CN112526138A - 一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物及其试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物及其试剂盒和应用。其中所述生物标志物至少包括转铁蛋白受体。本发明首次发现转铁蛋白受体可用于大肠癌的粪便筛查，通过利用包含转铁蛋白受体的生物标志物可以显著提高大肠癌筛查的灵敏度和阴阳性符合率，实现快速方便的大肠癌初步筛查，提高肠镜效率，且价格能够被大众所接收、检测时间短，适于POCT及家用检测，具有广泛的应用价值。

Description

一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物及其试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物及其试剂盒和应用。

背景技术

大肠癌(结直肠癌，colorectal cancer，CRC)是世界范围内发病率、死亡率较高的肿瘤。除了遗传因素外，主要致病因素是食物及肠道微生物。随着生活水平的提高，我国居民膳食结构中高脂肪、高蛋白、低纤维食品比例增加等多种原因，国内CRC发病率、死亡率逐年稳步增长，在城市白领阶层中尤为明显，北京、上海等市已稳占前三位。但是在美国发病率、死亡率却显著下降，1976年美国大肠癌的发病率为十万分之60.5，到2005年降为十万分之46.4；30年间发病率下降了23.3％；2007年大肠癌死亡率较1990年下降了35％。取得这样的进步，归因于大肠癌的早筛查、早诊断、早治疗。

一般认为绝大多数大肠癌的发生是一个较为长期的渐进性过程，经过息肉、腺瘤、腺癌等阶段；腺癌又分为I，II，III，IV期；大肠癌筛查不光检出CRC，也检出了很多癌前病变，如息肉、腺瘤；采取适当措施干预切除后，这些人将和普通人一样正常的生活、工作，。在美国2000年适龄人群做大肠癌筛查的比例是40％左右；2010年达到60％；2018年估计是80％左右，大肠癌筛查是有明确社会经济效益的一种肿瘤筛查。美国大肠癌的早筛手段主要是结肠镜(肠镜)，辅助以电子乙状结肠镜、粪便隐血筛查、DNA检查等。

粪便的主要成份包括：水、无机盐、未消化的食物纤维、有机小分子、蛋白质、肠道的脱落细胞等。经过消化系统消化、吸收后，食物中的蛋白质，包括上消化道(食管、胃)来源的蛋白质绝大部份变为小分子被人体吸收，粪便中的蛋白质主要来自下消化道(大肠)和肠道中的微生物。由于正常人体消化系统有基础性的生理失血(通常量很少)，所以血液中的肿瘤标志物会带入粪便，然而经过消化吸收，食物、消化液的稀释，其含量大大降低，而粪便中的肿瘤标志物大部份来自大肠(息肉、腺瘤、腺癌及脱落细胞，包括脱落的肿瘤细胞及炎症细胞)，即这些肿瘤标志物有了相对的“组织特异性”。但粪便中肿瘤标志物癌胚抗原CEA检测大肠癌筛查意义不大，原因可能与肿瘤有高度的异质性、个体间的高度差异，粪便样本本身的高度不均一性，残留酶和微生物的降解作用等有关。然而，由于肿瘤组织常常失血，一些来自于血液的含量极高的非肿瘤标记如血红蛋白、白蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白、补体等大大升高，却成为了粪便中的大肠癌“肿瘤标志物”；由于肿瘤失血没有固定的模式，有随机性及不均一性，很多检测试剂要求连续三天检验以增加准确性(三天中只要有一天是阳性就判定为阳性)，由于粪便检测的完全无创性和器官特异性(大肠)，因此在肠道疾病检测中是理想的标本之一。

我国受制于医疗资源，大肠癌筛查的主要方式是隐血筛查，阳性人员做肠镜(金标准)确诊。隐血筛查(现在主要是免疫法，化学法由于特异性较差正逐渐淡出市场)比较方便，但效果并不理想：很多的体检套餐中有隐血项目，由于试剂质量不稳定等原因，实际灵敏度往往只能达到3-30％，弃检率高，一般筛查对采样后送到检测点(卫生院、卫生所)有时间要求，要求2-4小时内送到(实际操作往往达不到这个要求)；加上气味大，体检人员不愿做，医生不愿推广，所以多年来推广响应性不高。现在有些公司开发基于核酸检测(DNA突变和/或甲基化、microRNA表达)的试剂，还有尚处于临床验证阶段的液态活检、肠道菌群NGS等方法，这些方法准确性大大提高，但价格昂贵，检测周期长，对广大城乡居民来说还不是一种最受欢迎的筛查方式。所以市场上迫切需要发明一种方便准确且价格能够被大众普遍接受的新大肠癌的检测方式。

发明人从粪便蛋白组数据来源的候选指标筛选CRC标志物时，意外发现一种能较好补充现有隐血检测的标志物。

发明内容

本发明公开了一种新的用于大肠癌筛查的生物标记物，使得大肠癌的筛查更加快速方便且准确性大大提高。

本发明的具体技术方案如下：

本发明第一方面公开了一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物，其中所述生物标志物至少包括转铁蛋白受体。

转铁蛋白受体(transferrin receptor，TFR)是一种细胞膜上介导转铁蛋白、Fe离子入膜的蛋白，通过精妙的PH变化和胞饮、胞吐作用完成铁离子的转运；转铁蛋白受体广泛分布于机体多种细胞，在正常组织表达较低或不表达。但在增殖活跃的肿瘤细胞、合成的幼红细胞及胎盘绒毛滋养合体细胞膜上转铁蛋白受体数目尤为丰富。

本发明首次发现大肠癌患者的粪便中转铁蛋白受体的含量显著增加。

优选地，其中所述生物标志物还包括血红蛋白。

更优选的，所述生物标记物包括以下任意一种组合：1)血红蛋白+TFR+TIMP(组织金属蛋白酶抑制剂)；2)血红蛋白+TFR+TF(转铁蛋白)；3)血红蛋白+TFR+calprotectin(钙卫蛋白)；4)血红蛋白+TFR+PKM2(丙酮酸激酶M2亚型)；5)血红蛋白+TFR+NGAL；6)血红蛋白+TFR+MMP9以及其它类组合。

应当理解，本发明所保护的生物标记物并不限于以上组合，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适蛋白质来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

在本发明的一具体实施例中，所述样本为人体自然排出粪便，或在做肠镜服用清肠液前收集，避免混入小便，取1-2g粪便到收集管中，在4小时内送到实验室处理(直接提取或置-80度保存，待样本收集好后一起提取处理，处理好的样本置-80度保存待测)。

本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物的产品。

优选的，所述产品为能够与上述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物特异性结合的物质。更优选的，所述物质是选自由抗体或其抗原结合片段、相互作用融合蛋白、适配体和亲和体组成的生物特异性捕获剂。

优选的，所述试剂盒为酶联免疫吸附测定试剂盒、化学发光试剂盒或免疫层析试剂盒。

更优选的，所述免疫层析试剂盒包括定量/定性的胶体金免疫层析试剂盒和荧光免疫层析试剂盒等。所述荧光免疫层析试剂盒还包括量子点免疫荧光层析试剂盒。

在本发明的一些具体实施例中，所述免疫层析试剂盒里面包括检测卡条。

应当理解本发明中的试剂盒并不限于上述种类，本领域技术人员可以根据需要选择任意种类的试剂盒，且均在本发明的保护范围之内。例如，试剂盒的检测方法包括质谱法，化学发光法，定量/定性的胶体金层析；还包括定量/定性的其它免疫层析法，如时间分辨荧光、免疫荧光、量子点层析等。

优选的，所述试剂盒采用分子生物学方法检测上述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物的mRNA与内参基因的相对表达量。

更优选的，所述内参基因为ACTB(β-肌动蛋白)。

更优选的，所述分子生物学方法包括采用RT-PCR和高通量测序方法。在本发明的一个具体实施例中，所述高通量测序方法采用基因芯片进行检测。

应当理解，本发明中所述的分子生物学并不限于以上方法，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的分子生物学来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

本发明第三个方面公开了如下应用：

(a1)上述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物在制备筛查和/或辅助诊断大肠癌产品中的应用；

(a2)上述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。

优选的，所述产品为试剂盒。

本发明第四个方面公开了如下应用：

(b1)转铁蛋白受体作为生物标志物在开发筛查和/或辅助诊断大肠癌的试剂中的应用；

(b2)转铁蛋白受体作为生物标志物在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。

本发明第五个方面公开了上述的试剂盒在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。通过使用试剂盒检测大肠癌粪便蛋白质生物标志物的蛋白浓度或者基因表达量，来辅助判断患者是否患有大肠癌。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明首次发现粪便转铁蛋白受体可用于大肠癌的筛查，通过利用包含转铁蛋白受体的生物标志物可以显著提高大肠癌筛查的灵敏度和准确率，能够实现快速方便的大肠癌筛查，价格能够被大众所接收且检测周期短，具有广泛的应用价值。

本发明进一步为大肠癌病变进展、加重的预警和预测评估提供新方法和新指标，为大肠癌的合理救治奠定基础，为降低大肠癌患者的死亡率提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明实施例中人血红蛋白的标准曲线图；

图2为本发明实施例中人转铁蛋白受体的标准曲线图；

图3为本发明实施例中人钙卫蛋白的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1ELISA试剂盒的准备

本实施例采用经典的双抗体夹心ELISA方法构建待测指标的标准曲线，(配对抗体、标准品来自美国R&D systems，Sigma，北京义翘神州和芬兰Medix等公司)，人血红蛋白、人转铁蛋白受体和人钙卫蛋白的标准曲线分别如图1-图3所示。

实施例2样本中大肠癌粪便蛋白质生物标志物的检测

本实施例使用实施例1所述的试剂盒检测样本中大肠癌粪便蛋白质生物标志物的浓度，具体包括以下步骤：

1.样本收集与处理：

收集大肠癌患者和健康人粪便样本，大肠癌患者样本在手术前收集，避免混入小便，取1-2g粪便到收集管中，在4小时内送到实验室处理(直接提取或置-80度保存，待样本收集好后一起处理)；具体信息见表1和表2所示。

表1肿瘤样本信息(复旦大学肿瘤医院)

28例样本	年龄		40-89
					性别		19男/9女
	肿瘤部位
						直肠癌	17
		结肠癌	11
					肿瘤分期
		I/II	18
						III/IV	10
	病理
						中低分化腺癌	4
		中分化腺癌	24

表2大肠癌病人、健康人一般信息

	大肠癌病人	健康人
				28人	22人
性别
			男	19	9
女	9	13
			年龄	40-89岁	43-83岁

2.样本提取：

标本平衡到室温，称重，计算粪便净重，加入5倍体积抽提缓冲液，震荡混匀，取250ul混合溶液加入1000ul抽提缓冲液，室温20-30分钟裂解；间隙震荡；12000rpm离心10分钟；上清液移入另一管中；-80度保存；

3.包被板子：用3ug/ml的抗体4度冰箱包被过夜，所述抗体分别为人血红蛋白、人转铁蛋白受体和人钙卫蛋白的抗体；

4.封闭液37度封闭1小时；

5.PBST washing buffer洗涤5次；

6.加入100ul样品(稀释上清液)或标准品37度孵育1-2小时；

7.PBST washing buffer洗涤3次；

8.加入biotin标记检测抗体37度孵育1-2小时；

9.PBST washing buffer洗涤3次；

10.加入1：50稀释SA-HRP 37度孵育45分钟；

11.加入TMB显色5-10分钟，终止后在酶标仪上读数。

根据酶标仪上的读数结合实施例1得到的标准曲线，获得各个样品中特定蛋白的浓度，检测结果如表3所示。

表3样本检测结果的四分位间距表格

*：P<0.001；&:P＝0.001；

表1采用SPSS19软件分析得出，独立样本非参数检验Mann－Whitney U检验。

上述检测中结直肠癌CRC组的血红蛋白平均值为451.36ng/ml；control对照组平均值8.08ng/ml；两者平均值差55.9倍；钙卫蛋白CRC平均值88.49ng/ml；control平均值，8.18ng/ml；两者平均值差10.8倍；而转铁蛋白受体的CRC平均值421.4pg/ml，control平均值0.36pg/ml，两者平均值差1185倍；转铁蛋白受体在CRC和对照组平均值的比值最大，有利于区分大肠癌和正常对照。

样品上清中血红蛋白50ng/ml，转铁蛋白受体50pg/ml，钙卫蛋白100ng/ml为Cut-off(临界)值，三者任一阳性即为阳性，28例CRC患者标本中有27例为阳性，1例阴性；22例正常人样本中有1例阳性，21例为阴性；灵敏度为96.4％(27/28)，特异度为95.5％(21/22)。

实施例3

在苏州大学附属张家港市第一人民医院、沈阳市第五医院等医院收集普通外科、消化内科门诊患者(排除妇女生理周期、服用阿司匹林、氯吡格雷等抗凝药物；肠镜非因肿瘤阻塞未达回盲部者)。服用清肠剂之前的自然排便样本，1-2g左右，2-3小时之内收集至-20度冰箱保存，2周内转入-80度冰箱冻存，按实施例2所述的方法取样、裂解、ELISA检测，以肠镜和病理结果为标准，同时用裂解上清做隐血检测；计算联合指标(血红蛋白、TFR和钙卫蛋白的组合)的灵敏度和特异度，并与现有的隐血方法、血红蛋白定量法作比较。

门诊患者基本信息和结果如表4和表5所示。

表4样本基本信息

门诊患者	141人
		性别
男	80人
		女	61人
年龄	22-82岁

表5新方法(血红蛋白、TFR，钙卫蛋白三指标)与现有指标的对比

本次肠镜检查141例患者中发现有4例CRC(其中直肠1例，乙状结肠1例，横结肠1例，升结肠1例)，137例受检者没有发现大肠癌，CRC阳性比例约为2.8％；用新的联合指标在141例标本中没有漏检，灵敏度为100％，特异度97.81％；虽然出现3例假阳性，假阳性率为43％，但没有假阴性的发生，对于筛查试剂是比较理想的效果。通过筛查试剂浓缩真正的病人，而不漏掉阳性患者，再通过精筛的肠镜方法确定病人，提高肠镜的阳性率，大大提高肠镜效率。

而市场上隐血试纸(蓝十字生物药业(北京)有限公司，京械注准20162400267)在本次检测中灵敏度为100％，特异度为85.4％；假阳性率为85％(由于本次检测中将样本精确定量后滴加到试纸条上，所以准确性偏高)，在实际检测中，其准确性更低；所以实际上市场上隐血试纸并没有很好的普及发挥作用；新的指标组合比隐血检测有很大的优越性。而表5中血红蛋白定量法实质与日本荣研公司定量隐血试剂的原理一致，通过定量方法提高检测准确性，结果表明血红蛋白定量法阴阳性符合率高于定性的隐血试剂(阳性符合率提高一倍)，但是该方法却存在假阴性的问题；所以其与本发明相比尚显不足。

本实施例中以血红蛋白、TFR和钙卫蛋白的组合为大肠癌粪便蛋白质生物标志物，显著提高了大肠癌筛查的灵敏度和准确率，能够实现快速方便的大肠癌筛查，价格能够被大众所接收且检测周期短，具有广泛的应用价值。为大肠癌病变进展、加重的预警和预测评估提供新方法和新指标，为大肠癌的合理救治奠定基础，为降低大肠癌患者的死亡率提供技术支撑。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式(如质谱、化学发光；时间分辨荧光；荧光免疫层析、胶体金、量子点免疫层析等POCT平台)；都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种大肠癌粪便蛋白质生物标志物，其中所述生物标志物至少包括转铁蛋白受体。

2.根据权利要求1所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物，其中所述生物标志物还包括血红蛋白。

3.根据权利要求1所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物，其特征在于，所述生物标记物包括以下任意一种组合：1)血红蛋白+TFR+TIMP；2)血红蛋白+TFR+TF；3)血红蛋白+TFR+钙卫蛋白；4)血红蛋白+TFR+PKM2；5)血红蛋白+TFR+NGAL；6)血红蛋白+TFR+MMP9。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1-3所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物的产品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述产品为能够与权利要求1-3所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物特异性结合的物质。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫吸附测定试剂盒、化学发光试剂盒或免疫层析试剂盒。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用分子生物学方法检测权利要求1-3所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物的mRNA与内参基因的相对表达量。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述分子生物学方法包括采用RT-PCR和高通量测序方法。

9.如下应用：

(a1)权利要求1-3任一项所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物在制备筛查和/或辅助诊断大肠癌产品中的应用；

(a2)权利要求1-3任一项所述的大肠癌粪便蛋白质生物标志物在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。

10.如下应用：

(b1)转铁蛋白受体作为生物标志物在开发筛查和/或辅助诊断大肠癌的试剂中的应用；

(b2)转铁蛋白受体作为生物标志物在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。

11.根据权利要求4-8任一项所述的试剂盒在筛查和/或辅助诊断大肠癌中的应用。

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