CN111944821A - 一种结肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在检测制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在检测制剂中的应用。核酸适体的序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰。本发明核酸适体具有与生物抗体相似甚至更加优越的特性，主要体现在其具有特异性和高亲和性，低毒性、低免疫原性，可体外合成且保存运输便利等。利用本发明的核酸适体经荧光基团标记后进行早期结肠癌组织检测时，操作简单易行且检测结果更为直观。同时，本次发明的核酸适体为短链核酸序列，其体外合成成本较低。

Description

一种结肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在检测制剂中 的应用

技术领域

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于结肠癌细胞及临床结肠癌样本组织检测的核酸适体及其在制备结肠癌临床诊断与治疗试剂中的应用。

背景技术

结肠癌是癌症相关死亡率第二位的恶性肿瘤。大约95％的结肠癌是腺癌，其他罕见的类型包括淋巴瘤、腺鳞癌和鳞状细胞癌。随着人民生活方式和膳食结构的改变，结肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。结直肠癌也是美国最常见的恶性肿瘤之一，但2000~2013年，50岁以上成年人发病率下降32%，≥65岁人群的远端结肠癌的发病率下降最多，其可归功于结肠癌早期筛查的普及。因此，早期诊断、早期治疗对降低结肠癌的发病率及死亡率十分重要。

目前结肠癌早期诊断的方法包括大便隐血检测、结肠镜检测、粪便DNA突变检测和粪便RNA特异性基因检测，钡灌肠等。其中结肠镜检测被认为是诊断结肠癌的金标准,但是它为侵入性检查，需要肠道准备，检查过程中有发生并发症如出血及穿孔危险，患者接受性不高，且花费较大。大便隐血检测虽然为非侵入性检测,但是检查结果容易受饮食等因素的影响。粪便DNA突变检测和粪便RNA特异性基因检测为非侵入性检测手段，患者适应性较好，但对于筛查结肠癌而言灵敏度和特异性不够理想。因此结肠癌检测亟需开发一种准确高效的分子识别探针。

核酸适体分为DNA适体和RNA适体，是经过一系列筛选得到的人工合成的寡聚核苷酸，通常为20-50个碱基，可与靶分子物质特异性结合。核酸适体利用其二级结构与靶分子物质结合，由于其结构的多样性，核酸适体具有较广的靶标范围。此外，核酸适体还具有免疫源性低、分子量小、亲和性强、特异性好的特点。核酸适体可在体外化学合成，易于改造和修饰，制备成本低且易于保存。利用适体与配体的高亲和性来对肿瘤细胞进行检测，有助于肿瘤的早期诊断、快速定位，进而为疾病的药物研制、靶向治疗、预后等提供有力的研究手段。

发明内容

本发明人利用生工公司修饰的核酸适体文库对临床结肠癌组织进行流式结合验证，最终得到可以与结肠癌细胞（SW480、HCT116）结合且不与人正常肠上皮细胞（FHs74Int）结合的核酸适体。因而，本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于结肠癌细胞检测的适体及其在制备结肠癌临床诊断与治疗试剂中的应用。

本发明提供一种检测人早期结肠癌组织以及结肠癌细胞的核酸适体，序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰。

所述核酸适体，为52个碱基的短链核酸序列，主要通过对该核酸序列进行荧光基团标记，通过荧光强弱检测其与结肠癌细胞的结合能力。

此外还可在该核酸序列上连接放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记基团，推进该核酸适体在结肠癌诊断与治疗中的应用。将所述的核酸适体成为制备检测结肠癌细胞的制剂。

所述的核酸适体，最优选是下述序列：

其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5所示序列，或将其进行标记修饰。

同时，本发明还提供所述的核酸适体在制备检测或诊断结肠癌细胞的制剂中的用途。所述用途，是将所述核酸适体与待测细胞样品摇床孵育，孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗，再通过流式细胞仪进行检测。

同时，本发明还提供一种检测或诊断人早期结肠癌的试剂盒，其含有所述的核酸适体。所述的试剂盒，还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液；所述结合缓冲液成分为：0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/L tRNA,1g/L BSA;所述洗涤缓冲液含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁。当前大多数结肠癌诊疗方法都是侵入性的，患者接受度不高。通过调查发现，越早诊断出恶性肿瘤，患者的生存率越高，早期发现癌症是结肠癌患者生存的关键。尽管目前已有多种应用于临床的检测手段，例如胸部X线透视检查，前列腺特异性抗原测试，结肠镜检查和结肠镜检查来帮助诊断结肠癌，但这些远远不足以达到早期诊断的敏感性和特异性标准。此外，可以通过这些方法诊断的结肠癌通常超出了早期结肠癌的严重程度。研究人员正在开发具有临床应用前景的分子探针，如何通过优化检测和治疗方法来帮助改善结肠的诊疗现状。开发一种能够准确高效的识别早期结肠癌的分子探针可能为确定疾病的类型和阶段以及预测不同治疗方案的结果提供重要工具。因此本发明中所提到的可特异性识别并结合结肠癌细胞的核酸适体，其具有免疫原性低、毒性低、组织渗透性强、稳定性好、制备成本低等优势，可发展为检测结肠癌的新型分子探针，为结肠癌的准确诊断、快速定位提供有效的工具。本发明是基于Tissue-SELEX 技术，以临床早期结肠癌组织为正筛样本，从3119122条序列中，进一步通过对实验组以及对照组的测序结果中选取丰度排名前30的核酸序列，最后在不同的进化树家族中挑选丰度较高的8条候选序列。后续实验进一步证明了其功能和效果，最终才得到本发明。

附图说明

图1为8条候选序列与结肠癌细胞SW480的结合情况，其中（A）为8条候选序列与结肠癌细胞SW480的结合情况流式验证图，（B）为8条候选序列与结肠癌细胞SW480的结合情况共聚焦验证图；

图2为8条候选序列与结肠癌细胞HCT116的结合情况，其中（A）为8条候选序列与结肠癌细胞HCT116的结合情况流式验证图，（B）为8条候选序列与结肠癌细胞HCT116的结合情况共聚焦验证图；

图3为8条候选序列与人小肠上皮细胞FHs74Int的结合情况，其中（A）为8条候选序列与人小肠上皮细胞FHs74Int的结合情况流式验证图，（B）为8条候选序列与人小肠上皮细胞FHs74Int的结合情况共聚焦验证图；

图4为候选序列中所挑选出的核酸适体MYH-1与HCT116（A）、SW480（B）细胞的解离平衡常数。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

本实验所用到的细胞系结肠癌细胞（HCT116）、结肠癌细胞（SW480）以及正常的人小肠上皮细胞（FHs74Int）均来源于中科院上海细胞库。结肠癌组织以及结肠癌癌旁组织来源于临床样本。

实施例1：临床结肠癌组织核酸适体筛选

基于Tissue-SELEX 技术，以临床结肠癌组织为正筛样本，结肠癌癌旁组织为负筛样本进行筛选。首先合成具有亲和基团修饰X-Aptamer 文库，随后将初始文库与结肠癌癌旁组织孵育，孵育后保留并分离与癌旁组织结合的核酸序列。同时将不结合的核酸序列与临床结肠癌组织孵育。孵育后再保留并分离与结肠癌组织结合的核酸序列。然后在第2轮筛选中，将上一轮中所保留的正筛、负筛文库分别分为三组依次与灭菌水（空白对照组），结肠癌组织（实验组）、结肠癌癌旁组织（实验对照组）再次孵育。孵育后分离纯化得到单链ssDNA，并进行PCR扩增富集核酸序列。最后将扩增后的 6 组核酸序列库送往上海生工进行二代测序以及对比分析。

本次筛选通过二代测序实验组共测出3119122条序列，随后，本发明人从实验组以及对照组的测序结果中选取丰度排名前30的核酸序列。同时对各组进行对比分析，挑选出只与临床结肠癌组织结合的且丰度较高的核酸序列，随后通过MEGA6对只结合结肠癌组织的核酸序列进行同源性比对并构建进化树将同源性接近的序列划归为一个家族，根据ssDNA的同质性，分成了八个家族，分别挑选了八个家族中出现频率最高，即丰度最高的链，这八条核酸序列的丰度分别为28、12、12、10、10、10、10、10。将8条候选序列进行后续实验（见表1）（MYH-1至MYH-8序列分别与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列相对应）。

表1 针对临床结肠癌组织核酸适体筛选所挑选的8条候选序列

Clone ID	Sequence of random region(5’ to 3’)
		MYH-1	TTTTTAAGCCCACTTTCCTGTGGGAGTCACAGGGCGACACCGTGGGCCCATG
MYH-2	TTTTTAACACGACAACCCTGTGCAAGACGAACCACAACAATGTCGTGCCATG
		MYH-3	TTTTTAAGCCCACTAAGGTTCGAACAGCACAGGCCGGCACGGTCGTGCCATG
MYH-4	TTTTTAACACGACCAACCTGTGGGAGCCGAACAACACCAGAGTCGTGCCATG
		MYH-5	TTTTTAACACGACTCCACTGTGACTCCCGAACGACACGCACGTGGGCCCATG
MYH-6	TTTTTAAGCCCACTCCCCTGTGGCAGCCGAACGTCACCACAGTCGTGCCATG
		MYH-7	TTTTTAACACGACGGAACTGTGCACACCACAGAACACGCCGGTCGTGCCATG
MYH-8	TTTTTAAGCCCACGAGCCTGTGAGCACCGAACCACGTCAGCGTGGGCCCATG

实施例2 ：确定与结肠癌细胞SW480系特异性结合能力最强的序列

首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。用灭菌水将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对结肠癌细胞SW480进行预处理。用DPBS清洗细胞2-3次；再用0.2% EDTA分别将贴壁状态的结肠癌细胞SW480从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打细胞并收集到离心管中。最后往处理后的细胞中加入候选序列和结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/LtRNA，1g/L BSA）。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图1（A））。

其次，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水将其稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后置于常温。其次，对结肠癌细胞SW480进行预处理。用DPBS清洗结肠癌细胞SW480 2-3次。最后在结肠癌细胞SW480中分别加入预处理后的候选序列和结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（PBS，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图1（B））。

根据图1（A）流式结果显示8条候选序列中MYH-1、MYH-5能与结肠癌细胞SW480结合，且出现不同程度的荧光偏移现象，而其他序列偏移不明显。同时，图1（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符，各候选序列与结肠癌细胞SW480结合，且在细胞膜表面甚至细胞内检测到FITC标记的绿色荧光。结合流式与共聚焦验证结果表明其中核酸适体MYH-1与结肠癌细胞SW480的结合能力最强。

实施例3 ：确定与结肠癌细胞HCT116特异性结合能力最强的序列

首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对结肠癌细胞HCT116进行预处理。用DPBS清洗细胞2-3次；再用0.2% EDTA分别将贴壁状态的结肠癌细胞HCT116从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液吹打细胞并收集。最后往处理后的细胞中加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图2（A））。

其次，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对结肠癌细胞HCT116进行预处理。用DPBS清洗光学皿中的细胞2-3次。最后在结肠癌细胞HCT116中分别加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图2（B））。

根据图2（A）流式结果显示8条候选序列中部分核酸序列能与结肠癌细胞HCT116结合，且出现不同程度的荧光偏移现象，其中MYH-1、MYH-5的荧光偏移相比其他核酸序列大。同时，图2（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符，部分候选序列与结肠癌细胞HCT116结合，且在细胞膜表面显示绿色荧光，而核酸适体MYH-2、MYH-3、MYH-4、MYH-6、MYH-7、MYH-8与SW480细胞不结合，没有出现荧光偏移现象，同时也没有检测到绿色荧光。结合流式与共聚焦验证结果发现核酸适体MYH-1以及MYH-5与结肠癌细胞HCT116的结合能力最强。

实施例4：MYH-1不与人小肠上皮细胞FHs74Int结合

首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对人小肠上皮细胞FHs74Int进行预处理。用DPBS清洗细胞2-3次；再用0.2% EDTA分别将贴壁状态的人小肠上皮细胞FHs74Int从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液吹打细胞并收集。最后往处理后的细胞中加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图3（A））

其次，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水稀释到终浓度为250nM，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对人小肠上皮细胞FHs74Int进行预处理。用DPBS清洗光学皿中的人小肠上皮细胞FHs74Int2-3次。最后在人小肠上皮细胞FHs74Int中分别加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图3（B））

根据图3（A）流式结果显示8条候选序列不与人小肠上皮细胞FHs74Int结合，没有明显的偏移，图3（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符，候选序列均不与人小肠上皮细胞FHs74Int结合。结合流式与共聚焦结果发现核酸适体MYH-1与结肠癌细胞具有较强的结合能力，而与结肠正常细胞没有明显结合。

实施例5：核酸适体MYH-1与结肠癌细胞的结合亲和力强弱

以核酸适体MYH-1为例进一步研究其与结肠癌细胞的结合亲和力强弱。首先对MYH-1进行预处理。我们将MYH-1设置成不同的浓度梯度，即0nM、20nM、40nM、60nM、100nM、120nM、180nM、250nM、300nM。经过95℃高温变性5min，4℃复性10min，复性完后置于常温。其次，对结肠癌细胞HCT116、结肠癌细胞SW480进行预处理。丢弃细胞培养皿中的原有培养基，加入DPBS润洗细胞2-3次。再用0.2% EDTA室温消化1min分别将贴壁状态的结肠癌细胞HCT116、结肠癌细胞SW480从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 %的葡萄糖，5 mM氯化镁）分别吹打细胞并收集到离心管中。最后，振荡混匀放置于4℃摇床孵育1h。孵育后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图4）。

根据通过流式细胞仪处理软件得出不同浓度下的平均荧光强度，扣除非特异性细胞的背景荧光，再根据Y=Bmax X/（Kd+X）公式，通过GraphPad Prism 5.0计算出核酸适体MYH-1 与HCT116 细胞的解离平衡常数，并以X 轴为核酸适体不同梯度浓度，Y 轴为平均荧光强度构建解离曲线图。如图4所示核酸适体 MYH-1 与 HCT116 细胞（A）以及 SW480 细胞（B）的解离平衡常数均在纳摩尔级别，说明该核酸适体与结肠癌细胞的结合亲和力较高，将来具有发展为识别结肠癌的分子探针。

<110> 湖南大学

<120>一种结肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在检测制剂中的应用

<160> 8

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<400> 1

TTTTTAAGCCCACTTTCCTGTGGGAGTCACAGGGCGACACCGTGGGCCCATG 52

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<400> 2

TTTTTAACACGACAACCCTGTGCAAGACGAACCACAACAATGTCGTGCCATG 52

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<400> 3

TTTTTAAGCCCACTAAGGTTCGAACAGCACAGGCCGGCACGGTCGTGCCATG 52

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<400> 4

TTTTTAACACGACCAACCTGTGGGAGCCGAACAACACCAGAGTCGTGCCATG 52

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<400> 5

TTTTTAACACGACTCCACTGTGACTCCCGAACGACACGCACGTGGGCCCATG 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<400> 6

TTTTTAAGCCCACTCCCCTGTGGCAGCCGAACGTCACCACAGTCGTGCCATG 52

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<400> 7

TTTTTAACACGACGGAACTGTGCACACCACAGAACACGCCGGTCGTGCCATG 52

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<400> 8

TTTTTAAGCCCACGAGCCTGTGAGCACCGAACCACGTCAGCGTGGGCCCATG 52

Claims (10)

1.一种检测人早期结肠癌组织或结肠癌细胞的核酸适体，序列选自SEQ ID NO.1至SEQID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰。

2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5所示序列，或将其进行标记修饰。

3.根据权利要求1或2所述的核酸适体，其特征在于，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。

4.根据权利要求3所述的核酸适体，其特征在于，所述标记修饰是指荧光标记。

5.权利要求1-4任一项所述的核酸适体在制备检测或诊断结肠癌细胞的制剂中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，将所述核酸适体与待测细胞样品摇床孵育，孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗，再通过流式细胞仪进行检测。

7.权利要求1-4任一项所述的核酸适体在制备检测或诊断人早期结肠癌的制剂中的用途。

8.一种检测或诊断人早期结肠癌的试剂盒，其特征在于，其含有如权利要求1-4任一项所述的核酸适体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，包括结合缓冲液和洗涤缓冲液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液成分为：0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA；所述洗涤缓冲液含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁。

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