TW202321296A

TW202321296A - 抗間皮素抗原結合分子及其用途

Info

Publication number: TW202321296A
Application number: TW111137868A
Authority: TW
Inventors: 科林科倫蒂; 克里斯托弗梅林; 大衛梅寧格; 阿肖克班達拉雅克
Original assignee: 美商鏈接免疫療法公司
Priority date: 2021-10-06
Filing date: 2022-10-05
Publication date: 2023-06-01
Also published as: US20230235091A1; AU2022360988A1; US20240294663A1; EP4413047A1; CA3242196A1; US11981745B2; WO2023060157A1; JP2025504681A

Abstract

本發明提供與間皮素(MSLN)特異性結合之抗體及多肽，其包括結合MSLN及T細胞抗原(例如CD3)兩者之雙特異性抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組成物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療個體之方法。

Description

抗間皮素抗原結合分子及其用途

[相關申請案]

本申請案主張2021年10月6日申請之美國臨時申請案第63/262,156號，及2022年8月1日申請之美國臨時申請案第63/369,989號之權益，其內容以全文引用方式併入於此。 [序列表]

以電子提交序列表XML(名稱：193452_SL；大小：95,711位元；創建：2022年9月8日)之內容以全文引用方式併入於此。

本發明係關於對人類間皮素(MSLN)具有特異性之抗體，其包括結合MSLN及T細胞抗原(例如CD3)之雙特異性抗體；及其使用方法。

間皮素(MSLN)為一種限於在胸膜、心包膜及腹膜內層之間皮細胞正常表現的細胞表面醣蛋白。間皮素基因編碼71 kDa前驅蛋白，其藉由內切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)裂解為40 kDa膜結合蛋白，稱為間皮素；及自細胞釋放的31 kDa脫落片段(shed fragment)，稱為巨核細胞增強因子(megakaryocyte-potentiating factor；MPF)。間皮素蛋白之可溶形式可能為導致框移突變及過早終止之異常剪接事件之結果，其缺失C端處負責蛋白質與細胞膜結合的胺基酸(Hassan等人, Clinical Cancer Research, 10:3937-3942, 2004)。

間皮素在多種腫瘤類型，包括間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌以及胃及肺腺癌中高度表現。間皮素在正常組織上之有限分佈使得其為腫瘤特異性療法之有前景的目標。證據表明，膜結合間皮素之胞外域自腫瘤細胞脫落，但尚未闡明與此脫落相關之精確機制(Ho及Lively, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 15(9):1751, 2006)。間皮素之此等可溶性形式可藉由產生結合抗MSLN抗體之抗原槽(antigen sink)阻礙腫瘤細胞定向免疫療法。

CD3為在與T細胞受體複合物(TCR)結合之T細胞上表現的同質二聚或異二聚抗原，且為T細胞活化所需。功能性CD3由四種不同鏈，包括γ/ε、δ/ε及ζ/ζ之二聚排列形成。已顯示抗CD3抗體在T細胞上聚集CD3，從而以類似於藉由肽負載的MHC分子參與TCR的方式引起T細胞活化。已提議能夠結合CD3及目標抗原之雙特異性抗體用於涉及對表現目標抗原之組織及細胞之靶向T細胞免疫反應的治療用途。

因此，需要用於靶向表現MSLN之腫瘤細胞及T細胞介導之殺死該等細胞之療法，其包括結合MSLN及T細胞抗原(例如CD3)之雙特異性抗體。

本發明提供與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體及多肽，其包括結合MSLN及T細胞抗原(例如CD3)兩者之雙特異性抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組成物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療個體之方法。本文揭示之抗體在人類FcRn嵌入小鼠具有高等電點及意外地血清清除快，因而特別有利。這種類型的藥物動力學資料已顯示導致個體內生物分布和組織保留增加、具有低等電點及血清清除慢的相對抗體(參見例如Li等人，MAbs., 6(5):1255-64, 2014；Boswell等人，Bioconjug Chem., 21(12): 2153-63, 2010)。申請人期望此種增加的生物分布將有利於治療人類個體之腫瘤。

在一個態樣中，本發明提供一種特異性結合人類MSLN之抗體，該抗體包含：VH，其包含SEQ ID NO: 11中說明之VH胺基酸序列之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO: 12中說明之VL胺基酸序列之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列，其中抗體不包含SEQ ID NO: 4及/或8。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 3、13及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 6、7及14中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 3、13、5、6、7及14中說明之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 3、30及5；3、29及5；3、31及5；3、32及5；3、33及5；或3、34及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 6、7及35；6、7及36；6、7及37；6、7及38；6、7及39；或6、7及40中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體分別包含SEQ ID NO: 3、30、5、6、7及35；3、29、5、6、7及35；3、29、5、6、7及36；3、29、5、6、7及37；3、29、5、6、7及38；3、29、5、6、7及39；3、29、5、6、7及40；3、30、5、6、7及36；3、30、5、6、7及37；3、30、5、6、7及38；3、30、5、6、7及39；3、30、5、6、7及40；3、31、5、6、7及35；3、31、5、6、7及36；3、31、5、6、7及37；3、31、5、6、7及38；3、31、5、6、7及39；3、31、5、6、7及40；3、32、5、6、7及35；3、32、5、6、7及36；3、32、5、6、7及37；3、32、5、6、7及38；3、32、5、6、7及39；3、32、5、6、7及40；3、33、5、6、7及35；3、33、5、6、7及36；3、33、5、6、7及37；3、33、5、6、7及38；3、33、5、6、7及39；3、33、5、6、7及40；3、34、5、6、7及35；3、34、5、6、7及36；3、34、5、6、7及37；3、34、5、6、7及38；3、34、5、6、7及39；或3、34、5、6、7及40中說明之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含SEQ ID NO: 11之VH胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含SEQ ID NO: 18、17、19、20、21或22之VH胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含視情況選自由人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2組成之群之重鏈恆定區。

在一具體例中，抗體包含作為野生型重鏈恆定區之變體之重鏈恆定區，其中變異重鏈恆定區以比野生型重鏈恆定區與FcγR結合更低之親和力與FcγR結合。

在一具體例中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 53、54、55、56或72之胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69、70或71之胺基酸序列的重鏈。

在一具體例中，抗體包含SEQ ID NO: 12之VL胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含SEQ ID NO: 24、23、25、26、27或28之VL胺基酸序列。

在一具體例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 48、47、49、50、51或52之胺基酸序列的輕鏈。

在一具體例中，VH及VL分別包含SEQ ID NO: 18及24、17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28中說明之胺基酸序列。

在一具體例中，重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 83及48、84及48、83及49、84及49、83及50、84及50、83及51、84及51、83及52、84及52、83及47、84及47、41及47、41及48、41及49、41及50、41及51、41及52、42及47、42及48、42及49、42及50、42及51、42及52、43及47、43及48、43及49、43及50、43及51、43及52、44及47、44及48、44及49、44及50、44及51、44及52、45及47、45及48、45及49、45及50、45及51、45及52、46及47、46及48、46及49、46及50、46及51、46及52、66及47、66及48、66及49、66及50、66及51、66及52、67及47、67及48、67及49、67及50、67及51、67及52、68及47、68及48、68及49、68及50、68及51、68及52、69及47、69及48、69及49、69及50、69及51、69及52、70及47、70及48、70及49、70及50、70及51、70及52、71及47、71及48、71及49、71及50、71及51或71及52中說明之胺基酸序列。

在一具體例中，抗體進一步包含CD3結合部分。

在一具體例中，CD3結合部分為多肽。在一具體例中，CD3結合部分為抗體。在一具體例中，CD3結合部分為單鏈可變片段(scFv)。在一具體例中，scFv包含SEQ ID NO: 76中說明之胺基酸序列。

在一具體例中，CD3結合部分與輕鏈共價連接。在一具體例中，CD3結合部分與輕鏈之C端共價連接。在一具體例中，CD3結合部分經由肽連接子與輕鏈之C端共價連接，視情況其中肽連接子包含SEQ ID NO: 63、64、73、74或75中說明之胺基酸序列。

在一個具體例中，輕鏈包含SEQ ID NO: 77、78、79、80、81或82中說明之胺基酸序列。

在一個態樣中，本發明提供一種特異性結合人類MSLN之抗體，該抗體包含重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 83及77、84及77、41及77、42及77、43及77、44及77、45及77、46及77、66及77、67及77、68及77、69及77、70及77、71及77、83及78、84及78、41及78、42及78、43及78、44及78、45及78、46及78、66及78、67及78、68及78、69及78、70及78、71及78、83及79、84及79、41及79、42及79、43及79、44及79、45及79、46及79、66及79、67及79、68及79、69及79、70及79、71及79、83及80、84及80、41及80、42及80、43及80、44及80、45及80、46及80、66及80、67及80, 68及80、69及80、70及80、71及80、83及81、84及81、41及81、42及81、43及81、44及81、45及81、46及81、66及81、67及81、68及81、69及81、70及81、71及81、83及82、84及82、41及82、42及82、43及82、44及82、45及82、46及82、66及82、67及82、68及82、69及82、70及82或71及82中說明之胺基酸序列。

在一個具體例中，重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 83及77中說明之胺基酸序列。

在一個態樣中，本發明提供一種多肽，其包含含有SEQ ID NO: 11中說明之VH胺基酸序列之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH，其中多肽不包含SEQ ID NO: 4。在一具體例中，VH分別包含SEQ ID NO: 3、13及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。在一具體例中，VH分別包含SEQ ID NO: 3、30及5；3、29及5；3、31及5；3、32及5；3、33及5；或3、34及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。在一具體例中，VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一具體例中，VH包含SEQ ID NO: 18、17、19、20、21或22之胺基酸序列。

在一具體例中，多肽包含含有SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69、70或71之胺基酸序列的重鏈。

在一個態樣中，本發明提供一種多肽，其包含含有SEQ ID NO: 12中說明之VL胺基酸序列之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL，其中多肽不包含SEQ ID NO: 8。在一具體例中，VL分別包含SEQ ID NO: 6、7及14中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。在一具體例中，VL分別包含SEQ ID NO: 6、7及35；6、7及36；6、7及37；6、7及38；6、7及39；或6、7及40中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。在一具體例中，VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一具體例中，VL包含SEQ ID NO: 24、23、25、26、27或28之胺基酸序列。

在一具體例中，多肽包含含有SEQ ID NO: 77、47、48、49、50、51、52、78、79、80、81或82之胺基酸序列的輕鏈。

在一個態樣中，本發明提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 73、74或75中說明之胺基酸序列。

在一具體例中，本文揭示之抗體或多肽與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記結合。

在一個態樣中，本發明提供一種多核苷酸，其編碼：本文揭示之抗體之VH、VL、重鏈及/或輕鏈；或本文揭示之多肽。

在一個態樣中，本發明提供一種載體，其包含本文揭示之多核苷酸。

在一個態樣中，本發明提供一種重組宿主細胞，其包含： (a)　本文揭示之多核苷酸； (b)　本文揭示之載體； (c)　編碼本文揭示之抗體之重鏈可變區或重鏈的第一多核苷酸，及編碼本文揭示之抗體之輕鏈可變區或輕鏈的第二多核苷酸； (d)　包含編碼本文揭示之抗體之重鏈可變區或重鏈之第一多核苷酸的第一載體，及包含編碼本文揭示之抗體之輕鏈可變區或輕鏈之第二多核苷酸的第二載體。

在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本文揭示之抗體、本文揭示之多肽、本文揭示之多核苷酸、本文揭示之載體、本文揭示之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

在一個態樣中，本發明提供一種產生抗體之方法，該方法包含在合適條件下培養本文揭示之宿主細胞，以使得表現多核苷酸及產生抗體。

在一個態樣中，本發明提供一種治療個體之癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文揭示之抗體、本文揭示之多肽、本文揭示之多核苷酸、本文揭示之載體、本文揭示之宿主細胞或本文揭示之醫藥組成物。

在一個態樣中，本發明提供一種本文揭示之抗體、本文揭示之多肽、本文揭示之多核苷酸、本文揭示之載體、本文揭示之宿主細胞或本文揭示之醫藥組成物之用途，其用於製造用於治療有需要之個體之癌症的藥物。

在一個態樣中，本發明提供一種本文揭示之抗體、本文揭示之多肽、本文揭示之多核苷酸、本文揭示之載體、本文揭示之宿主細胞或本文揭示之醫藥組成物，其用於醫藥中。

在一個態樣中，本發明提供一種本文揭示之抗體、本文揭示之多肽、本文揭示之多核苷酸、本文揭示之載體、本文揭示之宿主細胞或本文揭示之醫藥組成物，其用於治療有需要之個體的癌症。

本發明提供抗MSLN抗體及多肽，其包括結合MSLN及T細胞抗原(例如CD3)兩者之雙特異性抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組成物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療個體之方法。本文揭示之抗體尤其適用於治療個體之癌症。定義

如本文所用，表述「MSLN」係指間皮素。人類間皮素之胺基酸序列可在寄存編號Q13421 (UniProtKB)找到。MSLN為一種在胰臟癌、卵巢癌、間皮瘤及一些其他癌症類型中高度表現之細胞表面醣蛋白。間皮素在胸膜、心包膜及腹膜內層之正常間皮細胞上表現，但在正常組織上之分佈有限。除非明確指定為來自非人類物種，否則本文中對蛋白質、多肽及蛋白質片段之所有參考均意欲指各別蛋白質、多肽或蛋白質片段之人類型式。因此，除非指定為來自非人類物種，例如「小鼠MSLN」、「猴MSLN」等，否則表述「MSLN」意謂人類MSLN。

如本文所用，表述「CD3」係指作為多分子T細胞受體(TCR)之一部分在T細胞上表現的抗原，且其由同質二聚體或異二聚體組成，該同質二聚體或異二聚體由以下四種受體鏈中之兩者的結合形成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。

如本文所用，術語「抗體(antibody/ antibodies)」包括全長抗體、全長抗體之抗原結合片段以及包含抗體CDR、VH區及/或VL區之分子。抗體之實施例包括但不限於單株抗體、以重組方式產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、異結合抗體、抗體-藥物結合物、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、Fab片段、F(ab’) ₂片段、二硫鍵鍵聯的Fv (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)以及以上中之任一者的抗原結合片段。在某些具體例中，本文所描述之抗體係指多株抗體群體。抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁或IgA ₂)或任何子類別(例如IgG ₂a或IgG ₂b)之免疫球蛋白分子。在某些具體例中，本文所描述之抗體為IgG抗體或其類別(例如人類IgG ₁或IgG ₄)或子類別。在一特定具體例中，抗體為人源化單株抗體。在另一特定具體例中，抗體為人類單株抗體。

「多特異性抗體」為與兩種或更多種不同抗原或相同抗原之兩種或更多種不同區域特異性結合之抗體(例如雙特異性抗體)。多特異性抗體包括含有兩個不同抗原結合位點(不包括Fc區)之雙特異性抗體。多特異性抗體可包括例如以重組方式產生之抗體、人類抗體、人源化抗體、重塑抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、異結合抗體、鍵聯的單鏈抗體或鍵聯的單鏈Fv (scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、鍵聯的Fab片段、F(ab’) ₂片段、化學鍵聯的Fv及二硫鍵鍵聯的Fv (sdFv)。多特異性抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁或IgA ₂)或任何子類別(例如IgG ₂a或IgG ₂b)之免疫球蛋白分子。在某些具體例中，本文所描述之多特異性抗體為IgG抗體或其類別(例如人類IgG ₁、IgG ₂或IgG ₄)或子類別。

如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意謂在重鏈及輕鏈多肽之可變區內發現的非連續抗原組合位點。此等特定區域已由例如以下文獻描述：Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)，及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)，及MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)，以上所有均以全文引用之方式併入本文中，其中在彼此比較時，定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。在某些具體例中，術語「CDR」為如由以下所定義之CDR：MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)，及Martin A.「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」, Antibody Engineering, Kontermann及Dübel編, 第31章, 第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin (2001)。在某些具體例中，術語「CDR」為如由以下所定義之CDR：Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)，及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest. (1991)。在某些具體例中，抗體之重鏈CDR及輕鏈CDR使用不同規約來加以定義。在某些具體例中，重鏈CDR及/或輕鏈CDR藉由對抗體進行結構分析及鑑別可變區中預測與目標分子(例如人類MSLN)之抗原決定基區域接觸之殘基定義。CDRH1、CDRH2及CDRH3指代重鏈CDR，且CDRL1、CDRL2及CDRL3指代輕鏈CDR。

如本文所用，術語「可變區」及「可變域」可互換使用且在本技藝中常見。可變區通常係指抗體之一部分，一般係指輕鏈或重鏈之一部分，通常係指成熟重鏈中胺基端約110至120個胺基酸或110至125個胺基酸以及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其序列在抗體間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列中之可變性集中於稱為互補決定區(complementarity determining region；CDR)之彼等區中，而可變區中之更高度保守之區稱為構架區(framework region；FR)。在不希望受任何特定機制或理論束縛之情況下，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在某些具體例中，可變區為人類可變區。在某些具體例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在某些具體例中，可變區為靈長類動物(例如非人類靈長類動物)可變區。在某些具體例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類動物(例如非人類靈長類動物)構架區(FR)。

如本文所用，術語「VH」及「VL」分別係指抗體重鏈及輕鏈可變區，如Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH公開案第91-3242號, Bethesda)中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「恆定區」在本技藝中常見。恆定區為抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合但其可呈現各種效應功能，諸如與Fc受體(例如Fcγ受體)之相互作用。

如本文所用，術語「重鏈」在關於抗體使用時可指基於恆定區之胺基酸序列之任何不同類型，例如alpha (α)、delta (δ)、epsilon (ε)、gamma (γ)及mu (µ)，其分別產生抗體之IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別，包括IgG之子類別，例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃及IgG ₄。

如本文所用，術語「輕鏈」在關於抗體使用時可指基於恆定區之胺基酸序列之任何不同類型，例如kappa (κ)或lambda (λ)。輕鏈胺基酸序列為本技藝中所熟知的。在特定具體例中，輕鏈為人類輕鏈。

如本文所用，在抗體之情況下，術語「特異性結合」、「特異性識別」、「免疫特異性結合」及「免疫特異性識別」為類似術語，且係指分子與抗原(例如抗原決定基或免疫複合物)結合，如此類結合由熟悉本技藝者理解。舉例而言，藉由例如免疫分析、BIAcore ^®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或本技藝中已知之其他分析所測定，與抗原特異性結合之分子通常可以較低親和力與其他肽或多肽結合。在一特定具體例中，與抗原特異性結合之分子與抗原結合之K _A的對數(例如以10為係數)為該等分子與另一抗原非特異性結合時之K _A的對數的至少2、2.5、3、4或更多倍。

如本文所用，術語「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X針對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常見方法，包括本文所描述之彼等方法量測親和力。

如本文所用，術語「EU編號系統」係指抗體之恆定區之EU編號規約，如Edelman, G.M.等人, Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969) and Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 第5版, 1991，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「治療(treat/treating/ treatment)」係指本文所描述之治療或預防性措施。「治療」方法採用向患有疾病或病症或易患此類疾病或病症之個體投與抗體以便預防、治癒、延遲疾病或病症或復發性疾病或病症、減輕其嚴重程度或改善其一或多個症狀，或以便使個體之存活期延長超出在無此類治療存在下預期之存活期。

如本文所用，在向個體投與療法之情況下，術語「有效量」係指達成所需預防性或治療性作用之療法的量。

如本文所用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。在某些具體例中，個體為人類或非人類哺乳動物。在某些具體例中，個體為人類。

如本文關於抗體或多核苷酸所用，術語「經分離」係指與存在於抗體或多核苷酸之天然來源中之一或多種雜質(例如多肽、多核苷酸、脂質或碳水化合物等)分離的抗體或多核苷酸。另外考慮本文所描述之「經分離之抗體」之所有情形作為可(但未必)經分離之抗體。另外考慮本文所描述之「經分離之多核苷酸」之所有情形作為可(但未必)經分離之多核苷酸。另外考慮本文所描述之「抗體」之所有情形作為可(但未必)經分離之抗體。另外考慮本文所描述之「多核苷酸」之所有情形作為可(但未必)經分離之多核苷酸。

可使用數學演算法來實現兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的「一致性百分比」之測定。用於比較兩個序列之數學演算法之特定非限制性實施例為Karlin S及Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268之演算法，如在Karlin S及Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877中所修改，其各自以全文引用之方式併入本文中。此類演算法併入Altschul SF等人, (1990) J Mol Biol 215: 403之NBLAST及XBLAST程式中，其以全文引用之方式併入本文中。可利用NBLAST核苷酸程式參數設定(例如對於分數=100，字長=12)進行BLAST核苷酸檢索，以獲得與本文所描述之核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程式參數設定(例如分數為50，字長=3)進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了出於比較目的獲得間隙比對，可如Altschul SF等人, (1997) Nuc Acids Res 25: 3389-3402中所描述利用間隙式BLAST，其以全文引用之方式併入本文中。或者，PSI BLAST可用於進行迭代檢索，其偵測分子間之遠距離關係(同上)。當利用BLAST、間隙BLAST及PSI Blast程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見例如，全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於比較序列之數學演算法的另一特定非限制性實施例為Myers及Miller, 1988, CABIOS 4:11-17之演算法，其以全文引用之方式併入本文中。將此類算法併入ALIGN程式(2.0版)中，該程式為GCG序列比對套裝軟體之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4。

兩個序列之間的一致性百分比可在允許有間隙或不允許有間隙的情況下，使用與上文所描述類似的技術來測定。在計算一致性百分比時，通常僅對精確匹配進行計數。抗MSLN抗體

在一個態樣中，本發明提供與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體。例示性抗體之胺基酸序列說明於表1中。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有表1中說明之VH域之一個、兩個或所有三個CDR的VH域。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VH域的CDRH1。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VH域的CDRH2。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VH域的CDRH3。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有表1中揭示之VL域之一個、兩個或所有三個CDR的VL域。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VL域的CDRL1。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VL域的CDRL2。在某些具體例中，抗體包含表1中說明之VL域的CDRL3。

本文揭示之抗體之個別CDR可根據本技藝中已知之任何CDR編號方案判定。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR中之一或多者可根據以下判定：Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)，及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest (1991)，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由Kabat編號方案判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR中之一或多者可根據Chothia編號方案判定，其係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia C及Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917；Al-Lazikani B等人, (1997) J Mol Biol 273: 927-948；Chothia C等人, (1992) J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano A等人, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中)。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由Chothia編號系統判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR中之一或多者可根據MacCallum RM等人, (1996) J Mol Biol 262: 732-745判定，其以全文引用之方式併入本文中。亦參見例如Martin A.「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」, Antibody Engineering, Kontermann及Dübel編, 第31章, 第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin (2001)，其以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由MacCallum編號系統判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR可根據如以下中所描述之IMGT編號系統判定：Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136；Lefranc M-P等人, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212，其中之各者以全文引用之方式併入本文中；及Lefranc M-P等人, (2009) Nucleic Acids Res 37: D1006-D1012。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由IMGT編號系統判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR可根據AbM編號方案判定，其係指AbM高變區，其表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體(Oxford Molecular Group, Inc.)使用，其以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由AbM編號方案判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之CDR可根據如以下中所描述之AHo編號系統判定：Honegger及Plückthun, A., J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)，其以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本發明提供抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且包含藉由AHo編號系統判定之本文表1中揭示之抗體的CDR。

在某些具體例中，本文揭示之抗體之個別CDR各自獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者，或藉由多特異性分子之結構分析判定，其中結構分析鑑別可變區中預測與MSLN之抗原決定基區域接觸的殘基。

在某些具體例中，本發明提供特異性結合MSLN (例如人類MSLN)之抗體，其包含：VH，其包含SEQ ID NO: 11中說明之VH胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO: 12中說明之VL胺基酸序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列，其中各CDR獨立地根據Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM編號方案中之一者，或藉由多特異性分子之結構分析判定，其中結構分析鑑別可變區中預測與MSLN (例如人類MSLN)之抗原決定基區域接觸的殘基。在一些具體例中，抗體不包含SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 8。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體包含分別含有SEQ ID NO: 3、13及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體包含分別含有SEQ ID NO: 6、7及14中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體包含：VH，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區；及VL，其包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區分別包含SEQ ID NO: 3、13、5、6、7及14中說明之胺基酸序列。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、29及5；3、30及5；3、31及5；3、32及5；3、33及5；或3、34及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體分別包含SEQ ID NO: 6、7及35；6、7及36；6、7及37；6、7及38；6、7及39；或6、7及40中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、29、5、6、7及35；3、29、5、6、7及36；3、29、5、6、7及37；3、29、5、6、7及38；3、29、5、6、7及39；3、29、5、6、7及40；3、30、5、6、7及35；3、30、5、6、7及36；3、30、5、6、7及37；3、30、5、6、7及38；3、30、5、6、7及39；3、30、5、6、7及40；3、31、5、6、7及35；3、31、5、6、7及36；3、31、5、6、7及37；3、31、5、6、7及38；3、31、5、6、7及39；3、31、5、6、7及40；3、32、5、6、7及35；3、32、5、6、7及36；3、32、5、6、7及37；3、32、5、6、7及38；3、32、5、6、7及39；3、32、5、6、7及40；3、33、5、6、7及35；3、33、5、6、7及36；3、33、5、6、7及37；3、33、5、6、7及38；3、33、5、6、7及39；3、33、5、6、7及40；3、34、5、6、7及35；3、34、5、6、7及36；3、34、5、6、7及37；3、34、5、6、7及38；3、34、5、6、7及39；或3、34、5、6、7及40中說明之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含VH，該VH包含與SEQ ID NO: 11中說明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)一致的胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含VH，該VH包含SEQ ID NO: 11中說明之胺基酸序列。在某些具體例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含VH，該VH包含與SEQ ID NO: 12中說明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)一致的胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含VL，該VL包含SEQ ID NO: 12中說明之胺基酸序列。在某些具體例中，VL之胺基酸序列由SEQ ID NO: 12中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含：VH，其包含與SEQ ID NO: 11中說明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)一致的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 12中說明之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)一致的胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含：VH，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在某些具體例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11中說明之胺基酸序列組成；且VL之胺基酸序列由SEQ ID NO: 12中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其分別包含SEQ ID NO: 11及12中說明之VH及VL胺基酸序列。在某些具體例中，VH及VL之胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 11及12中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含SEQ ID NO: 17、18、19、20、21或22之VH胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其由SEQ ID NO: 17、18、19、20、21或22之VH胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含SEQ ID NO: 23、24、25、26、27或28之VL胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其由SEQ ID NO: 23、24、25、26、27或28之VL胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中VH及VL分別包含SEQ ID NO: 17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及24、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28中說明之胺基酸序列。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其中VH及VL分別由SEQ ID NO: 17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及24、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種抗體，其與分別包含SEQ ID NO: 11及12中說明之VH及VL胺基酸序列之抗體交叉競爭與MSLN (例如人類MSLN)結合。在某些具體例中，本發明提供一種抗體，其與分別包含以下中說明之VH及VL胺基酸序列的抗體交叉競爭與MSLN (例如人類MSLN)結合：SEQ ID NO: 17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及24、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28。

在某些具體例中，本發明提供一種抗體，其與本文所描述之抗體，例如分別包含SEQ ID NO: 11及12中說明之VH及VL胺基酸序列的抗體，結合MSLN之相同或重疊抗原決定基(例如人類MSLN之抗原決定基)。在某些具體例中，本發明提供一種抗體，其與本文所描述之抗體，例如分別包含以下中說明之VH及VL胺基酸序列的抗體，結合MSLN之相同或重疊抗原決定基(例如人類MSLN之抗原決定基)：SEQ ID NO: 17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及24、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28。

在某些具體例中，抗體之抗原決定基可例如藉由以下判定：NMR光譜分析、表面電漿子共振(BIAcore ^®)、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、與質譜偶聯之氫/氘交換(例如液相層析電噴霧質譜分析)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或誘變定位(例如定點誘變定位)。對於X射線結晶學而言，結晶可使用本技藝中之任一已知方法實現(例如Giegé R等人, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303，以上所有均以全文引用的方式併入本文中)。抗體:抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術研究，且可使用諸如X-PLOR之電腦軟體改良(refined) (Yale University, 1992,由Molecular Simulations, Inc.分銷；參見例如Meth Enzymol (1985)第114及115卷,Wyckoff HW等人編；美國專利申請案第2004/0014194號)，及BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60；Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423,Carter CW編；Roversi P等人, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323，以上所有均以全文引用的方式併入本文中)。誘變定位研究可使用熟悉本技藝者已知之任何方法來實現。關於誘變技術之描述，包括丙胺酸掃描誘變技術，參見例如Champe M等人, (1995) 見上文及Cunningham BC及Wells JA (1989)見上文。在一特定具體例中，抗體之抗原決定基係使用丙胺酸掃描誘變研究來測定。另外，或識別且結合MSLN (例如人類MSLN)之相同或重疊抗原決定基之抗體可使用諸如免疫分析之常規技術鑑別，例如藉由顯示一種抗體阻斷另一抗體與目標抗原結合之能力，亦即競爭性結合分析。競爭結合分析亦可用於判定兩種抗體針對一種抗原決定基是否具有相似的結合特異性。競爭性結合可在受測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(諸如MSLN (例如人類MSLN))之特異性結合的分析中加以測定。多種類型之競爭性結合分析為已知的，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli C等人, (1983) Methods Enzymol 9: 242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見 Kirkland TN等人, (1986) J Immunol 137: 3614-9)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow E及Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA (參見Morel GA等人, (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見Cheung RC等人, (1990) Virology 176: 546-52)；及直接標記RIA (參見Moldenhauer G等人, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82)，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。通常，此類分析涉及使用與攜帶未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白此等中之任一者之固體表面或細胞結合的純化抗原(例如MSLN，諸如人類MSLN)。競爭性抑制係藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。通常，測試免疫球蛋白以過量存在。通常，當競爭性抗體以過量存在時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更高。競爭結合分析可使用經標記之抗原或經標記之抗體以大量不同形式組態。在此分析之常見型式中，使抗原固定在96孔盤上。未經標記之抗體阻斷經標記之抗體與抗原之結合的能力接著係使用放射性標記或酶標記來量測。關於其他細節，參見例如Wagener C等人, (1983) J Immunol 130: 2308-2315；Wagener C等人, (1984) J Immunol Methods 68: 269-274；Kuroki M等人, (1990) Cancer Res 50: 4872-4879；Kuroki M等人, (1992) Immunol Invest 21: 523-538；Kuroki M等人, (1992) Hybridoma 11: 391-407 and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E及Lane D編者編見上文, 第386-389頁，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69、70或71中說明之胺基酸序列的重鏈。在某些具體例中，重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69、70或71中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 47、48、49、50、51或52中說明之胺基酸序列的輕鏈。在某些具體例中，輕鏈之胺基酸序列由選自由SEQ ID NO: 47、48、49、50、51或52組成之群的胺基酸序列組成。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，其包含重鏈及輕鏈，其中重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 83及48、84及48、83及49、84及49、83及50、84及50、83及51、84及51、83及52、84及52、83及47、84及47、41及47、41及48、41及49、41及50、41及51、41及52、42及47、42及48、42及49、42及50、42及51、42及52、43及47、43及48、43及49、43及50、43及51、43及52、44及47、44及48、44及49、44及50、44及51、44及52、45及47、45及48、45及49、45及50、45及51、45及52、46及47、46及48、46及49、46及50、46及51、46及52、66及47、66及48、66及49、66及50、66及51、66及52、67及47、67及48、67及49、67及50、67及51、67及52、68及47、68及48、68及49、68及50、68及51、68及52、69及47、69及48、69及49、69及50、69及51、69及52、70及47、70及48、70及49、70及50、70及51、70及52、71及47、71及48、71及49、71及50、71及51或71及52之胺基酸序列。

在某些具體例中，重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別由選自由以下組成之群之胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 83及48、84及48、83及49、84及49、83及50、84及50、83及51、84及51、83及52、84及52、83及47、84及47、41及47、41及48、41及49、41及50、41及51、41及52、42及47、42及48、42及49、42及50、42及51、42及52、43及47、43及48、43及49、43及50、43及51、43及52、44及47、44及48、44及49、44及50、44及51、44及52、45及47、45及48、45及49、45及50、45及51、45及52、46及47、46及48、46及49、46及50、46及51、46及52、66及47、66及48、66及49、66及50、66及51、66及52、67及47、67及48、67及49、67及50、67及51、67及52、68及47、68及48、68及49、68及50、68及51、68及52、69及47、69及48、69及49、69及50、69及51、69及52、70及47、70及48、70及49、70及50、70及51、70及52、71及47、71及48、71及49、71及50、71及51或71及52。

在某些具體例中，本發明提供與MSLN (例如人類MSLN)及T細胞抗原(例如CD3)特異性結合之抗體。

在某些具體例中，本發明提供一種抗體，其與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分。本技藝中已知之任何CD3結合部分可用於本文揭示之抗體及多肽中，包括但不限於多肽、適體及小分子CD3結合部分。在某些具體例中，CD3結合部分為抗體。在某些具體例中，CD3結合部分為單鏈可變片段(scFv)。例示性抗CD3抗體 (例如scFv)之VH及VL胺基酸序列說明於表2中。

在某些具體例中，CD3結合部分為抗CD3抗體(例如scFv)，其包含SEQ ID NO: 76中說明之胺基酸序列。在某些具體例中，CD3結合部分之胺基酸序列係由SEQ ID NO: 76中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，CD3結合部分與輕鏈共價連接。在某些具體例中，CD3結合部分與輕鏈之C端共價連接。在某些具體例中，CD3結合部分經由肽連接子與輕鏈之C端共價連接。在某些具體例中，肽連接子包含SEQ ID NO: 63、64、73、74或75中說明之胺基酸序列。

在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體為具有包含SEQ ID NO: 77、78、79、80、81或82中任一者說明之胺基酸序列之輕鏈。在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體為具有由SEQ ID NO: 77、78、79、80、81或82中任一者說明之胺基酸序列組成之輕鏈。

在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體包含重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 83及77、84及77、41及77、42及77、43及77、44及77、45及77、46及77、66及77、67及77、68及77、69及77、70及77、71及77、83及78、84及78、41及78、42及78、43及78、44及78、45及78、46及78、66及78、67及78、68及78、69及78、70及78、71及78、83及79、84及79、41及79、42及79、43及79、44及79、45及79、46及79、66及79、67及79、68及79、69及79、70及79、71及79、83及80、84及80、41及80、42及80、43及80、44及80、45及80、46及80、66及80、67及80、68及80、69及80、70及80、71及80、83及81、84及81、41及81、42及81、43及81、44及81、45及81、46及81、66及81、67及81、68及81、69及81、70及81、71及81、83及82、84及82、41及82、42及82、43及82、44及82、45及82、46及82、66及82、67及82、68及82、69及82、70及82或71及82中說明之胺基酸序列。

在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體包含重鏈及輕鏈，其分別由SEQ ID NO: 83及77、84及77、41及77、42及77、43及77、44 及77、45及77、46及77、66及77、67及77、68及77、69及77、70及77、71及77、83及78、84及78、41及78、42及78、43及78、44及78、45及78、46及78、66及78、67及78、68及78、69及78、70及78、71及78、83及79、84及79、41及79、42及79、43及79、44及79、45及79、46及79、66及79、67及79、68及79、69及79、70及79、71及79、83及80、84及80、41及80、42及80、43及80、44及80、45及80、46及80、66及80、67及80、68及80、69及80、70及80、71及80、83及81、84及81、41及81、42及81、43及81、44及81、45及81、46及81、66及81、67及81、68及81、69及81、70及81、71及81、83及82、84及82、41及82、42及82、43及82、44及82、45及82、46及82、66及82、67及82、68及82、69及82、70及82或71及82中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體包含重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 83及77中說明之胺基酸序列。在某些具體例中，與MSLN(例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體包含重鏈及輕鏈，其分別由SEQ ID NO: 83及77中說明之胺基酸序列組成。

在某些具體例中，與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合且進一步包含CD3結合部分之抗體為具有圖4之結構的雙特異性抗原結合分子。具有圖4之結構之分子對於目標抗原(例如MSLN及CD3)中之各者均為雙特異性及二價的，且在本文中亦被稱作IgG-scFv分子。此等分子包含其中抗原結合域對MSLN具有特異性之習知單特異性抗體結構，且亦包括兩個分別與兩個輕鏈恆定區之C端共價連接的scFv域，其中scFv域以VH-VL取向定向(亦即兩個scFv域中之各者之VH部分與各別輕鏈恆定區之C端共價連接)，且其對T細胞抗原(TCA) (例如CD3)具有特異性。在本文揭示之任一雙特異性分子(包括具有圖4之結構之彼等)中，抗癌或抗MSLN抗原結合域可衍生自本文揭示之任一抗MSLN抗體。舉例而言，抗MSLN抗原結合域可包含本文揭示之抗MSLN抗體之CDR及/或可變區。本發明之抗MSLN單特異性抗體或抗MSLN × 抗TCA (例如CD3)雙特異性抗原結合分子可與另一功能性分子(例如另一肽或蛋白質)鍵聯或共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價結合或以其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體或抗體片段以產生具有第二或其他結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。

在某些具體例中，本文揭示之抗體與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記結合。在某些具體例中，細胞毒性劑能夠誘導與其接觸之細胞的死亡或破壞。在某些具體例中，細胞生長抑制劑能夠預防或實質上減少與其接觸之細胞的增殖及/或抑制其活性或功能。在某些具體例中，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑為化學治療劑。在某些具體例中，放射性核種選自由以下組成之群：同位素 ³H、 ¹⁴C、 ³²P、 ³⁵S、 ³⁶Cl、 ⁵¹Cr、 ⁵⁷Co、 ⁵⁸Co、 ⁵⁹Fe、 ⁶⁷Cu、 ⁹⁰Y、 ⁹⁹Tc、 ¹¹¹In、 ¹¹⁷Lu、 ¹²¹I、 ¹²⁴I、 ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ¹⁹⁸Au、 ²¹¹At、 ²¹³Bi、 ²²⁵Ac及 ¹⁸⁶Re。在某些具體例中，可偵測標記包含螢光部分或點擊化學控點。

任何免疫球蛋白(Ig)恆定區均可用於本文揭示之抗體中。在某些具體例中，Ig區域為人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及IgA ₂)或任何子類別(例如IgG ₂a及IgG ₂b)之免疫球蛋白分子。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含視情況選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及IgA ₂。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含作為野生型重鏈恆定區之變體的重鏈恆定區，其中變異重鏈恆定區以比野生型重鏈恆定區與FcγR結合更低的親和力與該FcγR結合。

在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 72、53、54、55或56之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含由SEQ ID NO: 72、53、54、55或56之胺基酸序列組成的重鏈恆定區。

在某些具體例中，將一個、兩個或更多個突變(例如胺基酸取代)引入本文所描述之抗體之Fc區(例如CH2域(人類IgG ₁之殘基231-340))及/或CH3域(人類IgG ₁之殘基341-447，根據EU編號系統編號)及/或鉸鏈區(殘基216-230，根據EU編號系統編號)中，以改變抗體的一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。

在某些具體例中，將一個、兩個或更多個突變(例如胺基酸取代)引入本文所描述之抗體之鉸鏈區中，以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目改變(例如增加或減少)，如例如美國專利第5,677,425號中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目可改變以例如促進輕鏈及重鏈之組裝，或改變(例如增加或降低)抗體之穩定性。

在一特定具體例中，將一個、兩個或更多個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入IgG恆定區或其FcRn結合片段(較佳地Fc或鉸鏈-Fc片段)中，以改變(例如減少或增加)活體內抗體之半衰期。參見例如國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號；及美國專利第5,869,046號、第6,121,022號、第6,277,375號及第6,165,745號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中，關於將改變(例如減少或增加)活體內抗體之半衰期之突變的實施例。在某些具體例中，將一個、兩個或更多個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入IgG恆定區或其FcRn結合片段(較佳地Fc或鉸鏈-Fc片段)中，以減少活體內抗體之半衰期。在其他具體例中，將一個、兩個或更多個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入IgG恆定區或其FcRn結合片段(較佳地Fc或鉸鏈-Fc片段)中，以增加活體內抗體之半衰期。在一特定具體例中，抗體在第二恆定(CH2)域(人類IgG ₁之殘基231-340)及/或第三恆定(CH3)域(人類IgG ₁之殘基341-447)中可具有一或多個胺基酸突變(例如取代)，其根據EU編號系統編號。在一特定具體例中，本文所描述之抗體之IgG ₁之恆定區包含在位置252處甲硫胺酸(M)變為酪胺酸(Y)的取代、在位置254處絲胺酸(S)變為蘇胺酸(T)的取代及在位置256處蘇胺酸(T))變為麩胺酸(E)的取代，其根據EU編號系統編號。參見美國專利第7,658,921號，其以全文引用之方式併入本文中。此類型之突變型IgG，稱為「YTE突變體」，已顯示呈現半衰期相較於相同抗體之野生型型式增加四倍(參見Dall’Acqua WF等人, (2006) J Biol Chem 281: 23514-24，其以全文引用之方式併入本文中)。在某些具體例中，抗體包含IgG恆定區，該IgG恆定區包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389及428-436處之胺基酸殘基的一個、兩個、三個或更多個胺基酸取代，其根據EU編號系統編號。

在某些具體例中，將一個、兩個或更多個突變(例如胺基酸取代)引入本文所描述之抗體之Fc區(例如CH2域(人類IgG ₁之殘基231-340))及/或CH3域(人類IgG ₁之殘基341-447，根據EU編號系統編號)及/或鉸鏈區(殘基216-230，根據EU編號系統編號)中，以增加或降低抗體對於效應細胞表面上之Fc受體(例如活化Fc受體)的親和力。在抗體之Fc區中降低或增加抗體對Fc受體之親和力的突變及將此類突變引入Fc受體或其片段中的技術為熟悉本技藝者已知的。抗體之Fc受體中可進行突變以改變抗體對於Fc受體之親和力之突變的實施例描述於以下中：例如Smith P等人, (2012) PNAS 109: 6181-6186；美國專利第6,737,056號；及國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體例中，抗體包含作為野生型重鏈恆定區之變體之重鏈恆定區，其中變異重鏈恆定區以比野生型重鏈恆定區與FcγRIIB結合更高的親和力與FcγRIIB結合。在某些具體例中，變異重鏈恆定區為變異人類重鏈恆定區，例如變異人類IgG ₁、變異人類IgG ₂或變異人類IgG ₄重鏈恆定區。在某些具體例中，根據EU編號系統，變異人類IgG重鏈恆定區包含以下胺基酸突變中之一或多者：G236D、P238D、S239D、S267E、L328F及L328E。在某些具體例中，變異人類IgG重鏈恆定區包含一組選自由以下組成之群之胺基酸突變：S267E及L328F；P238D及L328E；P238D及一或多個選自由E233D、G237D、H268D、P271G及A330R組成之群的取代；P238D、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R；G236D及S267E；S239D及S267E；V262E、S267E及L328F；及V264E、S267E及L328F，其根據EU編號系統。在某些具體例中，FcγRIIB在選自由以下組成之群之細胞上表現：巨噬細胞、單核球、B細胞、樹突狀細胞、內皮細胞及活化T細胞。

在另一具體例中，將一個、兩個或更多個胺基酸取代引入IgG恆定區Fc區中，以改變抗體之效應功能。舉例而言，根據EU編號系統編號，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、239、243、267、292、297、300、318、320、322、328、330、332及396之胺基酸，可用不同胺基酸殘基置換，以使得抗體對於效應配體之親和力改變，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之C1成分。此方法進一步詳細描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，恆定區域之缺失或失活(經由點突變或其他手段)可減少Fc受體與循環抗體之結合，藉此增加腫瘤定位。關於使恆定區缺失或失活且藉此增加腫瘤定位之突變之描述，參見例如美國專利第5,585,097號及第8,591,886號，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，可將一或多個胺基酸取代引入本文所描述之抗體之Fc區中，以移除Fc區上之潛在醣基化位點，此可減少Fc受體結合(參見例如Shields RL等人, (2001) J Biol Chem 276: 6591-604，其以全文引用之方式併入本文中)。在各種具體例中，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行以下突變中之一或多者：N297A取代；N297Q取代；L234A取代；L234F取代；L235A取代；L235F取代；L235V取代；L237A取代；S239D取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；S239D取代；F243L取代；D265A取代；S267E取代；L328F取代；R292P取代；Y300L取代；A327Q取代；P329A取代；A330L取代；I332E取代；或P396L取代，其根據EU編號系統編號。

在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體的恆定區中進行選自由D265A、P329A及其組合組成之群的突變。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行選自由L235A、L237A及其組合組成之群的突變。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行選自由S267E、L328F及其組合組成之群的突變。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行選自由S239D、I332E、視情況A330L及其組合組成之群的突變。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行選自由L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L及其組合組成之群的突變。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，可在本文所描述之抗體之恆定區中進行選自由S267E、L328F及其組合組成之群的突變。

在一特定具體例中，本文所描述之抗體包含根據EU編號系統編號，具有N297Q或N297A胺基酸取代之IgG ₁的恆定區。在某些具體例中，本文所描述之抗體包含根據EU編號系統編號，具有選自由D265A、P329A及其組合組成之群之突變的IgG ₁的恆定區。在另一具體例中，本文所描述之抗體包含根據EU編號系統編號，具有選自由L234A、L235A及其組合組成之群之突變的IgG ₁的恆定區。在另一具體例中，本文所描述之抗體包含根據EU編號系統編號，具有選自由L234F、L235F、N297A及其組合組成之群之突變的IgG ₁的恆定區。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，在本文所描述之抗體之恆定區中處於對應於人類IgG ₁重鏈中位置L234、L235及D265之位置處的胺基酸殘基分別不為L、L及D。此方法詳細描述於國際公開案第WO 14/108483號中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，對應於人類IgG ₁重鏈中位置L234、L235及D265之胺基酸分別為F、E及A；或A、A及A，其根據EU編號系統編號。

在某些具體例中，根據EU編號系統編號，選自本文所描述之抗體之恆定區中胺基酸殘基329、331及322的一或多個胺基酸可由不同胺基酸殘基置換，以使得該抗體之C1q結合改變及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)減小或消除。此方法進一步詳細描述於美國專利第6,194,551號(Idusogie等人)中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，改變處於本文所描述之抗體之CH2域之N端區中的胺基酸位置231至238內的一或多個胺基酸殘基，以藉此改變該抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於國際公開案第WO 94/29351號中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，藉由在以下位置處使一或多個胺基酸突變(例如引入胺基酸取代)來修飾本文所描述之抗體的Fc區以增加該抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加該抗體對Fc

受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步描述於國際公開案第WO 00/42072號中，其以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本文所描述之抗體包含IgG ₁之經修飾之恆定區，其中該修飾增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力。在某些具體例中，藉由本文所描述及/或熟悉本技藝者已知之方法評定，0.1、1或10 µg/mL之抗體能夠在1、2或3小時內誘導至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%之MSLN表現細胞的細胞死亡。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，IgG ₁之經修飾之恆定區包含S239D及I332E取代。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，IgG ₁之經修飾之恆定區包含S239D、A330L及I332E取代。在某些具體例中，根據EU編號系統編號，IgG ₁之經修飾之恆定區包含L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L取代。在某些具體例中，抗體能夠誘導效應T細胞及Treg之細胞死亡，其中經歷細胞死亡之Treg的百分比比經歷細胞死亡之效應T細胞的百分比高至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。

在某些具體例中，根據EU編號系統編號，本文所描述之抗體包含IgG ₄抗體之恆定區，且在重鏈之胺基酸殘基228處的絲胺酸取代為脯胺酸。在某些具體例中，本發明提供一種與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 16或22之胺基酸序列的重鏈恆定區。

在某些具體例中，可將本文所描述之恆定區突變或修飾中之任一者引入本文中所描述之具有兩個重鏈恆定區之抗體的一個或兩個重鏈恆定區中。醫藥組成物

本文提供組成物，其包含在生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑中具有所需純度之本文揭示之抗MSLN抗體 (參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對於接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化烷基二甲基苄基銨；氯化苯索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。

在一特定具體例中，醫藥組成物包含於醫藥學上可接受之載劑中之本文揭示之抗MSLN抗體及視情況一或多種其他預防劑或治療劑。在一特定具體例中，醫藥組成物包含於醫藥學上可接受之載劑中之本文揭示之抗MSLN抗體及視情況一或多種其他預防劑或治療劑。在某些具體例中，抗體為醫藥組成物中所含的唯一活性成分。本文所描述之醫藥組成物可適用於增加或促進MSLN (例如人類MSLN)活性及治療病狀，諸如癌症。在某些具體例中，本發明係關於一種包含本發明之抗MSLN抗體之本發明之醫藥組成物，其適用作藥物。在另一具體例中，本發明係關於一種本發明之醫藥組成物，其用於治療癌症之方法中。

非經腸製劑中使用之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、鉗合劑或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實施例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可以將抑細菌或抑真菌濃度之抗微生物劑添加至封裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞(thimerosal)、氯化烷基二甲基苄基銨及氯化苯索寧。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因(procaine)。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80 (TWEEN ^®80)。金屬離子之鉗合劑或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括：對於水溶性媒劑，乙醇、聚乙二醇及丙二醇；及對於pH調節，氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。

醫藥組成物可經調配以用於任何向個體投與之途徑。投與途徑之特定實施例包括鼻內、經口、經肺、經皮、皮內及非經腸。本文亦涵蓋非經腸投與，其特徵在於皮下、肌肉內或靜脈內注射。可注射劑可以習知形式製備，呈液體溶液或懸浮液形式或適合於在注射前在液體中形成溶液或懸浮液之固體形式或呈乳液形式。可注射液、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。合適的賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，若需要，待投與之醫藥組成物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、溶解增強劑及其他此類藥劑，諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。

用於非經腸投與抗體之製劑包括可立即用於注射之無菌溶液、在臨用之前可立即與溶劑組合的無菌乾燥可溶產品(諸如凍乾粉) (包括皮下錠劑)、可立即用於注射之無菌懸浮液、在臨用之前可立即與媒劑組合的無菌乾燥不可溶產品、以及無菌乳液。溶液可為水溶液或非水溶液。

若經靜脈內投與，則合適的載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。

包含抗體之局部混合物係如對於局部及全身性投與所描述來製備。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似者，且可調配為乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、發泡體、氣溶膠、沖洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、經皮貼片或適合於局部投藥之任何其他調配物。

本文揭示之抗MSLN抗體可調配為用於諸如藉由吸入局部施用之氣溶膠(參見例如美國專利第4,044,126號、第4,414,209號及第4,364,923號，其描述用於遞送適用於治療發炎疾病，尤其哮喘之類固醇之氣溶膠，且以全文引用的方式併入本文中)。用於投與呼吸道之此等調配物可單獨或與諸如乳糖之惰性載劑組合，呈用於噴霧器之氣溶膠或溶液形式，或用於吹入之微細粉末形式。在此類情況下，調配物之粒子之直徑在某些具體例中將小於50微米，在某些具體例中小於10微米。

本文揭示之抗MSLN抗體可調配成凝膠、乳膏及洗劑形式用於局部(local/topical)施用，諸如局部施用於皮膚及黏膜，諸如眼中，及供施用於眼或腦池內或脊柱內施用。涵蓋局部投與以用於經皮遞送以及向眼睛或黏膜投與，或用於吸入療法。亦可投與單獨或與其他醫藥學上可接受之賦形劑組合的抗體之鼻用溶液。

包括離子導入及電泳裝置之經皮貼片為熟悉本技藝者熟知的，且可用於投與抗體。舉例而言，此類貼片揭示於美國專利第6,267,983號、第6,261,595號、第6,256,533號、第6,167,301號、第6,024,975號、第6,010715號、第5,985,317號、第5,983,134號、第5,948,433號及第5,860,957號中，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體例中，包含本文所描述之抗體的醫藥組成物為凍乾粉，其可經復原以用於以溶液、乳液及其他混合物形式投與。其亦可經復原且調配為固體或凝膠。凍乾粉係藉由將本文所描述之抗體或其醫藥學上可接受之衍生物溶解於合適的溶劑中來製備。在某些具體例中，凍乾粉為無菌的。溶劑可含有改良粉末或由該粉末製備之復原溶液的穩定性或其他藥理學成分的賦形劑。可使用之賦形劑包括但不限於右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的藥劑。溶劑亦可含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀，或熟悉本技藝者已知在某些具體例中處於約中性pH下之其他此類緩衝劑。隨後無菌過濾溶液，接著在熟悉本技藝者已知之標準條件下凍乾，得到所需調配物。在某些具體例中，將所得溶液分配至小瓶中用於凍乾。各小瓶將含有單劑量或多劑量之化合物。凍乾粉末可儲存在適當條件下，諸如在約4℃至室溫下。用注射用水復原此凍乾粉末得到用於非經腸投與之調配物。對於復原，將凍乾粉添加至無菌水或其他合適的載劑中。精確量取決於所選化合物。此類量可憑經驗判定。

本文揭示之抗MSLN抗體及本文提供之其他組成物亦可經調配以靶向待治療之個體身體的特定組織、受體或其他區域。許多此類靶向方法為熟悉本技藝者熟知的。本文中涵蓋所有此類靶向方法以用於本發明組成物中。關於靶向方法之非限制性實施例，參見例如美國專利第6,316,652號、第6,274,552號、第6,271,359號、第6,253,872號、第6,139,865號、第6,131,570號、第6,120,751號、第6,071,495號、第6,060,082號、第6,048,736號、第6,039,975號、第6,004,534號、第5,985,307號、第5,972,366號、第5,900,252號、第5,840,674號、第5,759,542號及第5,709,874號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。在一特定具體例中，本文所描述之抗體靶向腫瘤。

待用於活體內投與之組成物可為無菌的。此易於藉由經由例如無菌過濾膜過濾來實現。使用方法及用途

在另一態樣中，本發明提供一種使用本文揭示之抗MSLN抗體治療個體之方法。將得益於MSLN (例如人類MSLN)功能降低之個體之任何疾病或病症可使用本文揭示之抗MSLN抗體治療。在某些具體例中，疾病或病症對檢查點靶向劑(例如拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體或拮抗性抗PD-1抗體)具有抗性。在某些具體例中，疾病或病症在用檢查點靶向劑(例如拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體或拮抗性抗PD-1抗體)治療後復發。

本文揭示之抗MSLN抗體尤其適用於抑制對腫瘤之免疫系統耐受性，且因此可用作用於患有癌症之個體之免疫療法。舉例而言，在某些具體例中，本發明提供一種增加回應於個體中之抗原之T細胞(例如CD8 ⁺細胞毒性T細胞、CD4 ⁺輔助T細胞、NKT細胞、效應T細胞或記憶T細胞)活化之方法，該方法包含向個體投與有效量之如本文所揭示之抗MSLN抗體或其醫藥組成物。在某些具體例中，本發明提供一種治療個體之癌症之方法，該方法包含向個體投與有效量之如本文所揭示之抗體或醫藥組成物。

可用本文所揭示之抗MSLN抗體或醫藥組成物治療之癌症包括但不限於實體腫瘤、血液癌症(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤)及轉移性病灶。在某些具體例中，癌症為實體腫瘤。實體腫瘤之實施例包括惡性病，例如肉瘤及癌瘤，例如各種器官系統之腺癌，諸如影響肺、乳房、卵巢、淋巴、胃腸(例如大腸)、肛門、生殖器及泌尿生殖道(例如腎、尿道上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽、CNS (例如腦、神經或神經膠質細胞)、頭頸部、皮膚(例如黑色素瘤)及胰臟的彼等腺癌，以及包括惡性病的腺癌，諸如大腸癌、直腸癌、腎細胞癌瘤、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌)、小腸癌及食道癌。癌症可處於早期、中期、晚期或為轉移性癌症。在某些具體例中，癌症對檢查點靶向劑(例如拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體或拮抗性抗PD-1抗體)具有抗性。在某些具體例中，癌症用檢查點靶向劑(例如拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體或拮抗性抗PD-1抗體)治療後復發。

在某些具體例中，癌症選自肺癌(例如肺腺癌或非小細胞肺癌(NSCLC) (例如具有鱗狀及/或非鱗狀組織學之NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如晚期黑色素瘤)、腎癌(例如腎細胞癌)、肝癌(例如肝細胞癌)、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、前列腺癌、乳癌(例如不表現雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu中之一者、兩者或全部之乳癌，例如三陰性乳癌)、卵巢癌、大腸直腸癌、胰臟癌、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、肛門癌、胃食道癌(例如食道鱗狀細胞癌)、間皮瘤、鼻咽癌、甲狀腺癌、宮頸癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴增生疾病(例如移植後淋巴增生疾病)。

在某些具體例中，癌症為血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些具體例中，癌症為白血病，例如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性骨髓母細胞性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)或毛細胞白血病。在某些具體例中，癌症為淋巴瘤，例如B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤、生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、復發性非霍奇金淋巴瘤、難治性非霍奇金淋巴瘤、復發性濾泡性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、小淋巴球性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤或結外邊緣區淋巴瘤。在某些具體例中，癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。

在另一具體例中，癌症選自癌瘤(例如晚期或轉移性癌瘤)、黑色素瘤或肺癌瘤，例如非小細胞肺癌。

在某些具體例中，癌症為肺癌，例如肺腺癌、非小細胞肺癌或小細胞肺癌。

在某些具體例中，癌症為黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。在某些具體例中，癌症為對其他療法無反應之晚期或不可切除性黑色素瘤。在其他具體例中，癌症為具有BRAF突變(例如BRAF V600突變)之黑色素瘤。在又其他具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體或醫藥組成物係在於具有或不具有BRAF抑制劑(例如維羅非尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafenib))之情況下用抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab))治療後投與。

在另一具體例中，癌症為肝癌，例如伴有或不伴有病毒感染(例如慢性病毒性肝炎)之晚期肝癌。

在另一具體例中，癌症為前列腺癌，例如晚期前列腺癌。

在又另一具體例中，癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。

在又另一具體例中，癌症為腎癌，例如腎細胞癌(RCC) (例如轉移性RCC、透明細胞腎細胞癌(CCRCC)或腎臟乳頭狀細胞癌瘤)。

在又另一具體例中，癌症選自肺癌、黑色素瘤、腎癌、乳癌、大腸直腸癌、白血病或轉移性癌症病灶。

在某些具體例中，此等方法進一步包含向個體投與其他治療劑。在某些具體例中，其他治療劑為化學治療劑、放射性治療劑或檢查點靶向劑。在某些具體例中，化學治療劑為低甲基化劑(例如氮胞苷(azacitidine))。在某些具體例中，化學治療劑為DNA損傷誘導劑(例如吉西他濱(gemcitabine))。在某些具體例中，檢查點靶向劑選自由以下組成之群：拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體、拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD96抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、促效性抗CD137抗體、促效性抗GITR抗體及促效性抗OX40抗體。在某些具體例中，檢查點靶向劑選自由以下組成之群：拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體及拮抗性抗PD-1抗體，其中本文所揭示之MSLN (例如人類MSLN)抗體或醫藥組成物與檢查點靶向劑協同作用。

在某些具體例中，本發明係關於一種用於本發明方法中之本發明之抗體及/或醫藥組成物，其中該方法進一步包含向個體投與其他治療劑。在某些具體例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組成物及(b)其他治療劑，其適用作藥物。在某些具體例中，本發明係關於(a)一種本發明之抗體及/或醫藥組成物及(b)其他治療劑，其用於治療癌症之方法中。在另一具體例中，本發明係關於一種醫藥組成物、套組或套件(kit-of-parts)，其包含(a)本發明之抗體及/或醫藥組成物及(b)其他治療劑。在某些具體例中，其他治療劑為化學治療劑、放射性治療劑或檢查點靶向劑。

在某些具體例中，抗PD-1抗體用於本文揭示之方法中。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之納武利尤單抗(nivolumab)，亦稱為BMS-936558或MDX1106。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Merck &Co.研發之派姆單抗(pembrolizumab)，亦稱為蘭利珠單抗(lambrolizumab)或MK-3475。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由CureTech研發之皮地利珠單抗(pidilizumab)，亦稱為CT-011。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Medimmune研發之MEDI0680，亦稱為AMP-514。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Novartis Pharmaceuticals研發之PDR001。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Regeneron Pharmaceuticals研發之REGN2810。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Pfizer研發之PF-06801591。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由BeiGene研發之BGB-A317。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由AnaptysBio及Tesaro研發之TSR-042。在某些具體例中，抗PD-1抗體為由Hengrui研發之SHR-1210。

可用於本文揭示之治療方法中之抗PD-1抗體之其他非限制性實施例揭示於以下專利及專利申請案中，其均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中：美國專利第6,808,710號；美國專利第7,332,582號；美國專利第7,488,802號；美國專利第8,008,449號；美國專利第8,114,845號；美國專利第8,168,757號；美國專利第8,354,509號；美國專利第8,686,119號；美國專利第8,735,553號；美國專利第8,747,847號；美國專利第8,779,105號；美國專利第8,927,697號；美國專利第8,993,731號；美國專利第9,102,727號；美國專利第9,205,148號；美國公開案第US 2013/0202623 A1號；美國公開案第US 2013/0291136 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2014/0356363 A1號；美國公開案第US 2016/0075783 A1號；及PCT公開案第WO 2013/033091 A1號；PCT公開案第WO 2015/036394 A1號；PCT公開案第WO 2014/179664 A2號；PCT公開案第WO 2014/209804 A1號；PCT公開案第WO 2014/206107 A1號；PCT公開案第WO 2015/058573 A1號；PCT公開案第WO 2015/085847 A1號；PCT公開案第WO 2015/200119 A1號；PCT公開案第WO 2016/015685 A1號；及PCT公開案第WO 2016/020856 A1號。

在某些具體例中，抗PD-L1抗體用於本文揭示之方法中。在某些具體例中，抗PD-L1抗體為由Genentech研發之阿替利珠單抗(atezolizumab)。在某些具體例中，抗PD-L1抗體為由AstraZeneca、Celgene及Medimmune研發之德瓦魯單抗(durvalumab)。在某些具體例中，抗PD-L1抗體為由Merck Serono及Pfizer研發之阿維魯單抗(avelumab) (亦稱為MSB0010718C)。在某些具體例中，抗PD-L1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之MDX-1105。在某些具體例中，抗PD-L1抗體為由Amplimmune及GSK研發之AMP-224。

可用於本文揭示之治療方法中之抗PD-L1抗體之非限制性實施例揭示於以下專利及專利申請案中，其均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中：美國專利第7,943,743號；美國專利第8,168,179號；美國專利第8,217,149號；美國專利第8,552,154號；美國專利第8,779,108號；美國專利第8,981,063號；美國專利第9,175,082號；美國公開案第US 2010/0203056 A1號；美國公開案第US 2003/0232323 A1號；美國公開案第US 2013/0323249 A1號；美國公開案第US 2014/0341917 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2015/0203580 A1號；美國公開案第US 2015/0225483 A1號；美國公開案第US 2015/0346208 A1號；美國公開案第US 2015/0355184 A1號；及PCT公開案第WO 2014/100079 A1號；PCT公開案第WO 2014/022758 A1號；PCT公開案第WO 2014/055897 A2號；PCT公開案第WO 2015/061668 A1號；PCT公開案第WO 2015/109124 A1號；PCT公開案第WO 2015/195163 A1號；PCT公開案第WO 2016/000619 A1號；及PCT公開案第WO 2016/030350 A1號。

在某些具體例中，抗CTLA-4抗體用於本文揭示之方法中。在某些具體例中，抗CTLA-4抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之伊匹單抗。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與靶向免疫調節酶，諸如IDO (吲哚胺-(2,3)-二加氧酶 )及/或TDO (色胺酸2,3-二加氧酶)之化合物組合向個體投與。因此，在某些具體例中，其他治療劑為靶向免疫調節酶，諸如吲哚胺-(2,3)-二加氧酶 (IDO)之抑制劑的化合物。在某些具體例中，此類化合物選自由以下組成之群：艾卡哚司他(epacadostat) (Incyte Corp；參見例如WO 2010/005958，其以全文引用之方式併入本文中)、F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、因多莫得(indoximod) (NewLink Genetics)及NLG919 (NewLink Genetics)。在某些具體例中，化合物為艾卡哚司他。在另一具體例中，化合物為F001287。在另一具體例中，化合物為因多莫得。在另一具體例中，化合物為NLG919。在一特定具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與IDO抑制劑組合向個體投與以用於治療癌症。如本文所描述之用於治療癌症之IDO抑制劑以醫藥組成物之固體劑型(諸如錠劑、丸劑或膠囊)形式存在，其中該醫藥組成物包括IDO抑制劑及醫藥學上可接受之賦形劑。因此，如本文所描述之抗體及如本文中所描述之IDO抑制劑可作為各別劑型分開、依序或同時投與。在某些具體例中，抗體係經非經腸投與，且IDO抑制劑係經口投與。在某些具體例中，抑制劑選自由以下組成之群：艾卡哚司他(Incyte Corporation)、F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、因多莫得(NewLink Genetics)及NLG919 (NewLink Genetics)。艾卡哚司他已描述於PCT公開案第WO 2010/005958號中，其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，抑制劑為艾卡哚司他。在另一具體例中，抑制劑為F001287。在另一具體例中，抑制劑為因多莫得。在另一具體例中，抑制劑為NLG919。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與疫苗組合向個體投與。疫苗可為例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與佐劑組合向個體投與。各種佐劑可視治療情形而加以使用。適當佐劑之非限制性實施例包括但不限於弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、montanide ISA(不完全Seppic佐劑)、Ribi佐劑系統(RAS)、Titer Max、胞壁醯基肽、Syntex佐劑調配物(SAF)、明礬(氫氧化鋁及/或磷酸鋁)、鋁鹽佐劑、Gerbu ^®佐劑、硝化纖維素吸收之抗原、囊封或包覆之抗原、3脫氧-醯基化單磷醯基脂質A (3 D-MPL)、免疫刺激寡核苷酸、類鐸受體(TLR)配體、甘露聚糖結合性凝集素(MBL)配體、STING促效劑、免疫刺激性複合物(諸如皂素)、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX及其他。其他佐劑包括CpG寡核苷酸及雙股RNA分子，諸如poly(A)及poly(U)。亦可使用上述佐劑之組合。參見例如美國專利第6,645,495號；第7,029,678號；及第7,858,589號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。在某些具體例中，本文所用之佐劑為QS-21刺激子。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與包含TCR之其他治療劑組合向個體投與。在某些具體例中，其他治療劑為可溶性TCR。在某些具體例中，其他治療劑為表現TCR之細胞。因此，在某些具體例中，本發明係關於一種本發明之抗體及/或醫藥組成物與包含TCR之其他治療劑的組合，其適用作用於治療癌症的藥物及/或適用於治療癌症之方法中。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞組合向個體投與。在某些具體例中，細胞為T細胞。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與TCR模擬抗體組合向個體投與。在某些具體例中，TCR模擬抗體為與肽-MHC複合物特異性結合之抗體。關於TCR模擬抗體之非限制性實施例，參見例如美國專利第9,074,000號及美國公開案第US 2009/0304679 A1號及第US 2014/0134191 A1號，以上所有均以全文引用之方式併入本文中。

在某些具體例中，本文揭示之抗MSLN抗體與雙特異性T細胞接合子(BiTE) (例如如WO2005061547A2中所描述，其以全文引用之方式併入本文中)及/或雙親和力再靶向抗體(DART) (例如如WO2012162067A2中所描述，其以全文引用之方式併入本文中)組合向個體投與。在某些具體例中，BiTE及/或DART特異性結合腫瘤相關抗原(例如在腫瘤中過度表現之多肽、衍生自腫瘤病毒之多肽、包含對腫瘤具有特異性之轉譯後修飾的多肽、在腫瘤中特異性突變之多肽)及效應細胞上之分子(例如CD3或CD16)。在某些具體例中，腫瘤相關抗原為EGFR (例如人類EGFR)，視情況其中BiTE及/或DART包含西妥昔單抗之VH及VL序列。在某些具體例中，腫瘤相關抗原為Her2 (例如人類Her2)，視情況其中BiTE及/或DART包含曲妥珠單抗之VH及VL序列。在某些具體例中，腫瘤相關抗原為CD20 (例如人類CD20)。

抗MSLN抗體及其他治療劑(例如化學治療劑、放射性治療劑、檢查點靶向劑、IDO抑制劑、疫苗、佐劑、可溶性TCR、表現TCR之細胞、表現嵌合抗原受體之細胞及/或TCR模擬抗體)可作為各別劑型分開、依序或同時投與。在某些具體例中，抗MSLN抗體係經非經腸投與，且IDO抑制劑係經口投與。

本文所描述之抗體或醫藥組成物可藉由多種途徑遞送至個體。此等途徑包括但不限於非經腸、鼻內、氣管內、經口、皮內、局部、肌肉內、腹膜內、經皮、靜脈內、腫瘤內、經結膜、動脈內、及皮下途徑。亦可使用經肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及具有適用作噴霧之氣霧劑的調配物。在某些具體例中，本文所描述之抗體或醫藥組成物係皮下或靜脈內遞送。在某些具體例中，本文所描述之抗體或醫藥組成物係動脈內遞送。在某些具體例中，本文所描述之抗體或醫藥組成物係瘤內遞送。在某些具體例中，將本文所描述之抗體或醫藥組成物遞送至腫瘤引流淋巴結中。

將在治療及/或預防病狀中有效的抗體或組成物之量將視疾病性質而定，且可藉由標準臨床技術判定。

待用於組成物中之精確劑量亦將視投與途徑及感染或由其引起之疾病的嚴重性而定，且應根據醫師之判斷及各個體之情況來決定。舉例而言，有效劑量亦可視投與手段、目標位點、患者之生理學狀態(包括年齡、體重及健康狀況)、患者是人類還是動物、所投與之其他藥物或治療是預防性還是治療性而變化。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括基因轉殖哺乳動物。治療劑量經最佳地滴定以使安全性及功效最佳化。

本文所描述之抗MSLN抗體亦可用以使用熟悉本技藝者已知之經典免疫組織化學方法，包括免疫分析，諸如酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法，分析生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)蛋白含量。合適的抗體分析標記為此項技術中已知的，且包括酶標記，諸如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘( ¹²⁵I、 ¹²¹I)、碳( ¹⁴C)、硫( ³⁵S)、氚( ³H)、銦( ¹²¹In)及鍀( ⁹⁹Tc)；發光標記，諸如流明諾(luminol)；及螢光標記，諸如螢光素及玫瑰紅，以及生物素。此類標記物可用於標記本文所描述之抗體。或者，識別本文所描述之抗MSLN抗體之第二抗體可經標記且與抗MSLN抗體組合使用，以偵測MSLN (例如人類MSLN)蛋白含量。因此，在某些具體例中，本發明係關於一種本發明之抗MSLN抗體之用途，其用於活體外偵測生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)蛋白。在另一具體例中，本發明係關於一種本發明之抗MSLN抗體之用途，其用於分析及/或偵測活體外生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)蛋白含量，視情況其中抗MSLN抗體與放射性核種或可偵測標記結合，及/或攜帶本文所描述之標記，及/或其中使用免疫組織化學方法。

分析MSLN (例如人類MSLN)蛋白之表現量意欲包括直接(例如藉由測定或估計絕對蛋白質含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中之疾病相關蛋白含量比較)定性或定量量測或估計第一生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)蛋白含量。可量測或估計第一生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)多肽表現量，且與標準MSLN (例如人類MSLN)蛋白含量比較，該標準物例如係自獲自未患病症之個體的第二生物樣品獲得或係藉由對來自未患病症之個體群體的含量求平均測定。如本技藝中應瞭解，一旦已知「標準」MSLN (例如人類MSLN)多肽含量，則出於比較，其可作為標準物反覆地使用。因此，在另一具體例中，本發明係關於一種用於分析及/或偵測生物樣品中之MSLN蛋白含量，例如人類MSLN蛋白含量之活體外方法，其包含藉由免疫組織化學方法定性或定量量測或估計生物樣品中之MSLN蛋白，例如人類MSLN蛋白之含量。

如本文所用，術語「生物樣品」係指自可能表現MSLN (例如人類MSLN)之個體、細胞株、組織或其他細胞來源獲取之任何生物樣品。用於自動物(例如人類或石蟹獼猴)獲得組織活檢體及體液之方法為本技藝中熟知的。生物樣品包括周邊血液單核細胞(PBMC)。

本文所描述之抗MSLN抗體可用於預後、診斷、監測及篩選應用，包括熟悉本技藝者熟知及標準以及基於本說明書之活體外及活體內應用。用於活體外評定及評估免疫系統狀態及/或免疫反應之預後、診斷、監測及篩選分析可用以預測、診斷及監測以評估患者樣品，包括已知免疫系統功能異常或疑似免疫系統功能異常或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應的彼等。對免疫系統狀態及/或免疫反應之評定及評估亦適用於判定患者對藥物臨床試驗或對與不同藥劑或抗體對比投與特定化學治療劑、放射性治療劑或抗體(包括其組合)的適合性。此類型之預後及診斷監測及評定已在實踐中利用針對乳癌中之HER2蛋白之抗體(HercepTest ^TM, Dako)進行，其中該分析亦用於針對使用Herceptin ^®之抗體療法評估患者。活體內應用包括定向細胞療法及免疫系統調節以及免疫反應之放射成像。因此，在某些具體例中，本發明係關於一種本發明之抗MSLN抗體及/或醫藥組成物，其適用作診斷。在某些具體例中，本發明係關於一種本發明之抗MSLN抗體及/或醫藥組成物，其用於預測、診斷及/或監測免疫系統功能異常或疑似免疫系統功能異常之個體及/或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應對個體進行預測、診斷及/或監測之方法中在另一具體例中，本發明係關於一種本發明之抗MSLN抗體之用途，其藉由活體外分析及/或偵測個體之生物樣品中之人類MSLN蛋白含量，來預測、診斷及/或監測免疫系統功能異常或疑似免疫系統功能異常之個體及/或關於預期或所需免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應對個體進行預測、診斷及/或監測。

在某些具體例中，抗MSLN抗體可用於活檢樣品之免疫組織化學中。在某些具體例中，方法為活體外方法。在另一具體例中，抗MSLN抗體可用於偵測MSLN (例如人類MSLN)的含量或膜表面上含有MSLN (例如人類MSLN)之細胞的含量，該等含量接著可與某些疾病症狀相關。本文所描述之抗MSLN抗體可攜帶可偵測或功能性標記及/或可與放射性核種或可偵測標記結合。當使用螢光標記時，目前可用的本技藝中已知中已知之顯微法及螢光活化細胞分選分析或兩種方法程序之組合可用於鑑別及定量特異性結合成員。本文所描述之抗MSLN抗體可攜帶螢光標記或可與其結合。例示性螢光標記包括例如反應性及結合探針，例如胺基香豆素(Aminocoumarin)、螢光素及德克薩斯紅(Texas red)、Alexa Fluor染料、Cy染料及DyLight染料。抗MSLN抗體可攜帶放射性標記或放射性核種或可與其結合，該放射性標記或放射性核種諸如同位素 ³H、 ¹⁴C、 ³²P、 ³⁵S、 ³⁶Cl、 ⁵¹Cr、 ⁵⁷Co、 ⁵⁸Co、 ⁵⁹Fe、 ⁶⁷Cu、 ⁹⁰Y、 ⁹⁹Tc、 ¹¹¹In、 ¹¹⁷Lu、 ¹²¹I、 ¹²⁴I、 ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ¹⁹⁸Au、 ²¹¹At、 ²¹³Bi、 ²²⁵Ac及 ¹⁸⁶Re。在使用放射性標記時，目前可用的本技藝中已知之計算程序可用於鑑別及定量抗MSLN抗體與MSLN (例如人類MSLN)之特異性結合。在其中標記為酶之情況中，偵測可藉由本發明所利用的如本技藝中已知之比色、分光光度、氟分光光度、電流測定或氣體定量技術中的任一者來實現。此可藉由使樣品或對照樣品與抗MSLN抗體在允許抗MSLN抗體與MSLN (例如人類MSLN)之間形成複合物之條件下接觸來達成。偵測樣品及對照中之抗MSLN抗體與MSLN (例如人類MSLN)之間形成的任何複合物且進行比較。根據本文所描述之抗MSLN抗體對於MSLN (例如人類MSLN)之特異性結合，抗MSLN抗體可用於特異性偵測MSLN (例如人類MSLN)。本文所描述之抗MSLN抗體亦可經由免疫親和力純化用以純化MSLN (例如人類MSLN)。本文中亦包括一種用於定量分析例如MSLN (例如人類MSLN)/MSLN (例如人類MSLN)配體複合物之存在程度的分析系統，其可製備成測試套組、套組或套件形式。系統、測試套組、套組或套件可包含經標記之成分(例如經標記之抗體)及一或多種其他免疫化學試劑。多核苷酸、載體及產生抗體之方法

在另一態樣中，本文提供多核苷酸，其包含編碼本文所描述之抗體或其部分或與MSLN (例如人類MSLN)抗原特異性結合之其片段(例如VL及/或VH；及輕鏈及/或重鏈)的核苷酸序列；及載體，例如包含用於在宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)及哺乳動物細胞)中重組表現之此類多核苷酸的載體。本文提供多核苷酸，其包含編碼本文所提供任一抗體之重鏈及/或輕鏈的核苷酸序列；以及包含此類多核苷酸序列之載體，例如用於在宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中使該等多核苷酸有效表現的表現載體。

如本文所用，「經分離」之多核苷酸或核酸分子為與存在於核酸分子之天然來源中(例如小鼠或人類中)之其他核酸分子分離的多核苷酸或核酸分子。此外，「經分離」之核酸分子(諸如cDNA分子)可實質上不含其他細胞材料或培養基(當藉由重組技術產生時)，或實質上不含化學前驅物或其他化學物質(當化學合成時)。舉例而言，措辭「實質上不含」包括具有小於約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1% (尤其小於約10%)之其他材料(例如細胞材料、培養基、其他核酸分子、化學前驅物及/或其他化學物質)之多核苷酸或核酸分子製劑。在一特定具體例中，分離或純化編碼本文所描述之抗體之核酸分子。

在特定態樣中，本文提供包含編碼與MSLN (例如人類MSLN)多肽特異性結合之抗體之核苷酸序列之多核苷酸，且包含如本文所描述之胺基酸序列，以及與此類抗體競爭與MSLN (例如人類MSLN)多肽結合(例如以劑量依賴性方式)或與此類抗體結合相同抗原決定基的抗體。

在某些態樣中，本文提供包含編碼本文所描述之抗體之輕鏈或重鏈之核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包含編碼包含本文所描述之抗體之VL FR及CDR之輕鏈的核苷酸序列(參見例如表1)，或編碼包含本文所描述之抗體之VH FR及CDR之重鏈的核苷酸序列(參見例如表1)。在某些具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之VH、VL、重鏈及/或輕鏈。在另一具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之第一VH及第一VL。在另一具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之第二VH及第二VL。。在另一具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之第一重鏈及第一輕鏈。在另一具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之第二重鏈及第二輕鏈。在另一具體例中，多核苷酸編碼本文所描述之抗體之VH及/或VL、或重鏈及/或輕鏈。

本文亦提供編碼抗MSLN抗體之多核苷酸，其例如藉由密碼子/RNA最佳化、用異源訊號序列置換及消除mRNA不穩定性元件進行最佳化。藉由在mRNA中引入密碼子變化及/或消除抑制區以產生編碼抗MSLN抗體或其片段(例如輕鏈、重鏈、VH域或VL域)之最佳化之核酸用於重組表現的方法，可藉由採用例如以下中描述的最佳化方法進行：美國專利第5,965,726號；第6,174,666號；第6,291,664號；第6,414,132號；及第6,794,498號，相應地以上所有均以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，RNA內之潛在剪接位點及不穩定性元件(例如富含A/T或A/U之元件)可在不改變由核酸序列編碼之胺基酸的情況下進行突變以提高RNA的穩定性以用於重組表現。改變利用遺傳密碼之簡併，例如對相同胺基酸使用替代性密碼子。在某些具體例中，可能期望改變一或多個密碼子以編碼保守突變，例如具有與原始胺基酸類似之化學結構及特性及/或功能的類似胺基酸。相對於由未經最佳化之多核苷酸編碼之抗MSLN抗體的表現，此類方法可使抗MSLN抗體或其片段之表現增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多。

在某些具體例中，編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段(例如VL域及/或VH域)之經最佳化的多核苷酸序列可與編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段(例如VL域及/或VH域)之未經最佳化的多核苷酸序列的反義(例如互補)多核苷酸雜交。在特定具體例中，編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段之經最佳化的核苷酸序列在高嚴格條件下，與編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段之未經最佳化的多核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。在一特定具體例中，編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段之經最佳化的核苷酸序列在高嚴格、中等嚴格或低嚴格雜交條件下，與編碼本文所描述之抗MSLN抗體或其片段之未經最佳化的核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。已描述關於雜交條件之資訊，參見例如美國專利申請公開案第US 2005/0048549號(例如段落72-73)，其以全文引用之方式併入本文中。

可藉由本技藝中已知之任何方法獲得多核苷酸及判定該等多核苷酸之核苷酸序列。編碼本文所描述之抗體(例如表1中描述之抗體)及此等抗體之經修飾之型式的核苷酸序列可使用本技藝中熟知之方法測定，亦即，以使得產生編碼抗體之核酸之方式組裝已知編碼特定胺基酸的核苷酸密碼子。編碼抗體之此類多核苷酸可由化學合成的寡核苷酸組裝(例如如Kutmeier G等人, (1994), BioTechniques 17: 242-6中所描述，其以全文引用之方式併入本文中)，簡言之，其涉及合成含有編碼抗體之序列部分的重疊寡核苷酸，退火，及彼等寡核苷酸之接合，及接著藉由PCR擴增接合的寡核苷酸。

或者，編碼本文所描述之抗原結合區或本文所描述之抗體的多核苷酸可使用本技藝中熟知之方法(例如PCR及其他分子選殖方法)，由來自合適來源(例如融合瘤)的核酸產生。舉例而言，使用可與已知序列之3’及5’端雜交之合成引子的PCR擴增可使用自產生所關注抗體之融合瘤細胞獲得的基因體DNA來進行。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體輕鏈及/或重鏈之序列的核酸。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體之可變輕鏈區及/或可變重鏈區之序列的核酸。可將擴增的核酸選殖入載體中以用於在宿主細胞中表現及用於進一步選殖。

若含有編碼特定抗原結合區或抗體之核酸的殖株不可用，但抗原結合區或抗體分子之序列已知，則編碼免疫球蛋白的核酸可藉由PCR擴增，使用可與序列之3’及5’端雜交之合成引子，或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針(以鑑別例如來自cDNA庫之編碼抗體的cDNA殖株)選殖，化學合成或自合適來源(例如抗體cDNA庫，或表現抗體之任何組織或細胞，諸如選擇用於表現本文所描述之抗體之融合瘤細胞產生的cDNA庫，或自其分離的核酸，較佳地poly A + RNA)獲得。接著，可使用本技藝中熟知之任何方法將藉由PCR產生之擴增的核酸選殖至可複製之選殖載體中。

編碼本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之DNA，可使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)容易地分離及定序。融合瘤細胞可用作此類DNA之來源。一旦分離，可將DNA置於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞中，該等宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如來自CHO GS System™ (Lonza)之CHO細胞)或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中合成抗MSLN抗體。

為了產生完整抗體或抗原結合區，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及用於保護限制位點之側接序列之PCR引子可用於擴增scFv殖株中之VH或VL序列。利用熟悉本技藝者已知的選殖技術，可將PCR擴增之VH域選殖至表現重鏈恆定區(例如人類γ1或人類γ4恆定區)之載體中，且可將PCR擴增之VL域選殖至表現輕鏈恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。在某些具體例中，用於表現VH或VL域之載體包含EF-1α啟動子、分泌訊號、可變區之選殖位點、恆定區及諸如新黴素之選擇標記。亦可將VH及VL域選殖至一個表現必需恆定區之載體中。接著使用熟悉本技藝者已知之技術，將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中，以產生表現全長抗體，例如IgG之穩定或暫態細胞株。

DNA亦可例如藉由將鼠類序列取代為人類重鏈及輕鏈恆定區之編碼序列，或藉由將全部或一部分之非免疫球蛋白多肽之編碼序列共價接合於免疫球蛋白編碼序列來修飾。

亦提供在高嚴格、中等嚴格或低嚴格雜交條件下與編碼本文所描述之抗體之多核苷酸雜交的多核苷酸。在特定具體例中，本文所描述之多核苷酸在高嚴格、中等嚴格或低嚴格雜交條件下與編碼本文提供之VH域及/或VL域之多核苷酸雜交。

雜交條件已在本技藝中描述且為熟悉本技藝者已知的。舉例而言，在嚴格條件下雜交可能涉及與過濾物結合的DNA在約45℃之6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨後在約50-65℃之0.2× SSC/0.1% SDS中一或多次洗滌；在高嚴格條件下雜交可能涉及與過濾物結合的核酸在約45℃之6× SSC中雜交，隨後在約68℃之0.1× SSC/0.2% SDS中一或多次洗滌。在其他嚴格雜交條件下雜交為熟悉本技藝者已知的，且已描述，參見例如Ausubel FM等人編, (1989) Current Protocols in Molecular Biology，第I卷, Green Publishing Associates, Inc.及John Wiley & Sons, Inc., New York，第6.3.1-6.3.6及2.10.3頁，其以全文引用之方式併入本文中。

在某些態樣中，本文提供表現(例如以重組方式)本文所描述之與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之抗體之細胞(例如宿主細胞)，及相關多核苷酸以及表現載體。本文提供載體(例如表現載體)，其包含含有編碼抗MSLN抗體或片段之核苷酸序列的多核苷酸以用於在宿主細胞中，較佳地在哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中重組表現。本文亦提供宿主細胞，其包含此類載體以用於以重組方式表現本文所描述之抗MSLN抗體(例如人類或人源化抗體)。在一特定態樣中，本文中提供用於產生本文所描述之抗體之方法，其包含由宿主細胞表現抗體。

重組表現與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之本文所描述之抗體(例如全長抗原結合區或抗體，或本文所描述之抗體之重鏈及/或輕鏈)一般涉及構築含有編碼抗體之多核苷酸的表現載體。一旦已獲得編碼本文所描述之抗體分子、抗體之重鏈及/或輕鏈或其片段(例如重鏈及/或輕鏈可變區)的多核苷酸，則用於產生抗體分子之載體可藉由重組DNA技術使用本技藝中熟知之技術來產生。因此，本文描述用於藉由表現含有抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)編碼核苷酸序列之多核苷酸製備蛋白質的方法。熟悉本技藝者熟知之方法可用於構築含有抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)編碼序列及適當轉錄及轉譯控制訊號的表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供可複製的載體，其包含編碼本文所描述之抗體分子、抗體之重鏈或輕鏈、抗體之重鏈或輕鏈可變區或其片段、或重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接於啟動子。此類載體可例如包括編碼抗體分子之恆定區的核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；以及美國專利第5,122,464號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中)，且可將抗體之可變區選殖至此類載體中以用於表現整個重鏈、整個輕鏈或整個重鏈及輕鏈兩者。

在某些具體例中，載體包含編碼本文所描述之抗體之VH、VL、重鏈及/或輕鏈之多核苷酸。在另一具體例中，載體包含編碼本文所描述之抗體之VH及VL之多核苷酸。在另一具體例中，載體包含編碼本文所描述之抗體之重鏈及輕鏈之多核苷酸。

可藉由習知技術將表現載體轉移至細胞(例如宿主細胞)中，且接著可藉由習知技術培養所得細胞，以產生本文所描述之抗體或其片段。因此，本文提供宿主細胞，其含有編碼本文所描述之抗體或其片段，或其重鏈或輕鏈，或其片段，或本文所描述之單鏈抗體之多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接於用於在宿主細胞中表現此類序列之啟動子。

在某些具體例中，宿主細胞包含編碼本文所描述之抗體之VH及VL之多核苷酸。在另一具體例中，宿主細胞包含含有編碼本文所描述之抗體之VH及VL之多核苷酸的載體。在另一具體例中，宿主細胞包含編碼本文所描述之抗體之VH的第一多核苷酸，及編碼本文所描述之抗體之VL的第二多核苷酸。在另一具體例中，宿主細胞包含含有編碼本文所描述之抗體之VH之第一多核苷酸的第一載體，及含有編碼本文所描述之抗體之VL之第二多核苷酸的第二載體。

在特定具體例中，由第一細胞表現之重鏈/重鏈可變區與第二細胞之輕鏈/輕鏈可變區結合，以形成本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體。在某些具體例中，本文提供宿主細胞群體，其包含此類第一宿主細胞及此類第二宿主細胞。

在某些具體例中，本文提供載體群體，其包含：第一載體，其包含編碼本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之輕鏈/輕鏈可變區的多核苷酸；及第二載體，其包含編碼本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之重鏈/重鏈可變區的多核苷酸。

多種宿主表現載體系統可用於表現本文所描述之抗體分子(參見例如美國專利第5,807,715號，其以全文引用之方式併入本文中)。此類宿主表現系統表示可產生且隨後純化所關注編碼序列的運載體(vehicle)，且亦表示可在經適當核苷酸編碼序列轉化或轉染時原位表現本文所描述之抗體分子的細胞。此等包括但不限於微生物，諸如用例如含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉化之細菌(例如、大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis))；用例如含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉化之酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)及畢赤酵母屬(Pichia))；用例如含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；用例如重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；菸草嵌紋病毒，TMV)感染或用例如含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉化的植物細胞系統(例如綠藻，諸如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或哺乳動物細胞系統(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20及BMT10細胞)，其含有例如含有來源於哺乳動物細胞基因體(例如金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之啟動子的重組表現構築體。在一特定具體例中，用於表現本文所描述之抗體之細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，例如來自CHO GS System™ (Lonza)之CHO細胞。在某些具體例中，由CHO細胞產生的抗體之重鏈及/或輕鏈的N端麩醯胺酸或麩胺酸殘基可經焦麩胺酸置換。在某些具體例中，用於表現本文所描述之抗體之細胞為人類細胞，例如人類細胞株。在一特定具體例中，哺乳動物表現載體為pOptiVEC™或pcDNA3.3。在某些具體例中，尤其用於表現完整重組抗體分子之細菌細胞(諸如大腸桿菌)或真核細胞(例如哺乳動物細胞)，用於表現重組抗體分子。舉例而言，諸如CHO細胞之哺乳動物細胞結合諸如來自人類巨細胞病毒之主要中早期基因啟動子元件之載體為針對抗體的有效表現系統(Foecking MK及Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5；及Cockett MI等人, (1990) Biotechnology 8(7): 662-7，其中之各者以全文引用之方式併入本文中)。在某些具體例中，本文所描述之抗體由CHO細胞或NS0細胞產生。在一特定具體例中，編碼與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之本文所描述之抗體之核苷酸序列的表現係由組成型啟動子、誘導性啟動子或組織特異性啟動子調節。

在細菌系統中，多種表現載體可有利地視所表現之抗體分子的預期用途而加以選擇。舉例而言，當待產生大量此類抗體時，為了產生抗體分子之醫藥組成物，可能需要導引高含量之容易純化的融合蛋白產物之表現的載體。此類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruether U及Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794)，其中編碼序列可個別地接合至具有lac Z編碼區之載體中之框架中，以使得產生融合蛋白；pIN載體(Inouye S及Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109；Van Heeke G及Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509)；及其類似者，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，pGEX載體亦可用於將外源多肽表現為具有麩胱甘肽5-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言，此類融合蛋白為可溶性的，且可藉由吸附及結合麩胱甘肽瓊脂糖珠粒基質，繼而在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易地自溶解細胞純化。pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，以使得可自GST部分釋放選殖的目標基因產物。

在昆蟲系統中，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)可用作用於表現外源基因之載體。病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。可將編碼序列個別地選殖至病毒之非必需區(例如多角體蛋白基因)中，且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。

在哺乳動物宿主細胞中，可採用多種基於病毒之表現系統。在其中腺病毒用作表現載體之情況下，所關注之編碼序列可接合於腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因接著可藉由活體外或活體內重組而插入於腺病毒基因體中。插入於病毒基因體之非必需區(例如區域El或E3)中將產生活的且能夠在感染宿主中表現該分子之重組病毒(例如參見Logan J及Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9，其以全文引用之方式併入本文中)。為了高效轉譯所插入之編碼序列，亦可所需特定起始訊號。此等訊號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列的讀框同相，以確保轉譯完整插入物。此等外源性轉譯控制訊號及起始密碼子可為多種來源，天然及合成兩者。表現效率可藉由包括適當轉錄增強元件、轉錄終止子等增強 (參見例如Bitter G等人, (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544，其以全文引用之方式併入本文中)。

另外，可選擇調節插入序列之表現或以所需特定方式修飾及加工基因產物的宿主細胞株。蛋白質產物之此類修飾(例如醣基化)及加工(例如裂解)對於蛋白質之功能而言可能為至關重要的。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾的特徵及特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外源蛋白質之正確修飾及加工。為了此目的，可使用具有恰當加工初級轉錄本、基因產物之醣基化及磷酸化的細胞機制之真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於：CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0 (不內源性產生任何免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓瘤細胞株)、CRL7O3O、COS (例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10及HsS78Bst細胞。在某些具體例中，本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體係在哺乳動物細胞，諸如CHO細胞中產生。

在一特定具體例中，本文所描述之抗體的岩藻醣含量減少或無岩藻醣含量。此類抗體可使用熟悉本技藝者已知之技術來產生。舉例而言，抗體可在缺乏或不具有岩藻糖基化之能力的細胞中進行表現。在一特定實施例中，基因剔除α1,6-岩藻糖基轉移酶之兩個等位基因之細胞株可用於產生岩藻醣含量減少的抗體。Potelligent ^®系統(Lonza)為可用於產生岩藻醣含量減少之抗體的此類系統之實施例。

對於長期高產率產生重組蛋白而言，可產生穩定表現細胞。舉例而言，穩定表現本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之細胞株可經工程改造。在特定具體例中，本文提供之細胞穩定表現結合以形成本文所描述之抗原結合區或抗體的輕鏈/輕鏈可變區及重鏈/重鏈可變區。

在某些態樣中，宿主細胞可用受適當表現控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可篩選標記轉化，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。在引入外源DNA/多核苷酸後，可使經工程改造之細胞在富集培養基(enriched media)中生長1-2天，且接著交換至選擇培養基中。重組質體中之可篩選標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成變異區(foci)，該變異區繼而可選殖至細胞株中且擴增。此方法可宜用於工程改造表現本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)或其片段之細胞株。此類經工程改造之細胞株可尤其適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相互作用之組成物。

可使用多種選擇系統，包括但不限於分別在tk細胞、hgprt細胞或aprt細胞中之單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人, (1977) Cell 11(1): 223-32)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska EH及Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy I等人, (1980) Cell 22(3): 817-23)基因，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。此外，抗代謝產物抗性可用作以下基因之選擇根據： dhfr，其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler M等人, (1980) PNAS 77(6): 3567-70；O’Hare K等人, (1981) PNAS 78: 1527-31)； gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan RC及Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6)；neo，其賦予對胺基醣苷G-418之抗性(Wu GY及Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95；Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596；Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932；及 Morgan RA及Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217；Nabel GJ及Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5)；及 hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre RF等人, (1984) Gene 30(1-3): 147-56)，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。重組DNA技術技藝中通常已知之方法可常規地用於選擇所需重組殖株，且此類方法描述於例如以下中：Ausubel FM等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；且在第12及13章中，Dracopoli NC等人 (編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colbère-Garapin F等人, (1981) J Mol Biol 150: 1-14，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

抗體分子之表現量可藉由載體擴增來增加(關於綜述參見Bebbington CR及Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3卷 (Academic Press, New York, 1987)，其以全文引用之方式併入本文中)。當載體系統中之標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量增加將使標記基因複本之數目增加。因為擴增區域與所關注之基因相關，所以蛋白質之產量亦將增加(Crouse GF等人, (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66，其以全文引用之方式併入本文中)。

宿主細胞可經兩種或更多種本文所描述之表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。兩種載體可含有相同的可篩選標記，其使得能夠等量表現重鏈及輕鏈多肽。宿主細胞可經不同量之兩種或更多種表現載體共轉染。舉例而言，宿主細胞可用以下任一比率之第一表現載體與第二表現載體進行轉染：約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。

或者，可使用編碼且能夠表現重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。在此類情形下，應將輕鏈置放在重鏈之前以避免有毒游離重鏈過量(Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; and Köhler G (1980) PNAS 77: 2197-2199，該其中之各者以全文引用之方式併入本文中)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因體DNA。表現載體可為單順反子或多順反子。多順反子核酸構築體可編碼2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個基因/核苷酸序列，或在2-5、5-10或10-20個範圍內之基因/核苷酸序列。舉例而言，雙順反子核酸構築體按以下次序可包含啟動子、第一基因(例如本文所描述之抗體之重鏈)及第二基因及(例如本文所描述之抗體之輕鏈)。在此類表現載體中，兩種基因之轉錄均可由啟動子驅動，而來自第一基因之mRNA的轉譯可藉由帽依賴性掃描機制進行，且來自第二基因之mRNA的轉譯可藉由帽非依賴性機制(例如藉由IRES)來進行。

一旦已藉由重組表現產生本文所描述之抗體分子，則其可藉由本技藝中已知用於免疫球蛋白分子純化之任何方法來加以純化，例如藉由層析(例如離子交換、親和力，尤其藉由在蛋白質A之後對特定抗原的親和力，及篩分管柱層析)、離心、溶解性差異或藉由任何其他用於蛋白質純化之標準技術。此外，本文所描述之抗體可與本文所描述或本技藝中另外已知之異源多肽序列融合以促進純化。

在特定具體例中，本文所描述之抗體經分離或經純化。在某些具體例中，經分離之抗體為實質上不含具有與經分離之抗體不同的抗原特異性之其他抗體的抗體。舉例而言，在某些具體例中，本文所描述之抗體之製劑實質上不含細胞材料及/或化學前驅物。措辭「實質上不含細胞材料」包括抗體與自其中分離或重組地產生該抗體之細胞的細胞成分分離的抗體製劑。因此，實質上不含細胞材料之抗體包括以下之製劑：具有小於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1% (以乾重計)之異源蛋白質(在本文中亦稱為「雜質蛋白質」)之抗體及/或抗體之變體，例如抗體之不同轉譯後修飾形式或抗體之其他不同型式(例如抗體片段)。當以重組方式產生抗體時，其亦一般實質上不含培養基，亦即，培養基佔蛋白質製劑體積之少於約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%。當藉由化學合成產生抗體時，其一般實質上不含化學前驅物或其他化學物質，亦即其與涉及合成蛋白質之化學前驅物或其他化學物質分離。因此，此類抗體製劑具有少於約30%、20%、10%或5% (以乾重計)之除所關注抗體以外之化學前驅物或化合物。在一特定具體例中，本文所描述之抗體經分離或純化。

抗MSLN (例如人類MSLN)抗體或其片段可藉由本技藝中已知用於合成蛋白質或抗體之任何方法產生，例如藉由化學合成或藉由重組表現技術。除非另外指示，否則本文所描述之方法採用分子生物學、微生物學、基因分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交及本技藝內相關領域中的習知技術。此等技術描述於例如本文所引用之參考文獻中，且在文獻中充分解釋。參見例如Maniatis T等人, (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel FM等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987及每年更新)；Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987及每年更新) Gait (編) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press；Eckstein (編) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press；Birren B等人, (編) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在一特定具體例中，本文所描述之抗體係藉由涉及例如經由合成、基因工程改造DNA序列產生之任何手段製備、表現、產生或分離。在某些具體例中，此類抗體包含活體內不天然存在於動物或哺乳動物(例如人類)之抗體生殖系譜系內之序列(例如DNA序列或胺基酸序列)。

在一個態樣中，本文提供一種製備抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之方法，其包含培養本文所描述之細胞或宿主細胞。在某些具體例中，該方法係在活體外進行。在某一態樣中，本文提供一種製備抗MSLN (例如人類MSLN)抗體之方法，其包含使用本文所描述之細胞或宿主細胞(例如包含編碼本文所描述之抗體之多核苷酸的細胞或宿主細胞)表現(例如以重組方式表現)抗體。在某些具體例中，細胞為經分離之細胞。在某些具體例中，已將外源多核苷酸引入細胞中。在某些具體例中，方法進一步包含純化自細胞或宿主細胞獲得之抗體之步驟。

在某些具體例中，抗體係藉由在使得表現多核苷酸且產生抗體之合適條件下，在細胞中表現編碼本文所描述之抗體之VH及VL的多核苷酸產生。在另一具體例中，抗體係藉由在使得表現多核苷酸且產生抗體之合適條件下，在細胞中表現編碼本文所描述之抗體之重鏈及輕鏈的多核苷酸產生。在某些具體例中，抗體係藉由在使得表現多核苷酸且產生抗體之合適條件下，在細胞中表現編碼本文所描述之抗體之VH的第一多核苷酸及編碼本文所描述之抗體之VL的第二多核苷酸產生。在某些具體例中，抗體係藉由在使得表現多核苷酸且產生抗體之合適條件下，在細胞中表現編碼本文所描述之抗體之重鏈的第一多核苷酸及編碼本文所描述之抗體之輕鏈的第二多核苷酸產生。

用於產生多株抗體之方法為本技藝中已知的(參見例如Short Protocols in Molecular Biology, (2002)第5版, Ausubel FM等人編, John Wiley and Sons, New York之第11章，其以全文引用之方式併入本文中)。

單株抗體可使用本技藝中已知之多種技術來加以製備，該等技術包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術產生，該等融合瘤技術包括本技藝中已知且例如以下中教示之彼等者：Harlow E及Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988)；Hammerling GJ等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。如本文所用，術語「單株抗體(monoclonal antibody)」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。舉例而言，單株抗體可自外源地表現本文所描述之抗體或其片段(例如此類抗體之輕鏈及/或重鏈)的宿主細胞以重組方式產生。

在特定具體例中，如本文所用，「單株抗體」為由單一細胞(例如產生重組抗體之融合瘤或宿主細胞)產生的抗體，其中例如藉由ELISA或本技藝中或本文提供之實施例中已知之其他抗原結合或競爭性結合分析測定，該抗體與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合。在某些具體例中，單株抗體可為嵌合抗體或人源化抗體。在某些具體例中，單株抗體為單價抗體或多價(例如二價)抗體。在某些具體例中，單株抗體為單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。本文所描述之單株抗體可例如藉由如Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495 (其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之融合瘤方法製備，或舉例而言，可例如使用如本文所描述之技術自噬菌體庫分離。用於製備株系細胞株及因此表現之單株抗體之其他方法為本技藝中熟知的(參見例如Short Protocols in Molecular Biology, (2002)第5版, Ausubel FM等人,見上文之第11章)。

如本文所用，在抗體包含至少兩個(例如兩個或更多個)單價結合區，各單價結合區能夠與抗原上之抗原決定基結合時，抗體與抗原多價(例如二價)結合。各單價結合區可與抗原上之相同或不同抗原決定基結合。

用於使用融合瘤技術產生及篩選特異性抗體之方法為本技藝中常規且熟知的。舉例而言，在融合瘤方法中，對小鼠或其他適當宿主動物，諸如綿羊、山羊、兔、大鼠、倉鼠或獼猴免疫接種，以引發產生或能夠產生將與蛋白質(例如MSLN (例如人類MSLN))特異性結合、用於免疫接種之抗體的淋巴球。或者，淋巴球可活體外免疫接種。接著，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，使淋巴球與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding JW (編), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第59-103頁 (Academic Press, 1986)，其以全文引用之方式併入本文中)。另外，重複免疫接種多個位點(repetitive immunization multiple sites；RIMMS)技術可用於對動物免疫接種(Kilpatrick KE等人, (1997) Hybridoma 16:381-9，其以全文引用之方式併入本文中)。

在某些具體例中，小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴、驢、豬、綿羊、倉鼠或狗)可用抗原(例如MSLN (例如人類MSLN))免疫接種，且一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對抗原具有特異性之抗體，則收集小鼠脾臟且分離脾細胞。接著，脾細胞藉由熟知技術與任何合適的骨髓瘤細胞，例如來自可獲自American Type Culture Collection (ATCC ^®(Manassas, VA)之細胞株SP20的細胞融合，以形成融合瘤。藉由極限稀釋法選擇及選殖融合瘤。在某些具體例中，收集免疫接種小鼠的淋巴結且將其與NS0骨髓瘤細胞融合。

將由此製備之融合瘤接種且生長於合適的培養基中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質會阻止缺乏HGPRT之細胞生長。

特定具體例採用高效融合、支持所選產抗體細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的骨髓瘤細胞。此等骨髓瘤細胞株包括鼠類骨髓瘤細胞株，諸如可獲自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA, USA之NS0細胞株或來源於MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之細胞株，及可獲自American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA之SP-2或X63-Ag8.653細胞。對於人類單株抗體之產生，亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株(Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)，其中之各者以全文引用之方式併入本文中)。

分析其中生長融合瘤細胞之培養基以用於產生針對MSLN (例如人類MSLN)之單株抗體。由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性藉由本技藝中已知之方法(例如免疫沈澱)或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)來測定。

在鑑別出產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，可藉由限制稀釋法程序對殖株進行次選殖且藉由標準方法使其生長(Goding JW (編), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 見上文)。用於此目的之合適的培養基包括例如D-MEM或RPMI 1640培養基。另外，融合瘤細胞可在動物中活體內生長為腹水腫瘤。

藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，自培養基、腹水液或血清適當地分離由次殖株分泌之單株抗體。

本文所描述之抗體包括例如識別MSLN (例如人類MSLN)之抗體片段，且可藉由熟悉本技藝者已知之任何技術產生。舉例而言，本文所描述之Fab及F(ab’) ₂片段可藉由使用酶，諸如番木瓜蛋白酶(用於產生Fab片段)或胃蛋白酶(用於產生F(ab’) ₂片段)對免疫球蛋白分子進行蛋白水解裂解來產生。Fab片段對應於抗體分子之兩個相同臂中之一者，且含有與重鏈之VH及CH1域配對的完整輕鏈。F(ab’) ₂片段含有抗體分子中的在鉸鏈區中由二硫鍵鍵聯之兩個抗原結合臂。

此外，本文所描述之抗體亦可使用本技藝中已知之各種噬菌體呈現方法來產生。在噬菌體呈現方法中，功能抗體域呈現於攜帶編碼其之多核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。特定而言，編碼VH及VL域之DNA序列自動物cDNA庫(例如受感染組織之人類或鼠類cDNA庫)擴增。藉由PCR用scFv連接子將編碼VH及VL域之DNA重組在一起，且將其選殖至噬菌粒載體中。將載體電穿孔至大腸桿菌中，且大腸桿菌用輔助噬菌體感染。此等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，包括fd及M13，且VH及VL域通常以重組方式與噬菌體基因III或基因VIII融合。表現與特定抗原結合之抗原結合區之噬菌體可抗原，例如使用經標記之抗原或結合或捕獲於固體表面或珠粒之抗原進行選擇或鑑別。可用於製備本文所描述之抗體之噬菌體呈現方法之實施例包括揭示於以下中之彼等：Brinkman U等人, (1995) J Immunol Methods 182: 41-50；Ames RS等人, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186；Kettleborough CA等人, (1994) Eur J Immunol 24: 952-958；Persic L等人, (1997) Gene 187: 9-18；Burton DR及Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280；PCT申請案第PCT/GB91/ 001134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號及第WO 97/13844號；及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

如上文參考文獻中所描述，在噬菌體選擇之後，可分離來自該噬菌體之抗體編碼區且將其用於產生完整抗體(包括人類抗體)或任何其他所需抗原結合片段，且在任何所需宿主(包括例如如下文所描述之哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中進行表現。亦可使用本技藝中已知之方法採用以重組方式產生抗體片段，諸如Fab、Fab’及F(ab’) ₂片段之技術，諸如以下中揭示之彼等：PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax RL等人, (1992) BioTechniques 12(6): 864-9；Sawai H等人, (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34；及Better M等人, (1988) Science 240: 1041-1043，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體例中，為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及用於保護該限制位點之側接序列的PCR引子可用於自模板(例如scFv殖株)擴增VH或VL序列。利用熟悉本技藝者已知之選殖技術，可將PCR擴增的VH域選殖至表現VH恆定區之載體中，且可將PCR擴增的VL域選殖至表現VL恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。亦可將VH及VL域選殖至一個表現必需恆定區之載體中。接著使用熟悉本技藝者已知之技術，將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中，以產生表現全長抗體，例如IgG之穩定或暫態細胞株。

嵌合抗體為其中抗體之不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。舉例而言，嵌合抗體可含有與人類抗體之恆定區融合之小鼠或大鼠單株抗體的可變區。用於產生嵌合抗體之方法為本技藝中已知的。參見例如 Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7；Oi VT及Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221；Gillies SD等人, (1989) J Immunol Methods 125: 191-202；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

人源化抗體能夠與預定抗原結合，且其包含實質上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的構架區及實質上具有非人類免疫球蛋白(例如鼠類免疫球蛋白)之胺基酸序列的CDR。在某些具體例中，人源化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分(Fc)，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3、及CH4區。人源化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃及IgG ₄。人源化抗體可使用本技藝中已知之多種技術製備，該等技術包括但不限於CDR移植(歐洲專利第EP 239400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾或表面再塑(歐洲專利第EP 592106號及第EP 519596號；Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498；Studnicka GM等人, (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814；及Roguska MA等人, (1994) PNAS 91: 969-973)、鏈替換(美國專利第5,565,332號)，及例如以下中揭示之技術：美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 93/17105號；Tan P等人, (2002) J Immunol 169: 1119-25；Caldas C等人, (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60；Morea V等人, (2000) Methods 20(3): 267-79；Baca M等人, (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84；Roguska MA等人, (1996) Protein Eng 9(10): 895 904；Couto JR等人, (1995) Cancer Res. 55 (23增刊): 5973s-5977s；Couto JR等人, (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22；Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10；及Pedersen JT等人, (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。亦參見美國申請公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，其以全文引用之方式併入本文中。

已描述用於製備多特異性抗體(例如雙特異性抗體)之方法，參見例如美國專利第7,951,917號；第7,183,076號；第8,227,577號；第5,837,242號；第5,989,830號；第5,869,620號；第6,132,992號；及第8,586,713號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

雙特異性二價抗體及其製備方法例如描述於以下中：美國專利第5,731,168號、第5,807,706號、第5,821,333號，及美國申請公開案第2003/020734號及第2002/0155537號；其中之各者以全文引用之方式併入本文中。雙特異性四價抗體及其製備方法描述於例如以下中：國際申請公開案第WO 02/096948號及第WO 00/44788號，其兩者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。一般參見國際申請公開案第WO 93/17715號、第WO 92/08802號、第WO 91/00360號及第WO 92/05793號；Tutt等人, J. Immunol. 147:60-69 (1991)；美國專利第4,474,893號；第4,714,681號；第4,925,648號；第5,573,920號；及第5,601,819號；及Kostelny等人, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)；其中之各者以全文引用之方式併入本文中。

如本文所描述之雙特異性抗體可根據如例如以下中所描述之DuoBody技術平台(Genmab A/S)產生：國際公開案第WO 2011/131746號、第WO 2011/147986號、第WO 2008/119353號及第WO 2013/060867號，及Labrijn AF等人, (2013) PNAS 110(13): 5145-5150。DuoBody技術可用於將含有兩條重鏈及兩條輕鏈之第一單特異性抗體或第一抗原結合區的一半與含有兩條重鏈及兩條輕鏈之第二單特異性抗體或第二抗原結合區的一半組合。所得異二聚體含有與來自第二抗體或第二抗原結合區之一條重鏈及一條輕鏈配對的來自第一抗體或第一抗原結合區之一條重鏈及一條輕鏈。在單特異性抗體或抗原結合區中之兩者識別不同抗原上之不同抗原決定基時，所得異二聚體為雙特異性抗體。

DuoBody技術需要單特異性抗體或抗原結合區中之各者包括在CH3域中具有單點突變的重鏈恆定區。點突變允許所得雙特異性抗體中之CH3域之間的相互作用比單特異性抗體或抗原結合區中之CH3域與之間的相互作用更強。根據EU編號系統編號，各單特異性抗體或抗原結合區中之單點突變位於重鏈恆定區之CH3域中之殘基366、368、370、399、405、407或409處，如例如國際公開案第WO 2011/131746號中所描述。此外，相較於另一單特異性抗體或抗原結合區，單點突變位於一種單特異性抗體或抗原結合區之不同殘基處。舉例而言，根據EU編號系統編號，一種單特異性抗體或抗原結合區可包含突變F405L (亦即殘基405處苯丙胺酸突變為白胺酸之突變)，而另一單特異性抗體或抗原結合區可包含突變K409R (亦即殘基409處離胺酸突變為精胺酸之突變)。單特異性抗體或抗原結合區之重鏈恆定區可為IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃或IgG ₄同型(例如人類IgG ₁同型)，且藉由DuoBody技術產生之雙特異性抗體可保留Fc介導之效應功能。

用於產生雙特異性抗體之另一方法已稱為「杵-臼(knob-into-hole)」策略(參見例如國際公開案WO2006/028936)。Ig重鏈之錯配在此技術中藉由使所選擇之胺基酸突變，從而形成IgG中CH3域之界面來減少。在兩條重鏈直接相互作用之CH3域內之位置處，將具有小側鏈(臼)之胺基酸引入一條重鏈之序列中且將具有大側鏈(杵)之胺基酸引入另一重鏈上之對應物相互作用殘基位置中。在一些具體例中，本發明之組成物具有免疫球蛋白鏈，其中CH3域已藉由使兩個多肽之間的界面處相互作用之所選擇之胺基酸突變以便優先形成雙特異性抗體來修飾。雙特異性抗體可由相同子類別(例如IgG ₁或IgG ₃)或不同子類別(例如IgG ₁及IgG ₃，或IgG ₃及IgG ₄)之免疫球蛋白鏈構成。

在一些情況下，雙特異性抗體可含有IgG ₄及IgG ₁、IgG ₄及IgG ₂、IgG ₄及IgG ₃或IgG ₁及IgG ₃鏈異二聚體。此類異二聚重鏈抗體可通常藉由例如對所選擇之胺基酸修飾，從而形成人類IgG ₄及IgG ₁或IgG ₃中之CH3域的界面以便促進異二聚重鏈形成來工程改造。

在某些具體例中，與本文所描述之抗MSLN (例如人類MSLN)抗體結合MSLN (例如人類MSLN)之相同抗原決定基的本文所描述之抗體為人類抗體。在某些具體例中，競爭性地阻斷(例如以劑量依賴性方式)本文所描述之任一抗體與MSLN (例如人類MSLN)結合的本文所描述之抗體為人類抗體。人類抗體可使用本技藝中已知之任何方法來產生。舉例而言，可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠。尤其可將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物隨機或藉由同源重組而引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈基因以外，亦可將人類可變區、恆定區及多樣性區引入小鼠胚胎幹細胞中。可在藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座的情況下，使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因分開或同時變為非功能性的。尤其J _H區之同型接合缺失阻止內源性抗體產生。使經修飾之胚胎幹細胞擴增且將其顯微注射入囊胚中以產生嵌合小鼠。接著飼養嵌合小鼠以產生表現人類抗體之同型接合後代。基因轉殖小鼠係以正常方式免疫接種所選擇之抗原，例如抗原(例如MSLN (例如人類MSLN))之全部或一部分。針對該抗原之單株抗體可使用習知融合瘤技術而自免疫接種之基因轉殖小鼠獲得。基因轉殖小鼠含有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此，使用此類技術，可產生治療上適用的IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於用於產生人類抗體之此技術之概述，參見Lonberg N及Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93，其以全文引用之方式併入本文中。關於用於產生人類抗體及人類單株抗體之此技術及用於產生此類抗體之方案的詳細論述，參見例如國際公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。能夠產生人類抗體之小鼠之實施例包括XenoMouse ^TM(Abgenix, Inc.；美國專利第6,075,181號及第6,150,184號)、HuAb-Mouse ^TM(Medarex, Inc./Gen Pharm；美國專利第5,545,806號及第5,569,825號)、Trans Chromo Mouse ^TM(Kirin)及KM Mouse ^TM(Medarex/Kirin)，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

與MSLN (例如人類MSLN)特異性結合之人類抗體可藉由本技藝中已知之多種方法製備，包括使用來源於人類免疫球蛋白序列之抗體庫的上文描述之噬菌體呈現方法。亦參見美國專利第4,444,887號、第4,716,111號及第5,885,793號；及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號，以上所有均以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體例中，人類抗體可使用小鼠-人類融合瘤產生。舉例而言，經艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)轉化之人類周邊血液淋巴球可與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生分泌人類單株抗體之小鼠-人類融合瘤，且此等小鼠-人類融合瘤可經篩選以判定分泌與目標抗原(例如MSLN (例如人類MSLN))特異性結合之人類單株抗體的融合瘤。此類方法為本技藝中已知的且在本技藝中描述，參見例如Shinmoto H等人, (2004) Cytotechnology 46: 19-23；Naganawa Y等人, (2005) Human Antibodies 14: 27-31，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。套組

亦提供包含本文所描述之一或多種抗體或其醫藥組成物或結合物的套組。在一特定具體例中，本文提供一種醫藥封裝或套組，其包含一或多個填充有本文所描述之醫藥組成物成分中之一或多者，諸如一或多種本文所提供之抗體的容器。在某些具體例中，套組含有本文所描述之醫藥組成物及任何預防劑或治療劑，諸如本文所描述之彼等者。在某些具體例中，套組可含有T細胞促分裂原，諸如植物凝血素(PHA)及/或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate；PMA)，或TCR複合物刺激性抗體，諸如抗CD3抗體及抗CD28抗體。視情況與此類容器相關聯的可為呈由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構所規定之形式的注意事項，該注意事項反映由用於人類投與之製造、使用或銷售機構之批准。

亦提供可用於上述方法中之套組。在某些具體例中，套組包含在一或多個容器中之本文所描述之抗體，較佳地純化抗體。在一特定具體例中，本文所描述之套組含有實質上經分離之MSLN (例如人類MSLN)抗原作為對照。在另一特定具體例中，本文所描述之套組進一步包含不會與MSLN (例如人類MSLN)抗原反應之對照抗體。在另一特定具體例中，本文所描述之套組含有一或多個用於偵測抗體與MSLN (例如人類MSLN)抗原之結合的元件(例如抗體可與可偵測的受質結合，該受質諸如螢光化合物、酶促受質、放射性化合物、或發光化合物，或識別第一抗體之第二抗體可與可偵測受質結合)。在特定具體例中，本文提供之套組可包括以重組方式產生或化學合成的MSLN (例如人類MSLN)抗原。套組中提供之MSLN (例如人類MSLN)抗原亦可與固體載體(solid support)連接。在一更特定具體例中，上文所描述之套組之偵測手段包括與MSLN (例如人類MSLN)抗原連接的固體載體。此類套組亦可包括未連接的經報導子標記之抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在此具體例中，抗體與MSLN (例如人類MSLN)抗原之結合可藉由該經報導子標記之抗體的結合偵測。在某些具體例中，本發明係關於一種本發明之套組之用途，其用於活體外分析及/或偵測生物樣品中之MSLN (例如人類MSLN)抗原。 實施例

以下實施例係以說明且非限制之方式提供。實施例1：抗MSLN 1A12抗體變體之結合動力學及最佳化

製備抗MSLN 1A12抗體(參見上表1)之變體以改良特性且使分子最佳化。將親本1A12可變域之變體格式化為去醣基化(N297A)的人類κIgG1構築體，且使用慢病毒轉導在293 Freestyle細胞中表現。收集培養物上清液且使用蛋白A親和層析純化，且藉由尺寸排阻層析使用Agilent高壓液相層析系統(HPLC-SEC)進一步純化。表面電漿子共振用於在Carterra LSA系統上收集動力學結合資料。將純化的1A12抗體變體捕獲至具有固定的抗人類IgG之LSA生物感測晶片(HC30M)上，且純化的MSLN胞外域用作分析物。

為了修復預測的去醯胺位點，使1A12 CDRL3 (SEQ ID NO: 8)之「NS」模體突變。然而，某些突變對於抗體解離速率(antibody off rate)及抗體表現具有不利影響。輕鏈(SEQ ID NO: 10)中之位置92 (N)突變為丙胺酸或絲胺酸之突變影響抗體結合，導致較慢解離速率(off-rate) (圖1A)。N92S及S93A突變亦影響抗體表現(圖1B)。使重鏈CDRH2 (SEQ ID NO: 4)中之「DS」模體突變以修復預測的異構化位點不會影響抗體結合動力學。重鏈(SEQ ID NO: X)中位置62 (N)及63 (N+1)處之保守取代具有良好耐受性(圖2)。

相較於對照1A12抗體，評定具有用於修復預測的去醯胺化及異構化位點之CDRL3或CDRH2突變之抗MSLN 1A12抗體之LC/HC變體對之親和力的變化。此等組合產生多種配對方案以改良抗體功能及可發展性(圖3)。尤其包括N92A或N92S之組合產生相較於對照更高的親和力( K _D )。實施例2：雙特異性抗體

特異性結合MSLN及人類CD3之雙特異性IgG-scFv抗原結合分子係以圖4中所說明之結構型式製備，其使用1A12抗MSLN抗體(參見上表1)之Fab域及Micro194 (VH/VL = SEQ ID NO. 57/58)之抗CD3可變域、OKT3抗體之人源化形式(VH/VL = SEQ ID NO: 59/60)、或UCHT1抗體之人源化形式(VH/VL = SEQ ID NO: 61/62)。

用於產生此等分子之方法遵循各種參考文獻中描述之標準蛋白質表現方案。簡言之，採用「Daedalus」人類細胞株表現平台用於產生及純化分泌蛋白。該表現系統使用懸浮液調適之HEK293 Freestyle細胞及高度最佳化的慢病毒轉導方案，以產生以高含量分泌蛋白質之細胞株。慢病毒載體含有由內部核糖體進入位點(IRES)驅動的順式-鍵聯的螢光蛋白報導子，以允許追蹤相對蛋白質表現量。所描述之所有哺乳動物蛋白質均使用HisTrap FF粗物質管柱(GE #17528601)自改良性培養基直接純化，且隨後使用AKTA純25儀在Superose 6 10/300 GL SEC管柱(GE #17517201)上精製。

使用標準技術純化雙特異性抗原結合分子且表徵。顯示具有圖4之結構之IgG-scFv分子之純化的代表性層析圖顯示於圖5A至圖5B (UCHT1 scFv)及圖6A至圖6B (Micro194 scFv)中，確定成功產生且具有極少聚集物。

雙特異性IgG-scFv分子對於MSLN之親和力係使用與描述於實施例1中之抗MSLN 1A12變異抗體相同的方法評定。

如圖7中所示，將不同接合CD3之scFv部分與抗MSLN 1A12之輕鏈(SEQ ID NO: 10)融合不會影響對於MSLN的親和力。實施例3：用於評定在抗MSLN × 抗CD3雙特異性分子存在下T細胞介導之殺死MSLN表現細胞之基於FACS的細胞毒性分析

為了監測MSLN表現細胞之特異性殺死，在T細胞殺死分析中使用高表面表現MSLN之細胞(SKOV3及OVCAR3卵巢癌株)。簡言之，使用經程式化以同時進行無偏性96孔分析之自動化平台進行細胞毒性分析，其中在存在或不存在1A12:Micro194或1A12:OKT3雙特異性分子(8個濃度，在0-1 mg/ml範圍內)下，將100,000個T細胞(獲自健康供體，藉由流式細胞測量術，EasySep™無觸摸純化前後CD3、CD28、CD4、CD8合格)與20,000個Luc-iRFP癌細胞混合(5:1 E:T比率)。亦分析與MSLN、CD3及血清白蛋白結合之三特異性抗體HPN536 (亦稱為TriTAC，參見 WO 2018/209304，其內容以引用之方式併入本文中)以用於比較。在使細胞與雙特異性分子接觸後第5天(對於SKOV3細胞)或第2天(對於OVCAR3細胞)測定細胞毒性。

如圖8A至圖8B中所示，1A12:Micro194分子的細胞毒性效能比具有人源化OKT3 scFv之1A12:OKT3分子的細胞毒性效能更大，尤其針對SKOV3細胞。針對兩種類型之MSLN表現細胞，1A12:Micro194 IgG-scFv分子比HPN536三特異性抗體顯著強效得多。

將在存在或不存在可溶性MSLN (sMSLN)下，IgG-scFv及HPN536 (TriTAC)分子誘導SKOV3細胞中之細胞毒性之能力進行比較。如圖9A中所示，IgG-scFv分子之細胞毒性效能在sMSLN存在下顯著降低。不希望受理論所束縛，對於可溶性MSLN相關蛋白及細胞表面MSLN兩者之高親和力使得HPN536分子易受sMSLN之存在影響，從而降低細胞毒性效能。相反，具有圖4中顯示之結構之IgG-scFv分子對於細胞表面MSLN具有高親合力，且對於可溶性MSLN相關蛋白具有低親和力，且導致細胞毒性效能較小偏移(圖9B)。 實施例 4 ：活體內功效

對NOD/SCID/IL-2Rγc ^null(NSG)免疫缺乏小鼠腹膜內移植表現螢光素酶之SKOV3細胞。小鼠用包含抗MSLN 1A12結合域及人源化抗CD3 OKT3結合部分之1A12:OKT3雙特異性分子處理。未經處理之小鼠及僅用活化T細胞(ATC)處理之小鼠用作對照。ATC為自周邊血液單核細胞(PBMC)分離的CD3+ Pan T細胞，且刺激以用於快速擴增。圖10顯示，相較於對照，1A12:OKT3雙特異性分子隨著時間推移減弱腫瘤之生長。 實施例 5 ：改良的 MSLN-CD3 變體變體及特徵

雙特異性抗MSLN/抗CD3 IgG-scFv T細胞接合子分子之24種獨特的變體係以圖4中所說明之結構型式製備，其使用實施例1描述之1A12抗MSLN抗體或1A12變體之Fab域及Micro194抗CD3 scFv(參見表2)。該等變體結合了多種不同的：(i)VH及VL域之間的連接子長度，(ii)輕鏈異構化修復，(iii)重鏈去胺化修復，及(iv)效應功能緘默化方案。變體特徵及表現和聚集測定結果顯示於下表3。

分離輕鏈C端及scFv之連接子區(LC-連接子-scFv)對於最佳化雙特異性T細胞接合子之效能為重要的。另一個重要的為連接子分離scFv之可變域(VH-連接子-VL)。最佳化此等連接子的長度及適應性係被發現對於雙特異性分子的功能、製造和免疫原性為重要的。經設計一種新穎的包含甘胺酸及絲胺酸之連接子，以達到最大的輕鏈及scFv以及scFv之可變域二者之間連接之適應性。該連接子的一般結構為GGGGS-(X)-SGGGG (SEQ ID NO: 85)，其中X為常見的柔性或剛性連接子序列的任意組合(例如，甘胺酸-絲胺酸、脯胺酸-蘇胺酸、離胺酸-絲胺酸、人類抗體絞鏈區等)。最終該GGGGS-GGGSGGG-SGGGG (SEQ ID NO: 73)連接子經確認為防止雙價抗體形成的最佳長度。

IgG-scFv分子的表現量使用分析型蛋白A親合層析法效價分析或可變光程斜率光譜SoloVPE A280測量，並用1mg/mL的蛋白質的理論消光係數來測定。用於確認莫耳消光係數的方程式為ε ₂₈₀= 5500(Trp的數目) + 1490(Tyr的數目) +125(S-S鍵的數目)。粒徑篩析層析法(SEC-HPLC)係用於根據其流體動力體積的差異分離IgG-scFv分子。將蛋白質樣品裝填至Waters XBridge Protein BEH SEC 200A管柱(3.5 µm，7.8×300 mm)並在100mM磷酸鈉、250mM氯化鈉、pH 6.8泳動緩衝液中平衡。藉由計算每個分離成分與總積分面積相比的百分比來確認純度。

與其他測試的IgG-scFv分子相比，IgG-scFv變體M-3643、M-3642、M-3648、M-3651、M-3654及M-3641(在表3中以粗體顯示)具有更高的表現量和最小的總聚集體。基於此數據，選擇這6個變體進一步分析。

熱保持

進行熱保持測定以評估 IgG-scFv分子的構形穩定性。將樣品置於96孔BioradPCR盤中，並使用Biorad Thermal Cycler加熱至69℃至74℃的各種溫度5分鐘。加熱後，使用M5讀盤器讀取350nm (A350)處的吸光度來確認蛋白質沉澱。結果顯示M-3654對溫度變性更具抗性(表4)。

化學去折疊化

化學去折疊化曲線的拐點被認為與構形穩定性和長期儲存期間的穩定性有關，較大的拐點與結構或構形更穩定的分子有關。藉由將分子暴露於濃度增加的變性劑胍鹽酸鹽，為每個IgG-scFv分子生成化學去折疊化曲線。72小時後，使用SUPR-UV讀盤器測量樣品的固有螢光。然後對收集的原始數據進行處理，並根據處理後的數據計算化學去折疊化曲線及其拐點作為變性劑條件的函數。

發現M-3641(一種非醣化N297A突變體)比結合其他效應緘默化Fc突變的變體更不穩定(表5)

低pH聚集

低pH聚集測定可用於幫助選擇適合低pH 病毒去活化的候選物。在該測定中，使用醋酸將包含各種IgG-scFv分子的樣品滴定至pH 3.3並保持30分鐘，然後用tris鹼中和至pH 5。如上所述使用SEC-HPLC表徵樣品。使用相同體積的醋酸和tris鹼用PBS稀釋的樣品作為對照。展現出高分子量顯著增加的分子在低pH暴露期間被認為是不穩定的，如果要使用低pH病毒去活化，則需要進一步的方法開發。

在此低pH聚集測定中測試的所有變體中，M-3654在低pH下最穩定(說明修復突變改良了該分子的反應)，而M-3641最不穩定(表6)。

產品品質

SEC及非還原(NR)及還原(R)毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)顯示M-3654 IgG-scFv分子具有低量的高分子量和低分子量污染物種類(表7)。rCE-SDS 在變性和還原條件下也展現了M-3654之重鏈和輕鏈的乾淨分離，表明M-3654的反應符合對抗體的預期，即使異構化及去胺化位點發生突變。

* * *

本發明之範疇不受本文所描述之特定具體例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟悉本技藝者而言將變得顯而易見。此類修改意欲在所附申請專利範圍之範疇內。

本文所引用之所有參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)均以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。

其他具體例在以下申請專利範圍內。

[ 圖 1A]為顯示抗MSLN 1A12抗體之輕鏈變體之 K _a 及 K _d (分別左及右)之圖。對照MAb表示僅抗MSLN 1A12抗體。[ 圖 1B]為顯示相同輕鏈突變對於抗體表現之影響之圖。在圖1B中，y軸為吸光度強度的量測，以毫吸光度(mAU)為單位；且x軸以分鐘為單位，用於測定各峰的滯留時間。

[ 圖 2]為顯示抗MSLN 1A12抗體之重鏈變體之 K _a 及 K _d (分別左及右)之圖。對照MAb表示僅抗MSLN 1A12抗體。

[ 圖 3]為顯示抗MSLN 1A12抗體之輕鏈及重鏈變體之各種配對之MSLN的親和力的圖。對照MAb表示僅抗MSLN 1A12抗體。

[ 圖 4]為包含與scFv域(例如抗T細胞scFv域)鍵聯之Fab域(例如抗癌Fab域)以及免疫球蛋白Fc域之雙特異性IgG-scFv抗體的示意圖。CH2域中顯示之十字形表示抑制抗體與Fc受體之相互作用之視情況選用的突變。

[ 圖 5A] 至[ 圖 5B]為顯示在Ni-NTA純化包含抗MSLN 1A12結合域及人源化UCHT1抗CD3 scFv部分、具有圖4中所說明之結構之雙特異性分子之前(圖5A)及之後(圖5B)蛋白質富集的尺寸排阻層析圖。圖5A顯示經由Superdex 200 10/300 GL預填充的凝膠過濾管柱自包含雙特異性分子之運行粗蛋白萃取物獲取的尺寸排阻層析圖。圖5B顯示經由Superdex 200 10/300 GL預填充的凝膠過濾管柱自包含雙特異性分子之運行Ni-NTA純化後的蛋白質萃取物獲取的尺寸排阻層析圖，產生以約11 mL為中心之蛋白質的均質單峰。在圖5A至圖5B中，y軸為吸光度強度之量測，以毫吸光度(mAU)為單位；且x軸以毫升(mL)為單位，用於測定各峰之滯留體積。

[ 圖 6A] 至[ 圖 6B]為顯示在Ni-NTA純化包含抗MSLN 1A12結合域及Micro194抗CD3 scFv部分、具有圖4中所說明之結構之雙特異性分子之前(圖6A)及之後(圖6B)的蛋白質富集的尺寸排阻層析圖。圖6A顯示經由Superdex 200 10/300 GL預填充的凝膠過濾管柱自包含雙特異性分子之運行粗蛋白萃取物獲取的尺寸排阻層析圖。圖6B顯示經由Superdex 200 10/300 GL預填充的凝膠過濾管柱自包含雙特異性分子之運行Ni-NTA純化後的蛋白質萃取物獲取的尺寸排阻層析圖，產生以約13 mL為中心之蛋白質的均質單峰。在圖6A至圖6B中，y軸為吸光度強度之量測，以毫吸光度(mAU)為單位；且x軸以毫升(mL)為單位，用於測定各峰之滯留體積。

[ 圖 7]為顯示各自包含如所指示之抗MSLN 1A12結合域及抗CD3結合部分、各自具有圖4中所說明之結構之雙特異性分子之MSLN的親和力的圖。對照MAb表示僅抗MSLN 1A12抗體。

[ 圖 8A] 至[ 圖 8B]為顯示各自包含如所指示之抗MSLN 1A12結合域及抗CD3結合部分、各自具有圖4中所說明之結構之雙特異性分子誘導SKOV3 (圖8A)或OVCAR3 (圖8B)人類卵巢癌細胞中之細胞毒性的能力之結果的圖。細胞毒性報導為在使細胞與雙特異性分子接觸後第5天(對於SKOV3細胞)或第2天(對於OVCAR3細胞)測定之作為雙特異性分子之濃度之函數的死細胞百分比。

[ 圖 9A] 至[ 圖 9B]為顯示包含抗MSLN 1A12結合域及抗CD3結合部分、具有圖4中所說明之結構的雙特異性分子以及結合MSLN、CD3及血清白蛋白的TriTAC分子(圖9B) 誘導SKOV3細胞中之細胞毒性的能力(圖9A)之結果的圖。雙特異性分子及TriTAC分子誘導細胞毒性之能力係由可溶性MSLN (分別TriTAC + sMSLN及IgG-scFv + sMSLN)刺激。

[ 圖 10]為顯示隨著時間推移在NOD/SCID/IL-2Rγc ^null(NSG)小鼠中之腫瘤之生長的圖，該等小鼠腹膜內移植有表現螢光素酶之SKOV3細胞，用包含抗MSLN 1A12結合域及抗CD3 OKT3結合部分、具有圖4中所說明之結構之雙特異性分子處理。未經處理之小鼠及僅用活化T細胞(ATC)處理之小鼠用作對照。y軸為經由生物發光成像偵測之發光量測，以光子/秒(p/s)為單位。

TW202321296A_111137868_SEQL.xml

Claims

一種特異性結合人類MSLN之抗體，該抗體包含：VH，其包含SEQ ID NO: 11中說明之VH胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO: 12中說明之VL胺基酸序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列，其中該抗體不包含SEQ ID NO: 4或8。
如請求項1之抗體，其中,該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、13及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體分別包含SEQ ID NO: 6、7及14中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、13、5、6、7及14中說明之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、30及5；3、29及5；3、31及5；3、32及5；3、33及5；或3、34及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體分別包含SEQ ID NO: 6、7及35；6、7及36；6、7及37；6、7及38；6、7及39；或6、7及40中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體分別包含SEQ ID NO: 3、30、5、6、7及35；3、29、5、6、7及35；3、29、5、6、7及36；3、29、5、6、7及37；3、29、5、6、7及38；3、29、5、6、7及39；3、29、5、6、7及40；3、30、5、6、7及36；3、30、5、6、7及37；3、30、5、6、7及38；3、30、5、6、7及39；3、30、5、6、7及40；3、31、5、6、7及35；3、31、5、6、7及36；3、31、5、6、7及37；3、31、5、6、7及38；3、31、5、6、7及39；3、31、5、6、7及40；3、32、5、6、7及35；3、32、5、6、7及36；3、32、5、6、7及37；3、32、5、6、7及38；3、32、5、6、7及39；3、32、5、6、7及40；3、33、5、6、7及35；3、33、5、6、7及36；3、33、5、6、7及37；3、33、5、6、7及38；3、33、5、6、7及39；3、33、5、6、7及40；3、34、5、6、7及35；3、34、5、6、7及36；3、34、5、6、7及37；3、34、5、6、7及38；3、34、5、6、7及39；或3、34、5、6、7及40中說明之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含SEQ ID NO: 11之VH胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含SEQ ID NO: 18、17、19、20、21或22之VH胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含視情況選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及IgA ₂。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含作為野生型重鏈恆定區之變體的重鏈恆定區，其中該變異重鏈恆定區以比該野生型重鏈恆定區與FcγR結合更低的親和力與該FcγR結合。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO: 53、54、55、56或72之胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含含有SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69或70之胺基酸序列的重鏈。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含SEQ ID NO: 12之VL胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含SEQ ID NO: 24、23、25、26、27或28之VL胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該抗體包含含有SEQ ID NO: 48、47、49、50、51或52之胺基酸序列的輕鏈。
如前述請求項中任一項之抗體，其中，該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 18及24、17及23、17及24、17及25、17及26、17及27、17及28、18及23、18及25、18及26、18及27、18及28、19及23、19及24、19及25、19及26、19及27、19及28、20及23、20及24、20及25、20及26、20及27、20及28、21及23、21及24、21及25、21及26、21及27、21及28、22及23、22及24、22及25、22及26、22及27或22及28中說明之胺基酸序列。
如請求項13至17中任一項之抗體，其中，該重鏈及該輕鏈分別包含SEQ ID NO: 83及48、84及48、83及49、84及49、83及50、84及50、83及51、84及51、83及52、84及52、83及47、84及47、41及47、41及48、41及49、41及50、41及51、41及52、42及47、42及48、42及49、42及50、42及51、42及52、43及47、43及48、43及49、43及50、43及51、43及52、44及47、44及48、44及49、44及50、44及51、44及52、45及47、45及48、45及49、45及50、45及51、45及52、46及47、46及48、46及49、46及50、46及51、46及52、66及47、66及48、66及49、66及50、66及51、66及52、67及47、67及48、67及49、67及50、67及51、67及52、68及47、68及48、68及49、68及50、68及51、68及52、69及47、69及48、69及49、69及50、69及51、69及52、70及47、70及48、70及49、70及50、70及51、70及52、71及47、71及48、71及49、71及50、71及51或71及52中說明之胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體，其進一步包含CD3結合部分。
如請求項19之抗體，其中，該CD3結合部分為多肽。
如請求項19之抗體，其中，該CD3結合部分為抗體。
如請求項19之抗體，其中，該CD3結合部分為單鏈可變片段(scFv)。
如請求項22之抗體，其中，該scFv包含SEQ ID NO: 76中說明之胺基酸序列。
如請求項19至23中任一項之抗體，其中，該CD3結合部分與該輕鏈共價連接。
如請求項24之抗體，其中，該CD3結合部分與該輕鏈之C端共價連接。
如請求項25之抗體，其中，該CD3結合部分經由肽連接子與該輕鏈之C端共價連接，視情況其中該肽連接子包含SEQ ID NO: 63、64、73、74或75中說明之胺基酸序列。
如請求項26之抗體，其中，該輕鏈包含SEQ ID NO: 77、78、79、80、81或82中說明之胺基酸序列。
一種特異性結合人類MSLN之抗體，該抗體包含重量及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 83及77、84及77、41及77、42及77、43及77、44及77、45及77、46及77、66及77、67及77、68及77、69及77、70及77、71及77、83及78、84及78、41及78、42及78、43及78、44及78、45及78、46及78、66及78、67及78、68及78、69及78、70及78、71及78、83及79、84及79、41及79、42及79、43及79、44及79、45及79、46及79、66及79、67及79、68及79、69及79、70及79、71及79、83及80、84及80、41及80、42及80、43及80、44及80、45及80、46及80、66及80、67及80, 68及80、69及80、70及80、71及80、83及81、84及81、41及81、42及81、43及81、44及81、45及81、46及81、66及81、67及81、68及81、69及81、70及81、71及81、83及82、84及82、41及82、42及82、43及82、44及82、45及82、46及82、66及82、67及82、68及82、69及82、70及82或71及82中說明之胺基酸序列。
如請求項28之抗體，其中，該重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 83及77中說明之胺基酸序列。
一種多肽，其包含含有SEQ ID NO: 11中說明之VH胺基酸序列之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH，其中該多肽不包含SEQ ID NO: 4。
如請求項30之多肽，其中，該VH分別包含SEQ ID NO: 3、13及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。
如請求項30之多肽，其中，該VH分別包含SEQ ID NO: 3、30及5；3、29及5；3、31及5；3、32及5；3、33及5；或3、34及5中說明之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列。
如請求項30之多肽，其中，該VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
如請求項30之多肽，其中，該VH包含SEQ ID NO: 18、17、19、20、21或22之胺基酸序列。
如請求項30之多肽，其中，該多肽包含含有SEQ ID NO: 83、84、41、42、43、44、45、46、66、67、68、69或70之胺基酸序列的重鏈。
一種多肽，其包含含有SEQ ID NO: 12中說明之VL胺基酸序列之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL，其中該多肽不包含SEQ ID NO: 8。
如請求項36之多肽，其中，該VL分別包含SEQ ID NO: 6、7及14中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如請求項36之多肽，其中，該VL分別包含SEQ ID NO: 6、7及35；6、7及36；6、7及37；6、7及38；6、7及39；或6、7及40中說明之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列。
如請求項36之多肽，其中，該VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
如請求項36之多肽，其中，該VL包含SEQ ID NO: 24、23、25、26、27或28之胺基酸序列。
如請求項36之多肽，其中，該多肽包含含有SEQ ID NO: 77、47、48、49、50、51、52、78、79、80、81或82之胺基酸序列的輕鏈。
一種多肽，其包含SEQ ID NO: 73、74或75中說明之胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之抗體或多肽，其中，該抗體或該多肽與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記結合。
一種多核苷酸，其編碼：請求項1至29中任一項之抗體之VH、VL、重鏈及/或輕鏈；或請求項30至41中任一項之多肽。
一種載體，其包含請求項44之多核苷酸。
一種重組宿主細胞，其包含： (a)　請求項44之多核苷酸； (b)　請求項45之載體； (c)　編碼請求項1至29中任一項之抗體之重鏈可變區或重鏈的第一多核苷酸，及編碼請求項1至29中任一項之抗體之輕鏈可變區或輕鏈的第二多核苷酸； (d)　包含編碼請求項1至29中任一項之抗體之重鏈可變區或重鏈之第一多核苷酸的第一載體，及包含編碼請求項1至29中任一項之抗體之輕鏈可變區或輕鏈之第二多核苷酸的第二載體。
一種醫藥組成物，其包含請求項1至29或43中任一項之抗體、請求項30至41或43中任一項之多肽、請求項44之多核苷酸、請求項45之載體或請求項46之宿主細胞以及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
一種產生抗體之方法，該方法包含在合適條件下培養請求項46之宿主細胞，以使得表現該多核苷酸，及產生該抗體。
一種治療個體之癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量之請求項1至29或43中任一項之抗體、請求項30至41或43中任一項之多肽、請求項44之多核苷酸、請求項45之載體、或請求項46之宿主細胞或請求項47之醫藥組成物。
一種請求項1至29或43中任一項之抗體、請求項30至41或43中任一項之多肽、請求項44之多核苷酸、請求項45之載體、或請求項46之宿主細胞或請求項47之醫藥組成物用於製造治療有需要個體之癌症的藥物之用途。
如請求項1至29或43中任一項之抗體、請求項30至41或43中任一項之多肽、請求項44之多核苷酸、請求項45之載體、或請求項46之宿主細胞或請求項47之醫藥組成物，其用於醫藥中。
如請求項1至29或43中任一項之抗體、請求項30至41或43中任一項之多肽、請求項44之多核苷酸、請求項45之載體、或請求項46之宿主細胞或請求項47之醫藥組成物，其用於治療有需要個體之癌症。