CN111925556A - 一种复合微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合微球的制备方法及其应用。本发明的聚乳酸‑羟基乙酸/明胶复合微球包括：聚乳酸‑羟基乙酸(PLGA)基础微球和明胶；其中所述明胶与所述聚乳酸‑羟基乙酸基础微球的表面通过共价键结合，相对于所述聚乳酸‑羟基乙酸/明胶复合微球的总质量，所述明胶的质量为0.00001～10％。本发明的聚乳酸‑羟基乙酸/明胶复合微球的制备方法包括：制备具有一定尺寸的聚乳酸‑羟基乙酸基础微球，活化聚乳酸‑羟基乙酸基础微球；将基础微球与明胶通过共价键连接。本发明的聚乳酸‑羟基乙酸/明胶复合微球用于培养细胞的用途，聚乳酸‑羟基乙酸/明胶复合微球对细胞的粘附效果远好于聚乳酸‑羟基乙酸基础微球。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程细胞支架材料领域，涉及一种复合微球的制备方法及其应用，具体而言，涉及一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球、其制备方法和用途。
背景技术
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)有良好的生物相容性和生物降解性且降解速度可控，在生物医学工程领域有着广泛的用途。在美国，PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。市售的治疗晚期前列腺癌的LupronDepot即是选用PLGA充当药物载体。传统的PLGA微球多为微米级的实心球，已被广泛用作人工导管，药物缓释载体，组织工程支架材料和细胞培养微载体等。近年来，在组织工程支架材料和细胞培养微载体领域中，为了增大支架材料的比表面积并由此改善细胞的粘附，还开发了基于PLGA的微球结构。然而，由于PLGA本身的疏水性，又缺乏细胞识别位点，所以对细胞亲和性差，尤其在三维细胞培养时，细胞依然很难在由PLGA制成的支架材料的表面黏附伸展。
为此，对由PLGA制成的微球结构的修饰得到重视。例如，Nojehdehian H等人(2009)记载了表面修饰了多聚赖氨酸同时内部装载视黄酸(RA)的PLGA微球，其用于多功能胚胎肿瘤干细胞P19的培养(参考引用文献1)。然而，该文献中制备得到的微球的尺寸大约为13～100μm，难以得到更大的粒径且粒径大小不均一，不利于细胞的培养。
Tsung MJ(2001)报道了用于递送地塞米松的表面修饰明胶的PLGA微球，但其制备出的微球小于10μm，无法用于细胞粘附(参考引用文献2)。另外，该技术采用2-甲基戊烷作为致孔剂，但是2-甲基戊烷有毒，大量生产时残留较多，毒性大，生物相容性差。
张天柱(2013)记载了表面修饰了胶原蛋白的PLGA微球，其用于卵巢癌H08910细胞培养(参考引用文献3)。胶原是具有生物活性的蛋白质，在大量生产时不易于控制生产环境，容易失活；同时，胶原易在体内引起免疫原性，限制其应用。与胶原相比，明胶是另一类细胞培养用支架材料，一种天然的高分子材料，其结构与生物体组织结构相似，具有良好的生物相容性。明胶的氨基酸组成与胶原类似，但没有生物活性。明胶的凝胶性、固水性、粘合性和溶解性等多种特性，令其在医药行业有着广泛的用途。然而，明胶单独使用时会溶于热水，在冷水中会吸水膨胀，虽然可以静态培养细胞，但在三维动态培养中易溶解，导致其稳定性差。
Graves R.A.等(2006)用乙醇作为共溶剂制备的PLGA微胶囊(microcapsules)的直径小于100μm，可提高脑啡肽的装载和缓慢释放(参考引用文献4)。但是，由于其尺寸小，该PLGA微胶囊仍不适于细胞增殖。基于上述，人们亟待提升基于PLGA的用于细胞培养用的材料性能。
引用文献
1：Nojehdehian H,Moztarzadeh F,Baharvand H,Nazarian H,TahririM.Preparation and surface characterization of poly-L-lysine-coated PLGAmicrosphere scaffolds containing retinoic acid for nerve tissue engineering:in vitro study.Colloid Surf B Biointerfaces，2009，73:23-29。
2：Tsung M J,Burgess D J.Preparation and characterization of gelatinsurface modified PLGA microspheres.AAPS PharmSciTech 2001,3(2):14-24。
3：张天柱，PLGA微球的制备及其在卵巢癌细胞三维培养中的应用研究，东南大学硕士学位论文，2013。
4：Graves R.A.,Freeman T.,Pamajula S.,et al.,Effect of co-solvents onthe characteristics of enkephalin microcapsules,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,2006,17(6):709-720。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种生物可降解型聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其结构和性能稳定、可实现大规模培养细胞、提高细胞生产效率、有效降低生产成本。
本发明的目的在于提供一种上述聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其制备方法及用于细胞培养的体系/方法。
用于解决问题的方案
本发明基于聚乳酸-羟基乙酸基础微球，制备了一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球。
具体地，本发明提供一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其包括：聚乳酸-羟基乙酸基础微球和明胶，其中所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的表面与所述明胶共价键结合；所述明胶的质量为复合微球的总质量的0.00001～10％。
在某些实施方案中，构成所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的聚乳酸-羟基乙酸中的源自乳酸的单元和源自羟基乙酸的单元的摩尔比例(源自乳酸的单元/源自羟基乙酸的单元)为90:10～50:50。
在某些实施方案中，聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球为直径为100～500μm的球状颗粒。
本发明还提供一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的制备方法，其包括：
1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，向其加入致孔剂并以动态方式形成乳液一或溶液一，后将所述乳液一或溶液一在液面以下加入到聚乙烯醇水溶液中并在搅拌下形成乳液二，待去除所述致孔剂和有机溶剂后，进而收集、洗涤，得到聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
2)在所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的表面上进行活化反应，形成可与明胶反应的活性基团，得到活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
3)将所述活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球与明胶水溶液混合并反应，经收集，洗涤和干燥获得所述聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，
其中所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的直径为100～500μm，其表面与所述明胶共价键结合，
所述明胶的质量为所述复合微球总质量的0.00001～10％。
在某些实施方案中，所述有机溶剂为选自二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正已烷、已烷、石油醚、苯、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜、苯甲醇中的至少一种；聚乳酸-羟基乙酸在所述有机溶剂中的质量浓度为1～40％；所述聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇的质量浓度为0.1～5％。
在某些实施方案中，所述致孔剂选自碳酸氢钠水溶液、碳酸氢铵水溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠水溶液、二次水、明胶水溶液、聚乙烯醇水溶液、泊洛沙姆水溶液、甲醇、乙醇、2-甲基戊烷、蔗糖水溶液中的至少一种。
在某些实施方案中，所述动态方式为均质、涡旋或超声。
在某些实施方案中，步骤1)中，所述乳液一或溶液一在液面以下通过注射形式加入到聚乙烯醇水溶液。
在某些实施方案中，所述活化反应包括：将所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液中进行活化，洗涤收集得到活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球；所述NHS和所述EDC的摩尔比(NHS:EDC)为1:10～10:1。
在某些实施方案中，所述活化的时间为1～120min。
在某些实施方案中，步骤3)中，所述明胶水溶液中的明胶的浓度为0.1～20％，pH值为7.5～10。
在某些实施方案中，步骤3)中，所述反应在搅拌下进行，反应时间为1～24h，反应温度为20～50℃。
本发明还提供一种采用上述聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球用于细胞培养的方法。
在某些实施方案中，所述细胞为贴壁性细胞。根据本发明的某个实施方案，上述细胞培养方法包括二维细胞培养和三维细胞培养。
在某些实施方案中，经过7天培养后，细胞数量较接种量增长24倍。
在某些实施方案中，经过7天培养后，细胞数量密度达1.0×103个/mL～1.0×106个/mL。
发明的效果
通过上述技术方案的实施，能够获得如下技术效果：
(1)本发明的PLGA/明胶复合微球的成分明确，PLGA和明胶结构确定、性能稳定，不仅能在平面孔板上进行二维细胞培养，也能在摇瓶、生物反应器等三维培养器中进行培养。
(2)本发明的PLGA/明胶复合微球能够极大提高细胞扩增效率，尤其是，在用于培养干细胞时，可使干细胞生长正常；细胞在微球上扩增后仍保持了干细胞的“干性”。
(3)本发明还提供了上述PLGA/明胶复合微球的制备方法，整个过程工艺简单、操作容易，由此降低了生产成本并易于工业化应用。
附图说明
图1A-1B是实施例1中PLGA基础微球的SEM照片。
图2A-2B是实施例2中PLGA基础微球的SEM照片。
图3A-3B是实施例3中PLGA基础微球的SEM照片。
图4是实施例9中PLGA基础微球在显微镜下的照片。
图5是实施例13中PLGA/明胶复合微球的SEM照片。
图6是实施例14中PLGA/明胶复合微球的SEM照片。
图7是实施例15中PLGA/明胶复合微球的SEM照片。
图8A-8B是实施例16中PLGA/明胶复合微球的SEM照片。
图9是实施例22中所使用的PLGA基础微球和所得的PLGA/明胶复合微球的荧光照片。
图10是实施例23中两组微球活细胞染色的荧光照片以及示出与两组微球相关的细胞增长的图。
图11是实施例24中两组微球活细胞染色的荧光照片。
图12是实施例19的PLGA/明胶复合微球经实施例25培养不同的时间(24h和72h)及实施例26染色后活细胞染色的荧光照片。
图13是实施例20的PLGA/明胶复合微球经实施例25培养不同的时间(1天和4天)及实施例26染色后活细胞染色的荧光照片。
图14是实施例27中流式检测的结果图。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方式、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方式、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球(PLGA/明胶复合微球)>
本发明提供了一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球(下文中有时称为PLGA/明胶复合微球)，包括：
聚乳酸-羟基乙酸基础微球，
明胶；
其中聚乳酸-羟基乙酸基础微球(下文中有时称为PLGA基础微球)的表面与明胶通过共价键结合；
相对于聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的总质量，明胶的质量为0.00001～10％。在一些优选的实施方案中，相对于聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的总质量，明胶的质量不高于5％，更优选地，明胶的质量在0.001～5％之间。明胶含量选用BCA法测量。测量方法：称取100mg的PLGA/明胶复合微球溶于完全溶于1mL二甲亚砜溶液中，用水稀释10倍作为样品溶液1；将PLGA基础微球用相同处理方法作为溶液2，用于测量时扣除的背景。将一系列明胶溶于二甲亚砜:水＝1:9(v/v)的混合溶液中，用于建立标准曲线。将上述溶液与BCA工作液混合，孵育30分钟后，测试其吸光度，将样品溶液1的吸光度减去样品溶液2的吸光度，再代入明胶溶液的标准曲线，即得到明胶浓度。
本发明中，对于PLGA/明胶复合微球的形状没有特别限制，例如，可以为扁圆形状、柱形状、球形状、不规则形状等，并且可以根据实际需要进行选择。然而，从更好地获得本发明的技术效果的观点，PLGA/明胶复合微球的形状优选为球形状。进一步，球形状的PLGA/明胶复合微球的直径优选为100～500μm，更优选为100～450μm，又更优选为100～350μm。球形状的PLGA/明胶复合微球的直径的多分散系数(PDI)优选为0.3。此处，球形状的PLGA/明胶复合微球的直径及其多分散系数可以通过例如扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分布仪等本领域已知的设备来测量。
另外，为了更好地获得本发明的技术效果，PLGA/明胶复合微球的密度优选为1.0～1.3g/cm3，微球密度选用电子密度计测量。
聚乳酸-羟基乙酸
构成聚乳酸-羟基乙酸基础微球的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)为乳酸和羟基乙酸的共聚物，具有下式(1)表示的结构：
在以上式(1)中，m和n可以为任意正整数。然而，从更好地获得本发明的效果的观点，在一些具体实施方案中，PLGA中的源自乳酸的单元m和源自羟基乙酸的单元n的摩尔比例(m/n)优选为90:10～50:50，更优选为85:15～65:35，又更优选为80:20～70:30。出于相同的观点，在一些具体实施方案中，PLGA的重均分子量(Mw)优选为5000～200000Da，更优选为8000～150000Da，又更优选为20000～140000Da。本发明中，重均分子量(Mw)通过凝胶渗透色谱法(GPC)按聚苯乙烯换算来获得。
在本发明中，对所使用的PLGA中的单体—乳酸和羟基乙酸的分布结构及末端基团没有特别限制。例如，PLGA的末端基团可以为羧基封端或者酯基封端。
聚乳酸-羟基乙酸基础微球
从更好地获得本发明的效果的观点，在一些具体实施方案中，本发明的PLGA基础微球优选为球形状，进一步，其直径优选为100～500μm，更优选为100～450μm，又更优选为100～350μm球形状的PLGA基础微球的直径的多分散系数优选为0.3。上述直径及其多分散系数可以通过例如扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分布仪等本领域已知的设备来测量。
另外，出于相似的观点，PLGA基础微球的密度优选为1.0～1.3g/cm3，微球密度选用电子密度计测量。
明胶
本发明中的明胶可以为本领域通常使用的任意种类的明胶。
在一些具体实施方案中，为了更好地获得本发明的效果，明胶的重均分子量优选为10000～50000Da，更优选为25000～38000Da。本发明部分实施例中，重均分子量(Mw)通过凝胶渗透色谱法(GPC)按聚苯乙烯换算来获得。
另外，本发明的明胶还可以根据需要进行各种物理和化学的改性处理，从而根据需要对于所形成的PLGA/明胶复合微球赋予各种性能。
其它成分
除了PLGA和明胶以外，在不损害本发明的效果的范围内，本发明的PLGA/明胶复合微球还可以包括其它成分，例如各种药物制剂，以及如胶原蛋白、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐类等其它材料等。
<聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球(PLGA/明胶复合微球)的制备>
本发明提供了一种上述聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的制备方法，其包括：
步骤1)：将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，向其加入致孔剂并以动态方式形成乳液一或溶液一，后将乳液一或溶液一在液面以下加入到聚乙烯醇水溶液中并在搅拌下形成乳液二，待去除致孔剂和有机溶剂后，进而收集、洗涤，得到直径为100～500μm的聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
步骤2)：在聚乳酸-羟基乙酸基础微球的表面上进行活化反应，形成可与明胶反应的活性基团，得到活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
步骤3)：将活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球与明胶水溶液混合并反应，经收集，洗涤和干燥获得聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球。
以下详细说明本发明的聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的制备方法。
聚乳酸-羟基乙酸基础微球的制备步骤(步骤1))
本步骤基于液致相分离法来进行。液致相分离法它利用的是不同浓度的聚合物在不同比例的不良溶剂/良溶剂的混合溶剂中的溶解度不同。
在本步骤中，首先，将PLGA溶解于有机溶剂中，向其中加入致孔剂并在动态方式下形成乳液或溶液。
本发明中，对用于溶解PLGA的有机溶剂没有特别限制，只要可以良好地溶解PLGA即可。具体实例包括而不限于：二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正已烷、已烷、石油醚、苯、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜、苯甲醇等。这些有机溶剂可以单独或以组合使用。其中，从更好地进行聚乳酸-羟基乙酸基础微球的制备的观点，该有机溶剂优选为二氯甲烷。出于相同的观点，在一些优选的实施方案中，通过将PLGA溶解于有机溶剂中所得的PLGA溶液中的PLGA的质量浓度为1～40％(即100mL有机溶剂中的PLGA的质量为1～40g)，更优选质量浓度为1.5～30％，又更优选质量浓度为2.0～20％，进一步更优选质量浓度为2～10％。
本发明中，致孔剂可以为本领域通常使用的各种致孔剂，具体实例包括而不限于：碳酸氢钠水溶液、碳酸氢铵水溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠水溶液、二次水、明胶水溶液、聚乙烯醇水溶液、泊洛沙姆水溶液、甲醇、乙醇、2-甲基戊烷、蔗糖水溶液。这些致孔剂可以单独或以组合使用。当适用于本发明的致孔剂以溶液形式存在时，这些致孔剂(例如，上述的碳酸氢钠水溶液、碳酸氢铵水溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠水溶液、明胶水溶液、聚乙烯醇水溶液、泊洛沙姆水溶液、蔗糖水溶液等)中的固含量(即100mL的溶剂中的致孔剂的质量分数)优选为0.05～20％，更优选质量浓度为0.1～10％。
在一些特别优选的实施方案中，致孔剂与二氯甲烷的体积比例范围优选为20:1～1:20(v/v)，更优选为10:1～1:15(v/v)，又更优选为1:1～1:10(v/v)。
在形成乳液一或溶液一的过程中，动态方式的分散优选地通过例如均质、涡旋或超声来施加，但不限于此。通常，可以采用本领域通常使用的设备来施加均质、涡旋或超声等动态分散。在施加均质的情况下，所使用的均质机的转速优选为5000～25000rpm，更优选为8000～20000rpm，又更优选为10000～16000rpm；均质时间优选为10～300s，更优选为10～250s，又更优选为30～180s。
接下来，将如上所述所得的乳液一或溶液一加入聚乙烯醇水溶液中并在搅拌下形成乳液二。某些实施方案中，乳液一优选为W/O(水/油)型乳液。某些实施方案中，乳液二优选为W/O/W(水/油/水)型乳液。
本发明中，从有利于适于本发明的PLGA基础微球的形成且更好地获得本发明的效果的观点，聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇的质量浓度(即100mL的水中的聚乙烯醇的质量分数)优选为0.1～5％，更优选为0.2～2％，又更优选为0.3～1％，进一步更优选为0.3～0.8％；出于相同的观点，用于溶解PLGA的有机溶剂与聚乙烯醇水溶液的体积比例范围优选为1:10～1:300，更优选为1:20～1:200；又更优选1:30～1:100。
对加入乳液一或溶液一的具体方法没有特别限制，只要可以获得乳液二即可。从更好地获得乳液二的观点，优选地，将乳液一或溶液一在液面以下通过注射形式加入到聚乙烯醇水溶液。
在形成乳液二的过程中，可以采用本领域通常使用的搅拌机来进行机械搅拌。从更好地获得乳液二的观点，机械搅拌的速度优选为100～400rpm，更优选为100～300rpm；搅拌时间优选为1～48h，更优选4～24h。
在形成了乳液二之后，去除致孔剂和有机溶剂，并且收集并洗涤PLGA基础微球。
本发明中，对于除去致孔剂和有机溶剂的除去方法没有特别限制，可采用本领域通常已知的除去方法。例如，可使用使它们挥发的方法、或者将它们萃取分液方法等。
本发明中，对于PLGA基础微球的收集方法没有特别限制，例如，可以采用透析法、过滤法或离心法等本领域常用的收集方法以将PLGA基础微球与液相分离。
本发明中，经过收集和分离得到的PLGA基础微球需要进行洗涤，以进一步除去如聚乙烯醇等各种残留成分。洗涤优选使用水洗，并且可以根据需要选择水洗-收集分离的过程的重复次数。
聚乳酸-羟基乙酸基础微球的活化步骤(步骤2))
本步骤中，使得PLGA基础微球的表面上形成可与明胶反应的活性基团，以便PLGA基础微球在之后的步骤中进行与明胶的共价键结合。优选地，PLGA基础微球的表面上要形成的可与明胶反应的活性基团的实例包括而不限于羧基或其活化形式、羟基。其中，特别优选羧基(或其活化形式)作为可与明胶反应的活性基团。此处，羧基的活化形式是指羧基上存在与羧基相比更易于与明胶进行共价键结合的基团的形式。
在羧基作为活性基团的情况下，使得PLGA基础微球表面具有羧基的方法的具体实例包括而不限于：(1)用NaOH促进基础微球上的酯水解，从而在颗粒表面形成羧基；(2)采用羧基封端的PLGA(可以为市售品)来制备基础微球；(3)固化过程中依靠酸性或碱性PVA水解PLGA的酯键从而暴露羧基。这些方法可以单独使用或者以两种以上的组合使用。
进一步，在羧基作为活性基团的情况下，使得PLGA基础微球表面的羧基活化的方法的具体实例可以包括而不限于：(1)通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)来活化PLGA基础微球的表面；(2)通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)来活化PLGA基础微球的表面。这些方法可以单独使用或者以两种以上的任意组合使用。
在一些优选的实施方案中，在羧基作为活性基团的情况下，本步骤中优选地至少采用上述羧基活化方法(2)，例如，可以将PLGA基础微球浸泡NHS和EDC的溶液中。在采用上述羧基活化方法(2)的情况下，在活化过程中，从更好地活化PLGA基础微球的观点，NHS和EDC的摩尔比(NHS:EDC)优选为1:10～10:1，更优选为1:8～8:1，又更优选为1:5～5:1。进一步，NHS和EDC分别优选地以水溶液的形式使用。EDC水溶液中的EDC浓度优选为0.1～100mM，优选为0.8～50mM，更优选为1～20mM，又更优选为2～15mM；NHS水溶液中的NHS浓度优选为0.1～100mM，更优选为0.8～20mM，更优选为1～5mM。
另外，在采用上述羧基活化方法(2)的情况下，活化时间优选为1～120min，从更好地获得本发明的活化PLGA基础微球和提高生产效率的观点，更优选为5～60min，又更优选为15～30min。
本发明中，在活化结束之后，洗涤并收集活化的PLGA基础微球。
本发明中，对于活化的PLGA基础微球的收集方法没有特别限制，例如，可以采用透析法、过滤法或离心法等本领域常用的收集方法以将活化的PLGA基础微球与液相分离。
本发明中，经过收集和分离得到的活化的PLGA基础微球需要进行洗涤，以进一步除去如NHS和EDC等各种残留成分。洗涤优选使用水洗，并且可以根据需要选择水洗-收集分离的过程的重复次数。
明胶与PLGA基础微球的结合步骤(步骤3))
本步骤中，将活化的PLGA基础微球与明胶水溶液混合并借助其表面上的可与明胶反应的活性基团而与明胶反应，从而将明胶与PLGA基础微球通过共价键紧密的结合在一起，得到本发明的复合微球。
在一些优选的实施方案中，使得明胶上的氨基与活化的PLGA基础微球的表面上的羧基反应。
本发明中，为了更好地实现本发明的效果，明胶水溶液中的明胶的浓度(即100mL的水中的明胶的质量分数)优选为0.1～20％，更优选为0.5～10％，又更优选为1～8％。
在一些实施方案中，明胶浓度会影响PLGA/明胶复合微球上明胶的量，从而进一步影响细胞黏附。
在一些具体的实施方案中，为了促进明胶与活化的PLGA基础微球之间的反应，明胶水溶液的pH优选地在碱性范围内，更优选地在7.5～10的范围内，又更优选地在8.0～9.0的范围内。对于调节明胶水溶液的pH的方法没有特别限制，只要不损害本发明的技术效果即可。在一些特别优选的实施方案中，可以采用向明胶水溶液中添加碱性试剂的水溶液的方法。在此情况下，碱性试剂的具体实例包括而不限于氢氧化钾、氢氧化钠、氨水等。
从更好地获得本发明的复合微球和提高生产效率的观点，明胶与活化的PLGA基础微球之间的反应时间优选为1～24h，更优选为4～18h，又更优选为6～12h；反应温度优选为20～50℃，更优选为33～37℃。进一步，本发明的明胶与活化的PLGA基础微球之间的反应优选在搅拌下进行，搅拌速度优选为100～600rpm，更优选为120～300rpm，又更优选为150～250rpm。
在反应结束之后，收集，洗涤和干燥PLGA/明胶复合微球。
本发明中，对于PLGA/明胶复合微球的收集方法没有特别限制，例如，可以采用透析法、过滤法或离心法等本领域常用的收集方法以将PLGA/明胶复合微球与液相分离。
本发明中，经过收集和分离得到的PLGA/明胶复合微球需要进行洗涤，以进一步除去如未反应的明胶等各种残留成分。洗涤优选使用水洗，并且可以根据需要选择水洗-收集分离的过程的重复次数。
在洗涤和收集PLGA/明胶复合微球之后，可以采用本领域公知的各种干燥方法来干燥PLGA/明胶复合微球。为了更好地实现本发明的技术效果，优选采用冷冻干燥法。
<聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球(PLGA/明胶复合微球)的应用>
本发明的PLGA/明胶复合微球特别适用于培养细胞的用途。因此，本发明的培养细胞的方法使用上述PLGA/明胶复合微球作为微载体来培养细胞。本发明的PLGA/明胶复合微球可以用于如平面孔板静态培养细胞等二维培养细胞，也可以用于如在摇瓶、生物反应器中进行的三维动态培养细胞。
另外，在细胞培养的应用中，细胞优选为贴壁性细胞，其具体包括但不限于：293、HEK293、HEK-293T、293T、293TN、293FT、AAV-293、HUVEC、ECV-304、L929、WB-F344、L-02、THP-1、D407、CHO、间充质干细胞、胚胎干细胞、IPS细胞等包括一切能用于贴壁培养或/和经过诱导或驯化的贴壁细胞。
本发明的PLGA/明胶复合微球可以有效地使细胞黏附、伸展、增殖。在一些实施方案中，采用本发明的复合微球为微载体，经过一定时间(如7天)培养后，细胞数量较接种量增长24倍。在一些实施方案中，采用本发明的复合微球为微载体，经过一定时间(如7天)培养后，细胞密度达1.0×103个/mL～1.0×106个/mL。
实施例
以下通过实施例的方式更具体地说明本发明。然而，可以理解的是，本发明不限于这些实施例。以下实施例中的“％”是指“质量％”，除非另有说明。
PLGA基础微球的制备
实施例1
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝50:50，Mw 30000～50000，羧基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.2mL磷酸缓冲溶液(PBS)，13000rpm匀质30s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌8h)，得到乳液二，致孔剂PBS溶于水中，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。根据SEM图计算，PLGA基础微球粒径基本分布在200±100μm。“A±Bμm”的表达形式意味着，SEM图中的微球的粒径主要为A μm，但SEM图中不可避免地存具有在(A-B)μm～(A+B)μm的范围内的除了粒径A μm以外的其它粒径的微球。
实施例2
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 30000～50000，羧基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.2mL PBS，涡旋，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。根据SEM图计算，PLGA基础微球粒径约280±60μm。
实施例3
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.2mL PBS，涡旋，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。根据SEM图计算，PLGA基础微球粒径约220±60μm。
实施例4
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 30000～50000，羧基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.2mL 0.5％PVA溶液及0.66mL 0.1％明胶溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例5
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝85:15，Mw 40000～60000，羧基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.2mL 1％明胶溶液，涡旋，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌10h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例6
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝65:35，Mw 30000～50000，羧基封端)溶解于1mL乙酸乙酯及1mL苯甲醇中，加入0.2mL 1％明胶溶液，涡旋，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到1％的PVA水溶液中(搅拌速度为250rpm，搅拌12h)，得到乳液二，挥发除去乙酸乙酯和苯甲醇。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例7
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 70000～110000，羧基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.4mL 10％明胶溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌12h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例8
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.4mL 10％明胶与5％碳酸氢钠的混合溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例9
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.4mL 10％明胶与5％碳酸氢钠的混合溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例10
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于4mL二氯甲烷中，加入0.4mL 10％明胶与5％碳酸氢铵的混合溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例11
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于4mL二氯甲烷中，加入0.4mL 10％明胶与5％碳酸氢钠的混合溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例12
将0.1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝75:25，Mw 66000～105000，酯基封端)溶解于2mL二氯甲烷中，加入0.1mL 10％明胶与0.266mL乙醇的混合溶液，13000rpm匀质60s，得到乳液一。将乳液一在搅拌的条件下，在液面以下注射到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌6～8h)，得到乳液二，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm，时间5min)，从而得到PLGA基础微球。
实施例13
将1g PLGA(乳酸:羟基乙酸＝50:50，Mw 30000～50000，羧基封端)溶解于20mL二氯甲烷中，加入10mL无水乙醇，13000rpm匀质60s，得到溶液一。用将溶液一在搅拌的条件下，在液面以下打入到0.5％的PVA水溶液中(搅拌速度为200rpm，搅拌12h)，得到乳液，乙醇溶于聚乙烯醇水溶液中，挥发除去二氯甲烷。离心收集PLGA基础微球，二次水离心洗涤三次(转速3000rpm)，时间5min。根据SEM图计算，PLGA基础微球粒径约130μm。
PLGA基础微球与明胶的反应
实施例14
将实施例3中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将20mL4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。根据SEM图计算，PLGA/明胶复合微球粒径约260μm。
实施例15
将实施例2中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基20min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将40mL4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。根据SEM图计算，PLGA/明胶复合微球粒径约290μm。
实施例16
将实施例11中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将35mL4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。经BCA法测量，在所得的复合微球中，明胶的含量约占微球总质量的1.1％。根据SEM图计算，PLGA/明胶复合微球直径约为300μm。
实施例17
将实施例11中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将35mL0.1％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。在所得的复合微球中，明胶的质量明胶的含量占微球总质量的0.001％～0.01％。PLGA/明胶复合微球直径约为125±25μm。
实施例18
将实施例11中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将35mL10％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。在所得的复合微球中，明胶的质量明胶的含量占微球总质量的4.1％。
实施例19
将实施例12中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将40mL4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，250rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。在所得的复合微球中，明胶的质量明胶的含量占微球总质量的1.1％。PLGA/明胶复合微球直径约为125±25μm。
实施例20
将实施例7中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基20min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将40mL4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，250rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/明胶复合微球。在所得的复合微球中，明胶的质量明胶的含量占微球总质量的1.1％。PLGA/明胶复合微球直径约为125±25μm。
实施例21
将实施例1～13中制备的PLGA基础微球分别浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将45mL 4％明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥后收集，得到PLGA/明胶复合微球。经BCA法测量，明胶在PLGA/明胶复合微球中所占质量约0.5％～4.5％。
实施例22
将实施例7中的PLGA基础微球浸泡在8mM EDC，2.66mM NHS水溶液中，200rpm的脱色摇床活化羧基15min。二次水洗涤3次，离心得到活化的PLGA基础微球。用NaOH溶液将40mL4％Cy5修饰的明胶溶液的pH调至8.0～9.0从而得到碱性明胶溶液，然后加入到活化的PLGA基础微球中，200rpm，35℃摇床中过夜，次日二次水反复离心洗涤，冷冻干燥，得到PLGA/Cy5修饰的明胶复合微球。
荧光显微镜拍摄微球观察明胶分布，如图9中示出。通过图9C可以看出，Cy5修饰的明胶在微球上分布均匀，遍布整个微球。
复合微球应用
实施例23
将实施例12、实施例19制备的微球各称取0.1g灭菌后，用PBS充分漂洗，置于细胞培养转瓶中，加入50mL干细胞培养基，放入细胞培养箱中预培，转速设为40～45rpm，使得微球能在转瓶中均匀悬浮。预培24h后接种细胞，细胞接种量为1×105个细胞，每搅拌5min，静置30min，6个循环后，始终保持在悬浮状态培养，并观察比较第7天细胞粘附及增殖情况。
通过图10A、10B可以看出，PLGA/明胶复合微球远好于PLGA基础微球的细胞粘附效果，从图10C的细胞计数结果来看，PLGA/明胶复合微球组的细胞在7天内较之接种量增长了24倍(细胞数为2.4×106个)，而PLGA基础微球组的细胞在7天内仅增长了4倍。
实施例24
将实施例16、实施例17制备的微球各称取0.1g灭菌后，用PBS充分漂洗，置于细胞培养转瓶中，加入50mL干细胞培养基，放入细胞培养箱中预培，转速设为40～45rpm，使得微球能在转瓶中均匀悬浮。预培24h后接种细胞，细胞接种量为1×105个细胞，每搅拌5min，静置30min，6个循环后，始终保持在悬浮状态培养，并观察比较第3天细胞粘附及增殖情况。
如图11中所示，通过比较图11中的A和B可以看出，实施例16制备的PLGA/明胶复合微球上细胞量高于实施例17制备的微球。
实施例25
将实施例14～21中制备的PLGA/明胶复合微球称取0.1g灭菌后，用PBS充分漂洗，置于细胞培养转瓶中，加入50mL干细胞培养基，放入细胞培养箱中预培，转速设为40～45rpm，使得微球能在转瓶中均匀悬浮。预培24h后接种细胞，细胞接种量为1×105个细胞，每搅拌5min，静置30min，6个循环后，始终保持在悬浮状态培养，并观察细胞粘附及增殖情况。
实施例26
取一部分实施例25中培养细胞的微球(分别对应于实施例19和实施例20的复合微球)置于48孔板中，弃培养基，用PBS清洗一遍后，加入FDA工作液(2μg/mL)避光染色15min，移除工作液，用PBS漂洗3遍，再加入PI工作液(5μg/mL)避光染色5min，用PBS漂洗3遍后，用倒置荧光显微镜分别拍摄微球上的死、活细胞以及明场状态下的细胞形态，如在图12(采用实施例19中的复合微球)和图13(采用实施例20中的复合微球)中示出。图12结果显示，干细胞在72小时内增殖明显；图13结果也显示出，相较于第1天，第4天的干细胞量明显增加。
实施例27
实施例25中细胞在PLGA/明胶复合微球(对应实施例19)上培养至第七天时，将细胞与微球培养悬液转移到离心管中，静止一段时间，待微球全部沉到底部后，移除培养基后用PBS清洗，加入2mL重组胰蛋白酶，放入细胞培养箱中消化10min，轻轻吹打后用70μm的滤网过滤出去微球，最终得到细胞悬液。
将如上得到的间充质干细胞悬液以1000rpm/min的转速离心5min，去掉上清液，再用PBS重悬，对收集到的细胞计数后，用声波聚焦流式细胞仪检测其表面标志物的表达率。如图14中所示，检测结果显示干细胞的CD73+和CD90+表达呈阳性，CD34+和CD45+表达呈阴性，证明干细胞依旧保持了其“干性”。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (18)
1.一种聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其特征在于，包括：
1)聚乳酸-羟基乙酸基础微球，
2)明胶；
其中所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的表面与所述明胶共价键结合；所述明胶的质量为复合微球的总质量的0.00001～10％。
2.根据权利要求1所述的聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸中的乳酸单元和羟基乙酸单元的摩尔比例为90:10～50:50。
3.根据权利要求1所述的聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球为直径为100～500μm的球状颗粒。
4.一种制备聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球的方法，其特征在于，包括：
1)将聚乳酸-羟基乙酸溶解于有机溶剂中，向其加入致孔剂并以动态方式形成乳液一或溶液一，后将所述乳液一或溶液一在液面以下加入到聚乙烯醇水溶液中并在搅拌下形成乳液二，待去除所述致孔剂和所述有机溶剂后，进而收集、洗涤，得到聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
2)在所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的表面上进行活化反应，形成可与明胶反应的活性基团，得到活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球；
3)将所述活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球与明胶水溶液混合并反应，经收集，洗涤和干燥获得所述聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球，
其中所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球的直径为100～500μm，其表面与所述明胶共价键结合，所述明胶的质量为复合微球的总质量的0.00001～10％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为选自二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正已烷、已烷、石油醚、苯、甲苯、四氢呋喃、二甲亚砜、苯甲醇中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸在所述有机溶剂中质量浓度为1～40％；所述聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇的质量浓度为0.1～5％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述致孔剂选自碳酸氢钠水溶液、碳酸氢铵水溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠水溶液、二次水、明胶水溶液、聚乙烯醇水溶液、泊洛沙姆水溶液、甲醇、乙醇、2-甲基戊烷、蔗糖水溶液中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述动态方式为均质、涡旋或超声。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述乳液一或溶液一在液面以下通过注射形式加入到聚乙烯醇水溶液。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化反应包括：
将所述聚乳酸-羟基乙酸基础微球浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液中进行活化，洗涤收集得到所述活化的聚乳酸-羟基乙酸基础微球。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述NHS和所述EDC的摩尔比(NHS:EDC)为1:10～10:1。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述活化的时间为1～120min。
13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述明胶水溶液中的明胶的浓度为0.1～20％，pH值为7.5～10。
14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述反应在搅拌下进行，反应时间为1～24h，反应温度为20～50℃。
15.一种培养细胞的方法，其特征在于，该方法以根据权利要求1所述的聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合微球为微载体培养细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞为贴壁性细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，经过7天培养后，细胞数量较接种量增长24倍。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，经过7天培养后，细胞数量密度达1.0×103个/mL～1.0×106个/mL。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US202062992287P | 2020-03-20 | 2020-03-20 | |
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|---|---|---|---|
| CN202010831794.1A Pending CN111925556A (zh) | 2020-03-20 | 2020-08-18 | 一种复合微球的制备方法及其应用 |
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| CN (1) | CN111925556A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114262508A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-01 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种可用于细胞悬浮培养的微球及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104707173A (zh) * | 2015-04-01 | 2015-06-17 | 中国人民解放军总医院 | 一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法 |
| US20150238534A1 (en) * | 2014-02-27 | 2015-08-27 | Gwo Xi Stem Cell Applied Technology Co., Ltd. | Novel hollow particles |
| US20170292109A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Sutapa Barua | Method of forming microparticles for use in cell seeding |
-
2020
- 2020-08-18 CN CN202010831794.1A patent/CN111925556A/zh active Pending
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