，所述Fc片段与第二单链Fv直接相连。

另一方面，本发明所述Fc片段包含来源于人免疫球蛋白重链恒定区的铰链区、CH2和CH3结构域，例如，在某些实施方案中，本发明所述Fc片段来源于例如选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地选自例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且，所述Fc片段与其所源自的天然序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个置换、缺失或添加)。

在一些优选实施方案中，所述Fc片段被改变，例如被突变，以修饰本发明所述双特异性抗体分子的性质(例如改变下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、效应细胞功能或补体功能)。

例如，本发明提供的双特异性抗体包含具有改变的效应子功能(例如降低或消除)的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、ADCP、CDC等。通过替换抗体的Fc区中的氨基酸残基，以改变抗体对效应子配体(如FcγR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能的方法是本领域已知的(参见，例如EP 388,151A1；US 564,8260；US 562,4821；Natsume A等,Cancer Res.,68:3863-3872,2008；Idusogie EE等,J.Immunol.,166:2571-2575,2001；Lazar GA等,PNAS,103:4005-4010,2006；Shields RL等,JBC,276:6591-6604,2001；Stavenhagen JB等,Cancer Res.,67:8882-8890,2007；Stavenhagen JB等,Advan.Enzyme.Regul.,48:152-164,2008；Alegre ML等,J.Immunol.,148:3461-3468,1992；和Kaneko E等,Biodrugs,25:1-11,2011)。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸L235(EU编号)进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如L235E或L235A。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸234和235同时进行修饰，例如L234A和L235A(L234A/L235A)(EU编号)。

例如，本发明提供的双特异性抗体可包含具有延长的循环半衰期的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。研究发现M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S或者T250Q/M428L都能够延长抗体在灵长类动物中的半衰期。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2、US 2005/0014934A1、WO 97/43316、US 5,869,046、US 5,747,03、WO 96/32478。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸M428(EU编号)进行修饰以增强FcRn受体的结合亲和力，例如M428L。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸250和428(EU编号)同时进行修饰，例如T250Q和M428L(T250Q/M428L)。

例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有可以降低或消除Fc糖基化的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。例如，Fc变体包含正常存在于氨基酸位点297(EU编号)处的N-连接聚糖降低的糖基化。N297位糖基化对IgG的活性有很大影响，如果该位点糖基化被移除，则会影响IgG分子CH2上半部分的构象，从而丧失对FcγRs的结合能力，影响抗体相关的生物活性。在本发明的一些优选实施例中，对人IgG恒定区上的氨基酸N297(EU编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如N297A。

例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有消除电荷异质性的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。在工程细胞表达过程中发生的多种翻译后修饰会都会引起单克隆抗体的电荷异质性，而IgG抗体C末端赖氨酸的不均一性是其中的一个主要原因，重链C端的赖氨酸K可能在抗体生产过程中出现一定比例的缺失，从而造成电荷异质性，从而影响抗体的稳定性、有效性、免疫原性或药代动力学。在本发明的一些优选实施例中，将IgG抗体C末端的K447(EU编号)去除或缺失，以消除抗体的电荷异质性，提高表达产物的均一性。

本发明表4中示例性的例举了一些优选的Fc片段的氨基酸序列。与包含野生型人IgG Fc区的双特异性抗体相比，本发明提供的双特异性抗体所包含的Fc片段对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。例如，在本发明的一优选实施例中，双特异性抗体包含的Fc片段来自人IgG1，且具有L234A和L235A取代(L234A/L235A)，显示出对FcγRI降低的结合能力；此外，本发明提供的双特异性抗体包含的所述Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。例如，在本发明的一优选实施例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，它与其所源自的天然序列相比具有L234A/L235A/T250Q/N297A/P331S/M428L的氨基酸置换或取代，且K447被缺失或删除。

本发明所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链通过Fc片段铰链区的链间二硫键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链自N端至C端依次由抗-CD20 scFv、连接肽、抗-CD3 scFv和Fc片段组成。

本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD20和CD3，其氨基酸序列如下：

(1)SEQ ID NO：50所示的序列；

(2)与SEQ ID NO：50所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或

(3)与SEQ ID NO：50所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

在某些优选的实施方案中，(2)中所述的置换是保守置换。

本发明的第二方面，提供了编码上述双特异性抗体的DNA分子。

本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供了包含上述DNA分子的载体。

本发明的第四方面，提供了包含上述载体的宿主细胞；所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，进一步优选为CHO细胞。

本发明第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含上述双特异性抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明的第六方面，还提供了制备本发明所述双特异性抗体的方法，其包括：

(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；

(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染到宿主细胞中；

(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；

(d)分离、纯化产生的所述抗体。

其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为质粒，更优选地，所述表达载体为PCDNA3.1；

其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，进一步优选为CHO细胞。

其中，步骤(d)通过常规的免疫球蛋白纯化方法，包含蛋白质A亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法分离、纯化所述双特异性抗体。

本发明第七方面，提供了所述双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤的实例包括但不限于：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B淋巴细胞性白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、B细胞淋巴瘤(BCL)、T细胞淋巴瘤(TCL)(例如皮肤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、毛细胞白血病(HCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)(例如结外或脾)、滤泡性淋巴瘤(FL)(例如儿童型或胃肠道)、幼B淋巴细胞白血病(B-PLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、淋巴母细胞白血病(ALL)(例如B细胞)、淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)(例如B细胞)、浆母细胞性淋巴瘤(PBL)(例如B细胞)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，原发部位或炎症相关)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤、间变性大细胞淋巴瘤和HIV相关淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症。

本发明第八方面，提供了所述双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解自身免疫性或炎症性疾病的药物中的用途，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自：类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、反应性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、多发性硬化症、硬皮病、牛皮癣、牛皮癣关节病、溃疡性结肠炎(例如，慢性)、胰岛素依赖性糖尿病(例如，青少年)、甲状腺炎(例如，慢性)、甲状腺机能亢进、哮喘、变态反应性疾病、结节病、自身免疫溶血性贫血、恶性贫血、移植物抗宿主病、皮肌炎、慢性肝炎、微观肾脉管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、肠滑膜炎、自身免疫肠疾病、特发性白细胞减少症、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、间质肺炎、慢性天疱疮、寻常型天疱疮、动脉炎、结节性多动脉炎和强直性脊柱炎。

本发明第九方面，提供了一种用于增强或刺激免疫应答或功能的方法，其包含对所述个体施用治疗有效量的所述双特异性抗体或所述药物组合物。

本发明第十方面，提供了一种用于预防/治疗疾病、延迟其进展、降低/抑制其复发的方法，所述疾病包含免疫相关疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病或移植排异反应相关疾病或病症等疾病或病症，其包括将有效量的所述双特异性抗体或所述药物组合物给予或施用至所述患有以上疾病或病症的个体。

优选地，上述方法可与一种或多种额外的其他疗法组合施用，其中其他疗法选自下组：手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法及其组合。

本发明公开的技术方案，取得了有益的技术效果，概况如下：

1、本发明提供的双特异性抗体包含的抗-CD20 scFv位于双抗的N端，空间构像发生变化，与CD的结合能力在某些条件下可能减弱，尤其不易结合弱表达或低表达CD20的正常细胞，减少了非特异性杀伤，但对过表达或高表达CD20的细胞的结合特异性没有显著下降，表现出良好的体内杀伤效果。由此亦知，当靶抗原仅表达于肿瘤细胞上或本发明所述双特异性抗体仅与过表达靶抗原的肿瘤细胞特异性结合时，使得免疫效应细胞限制性仅在靶细胞组织内被激活，这使得所述双特异性抗体对正常细胞的非特异性杀伤以及细胞因子的伴随释放能够被降至最低，减小其在临床治疗中的毒副作用。

2、本发明提供的双特异性抗体选择的抗-CD3 scFv以微弱的结合亲和力(EC₅₀值大于50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM)与效应细胞特异性结合，此外因被包埋在抗-CD20 scFv和Fc之间，且位于其N端的连接肽L3包含的CTP刚性肽和位于其C端的Fc片段，都部分“遮盖”或“屏蔽”了抗-CD3scFv的抗原结合域，这种位阻效应使其以更微弱的结合亲和力(例如以大于1μM)与CD3结合，这使其对T细胞的活化刺激能力减弱，因而限制了细胞因子的过度释放，因而具有更高的安全性。另外，本发明采用的抗-CD3 scFv可同时结合人和食蟹猴和/或恒河猴的CD3天然抗原，使其临床前毒理学评价不需要再构建替代分子，且获得的有效剂量、毒性剂量和毒副反应更客观、准确，可以直接进行临床剂量的转换，降低临床研究的风险。

3、本发明提供的双特异性抗体创造性地采用了二价抗-CD3 scFv，这使得所述双特异性抗体在构型设计上规避了现有技术普遍所采用的异源二聚体型(所包含的抗-CD3scFv为单价)的非对称结构，因而也不存在重链间错配的问题，简化了下游纯化步骤；并且出人意料地，在体外细胞结合试验中未观察到抗-CD3 scFv与T细胞的非特异性结合，且细胞激活程度(IL-2等细胞因子的释放)控制在安全、有效的范围内，即本发明采用的二价抗-CD3 scFv结构并未引起非抗原依赖地诱导T细胞的过度活化，而对其他包含二价抗-CD3结构域的双特异性抗体而言，T细胞被不可控地过度激活是普遍存在的，因而抗-CD3双特异性抗体在设计时一般避免引入二价抗-CD3结构。

4、本发明提供的双特异性抗体所包含的经修饰的Fc片段不具有FcγR结合能力，避免了由FcγR所介导的T细胞全身性激活，因而允许免疫效应细胞限制性地仅在靶细胞组织内被激活。

5、本发明提供的双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配的问题，下游生产工艺稳定，纯化步骤简单高效，表达产物均一，且其理化和体内稳定性都显著提高。

发明详述

缩写和定义

BiAb 双特异性抗体(bispecific antibody)

CDR 用Kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区

EC₅₀ 产生50％功效或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区

HRP 辣根过氧化物酶

IL-2 白细胞介素2

IFN 干扰素

IC₅₀ 产生50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统

mAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

V区在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

K_D 平衡解离常数

k_a 结合速率常数

k_d 解离速率常数

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

“CD20”是B淋巴细胞表面的特异性的标志性分子，表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达，与抗体结合后无显著内化和脱落，不发生抗原凋变，可作为治疗B细胞淋巴瘤的理想作用靶点。CD20主要经ADCC、CDC等作用发挥抗肿瘤作用。近年来，针对CD20靶点的适应症不断被拓展，包括例如自身免疫性疾病(包括多发性硬化症、克隆氏症)、炎症性疾病(例如溃疡性结肠炎)等。针对CD20靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CD20的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CD20基因或cDNA转染的细胞表达。

CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志，由6条肽链组成，以非共价键与T细胞抗原受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，不仅参与TCR-CD3复合体的胞浆内组装，而且通过各多肽链胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)传递抗原刺激信号。CD3分子的主要功能为：稳定TCR结构，传递T细胞活化信号，当TCR特异性识别并结合抗原后，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，作为诱导T细胞活化的第一信号，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。

“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分，由三个不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering)，导致T细胞的活化，与T细胞受体介导的活化类似，但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别CD3，例如但不限于在下列专利中提到的CD3抗体：US7,994,289，US6,750,325；US6,706,265；US5,968,509；US8,076,459；US7,728,114；US20100183615。优选地，本发明中使用的抗人CD3抗体与食蟹猴和/或恒河猴具有交叉反应性，例如但不限于下列专利中提到的抗人CD3抗体：WO 2016130726，US 20050176028，WO2007042261或WO 2008119565。该术语还包括任何CD3变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞天然地表达，或在以编码前述的链的基因或cDNA转染的细胞上表达。

术语“抗体”具体包括单克隆抗体、多克隆抗体和抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体。“抗原结合片段”包括通过任何已知技术提供的片段，例如酶裂解，肽合成和重组技术。一些抗原结合片段由保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的完整抗体部分组成。例如，抗原结合片段可以包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链或轻链可变区)或一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的实例包括但不限于双特异性抗体和单链分子以及Fab，F(ab')2，Fc，Fabc和Fv分子，单链(Sc)抗体，单独的抗体轻链，单独的抗体重链，抗体链或CDR和其他蛋白质之间的嵌合融合物，蛋白质支架，重链单体或二聚体，轻链单体或二聚体，由一个重链和一个轻链组成的二聚体，由VL，VH，CL和CH1结构域，或如WO2007059782中所述的单价抗体，包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，dAb片段(Ward等人,Nature,1989,341:544-54)，其基本上由VH结构域组成，也称为结构域抗体(Holt等人,Trends Biotechnol.2003,21(11)：484-90)；或纳米体(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1)：111-24)；分离的互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可以包括非抗体蛋白质框架，其可以成功地将多肽片段并入赋予给定的感兴趣抗原(例如蛋白质支架)的亲和力的取向。可以通过完整抗体的酶切或化学切割来重组产生或产生抗原结合片段。术语“抗体或其抗原结合片段”可以用于表示给定的抗原结合片段掺入短语中提到的抗体的一个或多个氨基酸片段。

术语“超变区”或“CDR区”或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基，是非连续的氨基酸序列。CDR区序列可以由IMGT、Kabat、Chothia和AbM方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。例如，超变区包含以下氨基酸残基：来自序列比对所界定的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.；和/或来自根据结构来界定的“超变环”(HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基，参见Chothia和Leskl,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987。“构架”残基或“FR”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。本领域技术人员可以明确地将每种系统赋予任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身之外的任何实验数据。例如，给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与每种“标准”编号序列对比同源区来确定。基于本文提供的序列的编号，确定序列表中任何可变区序列的编号方案完全在本领域技术人员的常规技术范围内。

术语“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，是通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相交联以形成抗原结合位点，接头序列一般由柔性肽组成，例如但不限于G₂(GGGGS)₃。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994)The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,Rosenburg和Moore主编,Springer-Verlag,New York,第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。

术语“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。

术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分。

术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

术语“Fc”区指抗体重链恒定区片段，其包含至少铰链区、CH2和CH3结构域。

术语“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区，是包含完整抗原识别和结合位点的最小片段。

术语“Fd片段”由一条重链的CH1及可变区组成，是Fab片段除去轻链后剩下的重链部分。

术语“连接肽”是指连接两个多肽的肽，其中所述连接肽可以是两个免疫球蛋白可变区或一个可变区。连接肽的长度可以是0-30个氨基酸或0-40个氨基酸。在一些实施方案中，连接肽可以是0-25、0-20或0-18个氨基酸长度。在一些实施方案中，连接肽可以是不多于14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长的肽。在其它实施方案中，连接肽可以是0-25、5-15、10-20、15-20、20-30或30-40个氨基酸长。在其它实施方案中，连接肽可以是约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。连接肽是本领域技术人员已知的。连接肽的制备可以采用本领域任何方法。例如，连接肽可以是合成来源的。

术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施例中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。

术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。

术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域连接至CH2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域(Roux KH等,J.Immunol.,161:4083,1998)。

术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸含有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区由二硫键连接并且两个重链由两个二硫键连接，在对应于使用Kabat编号系统的239和242处(位置226或229，EU编号系统)连接。

“结合”定义抗原上的特定表位与其对应抗体之间的亲和性相互作用，一般也理解为“特异性识别”。“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。和特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。

术语“双特异性抗体”指本发明的双特异性抗体，例如抗CD20抗体或其抗原结合片段可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如TAA、细胞因子和细胞表面受体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。例如，“双特异性抗体”是指包含两个可变结构域或scFv单位使得所得抗体识别两种不同抗原。本领域已知双特异性抗体的许多不同的形式和用途(Chames P等,Curr.Opin.Drug Disc.Dev.,12:.276,2009；Spiess C等,Mol.Immunol.,67:95-106,2015)。

术语“hCG-β羧基末端肽(CTP)”是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)。CTP含有37个氨基酸残基，它具有4个O-糖基化位点，糖侧链终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期(Fares FA等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4304-4308,1992)。

术语“糖基化”意思是低聚糖(含有连接在一起的两个或更多个单糖、例如连接在一起的2个到约12个单糖的碳水化合物)附着形成糖蛋白。低聚糖侧链通常通过N-或O-连接连接到糖蛋白的骨架上。本文公开的抗体的低聚糖通常是连接到Fc区的CH2结构域，作为N-连接的低聚糖。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物类部分连接到糖蛋白链的天冬酰胺残基上。例如，技术人员可以识别鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD的CH2结构域中的每一个在残基297处有用于N-连接的糖基化的单一位点。

术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。

与新生儿受体(FcRn)结合亲和力改变的Fc变体

这里使用的“FcRn”指结合IgG抗体Fc区的至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。功能性FcRn蛋白包含经常被称为重链和轻链的两条多肽，轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。

本发明涉及对FcRn的结合被调节的抗体(调节包括增加以及降低结合)。例如：在有些情况下，增加的结合会导致细胞再循环抗体，并由此延长，例如治疗抗体的半衰期。有时，降低FcRn结合是合乎需要的，例如用作包含放射标记的诊断抗体或治疗抗体。另外，对FcRn的结合显示出增加，同时对其他Fc受体，例如FcγRs的结合被改变的抗体可以用于本发明。

本申请涉及包含调节对FcRn的结合力的氨基酸修饰的抗体。具有特殊意义的是在较低的pH时，对FcRn的结合亲和力显示出增加，而在更高的pH时，结合基本上不显示出改变的最低限度地包含Fc区的抗体或其功能性变体。

与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体

IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434(EU编号)中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian DC等,Nat.Rev.Immunol.,7:715-725,2007)。韩国专利号KR10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Hinton PR等,J.Immunol.,176:346-356,2006)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等,MAbs.Taylor&Francis,4:267-273,2012)。

其他可引起本发明抗体与FcRn亲和力增强的突变点包括但不限于以下氨基酸修饰：226,227,230,233,239,241,243,246,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,298,299,301,302,303,305,307,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,433,438,439,440,443,444,445,446，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

与FcRn结合亲和力增强的Fc变体还包括其他一切公知的氨基酸修饰位点以及尚未被发现的氨基酸修饰位点。

在可选择的实施方式中，可以优化IgG变体使其具有增加或降低的FcRn亲和力，以及增加或降低的人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和包括他们的等位基因变异的FcγRIIIb亲和力。

优先地，IgG变体的Fc配体特异性将决定它的治疗应用。给定IgG变体用于治疗目的将取决于靶抗原的表位或形式，以及待治疗的疾病或适应症。对大多数靶和适应症来说，增强的FcRn结合可是更优选的，因为增强的FcRn结合可以导致血清半衰期延长。较长的血清半衰期允许治疗时以较低的频率和剂量给药。为了使需要重复给药的适应症作出反应而施用该治疗剂时，这种特性可是特别优选的。对一些靶和适应症来说，当需要变体Fc具有增加的清除或降低的血清半衰期时，例如当Fc多肽用作显象剂或放射治疗剂时，降低的FcRn亲和力可是特别优选的。

延长半衰期的Fc改变

本文所述“延长半衰期的Fc改变”是指与包含相同Fc多肽、但其不包含改变的相似Fc蛋白质的半衰期相比，Fc多肽链中延长包含改变的Fc多肽链的蛋白质的体内半衰期的改变。所述改变可包含在作为双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。改变T250Q、M252Y、S254T和T256E(第250位的苏氨酸变为谷氨酰胺；第252位的甲硫氨酸变为酪氨酸；第254位的丝氨酸变为苏氨酸；和第256位的苏氨酸变为谷氨酸；根据EU编号进行编号)为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利7,083,784中。美国专利7,083,784中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。

同样地，M428L和N434S为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中。美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。

此外，按照本文含义，在以下位点之一处的任何置换都可被认为是延长半衰期的Fc改变：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。这些改变中的每一个或者这些改变的组合可用于延长本文所述双特异性抗体的半衰期。其它可用于延长半衰期的改变详细描述于2012年12月17日提交的国际申请PCT/US2012/070146(公开号:WO 2013/096221)中。这一申请中描述上述改变的部分以引用的形式并入本文。

延长半衰期的Fc改变还包括包含公知技术及未来可能被发现的位点及其修饰。

Fc可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。

编码双特异性抗体的核酸

使用本文描述的治疗剂和抗体或抗体片段，本领域技术人员可容易地构建含有功能等价核酸(例如序列不同、但编码相同的效应部分或抗体序列的核酸)的多个克隆。因此，本发明提供了双特异性抗体、编码抗体、抗体片段和缀合物及其融合蛋白的核酸、核酸变体、衍生物和物种同源物。

本领域已知许多编码包含VH、VL、铰链、CH1、CH2、CH3和CH4区的免疫球蛋白区的核酸序列。参见，如，Kabat等.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。根据本文提供的教导，本领域技术人员可将所述核酸序列和/或本领域已知的其它核酸序列结合，以构建编码本发明双特异性抗体的核酸序列。编码本发明双特异性抗体的示例性核苷酸包括SEQ ID NO：51。

此外，基于本文和其它地方提供的氨基酸序列及本领域常识，本领域技术人员可以确定编码本发明双特异性抗体的核酸序列。除较传统的生产编码特定氨基酸序列的克隆DNA片段的方法外，现今如DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)和Blue Heron(Bothell,WA,USA)等公司通常采用化学合成来生产任意期望顺序排序的基因大小的DNA，从而简化生产所述DNA的过程。

制备双特异性抗体的方法

可采用本领域任何已知的方法制备本发明双特异性抗体。早期构建双特异性抗体的方法有化学交联法或杂合杂交瘤或四价体瘤法(例如，Staerz UD等,Nature,314:628-31,1985；Milstein C等,Nature,305:537-540,1983；Karpovsky B等,J.Exp.Med.,160:1686-1701,1984)。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出双特异性单克隆抗体。例如两种不同单克隆抗体的化学结合，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学结合。杂合—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的。虽然这些技术用于制造BiAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标BiAb、低产率、生产费用高等。

最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一BiAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames&Baty,Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.,12:276-83,2009；Chames&Baty,mAbs,1:539-47)。相关纯化技术是公知的。

还可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生抗体，例如由Babcook J等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:7843-7848,1996；WO 92/02551；WO 2004/051268和WO 2004/106377所述的方法。

用于产生例如用于免疫宿主或用于淘选诸如用于噬菌体展示(或酵母细胞或细菌细胞表面表达)的抗体的抗原多肽可以通过本领域熟知的方法从包含表达系统的遗传工程改造的宿主细胞制备，或者它们可以是从天然生物来源回收。例如，可将编码双特异性抗体的一条或两条多肽链的核酸通过多种已知的方法(如转化、转染、电穿孔、用核酸包被的微粒轰击等)引入培养的宿主细胞。在一些实施方案中，编码双特异性抗体的核酸在被引入宿主细胞前可先插入至适于在宿主细胞中表达的载体中。典型的所述载体可包含使插入的核酸能够在RNA和蛋白质水平上表达的序列元件。

所述载体是本领域公知的，并且许多是商购可获得的。含有所述核酸的宿主细胞可在能够使细胞表达该核酸的条件下培养，且得到的BiAb可从细胞群或培养基中收集。可选地，BiAb可在体内生产，例如，在植物叶片中(参见，如Scheller J等,NatureBiotechnol.,19:573-577,2001和其中引用的参考文献)，鸟蛋中(参见，如Zhu L等,NatureBiotechnol.,23:1159-1169,2005和其中引用的参考文献)，或哺乳动物的奶中(参见，如Laible G等,Reprod.Fertil.Dev.,25:315,2012)。

可以使用的多种培养的宿主细胞包括，例如，原核细胞、真核细胞、细菌细胞(如大肠杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacilisstearothermophilus))、真菌细胞(如酿酒酵母或毕赤酵母)、昆虫细胞(如包括草地夜蛾细胞在内的鳞翅目昆虫细胞)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞、Hela细胞、人肝细胞癌细胞或293细胞等等)。

双特异性抗体可通过双特异性抗原的免疫原性制剂免疫合适的受试者(例如，兔，山羊，小鼠，或其它哺乳动物，包括转基因的和经剔除的上述哺乳动物)制备。合适的免疫原性制剂可以是，例如化学合成的或重组表达的双特异性抗原。所述的制剂可进一步包含佐剂，例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂或类似的免疫刺激化合物。而且，当用于制备抗体时，特别是通过体内免疫的方式，本发明的双特异性抗原可以单独使用，或优选地作为与载体蛋白的偶联物。这种加强抗体应答的方法是本领域所公知的。根据所需的抗体不同，可使用不同的动物宿主进行体内免疫。可使用自身表达有用的内源抗原的宿主，或使用已导致有用内源抗原缺陷的宿主。

双特异性抗体可通过结合的以上所述的方法制备。

本发明所述双特异性抗体分子可以作为关于每个靶点的单克隆抗体(MAb)。在一些实施方案中，抗体是嵌合的、人源化或全人的。

单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，诸如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,Nature,256:495-497,1975)，三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor D等，Immunology Today,4:72,1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole SPC等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)。

本发明的双特异性抗体，或其部分可通过常规的免疫学分析方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫分析(RIA)或组织免疫组织化学用于检测任一或所有这些抗原(例如在生物样品，如血清或血浆中)。本发明提供检测生物样品中的抗原的方法，该方法包括：使所述生物样品与本发明的可特异识别所述抗原的双特异性抗体，或抗体部分抗原相接触，并检测与抗原结合的抗体(或抗体部分)，或非结合抗体(或抗体部分)，由此检测所述生物样品中的所述抗原。所述抗体用可检测的物质进行直接或间接的标记，以便于检测结合或非结合抗体。合适的可检测物质包括多种酶，修复基团，荧光物质，发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶；合适的修复基团复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括7-羟基香豆素，荧光素，荧光素异硫氰酸盐，硷性蕊香红B，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括3-氨基邻苯二甲酰环肼；合适的放射性物质的例子包括I¹²⁵、I¹³¹、³⁵S或³H。

药物组合物

本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸可以应用于制备药物组合物或无菌组合物，例如，将双特异性抗体与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合。药物组合物可包括一种或组合的(如两种或更多不同的)本发明的双特异性抗体。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合的具有互补活性的抗体或抗体片段(或免疫缀合物)的组合。治疗和诊断剂的制剂可通过以例如冻干粉末、浆液、水性溶液或悬浮液的形式与药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备。

术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括糖类(如乳糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油、明胶、多元醇(如丙二醇)、海藻酸等。

在一些优选实施方案中，本发明药物组合物用于治疗、预防或缓解的疾病包括但不限于：癌症、淋巴系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、感染性疾病、免疫缺陷综合症以及其他相关疾病或症状。

双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸可连接至上述药学上可接受的载体或其组分的一些物质(作为免疫复合体)或与其分开施用。在后一种情况下，双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸可在上述药学上可接受的载体或其组分的一些物质之前、之后或与其共同施用，或可与其他已知疗法(如抗癌疗法、如辐射)共同施用。

本发明的组合物可以是多种形式。其包括例如，液体，半固体和固体的剂量形式，例如液体溶液(例如，可注射的和不熔化的溶液)分散剂或悬浮剂片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的方式依赖于施用方式和治疗用途。典型的优选组合物是可注射的或不熔化的溶液，例如那些类似于用其他抗体对人进行被动免疫的组合物。施用路径可以有多种形式，包括经口、直肠、经粘膜、经肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。优选的施用形式是非肠道的(例如静脉内，皮下，腹膜内，肌内)。在优选的实施方案中，所述的抗体通过静脉内注入或注射施用。在另一优选的实施方案中，所述的抗体通过肌内或皮下注射。

以上组合方法、治疗方法及施用方法是公知的，也包括未来可能发展的组合、治疗及施用方法。

本发明的药物组合物可以是两种药物的组合，可以是与已上市的类似功能相同产品或者增加治疗效果的产品的组合。

组合疗法

本发明涵盖双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可与一或多种活性治疗剂(例如化学治疗剂)或其他预防或治疗模式(例如，辐射)组合的用途。在此类组合疗法中，各种活性剂经常具有不同的互补作用机制，组合疗法可能导致协同效应。组合疗法包含影响免疫反应(例如增强或活化反应)之治疗剂及影响(例如抑制或杀死)肿瘤/癌细胞之治疗剂。组合疗法可降低抗药性癌细胞发生的可能性。组合疗法可允许试剂中的一或多种试剂剂量减少，以减少或消除与试剂中之一或多种相关的不良作用。此类组合疗法可对潜在疾病、病症或病状具有协同的治疗或预防作用。

“组合”包括可以分开施用的疗法，例如针对单独投药分开调配(例如，可以在套组中提供)，及可以按单一调配物(亦即，“共调配物”)一起投与的疗法。在某些实施例中，本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可依次序施用。在其他实施例中，双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可同时施用。本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可以与至少一种其他(活性)药剂以任何方式组合使用。

用本发明双特异性抗体治疗可以与可有效针对待治疗病症的其他治疗组合。本发明抗体组合治疗的非限制性实例包括手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法。

组合疗法还包括其他一切公知技术中已有的以及未来可能发展的部分。

附图说明

图1、双特异性抗体AP062纯化样品的SEC-HPLC检测结果。

图2、双特异性抗体AP062纯化样品的SDS-PAGE电泳结果。

图3、双特异性抗体AP062在5℃加速实验的SDS-PAGE结果。

图4、双特异性抗体AP062在25℃加速实验的SDS-PAGE结果。

图5、流式细胞检测双特异性抗体AP062与CD20阳性肿瘤细胞结合的能力。

图6、双特异性抗体AP062介导效应细胞杀伤Raji-luc细胞的能力。

图7、报告基因法检测双特异性抗体AP062和AB7K7活化Jurkat NFATRE Luc细胞的能力。

图8、双特异性抗体AP062在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图9、双特异性抗体AP062在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图10、正常食蟹猴多次给予双特异性抗体AP062后的白细胞和淋巴细胞变化。

具体实施方式

通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。

以下各实施例中，实验所用物料可购买，也可参照现有公开的技术制备；未标明来源和规格的均为市售可得；未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1、双特异性抗体分子表达载体的构建

本发明构建的双特异性抗体分子由两条相同的多肽链通过Fc片段铰链区的链间二硫键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链自N端至C端依次由抗-CD20 scFv、连接肽L2、抗-CD3 scFv和Fc片段组成，抗-CD20scFv和抗-CD3 scFv内部的VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。表1例举了一些优选的CD20第一单链Fv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列，其CDR区所含氨基酸残基根据Kabat规则定义。其中，抗-CD20 scFv的VH和VL之间的连接肽L1氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3，4或5。

表1、双特异性抗体包含的抗-CD20 scFv的氨基酸序列及其CDR区氨基酸序列

其中，抗-CD3 scFv在体外FACS结合分析测定中以大于约50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM的EC₅₀值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。

表2中例举了一些优选的抗-CD3 scFv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列，其CDR区所含氨基酸残基根据Kabat规则定义。其中，抗-CD3 scFv的VH和VL之间的连接肽L3氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3，4或5。

表2、双特异性抗体包含的抗-CD3 scFv的氨基酸序列及其CDR区氨基酸序列

其中，连接抗-CD20 scFv和抗-CD3 scFv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；优选地，柔性肽的氨基酸组成结构通式为G_xS_y(GGGGS)_z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。而刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：33所示)或其截短的片段；优选地，所述CTP刚性肽组成为SSSSKAPPPS(CTP¹)。表3中例举了一些优选的连接抗-CD20scFv和抗-CD3 scFv的连接肽L2的氨基酸序列。

表3、连接抗-CD20 scFv和抗-CD3 scFv的连接肽的氨基酸序列

SEQ ID NO：52	G2(GGGGS)3CTP1	GGGGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
			SEQ ID NO：53	(GGGGS)3CTP1	GGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
SEQ ID NO：54	GS(GGGGS)2CTP1	GSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
			SEQ ID NO：55	(GGGGS)1CTP4	GGGGSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

其中，Fc片段直接或通过连接肽与抗-CD3 scFv相连，连接肽包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)，更优地自Gly(G)和Ser(S)，最优选地，所述连接肽组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。

Fc片段优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且Fc是突变的，以修饰双特异性抗体分子的性质，例如，对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。此外，Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。

表4中例举了一些具有一个或多个氨基酸突变的Fc片段的氨基酸序列。

表4、人IgG Fc氨基酸序列

示例性的，优选的双特异性抗体AP062的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示。

按常规分子生物学方法合成上述双特异性抗体的编码基因，并将获得的融合基因的编码cDNA分别插入到经PCDNA3.1改造后的真核表达质粒pCMAB2M的相应酶切位点间。质粒pCMAB2M还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，pCMAB2M表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而在存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增目的基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。

实施例2、双特异性抗体分子的表达

将上述构建的表达质粒转染哺乳动物宿主细胞系，以表达双特异性抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染。在电穿孔中，用设置为300V电场和1500μFd电容的Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的5×10⁷个细胞中加入50μg表达载体质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用极限稀释亚克隆转染子，并用ELISA方法测定各细胞系的分泌率。筛选出高水平表达双特异性抗体的细胞株。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过5(较佳地约15)μg/10⁶(即百万)个细胞/24h的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养。收集细胞上清并分离纯化双特异性抗体。

实施例3、双特异性抗体的纯化工艺及稳定性试验

3.1、双特异性抗体的纯化

采用三步层析法对双特异性抗体进行纯化。分别为亲和层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure 25M。本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。

第一步，亲和层析：采用博格隆公司的AT Protein A Diamond或其它市售的亲和介质(例如GE公司的MabSelect Sure亲和层析介质等)进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer(20mM PB，150mM NaCl，pH 7.4)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；将经过澄清后的发酵液以100-200cm/h的线性流速上样，载量不高于20mg/mL填料；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，150mM NaCl，pH 7.4)以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer 1(50mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用去污buffer 2(50mM NaAc-HAc，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer(50mM NaAc-HAc，pH 3.5)，以不高于100cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰。

第二步，羟基磷灰石层析：使用BIO-RAD公司的CHT TypeⅡ或其它市售的羟基磷灰石介质进行中间纯化，用于降低聚合体含量。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质上的差异，包括电荷特性以及钙离子螯合等作用，我们使用电荷特性等的差异对二者进行分离。首先，使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；第一步亲和层析分离得到的目标蛋白调pH 7.0，然后上样，载量控制在<5mg/ml；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱buffer(20mM PB，1M NaCl，pH7.0)，以0-25％梯度洗脱，以不高于100cm/h的线性流速洗脱10个柱体积(CV)，对洗脱组分进行分段收集，分别送检SEC-HPLC。将单体百分比大于95％的目标组分合并进行下一步层析。

第三步，阴离子交换层析：使用GE公司的DEAE Sepharose Fast Flow或其它市售的阴离子交换层析介质(例如博格隆的Q HP、TOSOH的Toyopearl GigaCap Q-650、天地人和的DEAE Beads 6FF，赛分科技的Generik MC-Q、Merck的Fractogel EMD TMAE、Pall的QCeramic HyperD F)进行精细纯化，进一步去除HCP、DNA等污染物。首先使用平衡buffer(20mM PB，0.15M NaCl，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；经第二步羟基磷灰石层析分离得到的目标蛋白上样，收集流穿，上样完毕，使用平衡buffer(20mM PB，0.15M NaCl，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；对流穿组分进行收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC和电泳检测。

样品的SEC-HPLC纯度结果及SDS-PAGE电泳结果分见图1和图2，其中SEC-HPLC结果显示，三步层析后双特异性抗体的主峰纯度达99％以上，SDS-PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳(160KDa)，还原后可得清晰的(80KDa)单链条带。

3.2、双特异性抗体稳定性试验

对双特异性抗体AP062在不同pH(pH 5.5、6.0和6.5)的组氨酸盐(20mM组氨酸盐、8％蔗糖、0.02％吐温80)中的稳定性进行考察，同时探究震荡对样品稳定性的影响。将AP062双特异性抗体在5℃和25℃的加速条件下贮存2周，对蛋白的稳定性进行评估。

将AP062分别换液至pH 5.5、6.0和6.5的组氨酸盐缓冲液中。不同时间点取样检测，每个取样点取出样品进行检测分析，检测项目包括SEC-HPLC及SDS-PAGE。

3种制剂配方在5℃和25℃贮存0～2周后的SEC-HPLC和SDS-PAGE检测结果见表5和表6，图3和图4。样品在放置两周后，SEC-HPLC检测结果中聚体、主峰、肩峰及片段的比例无明显变化，在不同pH下，样品各组分的比例也相差不大。样品在pH5.5、6.0和6.5的组氨酸盐缓冲液中两周内SEC-HPLC结果无明显差异。

表5、5℃加速实验SEC-HPLC结果

表6、25℃加速实验SEC-HPLC结果

实施例4、双特异性抗体的体外药效学研究

4.1、利用流式分析法检测AP062与CD20阳性肿瘤细胞的结合活性

培养Raji细胞(购自中科院细胞库)，离心收集细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×10⁶个/ml，置于96孔板中，每孔100μl(2×10⁵个细胞)。然后加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBS溶液(PBSB)洗3遍，加入稀释好的AF488标记的山羊抗人IgG抗体(Jackson Immuno Research Inc.，货号109-545-088)或鼠抗6×his IgG抗体(R&D Systems，货号IC050P)，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％多聚甲醛重悬，流式细胞仪检测信号强度。再以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算AP062与Raji细胞结合的EC₅₀值。

如图5所示，AP062可以很好的与CD20阳性细胞结合，其信号强度与抗体浓度成正比，计算得出AP062与Raji细胞结合的EC₅₀值约为69.97nM。

4.2、AP062介导效应细胞靶向杀伤CD20阳性肿瘤细胞

正常培养的Raji-luc细胞(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)，调整细胞密度1×10⁵个/ml，加入96孔板中，40μl/孔。稀释一系列梯度的AP062抗体和同型对照抗体，分别加入到上述96孔板中，调整CIK细胞密度为5×10⁵/ml，40μl/孔加入96孔板，使效靶比E：T＝5：1，37℃培养24h。24h后，取出96孔板，每孔加入100μl One-Glo(Promega，货号E6120)溶液，室温放置至少3min。酶标仪检测冷发光值。以萤光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算AP062杀伤Raji-luc细胞的EC₅₀值。

如图6显示，AP062介导效应细胞杀伤Raji-luc细胞的EC₅₀只有42.8ng/ml，而且具有靶点特异性，作为阴性对照的同型抗体的EC₅₀为229.5ng/ml，对Raji-luc细胞几乎没有杀伤作用。

4.3、报告基因细胞株评价双特异性抗体活化T细胞的能力

含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞(BPS Bioscience，货号60621)，在双特异性抗体和CD20阳性的Raji细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。以双特异性抗体的浓度做X轴，荧光素信号作为Y轴，拟合四参数曲线。

如图7所示，AP062可以特异性的活化Jurkat NFATRE Luc细胞，EC₅₀值为0.2006μg/ml，且其浓度和信号强度成正比，而作为阴性对照的AB7K7几乎没有活化T细胞的能力。

实施例5、双特异性抗体的体内药效学研究

5.1、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞移植瘤模型

选取CD20表达阳性的人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

取正常人外周血，用密度梯度离心法(Lymphoprep^TM，人淋巴细胞分离液，STEMCELL)分离人PBMC细胞，然后用RPMI-1640培养液加入10％已灭活的FBS重悬，并且加入终浓度为1μg/ml的OKT3和250IU/ml的人IL-2；培养第三天后，300g离心5min后换液，用RPMI-1640加入10％已灭活FBS培养细胞，同时加入250IU/ml人IL-2；之后每2天添加新鲜的培养液，培养到第10天，收集CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的Raji细胞，将4×10⁶个Raji细胞和8×10⁵个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药2次，阳性对照单抗Rituxan(美罗华，罗氏制药)和双抗AP062分别都按1mg/kg和0.1mg/kg剂量给予。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图8所示，在给药后第24天，PBS对照组平均肿瘤体积为1766.84±155.62mm³；1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为647.92±277.11mm³，TGI为63.33％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)；0.1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为1893.81±186.99mm³，无药效；AP062的1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为116.18±39.50mm³，TGI为93.42％，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)；AP062的0.1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为1226.03±340.05mm³，TGI为30.61％，相对于对照组无显著性差异。上述结果表明，双功能特异性抗体AP062在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长，在相同的剂量下，双抗的药效优于单抗Rituxan，显示出良好的抗肿瘤效果。

5.2、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞移植瘤模型

选取CD20表达阳性的人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

根据实施例5.1中的方法获得CIK细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的Daudi细胞(购自中科院细胞库)，将4×10⁶个Daudi细胞和8×10⁵个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1小时后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，所有给药组均为每周给药两次。单抗Rituxan和双抗AP062分别都给予1mg/kg和0.1mg/kg。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例5.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm³)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。

如图9所示，在给药后第30天，PBS对照组平均肿瘤体积为889.68±192.13mm³；1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为241.51±44.91mm³，TGI为72.85％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)；0.1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为746.11±299.71mm³，相对于对照组无显著性差异；AP062的1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为72.05±11.89mm³，TGI为91.9％，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)；AP062的0.1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为75.36±11.81mm³，TGI为91.53％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)。上述结果表明，双功能特异性抗体AP062在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长，在相同的剂量下，双抗AP062的药效优于单抗Rituxan，低剂量的AP062也显示出良好的抗肿瘤效果。

实施例6、双特异性抗体的安全性评价

评价AP062的毒性反应情况，为后续的毒性试验确定合适的剂量范围及观察指标。选取3-4岁的雌性成年食蟹猴(购自广州相观生物科技有限公司)，体重3-4kg，分为2组，每组1只，分为溶媒对照组和AP062给药组。给药方式为蠕动泵静脉滴注1h，给药剂量和体积如下表7所示。分别于分别于第0天(D0)、第7天(D7)、第21天(D21)和第28天(D28)给药，共给药4次，药物剂量逐次递增。同时每周对动物体重进行称量。

表7、食蟹猴急性毒性评价给药安排

试验期间，周期性的监测动物的临床症状、体重、食量、体温、心电图、血压、临床病理指标(血细胞计数、凝血功能指标和血液生化)、淋巴细胞亚群、细胞因子、药物血浆浓度测定和毒代分析。给予AP062后，食蟹猴的体征无异常反应，体重较为稳定，体温变化波动幅度与溶媒对照组相似，给药期间各动物未见死亡或濒死。如图10所示，AP062组给药后食蟹猴的白细胞变化与对照组变化趋势相似；而首次给予0.06mg/kg的AP062对淋巴细胞的影响不大；二次给药后1h至6h，给药组动物的淋巴细胞的数量急剧下降，24小时后恢复正常；随着给药次数的增加，尽管剂量不断增加，但AP062对淋巴细胞的细胞数量减少的影响越来越弱。此外，首次给予AP062后，促进了IL-2、IL-6、TNF-ɑ因子的释放，微弱刺激IL-5的释放，但未刺激IFN-γ的释放；随着给药次数的增加，AP062对细胞因子的促释放作用越来越不明显，说明机体适应了双特异性抗体的刺激。

实施例7、双特异性抗体的药代动力学评价

雌性食蟹猴分成2组，每组1只，体重在3-4kg。第一组为空白对照组，第二组为AP062给药组，给药剂量为0.3mg/kg。采血时间点分别为15min、1h、3h、6h、10h、24h、30h、48h、54h、72h、96h和144h，共13个时间点。取血收集血清，-80℃冻存。

采用ELISA方法测定血清中的AP062药物浓度，利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表8。结果表明，AP062在正常食蟹猴体内的T_1/2为8.5小时左右。

表8、双抗AP062在食蟹猴体内的药代动力学参数

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导做出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可对本发明做各种修改或改动，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安源医药科技（上海）有限公司

<120> 针对CD20和CD3的双特异性抗体及其用途

<130> 2019

<150> CN201811294887.4

<151> 2018-11-01

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 HCDR1氨基酸序列()

<400> 1

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 HCDR2氨基酸序列()

<400> 2

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 HCDR3氨基酸序列()

<400> 3

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 LCDR1氨基酸序列()

<400> 4

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 LCDR2氨基酸序列()

<400> 5

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1 LCDR3氨基酸序列()

<400> 6

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 HCDR1氨基酸序列()

<400> 7

Asn Tyr Tyr Ile His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 HCDR2氨基酸序列()

<400> 8

Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 HCDR3氨基酸序列()

<400> 9

Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 LCDR1氨基酸序列()

<400> 10

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 LCDR2氨基酸序列()

<400> 11

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2 LCDR3氨基酸序列()

<400> 12

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 HCDR1氨基酸序列()

<400> 13

Tyr Ser Trp Ile Asn

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 HCDR2氨基酸序列()

<400> 14

Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 HCDR3氨基酸序列()

<400> 15

Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 LCDR1氨基酸序列()

<400> 16

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 LCDR2氨基酸序列()

<400> 17

Gln Met Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3 LCDR3氨基酸序列()

<400> 18

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 HCDR1氨基酸序列()

<400> 19

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 HCDR2氨基酸序列()

<400> 20

Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 HCDR3氨基酸序列()

<400> 21

Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 LCDR1氨基酸序列()

<400> 22

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 LCDR2氨基酸序列()

<400> 23

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4 LCDR3氨基酸序列()

<400> 24

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr

1 5

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1重链可变区氨基酸序列()

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 26

<211> 106

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体1轻链可变区氨基酸序列()

<400> 26

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2重链可变区氨基酸序列()

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 106

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体2轻链可变区氨基酸序列()

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3重链可变区氨基酸序列()

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体3轻链可变区氨基酸序列()

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4重链可变区氨基酸序列()

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 抗CD20抗体4轻链可变区氨基酸序列()

<400> 32

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 28

<212> PRT

<213> CTP: hCG β(118-145氨基酸序列)

<400> 33

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 HCDR1氨基酸序列()

<400> 34

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 35

<211> 19

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 HCDR2氨基酸序列()

<400> 35

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 HCDR3氨基酸序列()

<400> 36

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 LCDR1氨基酸序列()

<400> 37

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 LCDR2氨基酸序列()

<400> 38

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3 LCDR3氨基酸序列()

<400> 39

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 HCDR1氨基酸序列()

<400> 40

Lys Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 HCDR2氨基酸序列()

<400> 41

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 HCDR3氨基酸序列()

<400> 42

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 LCDR1氨基酸序列()

<400> 43

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn

1 5 10

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 LCDR2氨基酸序列()

<400> 44

Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4 LCDR3氨基酸序列()

<400> 45

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val

1 5

<210> 46

<211> 125

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3重链可变区氨基酸序列()

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 47

<211> 109

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体3轻链可变区氨基酸序列()

<400> 47

Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 48

<211> 125

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4重链可变区氨基酸序列()

<400> 48

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 49

<211> 109

<212> PRT

<213> 抗CD3 抗体4轻链可变区氨基酸序列()

<400> 49

Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 50

<211> 744

<212> PRT

<213> AP062氨基酸序列()

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190

Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

305 310 315 320

Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

325 330 335

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

340 345 350

Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

355 360 365

Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu

405 410 415

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg

420 425 430

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln

435 440 445

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys

450 455 460

Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly

465 470 475 480

Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu

485 490 495

Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly

500 505 510

Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

515 520 525

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

530 535 540

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

545 550 555 560

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

565 570 575

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

580 585 590

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

595 600 605

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

610 615 620

Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

625 630 635 640

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

645 650 655

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

660 665 670

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

675 680 685

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

690 695 700

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

705 710 715 720

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

725 730 735

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

740

<210> 51

<211> 2232

<212> DNA

<213> AP062核苷酸序列()

<400> 51

caagtgcagc tgcagcagcc tggagctgag ctggtgaaac ccggcgcctc cgtcaagatg 60

tcctgtaagg cctccggata caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaaacagacc 120

cctggaaggg gcctggagtg gatcggcgcc atttaccctg gcaacggcga tacctcctat 180

aatcagaagt ttaagggcaa ggccaccctg accgctgata agagcagcag cacagcctac 240

atgcagctgt ccagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actactgtgc tcggagcacc 300

tactacggcg gcgactggta ctttaacgtg tggggagctg gcaccacagt gaccgtgagc 360

gccggaggag gaggatctgg aggaggaggc tccggaggag gaggaagcca gatcgtgctg 420

agccagagcc ccgccatcct gagcgccagc cccggcgaga aggtgaccat gacctgccgc 480

gccagcagca gcgtgagcta catccactgg ttccagcaga agcccggcag cagccccaag 540

ccctggatct acgccaccag caacctggcc agcggcgtgc ccgtgcgctt cagcggcagc 600

ggcagcggca ccagctacag cctgaccatc agccgcgtgg aggccgagga cgccgccacc 660

tactactgcc agcagtggac cagcaacccc cccaccttcg gcggcggcac caagctggag 720

atcaagggtg gcggcggtgg aggatccggc ggtggaggta gcggcggagg cggtagctcc 780

agctctagta aagctccccc tccttccgag gtgcagctgc tggagtccgg aggaggactg 840

gtgcagccag gaggctccct gaagctgagc tgtgctgcct ctggctttac cttcaacaca 900

tatgccatga attgggtgcg gcaggctcca ggcaagggac tggagtgggt ggctaggatc 960

aggtctaagt acaacaatta tgccacctac tatgctgatt ccgtgaagga caggttcacc 1020

atctcccgcg acgatagcaa gaacacagcc tacctgcaga tgaacaatct gaagaccgag 1080

gataccgccg tgtactactg cgtgagacat ggcaactttg gcaatagcta cgtgtcctgg 1140

ttcgcttact ggggacaggg caccctggtc acagtgagct ctggaggagg aggatctgga 1200

ggaggaggct ccggaggagg aggaagcgag ctggtggtga cccaggagcc atctctgaca 1260

gtgtcccccg gcggcacagt gaccctgaca tgtagatcca gcaccggcgc cgtgaccaca 1320

tccaactacg ctaattgggt gcagcagaag ccaggacagg ctccaagggg actgatcgga 1380

ggaaccaaca agagggctcc tggaacacca gctcggttta gcggatctct gctgggaggc 1440

aaggctgccc tgaccctgtc cggagtgcag ccagaggatg aggccgagta ttattgcgct 1500

ctgtggtata gcaatctgtg ggtgttcgga ggaggaacca agctgacagt gctggacaag 1560

acccatacat gcccaccatg ccctgcccct gaagccgccg gaggaccttc cgtgttcctg 1620

ttccctccca agccaaaaga tcagctgatg atctctagaa cccccgaagt cacctgcgtg 1680

gtcgtcgacg tgtcccatga ggaccctgaa gtcaagttca actggtacgt ggacggtgtc 1740

gaagtccaca acgccaagac caagcctagg gaggagcagt atgccagcac ataccgggtg 1800

gtgtctgtgc tgaccgtgct gcatcaggat tggctgaatg gcaaggaata taaatgtaag 1860

gtgagcaata aggctctgcc ggctagcatt gaaaaaacca tttccaaggc taagggccag 1920

cccagggagc ctcaggtcta caccctgcct ccatctagag atgaactgac caaaaaccag 1980

gtgagcctga cttgcctggt caaaggcttc taccccagcg acattgccgt ggagtgggag 2040

tctaatggcc agcctgaaaa taactacaaa actacccctc ctgtgctgga ctctgatggc 2100

tccttctttc tgtactctaa actgaccgtg gacaagtctc gctggcagca gggtaacgtg 2160

ttttcttgct ccgtgctgca cgaggctctg cataaccatt acacccagaa gagcctgtct 2220

ctgtccccag ga 2232

<210> 52

<211> 27

<212> PRT

<213> G2(GGGGS3CTP1连接肽)

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20 25

<210> 53

<211> 25

<212> PRT

<213> (GGGGS)3CTP1连接肽

<400> 53

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20 25

<210> 54

<211> 22

<212> PRT

<213> GS(GGG2CTP1连接肽)

<400> 54

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20

<210> 55

<211> 33

<212> PRT

<213> (GGGGS)1CTP4连接肽

<400> 55

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

20 25 30

Gln

<210> 56

<211> 227

<212> PRT

<213> IgG1 Fc(L234A,L235A突变体恒定区氨基酸序列)

<400> 56

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 57

<211> 226

<212> PRT

<213> IgG1(L234A,L235A, T250Q,N297A,P331S,M428L,K447-突变体恒定区氨基酸序列)

<400> 57

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

Claims

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次由特异性结合肿瘤抗原CD20的第一单链Fv、连接第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段组成；其中，所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP效应子功能，

其中，

所述第一单链Fv的VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：1、2和3所示，和所述第一单链Fv的VL结构域，其包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：4、5和6所示；且所述第一单链Fv的VH和VL之间的连接肽L1氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝3；

所述连接第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示；和

所述第二单链Fv的VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：34、35和36所示，和所述第二单链Fv的VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：37、38和39所示；且所述第二单链Fv的VH和VL之间的连接肽L3氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝3。

2.权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv的VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；和所述第一单链Fv的VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。

3.权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv的VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示；和所述第二单链Fv的VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：47所示。

4.权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段包含根据EU编号系统确定的L234A/L235A/P331S的氨基酸置换。

5.权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段还包含以下一个或多个氨基酸的置换或缺失：

(1)根据EU编号系统确定的M428L、T250Q/M428L或M428L/N434S的氨基酸置换；

(2)根据EU编号系统确定的N297A的氨基酸置换；

(3)根据EU编号系统确定的K447的氨基酸缺失。

6.权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：57所示。

7.编码如权利要求1至6之一所述双特异性抗体的DNA分子。

8.包含如权利要求7所述DNA分子的载体。

9.如权利要求8所述载体的宿主细胞，其为原核细胞、酵母或哺乳动物细胞。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其为CHO细胞。

11.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1至6之一所述的双特异性抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

12.制备如权利要求1至6之一所述双特异性抗体的方法，其包括：(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染入宿主细胞中；(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；(d)分离、纯化产生的所述抗体；

其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒和病毒中的一种或多种；

其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞、酵母或哺乳动物细胞；

13.如权利要求12所述的方法，其中，步骤(a)中所述表达载体为pCDNA3.4载体。

14.如权利要求12所述的方法，其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞为CHO细胞或NS0细胞。

15.如权利要求12所述的方法，其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞为CHO细胞。

16.如权利要求1至6之一所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自：B细胞淋巴瘤。

17.如权利要求1至6之一所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自：滤泡性淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、急性B淋巴细胞性白血病、慢性B淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

18.如权利要求1至6之一所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解自身免疫性或炎症性疾病的药物中的用途，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化症。