CN115920126A - 负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法。负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，包括：将聚羟基脂肪酸酯纯化，得到纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末；将纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末溶解在二氯甲烷中配置第一油相，配置致孔剂水溶液作为第一水相，将第一水相与第一油相混合，在均质机中进行乳化制备乳液；将所述乳液作为第二油相，将聚乙烯醇溶解在水中配置成二次乳化的第二水相，将第二油相溶液滴加进第二水相中进行二次乳化，搅拌即得到多孔表面粗糙的聚羟基脂肪酸酯微球；将制得的聚羟基脂肪酸酯微球重新分散于无菌水中，将该分散液与植物外泌体溶液等体积混合，离心后得到负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，特别是涉及一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法。
背景技术
生物可降解医用材料由于良好的生物相容性和可降解性能被广泛应用于外科手术缝合线、人造器官、药物缓释剂等各个医疗器械领域，其中生物可降解有机高分子由于具备原料来源广泛、可再生、良好的可加工性和良好的生物相容性而被广泛应用。
可注射软组织填充剂是针对皮肤皱纹和凹陷填充的微创疗法采用的填充剂，市场上出现的软组织填充剂主要有交联透明质酸钠凝胶、胶原蛋白、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、羟基磷灰石钙等。基于微球的可注射软组织填充剂产品的粒径应为20微米或更大才能避免体内巨噬细胞的吞噬以发挥长效作用，同时50微米或更大的微球在注射的过程中容易出现针管阻塞的情况不利于实际操作。
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类天然的高分子生物材料，是由微生物合成的细胞内聚酯，具有良好的生物相容性。其可以制成微球，通过针头进行注射用作软组织填充剂。
外泌体是细胞分泌的包含了复杂RNA和蛋白质的用于信息交换的微小囊泡，由于其性质稳定、易于反应、没有免疫原性、容易获取且变与改造等诸多优势，被广泛应用于药理活性物质，一些植物来源的外泌体在进入软组织后可以自动释放营养物质，持续改善细胞环境，修复皮肤问题。
基于外泌体的载药缓释微球及其制备方法(CN114432260A)公开了一种基于外泌体的载药缓释微球及其制备方法，通过将外泌体与聚合物溶解在有机溶剂后电喷雾制得负载外泌体的微球。然而常见的N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂均会破坏外泌体表面的磷脂结构，导致最终外泌体结构的破坏和内含物的提前释放。
外泌体微球混悬液及其制备方法(CN114921406A)公开了一种外泌体微球混悬液的制备方法，通过将外泌体与多糖混悬液混合后进行静电喷雾得到不同尺寸的颗粒状微球，然而壳聚糖等多糖在水中无法良好分散，因此制成后外泌体分布并不均一，同时静电喷雾也会一定程度上破坏外泌体的囊泡结构造成内含物的提前释放。
一种植物外泌体的纯化方法(CN114540271A)通过过将PEG8000沉淀与凝胶过滤层析联合，实现大规模和高纯度外泌体的分离纯化。制得的外泌体尺寸为纳米级，不适合直接用于皮肤注射。
综上所述，使用常规方法制得的微球不具备良好的可填充性，不利于软组织填充的应用。现有的聚合物微球包载外泌体均无法做到不破坏外泌体的结构，无论是使用聚合物水混悬液与外泌体混合还是使用聚合物的有机溶液与外泌体混合，均无法同时实现良好分散和保持外泌体结构的完整性。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球及其制备方法。
第一方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，包括：
将聚羟基脂肪酸酯纯化，得到纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末；
将纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末溶解在二氯甲烷中配置第一油相，配置致孔剂水溶液作为第一水相，将第一水相与第一油相混合，在均质机中进行乳化制备乳液；
将所述乳液作为第二油相，将聚乙烯醇溶解在水中配置成二次乳化的第二水相，在磁力搅拌下，将第二油相溶液滴加进第二水相中进行二次乳化，搅拌即得到多孔表面粗糙的聚羟基脂肪酸酯微球；
将制得的聚羟基脂肪酸酯微球经辐照灭菌后重新分散于无菌水中，将该分散液与植物外泌体溶液等体积混合，于摇床室温孵育，离心后得到负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球。
上述技术方案在一种实施方式中，所述聚羟基脂肪酸酯为PHB、或PHBV、或PHBV的同族聚合物或共聚物。
上述技术方案在一种实施方式中，所述将聚羟基脂肪酸酯纯化，包括：取聚羟基脂肪酸酯分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，再用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，之后干燥处理。
上述技术方案在一种实施方式中，所述致孔剂水溶液包括碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氨、碳酸锌、双氧水、白蛋白、环糊精中的一种或多种。
上述技术方案在一种实施方式中，所述植物外泌体为香圆外泌体或虎杖外泌体。
第二方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球，由上述任一项所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法制备而成。
第三方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，包括：将负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到注射溶剂中，搅拌待混合均匀后，灌装在预灌封注射器中，得到可注射的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制剂。
上述技术方案在一种实施方式中，所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
第四方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，包括：将负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到含冻干保护剂和注射溶剂的溶液中，搅拌待混合均匀后，灌装于西林瓶中，冷冻干燥后得到可注射负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球冻干粉。
上述技术方案在一种实施方式中，所述冻干保护剂包括甘露糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖中的一种或多种；
所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
相对于现有技术，本发明可以控制合成50μm左右的多孔聚羟基脂肪酸酯微球，其尺寸不至于过小而提前被巨噬细胞吞噬，或者过大在注射中阻塞针头，适用于可注射软组织填充剂。同时，聚羟基脂肪酸酯微球多孔粗糙的结构赋予其更大的比表面积，有利于外泌体的负载，该负载过程可以有效防止外泌体结构的破坏和其内容物的提前泄漏，实现良好分散性和保持外泌体结构的完整性，同时具有修复作用的植物外泌体在软组织填充过程中也有利于的组织修复。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是制备的PHBV微球的扫描电子显微镜照片(标尺6μm)。
图2是制备的负载香圆外泌体的PHBV微球的扫描电子显微镜照片(标尺6μm)。
图3是香园外泌体、PHBV空白微球及PHBV微球负载香园外泌体的zeta电位柱状图。
图4是制备的PHBV光滑微球的显微镜照片(标尺50μm)。
图5是对照组、PHBV空白微球及PHBV微球负载香园外泌体的细胞增殖率随时间变化柱状图。
图6是PHBV空白微球与PHBV微球负载香园外泌体的HSF细胞划痕修复实验图。
具体实施方式
在本说明书中提到或者可能提到的上、下、左、右、前、后、正面、背面、顶部、底部等方位用语是相对于其构造进行定义的，它们是相对的概念。因此，有可能会根据其所处不同位置、不同使用状态而进行相应地变化。所以，也不应当将这些或者其他的方位用语解释为限制性用语。
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明通过利用易获得的聚羟基脂肪酸酯，通过二次乳化的方法制备多孔的聚羟基脂肪酸酯微球，粗糙的表面和多孔的结构可以赋予该聚合物微球较大的比表面积，有利于进一步的外泌体吸附，通过微球与植物外泌体的共孵育即可实现外泌体的负载。
第一方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，包括：
S1.将聚羟基脂肪酸酯纯化，得到纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末。
可选地，所述聚羟基脂肪酸酯为PHB、或PHBV、或PHBV的同族聚合物或共聚物。
具体地，所述将聚羟基脂肪酸酯纯化，包括：取聚羟基脂肪酸酯分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，再用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，采用索氏抽提或过滤均可，之后干燥处理。
S2.将纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末溶解在二氯甲烷中配置第一油相，配置致孔剂水溶液作为第一水相，将第一水相与第一油相混合，在均质机中进行乳化制备乳液。
可选地，所述致孔剂水溶液包括碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氨、碳酸锌、双氧水、白蛋白、环糊精中的一种。
S3.将所述乳液作为第二油相，将聚乙烯醇溶解在水中配置成二次乳化的第二水相，在较慢速度的磁力搅拌下，将第二油相溶液滴加进第二水相中进行二次乳化，搅拌待有机溶剂完全挥发后，即得到多孔表面粗糙的聚羟基脂肪酸酯微球。
S4.将制得的聚羟基脂肪酸酯微球经辐照灭菌后重新分散于无菌水中，将该分散液与植物外泌体溶液等体积混合，于摇床室温孵育，离心后得到负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球。
可选地，所述植物外泌体为香圆外泌体或虎杖外泌体。包载的植物外泌体可以缓慢释放，在软组织填充过程中也有利于的组织修复。
实施例1
本实施例为基于香圆外泌体的PHBV多孔微球，其制备方法如下：
S01.取5g PHBV粉末(分子量40万)分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，再通过索氏抽提并干燥，得到纯化的PHBV粉末。
S02.称取200mg纯化后的PHBV粉末，加入8mL二氯甲烷待其溶解后，加入2.4mL5mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以10000rpm的速度均质3min得到初乳。
S03.将上述初乳滴入200mL 5mg/mL的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,Mw＝27000)水溶液，以400rpm搅拌4h，挥发除去二氯甲烷，2000rpm离心收集得到PHBV微球。
S04.将PHBV微球用去离子水清洗3遍后，重新分散于20mL无菌去离子水中，得到多孔的PHBV微球水分散液。取上述多孔PHBV微球水分散液1mL，加入香圆外泌体(蛋白含量0.6mg/mL)1mL，于摇床机械搅拌24h后，2000rpm离心，重新分散在无菌去离子水中，即得到负载香圆外泌体的PHBV微球。
实施例2
PHBV微球的微观形态观察和表面电荷测试。
取一定量实施例1中制备得到的PHBV微球和负载香圆外泌体的PHBV微球，置于粘有导电双面胶的样品板上，镀金后在扫描电子显微镜下观察，得到如图1、图2所示的微球形貌。
观察图片可知，实施例1中所制得的PHBV微球，形态规则，尺寸约50微米，表面粗糙，随机分布着大量孔洞。所制得的负载香圆外泌体的PHBV微球，保留了原多孔PHBV微球的微观形貌和尺寸。
取一定量的实施例1中制备得到的PHBV微球、负载香圆外泌体的PHBV微球与香圆外泌体的水分散液于激光粒度仪上测试其表面电荷，得到如图3所示的表面电荷，可以得出香圆外泌体与多孔PHBV微球的表面电荷均为负电，且负载了香圆外泌体的多孔PHBV微球相对未负载香圆外泌体的PHBV微球表面电荷稍高，可以证明香圆外泌体在多孔PHBV微球表面的成功负载。
由以上分析可以进一步得出，本发明可以控制合成50μm左右的多孔聚羟基脂肪酸酯微球，其尺寸不至于过小而提前被巨噬细胞吞噬，或者过大在注射中阻塞针头，适用于可注射软组织填充剂。同时，聚羟基脂肪酸酯微球多孔粗糙的结构赋予其更大的比表面积，有利于外泌体的负载，该负载过程可以有效防止外泌体结构的破坏和其内容物的提前泄漏，实现良好分散性和保持外泌体结构的完整性，同时具有修复作用的植物外泌体在软组织填充过程中也有利于的组织修复。
实施例3
负载香圆外泌体的PHBV多孔微球生物功效验证。
选用人源皮肤成纤维细胞L929，按照100微升，密度为1×105个/毫升的细胞悬液铺96孔板，待细胞贴壁12小时后，吸出培养液，加入用细胞培养液分散的实施例1中制备的PHBV微球、负载香圆外泌体的PHBV微球及对照组(微球浓度为50微克/毫升)，抚育不同时间并采用MTT法测得其细胞增殖率。如图5所示，负载香圆外泌体的PHBV微球与对照组及空白PHBV微球组相比，随着时间的变化，细胞增殖率更高，说明负载香圆外泌体的PHBV微球不仅具有良好的安全性，还具有促进细胞增殖的效果。
将人皮肤成纤维细胞以2*105个/毫升的细胞密度接种于6孔板中，在培养箱中培养24h；用枪头笔直地划一条横线，用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清培养基；分别设立空白对照组和测试组，(浓度)，放入37℃，5％CO2培养箱，进行培养，并在不同时间点观察拍照。结果如图6所示，负载香圆外泌体的PHBV微球与空白PHBV微球组相比，划痕修复效果更为显著，进一步说明负载香圆外泌体的PHBV微球具有良好的促细胞修复性能。实施例4
本实施例为基于虎杖外泌体的PHBV多孔微球，其制备方法同实施例1，主要区别在于选用的外泌体为虎杖外泌体，具体如下：
S001.取5g PHBV粉末(分子量40万)分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，再通过索氏抽提并干燥，得到纯化的PHBV粉末。
S002.称取200mg纯化后的PHBV粉末，加入8mL二氯甲烷，待其溶解后，加入2.4mL5mg/mL碳酸氢铵的水溶液，用均质机以10000rpm的速度均质3分钟得到初乳。
S003.将上述初乳滴入200mL 5mg/mL的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,Mw＝27000)水溶液，以400rpm搅拌4h，挥发除去二氯甲烷，2000rpm离心收集得到PHBV微球。
S004.将PHBV微球用去离子水清洗3遍后，重新分散于20mL无菌去离子水中，得到多孔的PHBV微球水分散液。取上述多孔PHBV微球水分散液1mL，加入虎杖外泌体(蛋白含量0.4mg/mL)1mL，于摇床机械搅拌24h后，2000rpm离心，重新分散在无菌去离子水中，即得到负载虎杖外泌体的PHBV微球。
实施例5
本实施例为基于香圆外泌体的PHBVHHX多孔微球，其制备方法同实施例1，主要区别在于选用的微球聚合物为PHBVHHX，具体如下：
S0001.取5g PHBVHHX粉末(分子量50万)分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，再通过索氏抽提并干燥，得到纯化的PHBVHHX粉末。
S0002.称取200mg纯化后的PHBVHHX粉末加入8mL二氯甲烷待其溶解后，加入2.4mL5mg/mL碳酸氢铵的水溶液,用均质机以10000rpm的速度均质3分钟得到初乳。
S0003.将上述初乳滴入200mL 5mg/mL的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,Mw＝27000)水溶液，以400rpm搅拌4h，挥发除去二氯甲烷，2000rpm离心收集微球得到PHBVHHX微球
S0004.用去离子水清洗3遍后，重新分散于20mL无菌去离子水中，得到多孔的PHBVHHX微球水分散液。取上述多孔PHBVHHX微球水分散液1mL，加入香圆外泌体(蛋白含量0.6mg/mL)1mL，于摇床机械搅拌24h后，2000rpm离心，重新分散在无菌去离子水中，得到负载香圆外泌体的PHBVHHX微球。
实施例6
本实施例为基于香圆外泌体的PHBV多孔微球，其制备方法同实施例1，主要区别在于选用的致孔剂为过氧化氢，具体如下：
S00001.取5g PHBV粉末(分子量40万)分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质,用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，再通过索氏抽提并干燥，得到纯化的PHBV粉末。
S00002.称取200mg纯化后的PHBV粉末加入8mL二氯甲烷待其溶解后，加入2.4mL1％的过氧化氢溶液，用均质机以10000rpm的速度均质3分钟得到初乳。
S00003.将上述初乳滴入200mL 5mg/mL的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,Mw＝27000)水溶液，以400rpm搅拌4h，挥发除去二氯甲烷，2000rpm离心得到PHBV微球。
S00004.用去离子水清洗3遍后，重新分散于20mL无菌去离子水中，得到多孔的PHBV微球水分散液。取上述多孔PHBV微球水分散液1mL，加入香圆外泌体(蛋白含量0.6mg/mL)1mL，于摇床机械搅拌24h后，2000rpm离心，重新分散在无菌去离子水中，即得到负载香圆外泌体的PHBV微球。
对比例1
本对比例为PHBV的光滑微球，其制备方法如下：
步骤1.取5g PHBV粉末(分子量40万)分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，再通过索氏抽提并干燥得到可溶解于二氯甲烷的纯化PHBV粉末。
步骤2.称取200mg纯化后的PHBV粉末加入8mL二氯甲烷待其溶解后，滴入200mL5mg/mL的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,Mw＝27000)水溶液，以400rpm搅拌4h，挥发除去二氯甲烷，2000rpm离心收集微球，用去离子水清洗3遍后，重新分散于20mL无菌去离子水中，得到PHBV的光滑微球。
对比例2
PHBV的光滑微球的形态观察
取一定量对比例1中制备得到的PHBV的光滑微球，置于载玻片中，在光学显微镜下观察，得到如图4所示的微球形貌。
对比例1中所制得的PHBV光滑微球，形态规则，尺寸约50微米，表面光滑。与实施例1(图1)相比，表面光滑无空隙，具有较小的比表面积且不存在孔洞不利于植物外泌体的进一步包载。
第二方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球，由上述负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法制备而成。
第三方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，包括：将负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到注射溶剂中，搅拌待混合均匀后，灌装在预灌封注射器中，全程需无菌操作，得到可注射的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制剂。
可选地，所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
实施例7
本实施例为基于实施例4中负载虎杖外泌体的PHBV多孔微球的可注射制剂，其制备方法如下：
将实施例4中制得的1g负载虎杖外泌体的PHBV微球加入到20mL 2％透明质酸溶液中，300rpm搅拌6h，待混合均匀后，灌装在预灌封注射器中，即得到可注射的负载虎杖外泌体的PHBV多孔微球制剂。
第四方面，一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，包括：将负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到含冻干保护剂和注射溶剂的溶液中，以300rpm搅拌6h，待混合均匀后，灌装于西林瓶中，全程需无菌操作，冷冻干燥后得到可注射负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球冻干粉。
可选地，所述冻干保护剂包括甘露糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖中的一种或多种。
可选地，所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
实施例8
本实施例为基于实施例1中负载香圆外泌体的PHBV多孔微球的可注射冻干粉，其制备方法如下：
将实施例1中制得的1g负载香圆外泌体的PHBV微球加入到20mL含5％甘露糖和2％透明质酸的溶液中，300rpm搅拌6h，待混合均匀后，灌装于西林瓶中，冷冻干燥后得到可注射负载香圆外泌体的多孔PHBV微球冻干粉。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，包括：
将聚羟基脂肪酸酯纯化，得到纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末；
将纯化后的聚羟基脂肪酸酯粉末溶解在二氯甲烷中配置第一油相，配置致孔剂水溶液作为第一水相，将第一水相与第一油相混合，在均质机中进行乳化制备乳液；
将所述乳液作为第二油相，将聚乙烯醇溶解在水中配置成二次乳化的第二水相，在磁力搅拌下，将第二油相溶液滴加进第二水相中进行二次乳化，搅拌即得到多孔表面粗糙的聚羟基脂肪酸酯微球；
将制得的聚羟基脂肪酸酯微球经辐照灭菌后重新分散于无菌水中，将该分散液与植物外泌体溶液等体积混合，于摇床室温孵育，离心后得到负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球。
2.根据权利要求1所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述聚羟基脂肪酸酯为PHB、或PHBV、或PHBV的同族聚合物或共聚物。
3.根据权利要求1所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述将聚羟基脂肪酸酯纯化，包括：取聚羟基脂肪酸酯分别用去离子水和乙醇洗去聚合物中的水溶性杂质和醇溶性杂质，再用二氯甲烷溶解取得澄清的溶液，之后干燥处理。
4.根据权利要求1所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述致孔剂水溶液包括碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氨、碳酸锌、双氧水、白蛋白、环糊精中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述植物外泌体为香圆外泌体或虎杖外泌体。
6.一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法制备而成。
7.一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，其特征在于，包括：将权利要求6所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到注射溶剂中，搅拌待混合均匀后，灌装在预灌封注射器中，得到可注射的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制剂。
8.根据权利要求7所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
9.一种负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球的应用，其特征在于，包括：将权利要求6所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球加入到含冻干保护剂和注射溶剂的溶液中，搅拌待混合均匀后，灌装于西林瓶中，冷冻干燥后得到可注射负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球冻干粉。
10.根据权利要求9所述的负载植物外泌体的聚羟基脂肪酸酯微球制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括甘露糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖中的一种或多种；
所述注射溶剂包括透明质酸溶液、或羧甲基纤维素钠溶液、或海藻酸钠溶液、或胶原蛋白溶液。
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