CN113203805B - 同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5‑脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，包括：配制标准品混合液；配制内标物提取液；将内标物提取液加标准品混合液中，进行液相色谱串联质谱检测；根据液相色谱串联质谱检测结果分别建立葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5‑脱氧葡萄糖醇标准曲线；将内标物提取液加入待测血液样本中，进行液相色谱串联质谱检测；将待测血液样本的检测结果分别代入葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5‑脱氧葡萄糖醇标准曲线中，得到待测血液样本中葡萄糖浓度、果糖浓度和1，5‑脱氧葡萄糖醇浓度。本发明可准确、高通量和高灵敏度实现血液中葡萄糖、果糖和1，5‑脱氧葡萄糖醇的同时定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域。更具体地说，本发明涉及一种同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已经成为仅次于心血管疾病和癌症之后，人类的第三杀手，是一个全球性的严重公共卫生问题，血糖检测是糖尿病重要监测指标之一，而血清中1，5-脱氧葡萄糖醇(1，5-AG)能反映2天-2周的血糖状态，2015年《中国血糖监测临床应用指南》已经将血清1，5-AG列入辅助血糖监测的指标。此外，越来越多的研究表明，果糖水平监测也异常重要，因为大量食用果糖会导致人体肝脏合成脂肪的能力明显提升进而导致肥胖，而肥胖易引发胰岛素抵抗及非酒精脂肪肝等，这对全身代谢有着显著的负面影响。然目前只有血液中1，5-AG和葡萄糖检测的质谱方法，但是尚未报道同时监测葡萄糖、果糖和1，5-AG水平三个指标进行的质谱分析方法。因此需要建立一种可同时进行葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇准确的检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，可准确、高通量和高灵敏度实现血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的同时定量检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，包括：
配制同时含葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的标准品混合液多个，多个标准品混合液中葡萄糖浓度均不相同，多个标准品混合液中果糖浓度均不相同，且多个标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度均不相同；
配制同时含13C6葡萄糖、13C3果糖和13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇的内标物提取液；
将内标物提取液分别加入多个标准品混合液中，再将混有内标物提取液的多个标准品混合液分别进行液相色谱串联质谱检测；
根据混有内标物提取液的多个标准品混合液的液相色谱串联质谱检测结果分别建立葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线；
将内标物提取液加入待测血液样本中，再将混有内标物提取液的待测血液样本进行液相色谱串联质谱检测；
将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测结果分别代入葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线中，得到待测血液样本中葡萄糖浓度、果糖浓度和1，5-脱氧葡萄糖醇浓度。
优选的是，混有内标物提取液的标准品混合液先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测，混有内标物提取液的待测血液样本也先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测。
优选的是，涡旋时间为1～5min，离心转速为14000～16000rpm，离心温度为1～5℃，离心时间为8～12min。
优选的是，液相色谱串联质谱检测所用的设备为超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪。
优选的是，液相色谱串联质谱检测过程中采用的色谱分离条件为：色谱柱为ACQUITY
BEH Amide 1.7μm，3.0×150mm，流速为0.3mL/min，柱温为35℃；等度洗脱，流动相为含0.05～0.15％氨水的74.95～84.85％乙腈水溶液。
优选的是，液相色谱串联质谱检测过程中采用的质谱条件为：ESI负离子模式，离子源温度350℃，雾化器气压45psi，辅助气压50psi，气帘气压40psi，喷雾电压-4500V，采用多反应监测模式。
优选的是，液相色谱串联质谱检测过程中质谱分析的母离子-子离子对为：葡萄糖， m/z 178.9-m/z 59.01；果糖，m/z 178.9-m/z 59.01；1，5-脱氧葡萄糖醇，m/z 162.9-m/z 101；13C6葡萄糖，m/z 184.9-m/z 92；13C3果糖，m/z 181.9-m/z 92；13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇， m/z 168.9-m/z 105。
优选的是，标准品混合液中葡萄糖浓度范围为5～500000ng/mL，标准品混合液中果糖浓度范围为5～500000ng/mL，标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度范围为5～500000 ng/mL。
优选的是，内标物提取液与待测血液样本的体积比为(1～4)：1。
优选的是，标准品混合液的配制方法包括：
分别配制特定浓度的葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液，取葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液混合后逐级稀释，配制成多个标准品混合液，稀释液采用质量体积分数为1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液；
内标物提取液的配制方法包括：分别配制特定浓度的13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液，取13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液混合后逐级稀释至预设浓度，配制成内标物混合液，稀释液采用含0.05～0.15％氨水的74.95～84.85％乙腈水溶液，再取内标物混合液与相同的稀释液按预设体积比混合，制得内标物提取液。
本发明至少包括以下有益效果：本发明首次成功建立液相色谱串联质谱同时检测血液中葡萄糖、果糖和1，5-AG的质谱方法，血清经简单萃取即可进行上机分析，检测过程简便快速，且本方法中待测样品前处理简单，无需衍生，血清用量较少。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中标准品混合液4的色谱图；
图2为本发明所述葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的标准曲线，图2a为1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线，图2b为葡萄糖标准曲线，图2c为果糖标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例>
本发明提供一种同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，包括：
步骤A、配制同时含葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的标准品混合液多个，多个标准品混合液中葡萄糖浓度均不相同，多个标准品混合液中果糖浓度均不相同，且多个标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度均不相同；
具体的，分别配制特定浓度的葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液，取葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液混合后逐级稀释，配制成多个标准品混合液，稀释液采用质量体积分数为1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液；
更具体的，葡萄糖标准品母液中葡萄糖的浓度为1mg/mL，果糖标准品母液中果糖的浓度为1mg/mL，1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度为100μg/mL，按1：1：1体积比取葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液混合后(这里按体积比取标准品母液并非对标准品母液用量进行限制，而是为了使标准品混合液中三种成分浓度比接近人体血液中的比例，可以按实际需求进行调整)，使用质量体积分数为1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液逐级稀释，配制成8个标准品混合液 1～8，如表1所示：
表1
步骤B、配制同时含13C6葡萄糖、13C3果糖和13C61，5-脱氧葡萄糖醇的内标物提取液；
具体的，分别配制特定浓度的13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C61，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液，取13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C6 1， 5-脱氧葡萄糖醇内标物母液混合后逐级稀释至预设浓度(这里的预设浓度可根据实际需求进行调整)，配制成内标物混合液，稀释液采用含0.05～0.15％氨水的74.95～84.85％乙腈水溶液，再取内标物混合液与相同的稀释液按预设体积比混合，制得内标物提取液；
更具体的，13C6葡萄糖内标物母液中13C6葡萄糖的浓度为1mg/mL，13C3果糖内标物母液中13C3果糖的浓度为1mg/mL，13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液中13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇浓度为100μg/mL，按1：1：1体积比取13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液混合后(这里按体积比取内标物母液并非对内标物母液用量进行限制，而是为了使内标物混合液中三种成分浓度比接近人体血液中的比例，可以按实际需求进行调整)，使用含0.1％氨水的75％乙腈水溶液逐级稀释至13C6葡萄糖的浓度为10000ng/mL、13C3果糖的浓度为10000ng/mL、13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇浓度为1000ng/mL，取内标物混合液与含0.1％氨水的75％乙腈水溶液按2：13的体积比混合(这里的体积比可根据实际需求进行调整)，制得内标物提取液。
步骤C、将内标物提取液分别加入多个标准品混合液中，再将混有内标物提取液的多个标准品混合液分别进行液相色谱串联质谱检测；
具体的，混有内标物提取液的标准品混合液先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测；
具体的，涡旋时间为1～5min，离心转速为14000～16000rpm，离心温度为1～5℃，离心时间为8～12min；
具体的，液相色谱串联质谱检测所用的设备为超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪；
更具体的，包括：
(1)移取100μL标准品混合液1于1.5mL离心管，再加入300μL内标物提取液，涡旋混匀5min，再使用离心机在4℃、15000rpm条件下离心10min，然后移取上清液至96 孔微孔板，将96孔微孔板放入液相色谱串联质谱系统自动进样器中，打开应用软件，调用设计好的采集文件，建立样品列表，进行上机检测；
(2)将标准品混合液2～8按步骤(1)分别进行上机检测；
更具体的，液相色谱串联质谱检测过程中采用的色谱分离条件均为：色谱柱为ACQUITY
BEH Amide 1.7μm，3.0×150mm，流速为0.3mL/min，柱温为35℃；等度洗脱，流动相为含0.1％氨水的75％乙腈水溶液；在洗脱过程中，1，5-脱氧葡萄糖醇的保留时间为4.87min，果糖的保留时间为5.85min，葡萄糖的保留时间为6.56min，总色谱时间为8min，检测得到典型谱图如图1所示。
更具体的，液相色谱串联质谱检测过程中采用的质谱条件为：ESI负离子模式，离子源温度350℃，雾化器气压45psi，辅助气压50psi，气帘气压40psi，喷雾电压-4500V，采用多反应监测模式，具体定量母离子-子离子对及对应的碰撞能量如表2所示：
表2
步骤D、根据混有内标物提取液的多个标准品混合液的液相色谱串联质谱检测结果分别建立葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线；
具体的，利用液相色谱串联质谱系统的数据处理软件，分别获得葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线，如图2所示：
图2a为1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线，其中横坐标为标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度，纵坐标为1，5-脱氧葡萄糖醇标准品信号强度与13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物信号强度的比值，1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线方程为y＝0.01438x+0.01158(r＝0.99994， r2＝0.99989)；
图2b为葡萄糖标准曲线，其中横坐标为标准品混合液中葡萄糖浓度，纵坐标为葡萄糖标准品信号强度与13C6葡萄糖内标物信号强度的比值，葡萄糖标准曲线方程为 y＝4.86952×10-4x-0.00642(r＝0.99969，r2＝0.99938)；
图2c为果糖标准曲线，其中横坐标为标准品混合液中果糖浓度，纵坐标为果糖标准品信号强度与13C3果糖内标物信号强度的比值，果糖标准曲线方程为y＝0.00127x+0.01118 (r＝0.99991，r2＝0.99982)。
步骤E、将内标物提取液加入待测血液样本中，再将混有内标物提取液的待测血液样本进行液相色谱串联质谱检测；
具体的，混有内标物提取液的待测血液样本先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测；
具体的，涡旋时间为1～5min，离心转速为14000～16000rpm，离心温度为1～5℃，离心时间为8～12min；
具体的，液相色谱串联质谱检测所用的设备为超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪；
更具体的，包括：
移取100μL待测血液样本于1.5mL离心管，再加入300μL内标物提取液，涡旋混匀5min，再使用离心机在4℃、15000rpm条件下离心10min，然后移取上清液至96孔微孔板，将96孔微孔板放入液相色谱串联质谱系统自动进样器中，打开应用软件，调用设计好的采集文件，建立样品列表，进行上机检测；
更具体的，液相色谱串联质谱检测过程中采用的色谱分离条件均为：色谱柱为ACQUITY
BEH Amide 1.7μm，3.0×150mm，流速为0.3mL/min，柱温为35℃；等度洗脱，流动相为含0.1％氨水的75％乙腈水溶液。
更具体的，液相色谱串联质谱检测过程中采用的质谱条件为：ESI负离子模式，离子源温度350℃，雾化器气压45psi，辅助气压50psi，气帘气压40psi，喷雾电压-4500V，采用多反应监测模式，具体定量母离子-子离子对及对应的碰撞能量如表2所示。
步骤F、将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测结果分别代入葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线中，得到待测血液样本中葡萄糖浓度、果糖浓度和1，5-脱氧葡萄糖醇浓度。
具体的，将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测得到的葡萄糖信号强度与13C6葡萄糖内标物信号强度的比值带入图2b中的标准曲线中，即可计算出待测血液样本中葡萄糖浓度；
将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测得到的果糖信号强度与13C3果糖内标物信号强度的比值带入图2c中的标准曲线中，即可计算出待测血液样本中果糖浓度；
将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测得到的1，5-脱氧葡萄糖醇信号强度与13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇内标物信号强度的比值带入图2a中的标准曲线中，即可计算出待测血液样本中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (9)
1.同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，包括：
配制同时含葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的标准品混合液多个，多个标准品混合液中葡萄糖浓度均不相同，多个标准品混合液中果糖浓度均不相同，且多个标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度均不相同；
配制同时含13C6葡萄糖、13C3果糖和13C61，5-脱氧葡萄糖醇的内标物提取液；
将内标物提取液分别加入多个标准品混合液中，再将混有内标物提取液的多个标准品混合液分别进行液相色谱串联质谱检测；
根据混有内标物提取液的多个标准品混合液的液相色谱串联质谱检测结果分别建立葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线；
将内标物提取液加入待测血液样本中，再将混有内标物提取液的待测血液样本进行液相色谱串联质谱检测；
将混有内标物提取液的待测血液样本的液相色谱串联质谱检测结果分别代入葡萄糖标准曲线、果糖标准曲线和1，5-脱氧葡萄糖醇标准曲线中，得到待测血液样本中葡萄糖浓度、果糖浓度和1，5-脱氧葡萄糖醇浓度；
液相色谱串联质谱检测过程中采用的色谱分离条件为：色谱柱为
BEHAmide 1.7μm，3.0×150mm，流速为0.3mL/min，柱温为35℃；等度洗脱，流动相为含0.05～0.15％氨水的74.95～84.85％乙腈水溶液。
2.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，混有内标物提取液的标准品混合液先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测，混有内标物提取液的待测血液样本也先进行涡旋、离心，再取上清液进行液相色谱串联质谱检测。
3.如权利要求2所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，涡旋时间为1～5min，离心转速为14000～16000rpm，离心温度为1～5℃，离心时间为8～12min。
4.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测所用的设备为超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪。
5.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测过程中采用的质谱条件为：ESI负离子模式，离子源温度350℃，雾化器气压45psi，辅助气压50psi，气帘气压40psi，喷雾电压-4500V，采用多反应监测模式。
6.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，液相色谱串联质谱检测过程中质谱分析的母离子-子离子对为：葡萄糖，m/z 178.9-m/z 59.01；果糖，m/z 178.9-m/z 59.01；1，5-脱氧葡萄糖醇，m/z162.9-m/z 101；13C6葡萄糖，m/z 184.9-m/z 92；13C3果糖，m/z 181.9-m/z 92；13C6 1，5-脱氧葡萄糖醇，m/z 168.9-m/z 105。
7.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，标准品混合液中葡萄糖浓度范围为5～500000ng/mL，标准品混合液中果糖浓度范围为5～500000ng/mL，标准品混合液中1，5-脱氧葡萄糖醇浓度范围为5～500000ng/mL。
8.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，内标物提取液与待测血液样本的体积比为(1～4)∶1。
9.如权利要求1所述的同时测定血液中葡萄糖、果糖和1，5-脱氧葡萄糖醇的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，标准品混合液的配制方法包括：
分别配制特定浓度的葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液，取葡萄糖标准品母液、果糖标准品母液和1，5-脱氧葡萄糖醇标准品母液混合后逐级稀释，配制成多个标准品混合液，稀释液采用质量体积分数为1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液；
内标物提取液的配制方法包括：分别配制特定浓度的13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C61，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液，取13C6葡萄糖内标物母液、13C3果糖内标物母液和13C61，5-脱氧葡萄糖醇内标物母液混合后逐级稀释至预设浓度，配制成内标物混合液，稀释液采用含0.05～0.15％氨水的74.95～84.85％乙腈水溶液，再取内标物混合液与相同的稀释液按预设体积比混合，制得内标物提取液。
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| CN108780099A (zh) * | 2016-03-11 | 2018-11-09 | 学校法人冲绳科学技术大学院大学学园 | 一种用于测定老化程度的方法、装置、系统和试剂盒 |
| CN112611814A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-04-06 | 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 | 一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法 |
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