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CN111893171A - 利用不同检测温度的靶核酸序列检测 - Google Patents

利用不同检测温度的靶核酸序列检测 Download PDF

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CN111893171A
CN111893171A CN202010806475.5A CN202010806475A CN111893171A CN 111893171 A CN111893171 A CN 111893171A CN 202010806475 A CN202010806475 A CN 202010806475A CN 111893171 A CN111893171 A CN 111893171A
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target nucleic
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Abstract

本发明涉及利用不同检测温度的靶核酸序列检测。在利用不同检测温度的本发明中，在1个反应容器中仅用单一类型的标记以现有的实施方式也可检测多个靶核酸序列。在现有技术中，在靶扩增后通过解链分析检测多个靶核酸序列。与此不同地，本发明在靶扩增后无需进行解链分析，从而显著缩短分析时间。

Description

利用不同检测温度的靶核酸序列检测
本申请是申请日为2014年12月9日、发明名称为“利用不同检测温度的靶核酸序列检测”的中国发明专利申请No.201480077317.3的分案申请。
技术领域
本发明涉及利用不同检测温度的靶核酸序列检测。
背景技术
为了检测靶核酸序列，广泛利用以实时方式一边监控靶扩增，一边可检测靶核酸序列的实时检测方法。通常，在实时检测方法中利用与靶核酸序列特异性杂交的已标记的探针或引物。作为利用已标记的探针及靶核酸序列之间的杂交的方法的例，包括利用具有发夹结构的双重标记的探针的分子信标(Molecular beacon)方法(Tyagi等，NatureBiotechnology v.14 MARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJ等，Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001)、利用2个分别标记成供体(donor)及受体(acceptor)的2个探针的杂交探针方法(Bernad等，147-148 Clin Chem 2000；46)及利用单一标记的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本技术领域中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)利用借助双重标记的探针和脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探针的切割。
作为利用标记的引物的方法的例，包括日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko等，2516-2521 Nucleic Acids Research,1997,v.25 no.12及美国专利第6117635号)及蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombe等，804-807,Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999及美国专利第6326145号)及TSG引物方法(WO 2011-078441)。
作为代替接近法，提出利用以依赖于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚物的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、美国专利第6358691号及美国专利第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage and extension；PTOCE)方法(WO 2012/096523)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling OligonucleotideHybridization；PCE-SH)方法(WO 2013/115442)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization；PCE-NH)方法(PCT/KR2013/012312)。
如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相相关或无关的信号扩增过程中，在1个所选择的检测温度下检测从荧光标记产生的信号。根据现有实时检测技术，在一个反应管中利用单一类型的标记来检测多个靶核酸序列时，互不区别针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标记。在利用单一类型的标记的情况下，利用Tm差异的解链分析可检测多个靶核酸序列，但是，解链分析具有如下缺点：解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探针的设计变得越来越难。
因此，若开发不依赖于解链分析且在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，若结合上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)，则能够以效率大大提高的方式在1个反应容器中利用单一类型的标记检测多个靶核酸序列。
在本说明书全文中，参照了多篇专利及文献，并用括号表示了其引用。为了更加明确地说明本发明及本发明所属技术领域的水平，这种专利及文献的公开内容全插入于本说明书作为参照。
发明内容
本发明人为了开发在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的新方法而进行了努力研究。研究结果，本发明人在调节的检测温度下获得针对靶核酸序列的信号后，通过合适地分析检测结果确认到能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。
因此，本发明的目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法及试剂盒。
本发明的再一目的在于，提供利用不同检测温度来对试样内核酸序列的核苷酸多态性(SNP)基因型进行分析的方法及试剂盒。
本发明的还一目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供利用不同检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。
本发明的又一目的在于，提供利用检测温度分析及解链分析检测至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。
本发明的又一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法。
本发明的又一目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置。
本发明的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质。
本发明的又一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于利用不同检测温度确定试样内3个靶核酸序列的存在的方法。
与所附的发明要求保护范围及附图一同，通过以下详细说明可使本发明的其他目的及优点更加明确。
附图说明
图1a为示出为了检测具有相对较高检测温度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原体(CT，Chlamydia trachomatis)的基因组脱氧核糖核酸)、具有相对较低检测温度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌(NG，Neisseria gonorrhoeae)基因组脱氧核糖核酸)及它们的组合而利用不同检测温度的本发明的检测结果的图。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应(PCR)方法产生针对上述沙眼衣原体及淋球菌的信号。
图1b为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。
图1c为示出通过对相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率进行浮动来确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。
图1d及图1e为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的差异确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图，将上述相对较高检测温度下的信号变形成阈值且用于获得上述差异。
图2a为示出为了检测具有相对较高检测温度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸)、具有相对较低检测温度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸)及它们的组合而利用不同检测温度的本发明的检测结果的图。通过TaqMan实时聚合酶链式反应方法产生针对上述沙眼衣原体的信号，通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法产生针对上述淋球菌的信号。
图2b为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。
图2c为示出通过对相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率进行浮动来确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。
图2d及图2e为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的差异确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图，将上述相对较高检测温度下的信号变形成阈值且用于获得上述差异。
图3为示出根据利用不同检测温度的实时聚合酶链式反应及解链分析的针对具有相对较高检测温度(72℃)的的靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸)、具有相对较低检测温度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸)及它们的组合的检测结果的图，通过TaqMan实时聚合酶链式反应方法产生针对上述沙眼衣原体的信号，通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法产生针对上述淋球菌的信号。
图4a为示出以实时方式利用不同检测温度的本发明的核苷酸多态性基因型分析结果的图。作为模板(靶序列)使用亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸。并且检测到野生型纯合子(CC)、突变型纯合子(TT)及杂合子(CT)。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法产生所有信号。
图4b为示出利用相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率的核苷酸多态性基因型分析的图。
图5a至图5c为示出为了检测3个靶序列(淋球菌的基因组脱氧核糖核酸)的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸及生殖支原体(MG，Mycoplasmagenitalium)的基因组脱氧核糖核酸)而利用不同检测温度的本发明的检测结果的图。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法产生针对上述沙眼衣原体及淋球菌的信号。考虑信号发生机构，作为对生殖支原体的信号检测温度选择“95℃”，作为对沙眼衣原体的信号检测温度选择“72℃”，作为对淋球菌的信号检测温度选择“60℃”
图5d为示出为了确定沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的存在而在95℃及72℃的温度下利用端点的相对荧光单位(RFU)值来计算的End-△RFU的图。
图5e为示出为了确定淋球菌基因组脱氧核糖核酸的存在而在72℃及60℃的温度下利用端点的RFU值来计算的End-△RFU的图。
具体实施方式
本发明的最大的特征是在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。在利用不同检测温度的本发明中，在1个反应容器中用单一类型的标记的情况下也可检测多个靶核酸序列。根据本发明的特征选择本发明的结构，并成为用于检测靶核酸序列的惊人的工艺。
在现有的实时聚合酶链式反应方法中，为了检测2个靶核酸序列而需要2种类型的荧光标记或解链分析。
本发明可实现在1个反应容器中利用单一类型的荧光标记来检测2个靶核酸序列的实时聚合酶链式反应方案。择一性地，本发明利用实时聚合酶链式反应检测2个靶核酸序列中的一个序列，而且利用解链分析检测2个靶核酸序列中的另一个序列，从而可检测2个靶核酸序列。
本发明利用可根据针对靶核酸序列的信号-产生机构、借助温度调节信号检测的本发明人的研究结果。
例如，当为了检测第一靶核酸序列而使用基于靶核酸序列和探针的杂交的信号-产生机构时，在探针与第一靶核酸序列杂交的温度下可产生表示第一靶核酸序列存在的信号，从而可检测出。与此相反地，在探针与第一靶核酸序列不进行杂交的温度下不产生信号，从而无法检测出。在这种观点中可知，根据信号-产生机构存在产生信号的温度和无法产生信号的温度。
在这种信号-产生机构中，可将探针和第一靶核酸序列杂交的温度作为针对第一靶核酸序列的检测温度使用。并且无法将探针和第一靶核酸序列未杂交的温度作为检测温度使用。
并且，为了检测第二靶核酸序列，当使用杂交探针时，可根据存在产生信号的温度范围和无法产生信号的温度范围的事实来确定第二靶核酸序列的检测温度。
当为了检测第二靶核酸序列而使用的探针的Tm值小于用于检测第一靶核酸序列的探针的Tm值时，可在未产生针对第二靶核酸序列的信号的相对更高的温度下检测针对第一靶核酸序列的信号。即，在针对2个靶核酸序列的2个信号-产生机构之间产生信号，并且在所检测出的温度上存在差异。
当上述2个靶核酸序列共存于试样内时，存在产生针对第一靶核酸序列的信号且无法产生针对第二靶核酸序列的信号的温度范围。另一方面，在低于上述温度范围的温度范围下产生针对上述2个靶核酸序列的信号。
可根据2个温度范围确定针对各个靶核酸序列的检测温度。可从前者的温度范围选择相对较高检测温度，上述相对较高检测温度被分配于第一靶核酸序列。可从后者的温度范围选择相对较低检测温度，上述相对较低检测温度被分配于第二靶核酸。
根据本发明，为了确定第一靶核酸序列的存在而测定相对较高检测温度下的信号。根据本发明，上述相对较高检测温度下的检测可确定第一靶核酸序列的存在。
本发明的重要的技术特征如下：为了确定具有相对较低检测温度的第二靶核酸序列的存在而均利用相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号来确认在相对较低检测温度下检测出的信号。
择一性地，本发明人可通过利用不同检测温度在相对较高检测温度下检测第一靶核酸序列，并且可通过利用作为另一信号产生接近法的解链分析来检测第二靶核酸序列。在实时检测过程期间，为了解链分析而使用的信号-产生机构可在特定温度下提供信号。因此，即使在通过解链分析检测出2个靶核酸序列中的一个序列的情况下，2个靶核酸序列也需要具有互不相同的检测温度。
本发明可实现为如下的多种实施方式：
(a)利用不同检测温度的试样内2个靶核酸序列的检测；
(b)利用不同检测温度的试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型分析；
(c)利用不同检测温度的试样内至少3个靶核酸序列的检测；
(d)利用不同检测温度及解链分析的试样内2个靶核酸序列的检测；以及
(e)利用检测温度分析及解链分析的试样内至少3个靶核酸序列的检测。
I.利用不同检测温度的试样内2个靶核酸序列的检测
在本发明的一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，包括：步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的信号-产生机构(signal-generating means)一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较高检测温度(relatively highdetection temperature)，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度(relatively low detection temperature)，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均进行上述检测；以及步骤(b)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定2个靶核酸序列的存在；(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在上述相对较高检测温度检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
根据利用扩增曲线的现有的实时聚合酶链式反应方法，使用提供不被区别的相同信号的信号-产生机构来区别多个靶核酸序列，从而无法进行检测，这是本发明所属技术领域的普通常识。
本发明克服与本技术领域的普通常识相关的局限，提供以大大提高的方式检测靶核酸序列的未期待的结果。
按各个步骤如下的详细说明本发明。
步骤(a)：与信号-产生机构的培养以及检测信号
首先，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的信号-产生机构一同培养所要分析的试样后，利用单一类型的检测器检测所产生的信号。由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别。
本发明为了产生针对靶核酸序列的信号而利用信号-产生机构。借助相应的信号-产生机构检测各个靶核酸序列。在本说明书中所使用的术语“信号-产生机构(signal-generating means)”意味着在产生用于表示靶核酸序列存在的信号的过程中所使用的任何物质(any material)，例如，其包括寡核苷酸、标记及酶。择一性地，在本说明书中所使用的术语“信号-产生机构”意味着利用用于产生信号的物质的任何方法(any method)。
根据本发明的一实例，培养是在借助上述信号-产生机构可产生信号的条件下进行的。这种条件包括溶液的温度、盐浓度及pH。
作为信号-产生机构使用的寡核苷酸的例包括与靶核酸序列特异性杂交的寡核苷酸(例如，探针及引物)，当与靶核酸序列杂交的探针或引物被切割而放出片段时，作为上述信号-产生机构使用的寡核苷酸包含与上述片段特异性杂交的捕捉寡核苷酸(captureoligonucleotide)，当与上述捕捉寡核苷酸杂交的片段延伸而形成延伸链时，作为上述信号-产生机构使用的寡核苷酸包含与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸，作为上述信号-产生机构使用的寡核苷酸包含与上述捕捉寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，作为上述信号-产生机构使用的寡核苷酸包含它们的组合。
即使信号产生原理相同，也可将包含不同序列的寡核苷酸的信号发生机构视为互不相同的。
上述标记可与寡核苷酸相连接或者以自由形态(free form)存在。在延伸反应期间上述标记可插入于延伸产物(extended products)。
在信号产生的过程中使用上述寡核苷酸的切割时，作为上述酶的例包括5’-核酸酶、3’-核酸酶、尤其包括具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶、具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶或FEN核酸酶。
在本发明中，可利用上述的多种物质以多种方式产生信号。
根据一实例，在2个信号-产生机构中的至少1个为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，上述二聚物包含双链靶核酸序列。
在本说明说中，与信号-产生机构一同使用的表达“以依赖于二聚物形成的方式产生信号”意味着以依赖于2个核酸分子的结合(association)或解离(dissociation)的方式提供被检测出的信号。上述表达包括根据以依赖于靶核酸序列存在的方式形成的二聚物(例如，包含标记的检测寡核苷酸及核酸序列)提供信号。并且，上述表达包括通过抑制二聚物(例如，具有标记的检测寡核苷酸及核酸序列)的杂交来提供信号，上述抑制随着其他二聚物的形成产生。
尤其，通过与靶核酸序列及上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚物的形成产生上述信号。
在本说明书中所使用的术语“检测寡核苷酸(detection oligonucleotide)”是参与产生被检测的信号的寡核苷酸。根据本发明的一实例，上述检测寡核苷酸包含参与产生实质信号的寡核苷酸。例如，其他寡核苷酸(例如，包含与靶核酸序列或检测寡核苷酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸)和检测寡核苷酸的杂交或非杂交确定信号产生。
根据本发明的一实例，上述检测寡核苷酸至少包含1个标记。
基于靶核酸序列及检测寡核苷酸之间的二聚物形成的信号可通过包括蝎形方法(Whitcombe等，Nature Biotechnology 17:804-807(1999))、日出(或Amplifluor)方法(Nazarenko等，Nucleic Acids Research,25(12):2516-2521(1997)及美国专利第6117635号)、LUX方法(美国专利第7537886号)、叩诊槌(Plexor)方法(Sherrill CB等，Journal ofthe American Chemical Society，126:4550-4556(2004))、分子信标方法(Tyagi等，Nature Biotechnology v.14MARCH 1996)、Hybeacon方法(French DJ等，Mol.CellProbes,15(6):363-374(2001))、相邻的杂交探针方法(Bernard P.S.等，Anal.Biochem.,273:221(1999))及LNA方法(美国专利第6977295号)的多种方法产生。
尤其，通过以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸(mediationoligonucleotide)的切割的方式形成的二聚物产生上述信号。
在本说明书中所使用的术语“介导寡核苷酸”为介导形成不包含靶核酸序列的二聚物的寡核苷酸。
根据本发明的一实例，上述介导寡核苷酸的切割本身不产生信号，在进行介导寡核苷酸的杂交及切割之后，通过上述切割形成的片段参与用于产生信号的连续反应。
根据一实例，上述介导寡核苷酸的杂交或切割本身不产生信号。
根据本发明的一实例，上述介导寡核苷酸以与靶核酸序列杂交或被切割的方式放出片段，从而包含介导二聚物生成的寡核苷酸。尤其，上述片段在捕捉寡核苷酸中介导基于上述片段的延伸的二聚物的形成。
根据本发明的一实例，上述介导寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。
根据本发明的一实例，上述介导寡核苷酸的切割放出片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，并在上述捕捉寡核苷酸中延伸。
根据本发明的一实例，与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，上述片段以延伸的方式形成延伸链，这导致形成上述延伸链及捕捉寡核苷酸之间的延伸二聚物，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与上述延伸链互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，上述第三寡核苷酸及延伸链的杂交通过形成其他类型的二聚物，来提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与上述捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，上述第三寡核苷酸及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚物形成受到上述延伸链及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚物形成的抑制，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，上述片段、上述延伸链、上述捕捉寡核苷酸、上述第三寡核苷酸或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
基于以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号可通过包括探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage and extension)方法(WO 2012/096523)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PTO Cleavage andExtension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)方法(WO2013/115442)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PTO Cleavage andExtension-Dependent Non-Hybridization)方法(PCT/KR2013/012312)的多种方法产生。
与在上述的参考文献中公开的术语相关地，与寡核苷酸的相应的例如下：介导寡核苷酸与探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide；PTO)相应，捕捉寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and Templating Oligonucleotide；CTO)相应，第三寡核苷酸分别与信号转导寡核苷酸(Signaling Oligonucleotide；SO)或杂交寡核苷酸(Hybridization Oligonucleotide；HO)相应。信号转导寡核苷酸、杂交寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、延伸链或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号包含以由以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物抑制其他二聚物的形成的方式提供的信号(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交)。
例如，当通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生基于以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号时，上述信号-产生机构包含：上游寡核苷酸；探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide；PTO)，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and TemplatingOligonucleotide；CTO)；以及模板-依赖性核酸聚合酶，具有5’-核酸酶活性。上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含捕捉部位(i)及模板化部位(ii)，上述捕捉部位(i)包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，上述模板化部位(ii)包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的产生信号的特定实施例包括如下步骤。
包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物及探测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，从上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应，通过使与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交的上述片段延伸来形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有可通过(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或、(ⅲ)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度调节的Tm值，上述延伸二聚物根据(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的至少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间插入于上述延伸二聚物内的标记、(ⅲ)在上述延伸反应期间插入于上述延伸二聚物内的标记和与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的至少1个标记或(ⅳ)插入标记(intercalating label)提供靶信号；步骤(e)，上述延伸二聚物在维持其双链形态的指定的温度下测定上述靶信号，由此检测上述延伸二聚物，上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。在这种情况下，在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在语句“在反复循环之间包括变性”中，术语“变性(denaturation)”意味着将双链核酸分子解离成单链核酸分子。
在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的步骤(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在这种情况下，在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在使与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸片段延伸而形成延伸链后，上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法可分类为检测上述延伸链的工艺。上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的特征在于，利用上述延伸链及上述捕捉和模板化寡核苷酸之间的二聚物检测上述延伸链的形成。
还存在检测上述延伸链形成的其他接近法。例如，可利用与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸，来检测上述延伸链的形成(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)。在这种方法中，信号可从(i)连接在与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记、(ii)连接在与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记及与上述探测和标记寡核苷酸片段相连接的标记、(iii)连接在与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记及在上述延伸反应期间插入于上述延伸链内的标记或(iv)连接在与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记及嵌入染料提供。择一性地，信号可从(i)与上述延伸链相连接的标记或(ii)嵌入染料提供。
择一性地，通过检测用于抑制可与上述捕捉和模板化寡核苷酸及上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸之间的杂交的其他方法(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)检测上述延伸链形成。可将这种抑制视为用于表现靶核酸序列的存在的。上述信号可从(i)连接在可与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)连接在可与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入染料提供。
根据一实例，可与上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的上述寡核苷酸具有与上述探测和标记寡核苷酸片段重叠的序列(overlapping sequence)。
根据一实例，上述检测寡核苷酸包含：可与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)及可与上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)。根据本发明，上述检测寡核苷酸包含在反应期间生成的延伸链或捕捉和模板化寡核苷酸。
通常，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法伴随依赖于靶核酸序列的存在的延伸链的形成。在本发明中为了包括用于提供信号的多种方法使用上述术语“基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法”，上述多种方法包括通过探测和标记寡核苷酸的切割及延伸形成延伸链的步骤。
基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法产生信号的例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物及探测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸的切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶与相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，从上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来形成延伸二聚物；步骤(e)，通过检测与上述延伸链的存在依赖性地产生的信号来检测上述延伸链的形成。在上述步骤(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组，在这种情况下，在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
根据一实例，基于二聚物的形成产生的上述信号包括基于上述二聚物杂交(例如，二聚物本身的杂交或第三寡核苷酸的杂交)被诱导的信号或基于抑制因二聚物形成而引起的第三寡核苷酸的杂交而被诱导的信号。
根据一实例，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
根据一实例，在2个信号-产生机构中至少1个为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构。
尤其，在使上述检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，上述信号基于上述检测寡核苷酸的切割产生。
在使上述检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，基于上述检测寡核苷酸的切割的上述信号可通过包括TaqMan探针方法(美国专利第5210015号及美国专利第5538848号)的多种方法产生。
当通过TaqMan探针方法产生上述信号时，上述信号-产生机构包含用于扩增靶核酸序列的引物组、具有适当的标记(例如，相互作用性双重标记)的TaqMan探针及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶。在靶扩增期间，与上述靶核酸序列杂交的TaqMan探针被切割，并产生表示上述靶核酸序列存在的信号。
通过TaqMan探针方法产生信号的特定例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与具有引物组及适当的标记(例如，相互作用性双重标记)的TaqMan探针杂交的步骤；步骤(b)，利用上述步骤(a)的结果物及具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶，来扩增靶核酸序列，上述TaqMan探针被切割而放出上述标记；以及步骤(c)，从所放出的上述标记检测信号产生。
尤其，上述信号以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式借助检测寡核苷酸的切割产生。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段的情况下，上述片段与检测寡核苷酸特异性杂交，上述片段诱导上述检测寡核苷酸的切割。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段的情况下，上述片段被延伸而切割包含与捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的检测寡核苷酸。
基于以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式的检测寡核苷酸的切割的信号可通过包括Invader分析(美国专利第5691142号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性切割(PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage；PCEC)方法(WO 2012/134195)及在美国专利第7309573号中记载的方法等多种方法产生。尤其，在美国专利第7309573号中记载的方法可被视为利用基于切割的产生信号的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中的一种。在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，检测基于上述延伸链的形成的与上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸的切割，从而可检测上述延伸链的形成。在Invader分析中，借助介导寡核苷酸的切割形成片段，并且以无片段延伸的方式诱导连续的切割反应。
根据本发明的一实例，当以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生上述信号时，上述检测寡核苷酸的切割诱导信号变化或者诱导所要检测的已标记片段的放出。
当信号-产生机构基于检测寡核苷酸的切割及二聚物的形成而同时产生信号时，只要上述信号-产生机构基于切割产生信号，就可被视为基于切割提供信号的信号发生机构。
根据一实例，以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式的信号产生用于具有相对较高检测温度的靶核酸序列。当基于上述检测寡核苷酸的切割产生上述信号时，即使在任何温度下也可检测基于切割放出的标记。因此，基于上述检测寡核苷酸的切割产生的信号可不使用于具有需要局限的检测温度的上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，依赖于上述检测寡核苷酸的切割的信号产生只使用于一个靶核酸序列。在依赖于上述检测寡核苷酸切割的信号产生使用于2个靶核酸序列的情况下，不能够以根据检测温度区分的方式检测上述2个靶核酸序列。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
根据一实例，上述检测寡核苷酸包含至少1个标记。
根据本发明的一实例，上述检测寡核苷酸可由至少1个寡核苷酸形成。根据本发明的一实例，当上述检测寡核苷酸由多个寡核苷酸形成时，上述检测寡核苷酸能够以多种方式具有标记。例如，多个寡核苷酸中的一个可具有至少1个标记、多个寡核苷酸均可具有至少1个标记或者寡核苷酸的一个部位可具有至少1个标记而其它部位能够不具有标记。
借助上述2个信号-产生机构产生的信号不被单一类型的检测器区别。上述术语“不被单一类型的检测器区别的信号”意味着因它们的相同或实质上相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)不被单一类型的检测器相互区别。例如，为了2个靶核酸序列使用相同的标记(例如，FAM)且为了检测从FAM的发光波长使用单一类型的检测器时，则无法以区别的方式检测信号。
在本说明书中所使用的术语“单一类型的信号(single type of signal)”意味着提供相同或实质相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)的信号。例如，FAM及CAL Fluor 610提供不同类型的信号。
在本说明书中所使用的术语“单一类型的检测器(single type of detector)”意味着用于单一类型的信号的检测机构。在包括用于多个不同类型的信号的多个通道(例如，光电二极管)的检测器中，各个通道(例如，光电二极管)相当于“单一类型的检测器”。
根据本发明的一实例，上述2个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被上述单一类型的检测器区别。
在本发明中，有用的标记包括在本技术领域中公知的多种标记。例如，在本发明中，有用的标记包括单一标记、相互作用性双重标记、嵌入染料及插入标记(incorporatinglabel)。
例如，上述单一标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。根据一实例，上述单一标记根据是否存在于双链或者是否存在于单链来提供不同的信号(例如，不同的信号强度)。根据一实例，上述单一标记为荧光标记。在本发明中所使用的单一荧光标记的优选种类及结合位点公开在美国专利号第7537886号及美国专利号第7348141号中，且其相关教导事项包含在本说明书中作为参照。例如，上述单一荧光标记包含JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记。上述单一荧光标记可通过多种方法与寡核苷酸相连接。例如，上述标记可通过包含碳原子的隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或12-碳间隔区)与探针相连接。
作为相互作用性标记系统的代表性的例，荧光共振能量转移(FRET，fluorescenceresonance energy transfer)标记系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移中，能量供体可以为荧光性，能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量受体为发光性(luminescent)，例如为生物发光性、化学发光性或电化学反光性，受体为荧光性。上述相互作用性标记系统包含基于“接触-介导猝灭(contact-mediated quenching)”的双重标记(Salvatore等.,Nucleic Acids Research,2002(30)no.21e122及Johansson等.,J.AM.CHEM.SOC 2002(124)pp 6950-6956)。相互作用性标记系统还包含基于至少2个分子(例如，染料)之间的相互作用诱导信号变化的任何标记系统。
在本发明中，有用的报道分子及猝灭分子可包括在本发明所属技术领域中公知的任何分子。具体例如下：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、Rhodamine 110(520)、Oregon GreenTM500(522)、Oregon GreenTM488(524)、RiboGreenTM(525)、Rhodamine GreenTM(527)、Rhodamine 123(529)、Magnesium GreenTM(531)、Calcium GreenTM(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM546(570)、TRITC(572)、Magnesium OrangeTM(575)、Phycoerythrin R&B(575)、Rhodamine Phalloidin(575)、Calcium OrangeTM(576)、Pyronin Y(580)、Rhodamine B(580)、TAMRA(582)、Rhodamine RedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、Calcium CrimsonTM(615)、AlexaTM594(615)、Texas Red(615)、Nile Red(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiDDilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、CAL Fluor Gold 540(544)、CAL FluorOrange560(559)、CAL Fluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red635(637)、FAM(520)、Fluorescein(520)、Fluorescein-C3(520)、Pulsar 650(566)、Quasar570(667)、Quasar 670(705)及Quasar 705(610)。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大发光波长。优选地，报道分子-猝灭分子包含JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记。
在如下多种文献中公开适合的荧光分子及适合的报道-猝灭对：Pesce等，editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971)；White等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,Color AND Constitution of OrganicMolecules(Academic Press,New York,1976)；Bishop,editor,Indicators(PergamonPress,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)；Hauglandd,R.P.,Handbook of Fluore 9scent Probes and Research Chemicals,6th EditionMolecularProbes,Eugene,Oreg.,1996)；美国专利第3996345号及第4351760号。
在本发明中，值得关注的是，可利用能够对多种范围的波长或特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光猝灭分子(例如，黑猝灭分子或黑暗猝灭剂)。
在包含报道分子及猝灭分子的信号转导系统中，上述报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的另一伙伴(受体)。例如，将荧光素染料(fluorescein dye)作为报道分子使用，将罗丹明染料(rhodamine dye)作为猝灭分子使用。
上述相互作用性双重标记可与二聚物中的任何一条链相连接。当包含上述相互作用性双重标记的链以单链状态存在时，上述链通过形成发夹或无规卷曲结构来诱导相互作用性双重标记之间的猝灭。当上述链形成二聚物时，上述猝灭减少。择一性地，当上述相互作用性双重标记与位于邻近链的位置的核苷酸相连接时，产生相互作用性双重标记之间的猝灭。在上述链形成二聚物并被切割的情况下，上述猝灭减少。
各个相互作用性双重标记可分别与二聚物的两条链相连接。上述二聚物的形成诱导猝灭，上述二聚物的变形诱导进行猝灭。择一性地，在两条链中的一条链被切割的情况下，可诱导进行猝灭。
在本发明中作为有用地嵌入染料的例包含SYBRTM Green I、PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM及噻唑橙(thiazoleorange)。上述嵌入染料特异性地插入于双链核酸分子内来产生信号。
在产生信号过程中能够以在延伸期间插入标记的方式使用插入标记(例如，Plexor方法，Sherrill C B,等，Journal of the American Chemical Society,126:4550-45569(2004))。并且，在基于以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号产生过程也可使用上述插入标记。
通常，上述插入标记可与核苷酸相结合。并且，还可利用具有非-天然碱基核苷酸。
在本说明书中所使用的术语“非-天然碱基(non-natural base)”意味着可形成氢键碱基对的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)等的天然碱基的衍生物。在本发明中所使用的术语“非-天然碱基”作为母体化合物(mother compound)包含具有与天然碱基不同的碱基对模式的碱基，例如，公开于美国专利第5432272号、美国专利第5965364号、美国专利第6001983号及美国专利第6037120号中。非-天然碱基之间的碱基对与天然碱基相同，具有2个或3个氢键。并且，非-天然碱基之间的碱基对还以特定方式形成。在非-天然碱基的特定例中，在碱基对组合中包含如下碱基。iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、K/X、H/J及M/N(参照美国专利第7422850号)。
在通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号的情况下，在进行上述延伸反应期间插入的上述核苷酸可具有第一非-天然碱基，上述杂交-捕捉和模板化寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有对上述第一非-天然碱基产生特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
在本说明书中所使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测或定量的核酸序列。上述靶核酸序列不仅包含双链，还包含单链。上述靶核酸序列不仅包含在反应中新生成的序列，还包含起初存在于核酸试样内的的序列。
上述靶核酸序列包含所有脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))及核糖核酸分子及它们的杂化体(嵌合核酸)。上述序列可以为双链或单链形态。在作为初始物质的上述核酸为双链的情况下，优选地，将上述两条链制备成单链或部分单链形态。作为用于链分离的公知的方法包含加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，链分离可在80℃～105℃的温度范围内进行加热来实现。在文献[Joseph Sambrook,等,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)]中公开了用于实现这种处理的常规方法。
当将信使核糖核酸(mRNA)用作初始物质时，在进行退火步骤之前必需进行反转录步骤，其相关详细内容公开于文献[Joseph Sambrook,等,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；及Noonan,K.F.等,Nucleic Acids Res.16:10366(1988)中。为了实现反转录反应，可利用能够与信使核糖核酸的聚腺苷酸尾杂交的寡核苷酸dT引物、随机引物或靶特异性引物。
靶核酸序列包含任何天然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。并且，上述核酸分子可以为通过重组生产的或可生产的任何核酸分子或化学合成或可化学合成的任何核酸分子。因此，可自然发现或无法发现上述核酸序列。上述靶核酸序列可包含已知或未知的序列。
在本说明书中术语“试样”意味着从生物学供给源的细胞、组织、流体或可根据本发明有益地进行评价的其他任何介质(medium)，并包含病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴、牛奶、尿液、粪便、眼内液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液、阑尾、脾脏及扁桃组织提取物、羊水、腹水及非-生物学试样试样(例如，食品及水)。并且，上述试样包含从生物学供给源绝缘的核酸分子及合成的核酸分子。
根据本发明的一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中实施上述步骤(a)。
在本发明中，由信号-产生机构产生的上述信号可与靶扩增一同进行扩增。择一性地，上述信号可无靶扩增地进行扩增。
根据本发明的一实例，上述信号产生与靶扩增一同在包含信号扩增的过程中实施。
根据本发明的一实例，根据聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)实施上述靶扩增。为了靶扩增，在本发明所属技术领域中广泛利用聚合酶链式反应，上述聚合酶链式反应包括靶序列的变性、靶序列及引物之间的退火(杂交)及引物延伸的循环(Mullis等，美国专利第468319号、第4683202号及第4800159号；Saiki等，(1985)Science230,1350-1354)。可通过在聚合酶链式反应的过程中适用上述的信号产生方法(例如，TaqMan方法及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法)来扩增信号。根据一实例，本发明通过实时聚合酶链式反应方法提供信号。根据一实例，上述靶核酸序列的扩增通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)、连接酶链式反应(ligase chainreaction；LCR，参照Wiedmann M,等，“Ligase chain reaction(LCR)-overview andapplications.”PCR Methods and Applications 1994Feb；3(4):S51-64)、缺口填补连接酶链式反应(gap filling LCR；GLCR，参照WO 90/01069、欧洲专利第439182号及WO93/00447)、Q-β复制酶扩增(Q-beta replicase amplification；Q-beta，参照Cahill P,等，Clin Chem.,37(9):1482-5(1991)，美国专利第5556751号)、链置换扩增(stranddisplacement amplification；SDA，参照G T Walker等，Nucleic Acids Res.20(7):16911696(1992)，欧洲专利第497272号)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification；NASBA，参照Compton,J.Nature 350(6313):912(1991))，转录介导的扩增(Transcription-Mediated Amplification；TMA，参照Hofmann WP等，J ClinVirol.32(4):289-93(2005)；美国专利第5888779号)或滚环扩增(Rolling CircleAmplification；RCA，参照Hutchison C.A.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA.102:1733217336(2005))实施。
上述的扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一序列反应来扩增靶序列。以“循环(cycle)”表示包括重复上述一序列反应的扩增的单位。根据扩增方法上述循环的单位能够以重复次数或时间表示。
例如，可在扩增的各循环、选择的一部分循环或反应的端点(end-point ofreaction)中进行信号检测。根据一实例，在至少2个循环中检测出信号的情况下，可在所有检测温度下或者在选择一部分的检测温度下实施各个循环中的信号检测。根据本发明的一实例，在奇数的循环中，在相对较高检测温度下进行上述检测，在偶数的循环中，在相对较高检测温度下进行上述检测。
根据本发明的一实例，与基于信号-产生机构的信号产生一同在可实现靶扩增的条件下进行培养。
根据本发明的一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
在通过包括寡核苷酸的切割的方法产生信号的情况下，上述信号能够以无靶扩增的方式被扩增。例如，虽然可通过CPT方法(Duck P,等，Biotechniques,9:142-148(1990))，Invader分析(美国专利第6358691号及第6194149号)，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法及PCEC方法)或根据CER方法(WO 2011/037306)使信号扩增，但以不扩增靶核酸序列的方式进行上述步骤(a)。
上述的扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一序列反应来扩增靶序列。以“循环(cycle)”表示包括重复上述一序列反应的扩增的单位。根据扩增方法上述循环的单位能够以重复次数或时间表示。
例如，可在扩增的各循环、选择的一部分循环或反应的端点中进行信号检测。
借助包含用于扩增的引物组及核酸聚合酶的靶扩增机构实现上述靶核酸序列的扩增。
根据本发明的一实例，可使用具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶。根据本发明的一实例，可使用不具有核酸酶活性的核酸聚合酶。
本发明中，具有有用的核酸聚合酶为从各种细菌种得到的热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶，上述脱氧核糖核酸聚合酶包含栖热水生菌(Taq，Thermus aquaticus)、极端嗜热菌(Tth，Thermus thermophilus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermisflavus)、超好热性古细菌(Thermococcus literalis)、典型嗜热菌(Thermusantranikianii)、卡德菲勒斯嗜热菌(Thermus caldophilus)、切拉罗菲勒斯嗜热菌(Thermus chliarophilus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、火地栖热菌(Thermusigniterrae)、嗜齿菌(Thermus lacteus)、死亡嗜热菌(hermusoshimai)、红栖热菌(Thermus ruber)、鲁本斯栖热菌(Thermus rubens)、水生栖热菌(Thermus scotoductus)、西凡纳斯热袍(Thermus silvanus)、栖热菌种Z05(Thermus species Z05)、栖热菌种sps17(Thermus species sps 17)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、海栖热袍菌(hermotogamaritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、巴罗西热袍菌(Thermococcus barossi)、嗜热古细菌(Thermococcus gorgonarius)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、沃氏热球菌(Pyrococcuswoesei)、掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)、隐蔽热网菌(Pyrodictiumoccultum)、嗜火产液菌(Aquifexpyrophilus)以及菌属超嗜热菌(Aquifexaeolieus)。在特定实例中，热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明的一实例，通过非对称性聚合酶链式反应(asymmetric PCR)实现上述靶核酸序列扩增。可通过考虑下游寡核苷酸的切割或杂交来选择上述引物的比率。
与用于产生信号的2个信号-产生机构一同，在试样的培养(反应)期间或培养后，可利用单一类型的检测器检测所产生的信号。
上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度。
在本说明书中所使用的表达“靶核酸序列具有通过相应的上述信号-产生机构确定的检测温度”意味着可在具有预先分配在上述靶核酸序列的检测温度下检测出靶核酸序列，上述检测温度可检测出从以在上述检测温度下产生信号的方式设计的信号-产生机构产生的信号检测。
根据本发明的一实例，借助相应的上述信号-产生机构确定的一个检测温度被分配在一个靶核酸序列。
上述相对较高检测温度为可产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为可产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号。
本发明的特征之一为在不同检测温度下检测表示2个靶核酸序列存在的信号，从而通过区别2个靶核酸序列的存在来进行确定。
根据一实例，考虑可借助上述信号-产生机构产生信号的温度范围来预先确定针对上述靶核酸序列的检测温度。
在本发明中，利用存在能够以依赖于信号-产生机构的方式产生信号的特定温度范围的技术特征。
例如，当2个核酸分子杂交(或结合)时，信号-产生机构产生信号，当非-杂交(或解离)时，上述信号-产生机构不产生信号，在此情况下，虽然在可实现2个核酸分子的杂交的温度下产生信号，但在2个核酸分子未进行杂交的温度下不产生信号。如上所述地，存在可产生信号(即，信号检测)的特定温度范围及不产生信号的其他温度范围。上述温度范围受在上述信号-产生机构所使用的2个核酸分子的杂交物的Tm值的影响。
当利用信号产生方法时，上述信号产生方法利用切割后具有标记的所放出的片段，在理论上，可在任何温度(例如，30～99℃)下检测信号。
检测温度选自可由上述信号发生机构产生信号的温度范围。
在本发明中，术语“检测温度范围”是为了特别记述可产生信号产生(即，信号检测)的温度范围而使用。
当根据针对2个靶核酸序列的信号-产生机构存在不同的检测温度范围时，可选择不重叠的检测温度范围(non-overlapped detection temperature range)用作相对较高检测温度。借助提供相对较高检测温度的信号-产生机构检测的靶核酸序列被确定为具有上述相对较高检测温度。可选择重叠的检测温度范围(overlapped detectiontemperature range)用于相对较低检测温度。借助提供相对较低检测温度且不提供相对较高检测温度的信号-产生机构进行检测的靶核酸序列被确定为具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，上述不重叠的部位及重叠的部位能够以互不区分的方式被区别。例如，在为了具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列而选择的相对较高检测温度下，基于具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列提供的信号能够以更低的强度产生。在这种情况下，可通过适当地选择用于确定在上述相对较高检测温度下检测出的信号的显著性(significance)的基准值(reference value)来克服因在上述相对较高检测温度下基于具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列提供的信号而引起的错误信号(false signal)问题。
根据一实例，可通过考虑在检测温度中不重叠的检测温度范围及重叠的检测温度范围来预先确定上述检测温度。
根据一实例，针对靶核酸序列被分配的上述检测温度相互具有至少2℃、3℃、4℃、5℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、15℃或20℃的差异。
根据本发明，可通过考虑信号-产生机构来分配用于检测各个靶核酸序列的存在的温度。
根据本发明的一实例，上述2个靶核酸序列中的一个被分配成相对较高检测温度，而另一个被分配成相对较低检测温度，在此之后，构筑适合于上述检测温度的信号-产生机构，然后进行上述步骤(a)。
根据一实例，可预先确定用于进行检测的上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度。例如，将上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度预先设定为72℃及60℃后，构筑适合于上述检测温度的信号-产生机构，然后进行上述步骤(a)。
根据一实例，首先，在构筑针对2个靶核酸序列的信号-产生机构后，分配针对上述2个靶核酸序列的检测温度，然后进行上述步骤(a)。
根据本发明的一实例，当上述信号-产生机构以依赖于二聚物形成的方式产生信号时，基于上述二聚物的Tm选择上述检测温度。
根据本发明的一实例，当上述信号-产生机构以依赖于二聚物形成的方式产生信号时，可通过调节上述二聚物的Tm值来调节上述检测温度。
例如，在基于与上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸(例如，LUX探针、分子信标探针、HyBecon探针及相邻的杂交探针)产生上述信号的情况下，通过调节上述二聚物的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现上述信号的检测。当使用蝎形引物时，通过调节与延伸链杂交的部位的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现上述信号的检测。
在基于根据上述靶核酸序列的存在形成的二聚物来产生上述信号的情况下，通过调节上述二聚物的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现上述信号的检测。例如，在通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生上述信号的情况下，在捕捉和模板化寡核苷酸上通过调节通过探测和标记寡核苷酸片段的延伸形成的延伸二聚物的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现上述信号的检测。
上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法具有可容易调节上述二聚物的Tm值或基于上述二聚物对杂交起到影响的第三杂交物的Tm值的优点。
根据本发明的一实例，当上述信号-产生机构以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号时，任意选择上述检测温度。即，只要可检测基于检测寡核苷酸的切割产生的信号，就可选择任何温度。如上所述地，当以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式产生上述信号时，可在各种温度下检测出借助上述切割放出的标记。
根据一实例，当以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式产生上述信号时，可将上述检测温度用作相对最高检测温度。
如上所述地，通过考虑取决于信号-产生机构的检测温度范围，来确定上述检测温度。因此，可如下的说明在特定检测温度下的上述信号检测，即，在相对较高检测温度下的上述检测用于检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，在相对较低检测温度下的上述检测用于均检测具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。
例如，当针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号均通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生时，基于具有适合于上述相对较高检测温度的Tm值的延伸二聚物产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号，基于具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号。在上述相对较高检测温度下检测出信号的情况下，具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物被解离成单链，因此不产生信号，由此仅检测出针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。在上述相对较低检测温度下检测出信号的情况下，具有适合于上述相对较高检测温度的Tm值的延伸二聚物及具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物均具有二聚物形态，由此均检测出针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号。
在一例中，当通过TaqMan方法产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号且通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号时，借助所放出的荧光标记提供针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号，而且借助具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物提供针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号。在上述相对较高检测温度下检测出信号的情况下，具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物被解离成单链，因而不产生信号，由此仅检测出从针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的已放出的荧光标记的信号。在上述相对较低检测温度下检测出信号的情况下，不仅检测出从具有适合于上述相对较低检测温度的Tm值的延伸二聚物提供的信号，还检测出从放出的荧光标记的信号，由此，检测出针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号。.
在本发明中所使用的检测器包括可检测信号的任何机构。例如，当使用荧光信号时，可将适合于检测荧光信号的的光电二极管作为检测器使用。利用单一类型的检测器的检测意味着可检测单一类型的信号的检测器或利用包含括多种通道(即，光电二极管)的检测器的各通道(即，光电二极管)来进行检测。
根据一实例，上述信号的产生包括从标记“产生或消灭信号”以及“增加或减少信号”。
步骤(b)：确定靶核酸序列的存在
在检测信号后，借助在上述步骤(a)中检测出的信号确定2个靶核酸序列的存在。
通过在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在。根据在上述相对较高检测温度下检测出到的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
为了确定靶的存在而使用的信号包含通过对从信号检测获得的多种信号特性进行数学处理来获得的值，例如，包含对信号强度(例如，RFU(相对荧光单位)值、进行扩增时的特定循环、选择的循环或端点中的RFU值)，信号变化形状(或图案)、Ct值或上述特性进行数学处理来获得的值。
根据本发明的一实例，在通过实时聚合酶链式反应获得扩增曲线的情况下，为了确定靶的存在可选择从上述扩增曲线的多种信号值(或特性)。
为了确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在可使用在上述相对较高检测温度下获得的信号的特性本身。
择一性地，为了确定具有上述相对较高检测温度靶核酸序列的存在，可使用通过对上述信号的特性进行数学处理来提供的变形的信号。
为了获得相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号之间的差异可使用上述相对较高检测温度下的信号特性本身及相对较低检测温度下的上述信号特性本身。
择一性地，可通过对信号特性进行数学处理，使上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下的信号中的一个或全部变形，并且用于获得相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号之间的差异。
根据一实例，与语句“在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号”相关地使用的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，还包含通过对上述信号进行数学处理来提供的变形的信号。
根据一实例，在进行上述数学处理的情况下，上述信号的特性应该是可实现数学处理的特性。在特定实例中，上述数学处理包括利用信号的计算(例如，加法、乘法、减法及除法)或者获得来源于上述信号的其他值的处理。在本发明中，为了确定靶核酸序列的存在而使用的信号通常是显著信号(significant signal)。即，上述信号是依赖于靶核酸序列的存在而产生的信号。另一方面，当计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异时，为了计算上述差异，可使用背景信号等无显著性的信号。与此相关地，只要为了确定靶核酸序列的存在而使用的信号能够用于计算差异或者参与确定过程，就可理解成上述信号不仅包括具有显著性的信号，还包含无显著性的信号。
根据一实例，可利用阈值来确定检测出的信号的显著性。例如，在以考虑检测器的背景信号、敏感度或所使用的标记的方式从阴性对照组预先确定阈值后，可确定从试样的信号的显著性。
在相对较高检测温度下检测出信号(即，显著信号)的情况下，确定为存在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。
在本文中，能够以“信号不存在”或“未检测出信号”的语句表示无显著性的信号。
在本说明书中，与确定靶核酸序列的存在相关地使用的术语“基于信号(by asignal)”意味着通过以利用信号的数字值或它们的变形、利用信号的存在/不存在以及比较阈值和信号的方式直接或间接利用由信号-产生机构产生的信号或者使由信号-产生机构产生的信号变形来确定靶核酸序列的存在。
在本说明书中，与确定具有相对较高检测温度的靶核酸序列的存在相关地使用的术语“基于信号的确定(determination by a signal)”可包括通过考虑在相对较高检测温度下检测出的信号的显著性来确定具有相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的方式。
在本发明中，根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
在相对较低检测温度下检测出信号的情况下，利用上述信号本身无法确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。其理由是在上述相对较低检测温度下可检测出针对具有相对较高检测温度的靶核酸序列的信号。
本发明的特征在于，为了对在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行分析，而利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号。
有趣地是本发明人了解到，在一个反应容器中，在预先确定的2个检测温度下检测出用于表示单一靶核酸序列的存在的信号时，以特定图案(规则)存在信号变化。
例如，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的信号变化呈特定图案(规则)。例如，在2个检测温度下，上述信号的强度可相同或者实质上相同，即使上述信号的强度互不形同，但可存在于特定范围内。
本发明的特征在于，将上述结果适用于靶核酸序列的检测。
在一个反应容器中，针对靶核酸序列的信号仅以检测温度不同的方式(例如，无靶含量的变化或者无缓冲液条件的变化)检测出，因而在2个检测温度之间的信号变化中存在特定图案(规则)。基于信号变化中的特定图案(规则)，为了分析在上述相对较低检测温度下检测出的信号可使用在上述相对较高检测温度下检测出的信号。
根据一实例，在针对靶核酸序列的2个检测温度之间的信号变化中存在特定图案(规则)的条件下实施本发明的方法。
根据一实例，为了确认在上述相对较低检测温度下检测出的信号是否包含由具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列提供的信号，而利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号，并以分析在上述相对较低检测温度下检测出的信号的方式确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
可在获得在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异后，对上述差异进行分析，由此实施以利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号的方式在上述相对较低检测温度下检测出的信号的分析。
根据本发明的一实例，可根据利用上述相对较高检测温度下的信号的原理获得在上述相对较低检测温度下检测出的信号中的具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号的大小(或部分)。
根据一实例，借助在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
例如，(i)在试样内仅存在具有相对较高检测温度的靶核酸序列的情况下，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下均检测出信号。在上述相对较高检测温度下检测出的信号存在与在上述相对较低检测温度下检测出的信号有可能不同。由于除了检测温度之外，这种差异的所有条件相同，因此属于特定范围内的可能性非常高。在对试样进行计算的上述差异属于特定范围内的情况下，在上述相对较低检测温度下检测出的信号仅针对于具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。即，可确定为具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列不存在于试样内。
(ii)在试样内均存在具有相对较高检测温度的靶核酸序列及具有相对较低检测温度的靶核酸序列的情况下，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下均检测出信号。由于存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列，因而与上述事例(i)中的差异相比，可更好地区别上述信号之间的差异。可利用上述差异来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
(iii)在试样内仅存在具有相对较低检测温度的靶核酸序列的情况下，虽然可在相对较低检测温度下检测出信号，但在相对较高检测温度下未检测出信号。在相对较高检测温度下未检测出信号表示不存在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，因而在上述相对较低检测温度下检测出的信号可识别为基于具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。由此，可确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
择一性地，在上述事例(iii)中，可利用在上述相对较高检测温度下检测出的无显著性(例如，背景信号)的信号来获得上述差异。在这种备选方案中，上述差异与上述事例(i)中的差异确实不同的可能性非常高，由此可确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
可根据多种接近法获得在上述检测温度下检测出的信号之间的差异。
在本说明书中，与“基于信号之间的差异(或利用信号之间的差异的)”相关地使用的术语“差异(difference)”不仅包括对信号本身或变形的信号进行数学处理来获得的差异，而且还包括基于信号的存在或不存在的差异。例如，可通过计算在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的比率(ratio)或减法(subtraction)来获得上述差异。择一性地，可使在一个检测温度下的信号变形，并将其与在其他检测温度温度下的信号进行比较，从而获得上述差异。可在多种方面(aspect)表示在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异。例如，可通过具有数值、信号的存在/不存在或信号特性的绘制表示上述差异。
根据本发明的一实例，在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异包括对在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异。
根据本发明的一实例，在上述相对较高检测温度下未检测出信号的情况下，考虑到在上述相对较高检测温度下未检测出信号，可基于在上述相对较低测温度下检测出的信号来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。这种实例表示，可通过利用基于在2个检测温度下的信号的存在及不存在的差异来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，为了计算上述差异，可将在相对较高检测温度下检测出的背景信号处理成“0”或“1”。
根据一实例，当在计算过程中获得负数值时，负数值以转换成绝度值的方式用于获得差异。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号为计算参数(calculation parameter)，上述计算参数用于分析针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号。
用于确定在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的信号可具有互不相同的规模(dimensions)或单位(units)，并且可具有相同的大小或单位。
在本说明书中所示用的术语“基于差异的确定(determined by a difference)”包括基于差异的产生/非-产生的确定、具有数值差异的值或基于范围的确定及基于差异的绘图结果的确定。尤其，“基于差异的确定”包括基于上述差异获得针对具有相对较低检测温度的靶核酸的值(例如，CT)的确定。
在本说明书中与确定靶核酸序列的存在一同使用的术语“基于差异(by adifference)”意味着通过以包括利用差异的数值或其变形、利用信号的存在/不存在以及与阈值比较差异的方式直接或间接地利用差异或变形来确定靶核酸序列的存在。术语“基于差异”和“利用差异(by Using a difference)”没有差异，在本说明书中混用。
上述信号的数学处理可通过多种计算方法及他们的变形来进行。
根据本发明的一实例，用于获得上述信号之间的差异的信号的数学处理是针对在上述相对较高检测温度下检测出的信号的在上述相对较低检测温度下检测出的信号的比率的计算。根据本发明的一实例，用于获得上述信号之间的差异的信号的数学处理是针对在上述相对较低检测温度下检测出的信号的在上述相对较高检测温度下检测出的信号的比率的计算。
在本说明书中所使用的术语“比率(ratio)”意味着2个数字之间的关系。可通过利用比率来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。当针对在上述相对较高检测温度下检测出的信号的在上述相对较低检测温度下检测出的信号的比率显著时，这种现象成为针对具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的指示器(indicator)例如，当真对在上述相对较高检测温度下检测出到的信号的端点强度的在在上述相对较低检测温度下检测出的信号的端点强度的比率显著时(即，端点强度的增加)，这中现象表示具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
上述数学处理能够以多种方式进行。
上述数学处理可利用机器来进行。例如，可借助通过检测器或实时聚合酶链式反应装备处理器对信号进行数学处理。择一性地，尤其，可根据预先设定的算法手动地(manually)对上述信号进行数学处理。
根据本发明的一实例，根据用于获得上述差异的接近法，为了分析所获得的上述差异是否表示具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，可使用阈值。例如，以考虑从包含具有上述相对较高检测温度的靶核酸及具有上述相对较低检测温度的靶核酸的基准试样获得的差异的方式预先确定上述阈值。为了确定阈值还可添加阴性对照组、敏感度或所使用的标记。
根据本发明的一实例，根据用于获得上述差异的接近法，可通过利用所获得的上述差异本身来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。例如，在对上述相对较高检测温度下的信号乘以阈值后，可获得所乘的上述信号及相对较低检测温度下的信号之间的差异。尤其，以考虑从包含具有上述相对较高检测温度的靶核酸及具有上述相对较低检测温度的靶核酸的基准试样获得的差异的方式预先确定上述阈值。
根据本发明的一实例，由用户(user)确定阈值或者自动(automatically)确定阈值。
在一实例中，当真对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的上述相对较高检测温度下的信号及上述在相对较低检测温度下的信号之间的差异变得更大时，可利用上述阈值来减少检测错误。
在一实例中，当由具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列提供的信号在2个检测温度之间具有几乎无差异或毫无差异的图案(或规则)时，在以利用计算或差异的方式确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方面，能够以无追加变形的方式使用在上述相对较高检测温度下检测出的信号。
在一实例中，在特定范围内具有表示差异的图案(或规则)的情况下，在确定上述靶核酸序列的存在的过程中，可使上述相对较高检测温度下的信号以反映上述差异的方式变形。
上述基准值是反映不同检测温度下的信号变化的图案(规则)的值。
根据本发明的一实例，上述基准值是反映针对具有相对较高检测温度的靶核酸序列的2个不同检测温度下的信号变化的图案(或规则)的值。
例如，当针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号相同或实质上相同且通过信号的减法计算2个检测温度下的信号之间的差异程度时，相对于针对具有上述相对较高检测温度的2个检测温度下的信号的上述基准值为“0”。作为再一例，当根据上述信号的除法计算上述2个检测温度下的信号之间的差异时，针对具有上述相对较高检测温度的2个检测温度下的信号的上述基准值为“1”。
另一方面，当真对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号互不相同且根据减法计算上述2个信号之间的差异程时，相对于针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的2个检测温度下的信号的上述基准值为除了“0”以外的正数值或负数值。作为另一例，当根据上述信号的除法计算上述2个检测温度下的信号时，相对于针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的2个检测温度的信号的上述基准值为除了“1”之外的大于1或小于1的值。
在特定实例中，当针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号互不相同时，上述2个信号之间的差异程度属于特定范围。
在特定实例中，可通过基准值表示根据具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列提供的上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号之间的差异。在特定实例中，针对根据具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列提供的上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号互不相同时的基准值与针对两个信号相同时的基准值相比，差异为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、12％、15％、20％或30％以上。
在一实例中，当针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的上述相对较高检测温度及上述在相对较低检测温度下的信号之间的差异变得更大时，利用针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值，从而在确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在过程中中更有利于减少检测错误。
在特定实例中，针对从上述2个检测温度下的信号计算出的具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值与针对上述2个信号相同时的基准值相比，差异为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、12％、15％、20％或30％以上的情况下，在确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的过程中可使用针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值。
根据一实例，在为了确定是否使用基准值而进行上述比较的情况下，根据信号的除法计算上述基准值。根据一实例，用于确定是否使用上述基准值的方法可与用于检测上述靶核酸序列的基准值的计算方法相同或不同。
根据一实例，为了根据上述相对较高检测温度下的信号及上述相对较低检测温度下的信号之间的差异来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，而使用基准值。尤其，基准值与具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列相关。
根据本发明的一实例，为了分析所获得的上述差异是否表示具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，可使用上述基准值。
根据本发明的一实例，为了获得上述相对较高检测温度下的信号及上述相对较低检测温度下的信号之间的差异，可使用上述基准值。例如，能够以具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值乘以或除于上述相对较高检测温度下的信号，由此，可获得上述乘以或处于的信号及上述在相对较低检测温度下的信号之间的差异，作为另一例，能够以具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值乘以或除于上述相对较低检测温度下的信号，由此，可获得上述相对较高检测温度下的信号之间的差异。
根据本发明的一实例，为了确定阈值而使用基准值。根据本发明的一实例，基准值以对上述值进行变形或不进行变形的方式作为阈值使用。为了通过分析信号之间的差异来确定靶核酸序列的存在，在本说明书中所使用的术语“阈值(threshold)”及“基准值”可具有相同的值或相同的意义。
择一性地，当为了获得上述相对较高检测温度下的信号及上述相对较低检测温度下的信号之间的差异而使用上述基准值时，为了确定上述差异的显著性，即，为了确定上述差异是否表示具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，可使用额外的阈值。
根据一实例，在存在具有相对较高检测温度的靶核酸序列的情况下，为了确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，可使用基准值。
存在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的情况包括检测出用于表示具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的显著信号的情况。
根据一实例，当具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列不存在时，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，可选择性地使用上述基准值。
不存在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的情况包括仅检测出具有与背景信号类似的强度的信号的情况。
根据本发明的一实例，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在上述方法中利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的反应容器中与用于检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的检测的信号-产生机构一同培养具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
根据一实例，在上述(iii)中获得的在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异为一个值，上述值以无变形或变形的方式作为基准值使用。
根据一实例，可通过计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的比率或减法来获得基准值。根据本发明的一实例，可通过计算针对在上述相对较高检测温度下检测出的信号的在上述相对较低检测温度下检测出的信号的比率来获得基准值。根据本发明的一实例，通过计算针对在上述相对较低检测温度下检测出的信号的在上述相对较高检测温度下检测出的信号的比率来获得基准值。
根据一实例，针对从试样的信号差异的计算方法及针对用于获得基准值的差异的计算方法可相同或不同。例如，可根据2个信号的减法进行从试样的信号差异。择一性地，从上述试样的信号差异及用于获得上述基准值的差异均可根据用于获得比率的2个信号的除法进行。
根据本发明的一实例，针对上述基准值的信号-产生机构可与用于检测上述靶核酸序列的信号-产生机构相同。
针对靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信号-产生机构、酶或dNTPs)的量、缓冲液pH或反应时间的多种反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号(saturated signal)的充分的反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，在计算基准值的过程中获得的信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内或者参照上述特定范围来选择基准值。根据本发明的一实例，可选择上述特定范围的最大值或最小值作为基准值或者参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值、尤其，考虑到在多种条件下获得的上述基准值的标准变化(standard variation)、允许误差范围(acceptable error ranges)、特异度或敏感度，可使基准值变形。
根据本发明的一实例，可在包括成分(若使用，则就使用酶或扩增引物)、缓冲液pH或反应过程的试样中使用的相同的反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，可利用伴随核酸扩增的信号扩增过程或无核酸扩增的信号扩增过程来获得基准值。
根据本发明的一实例，在为了确定上述基准值及具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在而获得的差异之间存在显著的差异的情况下，具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列被确定为存在。上述基准值可表示为与为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在而获得的差异相同的类型的值(例如，信号强度的端点值的比率)。
在特定例中，当相对于在上述相对较低检测温度下检测出的信号强度的端点值的在上述相对较高检测温度下检测出的信号强度的端点值的比率为1.8且上述基准值为1.1时，可被确定为在为了确定具有上述基准值及上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在而获得的差异之间具有显著差异。这表示存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，当用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的差异与上述基准值相同或大于上述基准值时，确定为存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，当用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的差异与上述基准值相同或小于上述基准值时，确定为存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
择一性地，为了计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异可使用上述基准值。例如，可通过如下的方式计算用于确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的差异，即，在上述相对较高检测温度下检测出的信号(例如，RFU)乘以具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值之后(或除以之后)，从上述乘法(或除法)结果减去在相对较低检测温度下检测的信号(例如，RFU)。在差异大于(或小于)“0”或预先确定的值的情况下，可确定为存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
作为另一例，可通过如下的方式计算用于确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的差异，即，在上述相对较低检测温度下检测出的信号(例如，RFU)乘以具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值之后(或除以之后)，从上述乘法(或除法)结果减去在相对较高检测温度下检测的信号(例如，RFU)。在差异大于(或小于)“0”或预先确定的值的情况下，可确定为存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，预先确定的值可起到阈值作用。
根据一实例，当检测出针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号或者通过数学处理过程获得上述相对较高检测温度下的信号及上述在相对较低检测温度下的信号之间的差异时，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在而使用上述基准值。
根据一实例，当以与基于聚合酶链式反应的靶扩增相关的实时方式产生信号时，上述信号的数学处理包括针对每个扩增循环过程中的在上述相对较低检测温度下检测出的信号强度的在上述相对较高检测温度下检测出的信号强度的比率计算。上述计算结果针对循环进行绘图，并用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，当以与基于聚合酶链式反应的靶扩增相关的实时方式产生信号时，Ct值为用于靶检测的信号。
可利用在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下检测出的信号来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值，可利用如下例进行说明：首先，对需要分析的试样进行实时聚合酶链式反应，在获得在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下检测出的信号后，获得上述2个检测温度的扩增曲线。
(a)在上述相对较高检测温度下的检测过程中，当具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的Ct值不存在时，可确定为不存在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。然后，从在相对较低检测温度下获得的扩增曲线计算具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值。当具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列也不存在，则具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值也不存在。
(b)在上述相对较高检测温度下的检测过程中，当具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的Ct值存在时，在表示Ct值的循环中计算针对在上述相对较高检测温度下获得的RFU值的在上述相对较低检测温度下获得的RFU值的比率。并且，还计算在表示上述Ct值的循环之后的循环中获得的的比率。(i)在所有RFU值的比率小于基准值(例如，如上所述，仅利用具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列来获得的值)的情况下，确定为不存在具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。因此，无具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值。(ii)在所有RFU值的比率大于上述基准值的情况下，从上述相对较低检测温度下获得的扩增曲线计算出的Ct值被确定为具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值。(iii)当表示上述Ct值的循环过程中的RFU值的比率小于上述基准值且特定循环之后的RFU值的比率大于上述基准值时，上述特定循环被确定为具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值。
在经计算的比率与上述基准值相同的情况下，可任意实现上述确定。例如，在上述的例中，以考虑上述比率是否小于或大于基准值的方式进行上述确定。
择一性地，可如下的计算具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值，即，在每个循环中，计算针对在上述相对较高检测温度下获得的RFU值的在上述相对较低检测温度下获得的RFU值的比率之后，考虑阈值来计算Ct值。
择一性地，可如下的计算具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的Ct值，即，利用每个循环的基准值来使在每个循环的上述相对较高检测温度下获得的RFU值变形，在对每个循环计算针对上述变形的RFU值的在上述相对较低检测温度下获得的RFU值的比率之后，计算Ct值。
根据本发明的一实例，利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号的步骤包括获得用于确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的限定值(qualifyingvalue)的步骤，利用上述差异的步骤包括获得用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的步骤。
根据本发明的一实例，利用上述差异的步骤包括获得用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的限定值的步骤，当(i)对在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理或者(ii)在上述相对较高检测温度下未检测出信号时，考虑到在上述相对较高检测温度下未检测出信号，通过利用在上述相对较低检测温度下检测出的信号来获得上述限定值。
为了获得变形的值，还可对上述限定值进行数学处理。上述限定值用于确定试样内2个靶核酸序列的存在。
根据一实例，上述一个反应容器还包括至少1个附加装置(additional set)，上述至少1个附加装置(additional set)分别包括用于检测除了上述2个靶核酸序列之外的靶核酸序列的额外的2个信号-产生机构，在上述容器相互区别由2个信号-产生机构的各个装置产生的上述信号，借助不同类型的检测器分别检测上述信号。例如，当以FAM标记上述步骤(a)中的两个信号-产生机构且以Quasar 570标记额外的2个信号-产生机构时，在上述容器中由被FAM-标记的信号-产生机构产生的信号与由Quasar 570-标记的信号-产生机构产生的信号相互区别，因此需要用于检测2个不同的放出光(emission lights)的2种类型的检测器。
根据本发明的一实例，上述2个靶核酸序列包含核苷酸变异(nucleotidevariation)，上述2个靶核酸序列中的一个包含一种类型的核苷酸变异，另一个包含另一类型的核苷酸变异。
在本说明书中所使用的术语“核苷酸变异(nucleotide variation)”意味着在连续的脱氧核糖核酸片段中特定位置的脱氧核糖核酸序列中的所有单一或多个核苷酸置换、缺失或插入。这种连续的脱氧核糖核酸片段包含一个基因或一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以为突变(mutant)或多态性等位基因变异(polymorphic allelevariations)。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)、突变(mutation)、缺失、插入、置换以及移位。核苷酸变异的例包括人类基因组内的各种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因的变异)、病原体的药物耐性相关的变异以及肿瘤形成-诱发变异。在本说明书中所使用的术语“核苷酸变异”包含核酸序列的特定位置的所有变异。即，术语“核苷酸变异”包含核酸序列的特定位置的野生型及其所有突变型。
根据本发明的一实例，通过本法明检测出的核苷酸变异是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism；核苷酸多态性)。
根据本发明的一实例，上述核苷酸多态性等位基因中的一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较高检测温度，另一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度。
在核苷酸多态性检测中会进一步强调本发明的优点。
针对野生型等位基因(allele)的检测温度为相对较高检测温度，针对突变等位基因的检测温度为相对较低检测温度，在试样为突变纯合子(homozygous)的情况下，在上述相对较高检测温度下不能检测出信号，而在上述相对较高检测温度下检测出信号。上述试样确定为不包含野生型等位基因，当包含突变型等位基因。另一方面，针对突变纯合子试样，即使在上述相对较高检测温度下产生错误的信号的情况下，也可通过计算用于确定具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因存在的在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异的结果确认在相对较高检测温度下检测出的信号是否为假阳性信号。上述理由是针对核苷酸多态性的杂合子(heterozygote)以1：1的比率包含野生型等位基因及突变等位基因。
II.利用不同检测温度分析核苷酸多态性基因型(SNP Genotyping)
在本发明的再一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法包括：步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养包含含有上述单核苷酸多态性位点的核算序列的试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述核苷酸多态性等位基因，上述核苷酸多态性等位基因中的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号以及针具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均进行上述检测；以及步骤(b)，根据上述步骤(a)中的在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定核苷酸多态性基因型。
本发明基于在上述的本发明的第一实施方式的原理，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。为了说明本实施方式，而涉及针对上述第一实施方式的说明的情况下，需要留意地是本实施方式的步骤(b)与第一个实施方式的步骤(b)的一部分互补不同。因此，本发明所属技术领域的普通技术人员应理解针对第一个实施方式的一部分说明可直接适用于针对本实施方式的步骤(b)的说明，经过变形的其他说明可适用于针对本实施方式的步骤(b)的说明。
步骤(a)：与信号-产生机构的培养及信号检测
首先，在一个反应容器中与用于检测核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养包含含有上述单核苷酸多态性位点的核算序列的试样后，利用单一类型的检测器检测所产生的信号。由上述信号-产生机构产生的信号不被单一类型的检测器区别。
包含上述核苷酸多态性位点的核酸序列可包含人类的染色体对。
上述核苷酸多态性等位基因中的一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号以及针具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，
根据本发明的一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据本发明的一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
步骤(b)：核苷酸多态性基因型的确定
在检测信号之后，根据上述步骤(a)中的在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定核苷酸多态性基因型。
在本发明中，即使无针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的确定，也可仅利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来分析核苷酸多态性基因型。
根据一实例，通过对在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理，来获得上述差异。
根据一实例，通过计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述差异。
根据一实例，为了计算上述差异而使用在上述相对较高检测温度下检测出的背景信号。
根据一实例，为了计算上述差异，可将在相对较高检测温度下检测出的背景信号处理成“0”或“1”。
根据一实例，在进行起算期间获得负数值的情况下，为了获得差异，可将负数值转换为绝对值来使用。
根据本发明的一实例，能够以未确定具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的存在的方式进行用于确定核苷酸多态性基因型的上述步骤(b)。可利用在相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来进行核苷酸多态性基因型分析。
不需要确定具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的存在的理由在于，存在3个核苷酸多态性基因型，并且针对核苷酸多态性的杂合子以1：1的比率包含野生型等位基因及突变基因型。通过组合本发明的原理和上述理由，即使未确定具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的存在也可分析核苷酸多态性基因型。
根据本发明的一实例，包含具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的纯合子(homozygote)试样表示特定范围内的差异(例如，比率)，杂合子试样表示其他特定范围内的差异(例如，比率)，包含上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因的纯合子表示另一特定范围内的差异(例如，比率)。
根据本发明的一实例，针对各个核苷酸多态性基因型的特定范围可与针对各个核苷酸多态性基因型的基准值相关。
根据本发明的一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法利用针对由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子、由具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子及杂合子的基准值中的至少1种。
根据本发明的一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法使用所有上述3个基准值。根据本发明的一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法利用由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子及杂合子的至少2个基准值。
根据一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法中利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与用于检测具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
根据一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法中利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养杂合子，上述杂合子由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因及具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因形成，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得基准值。
根据一实例，为了确定核苷酸多态性基因型，上述利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法中利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的反应容器中与用于检测具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养纯合子，上述纯合子由具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因形成，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得基准值。
根据一实例，为了分析试样的核苷酸多态性基因型，计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异，并与各个核苷酸多态性基因型的基准值进行比较。
根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号的充分的反应条件下获得上述基准值。例如，为了获得针对由有具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因及具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的杂合子的基准值，选择与各个核苷酸多态性等位基因的含量相同的反应条件，以在反应结束时提供针对各个核苷酸多态性等位基因的饱和信号。根据本发明的一实例，在上述基准值计算过程中获得的上述信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内选择上述基准值或者参照上述特定范围来选择上述基准值。
针对上述野生型等位基因的检测温度为上述相对较高检测温度，针对上述突变等位基因的检测温度为上述相对较低检测温度，当通过计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的比率来获得差异时，上述野生型纯合子试样表示特定范围内的比率，杂合子试样表示其他特定范围内的比率。
例如，野生型纯合子试样表示约1.0的比率，针对核苷酸多态性的杂合子试样表示约2.0的比率。
当试样为突变纯合子时，为了计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的比率，可使用在上述相对较高检测温度下检测出的背景信号。在这种情况下，计算出的比率可表示远远大于2.0的值，这表示试样的核苷酸多态性基因型为突变纯合子。择一性地，计算出的比率可表示属于根据突变杂合子表示的特定范围的比率(例如，约9.0)的值。
尤其，针对突变纯合子试样，即使在相对较高检测温度下产生错误的信号的情况下，上述比率也表示远远大于2.0的值，这表示试样内的核苷酸多态性基因型为突变纯合子。
因此，在用于核苷酸多态性基因型的本发明中，能够以仅利用在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异的方式确定核苷酸多态性基因型。
根据一实例，上述差异提供通过对在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的限定值。
根据一实例，利用包含野生型纯合子、突变纯合子或杂合子的标准试样来获得上述基准值，上述基准值用于分析从实验试样获得的差异。
III.利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，上述利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法包括：步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列，还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个不同检测温度下进行上述检测；以及步骤(b)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定至少3个靶核酸序列的存在，当确定具有上述至少3个靶核酸序列中的特定检测温度(certain detectiontemperature)的靶核酸序列的存在时，根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度relatively highest detection temperature)时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定上述靶核酸序列的存在。
本发明基于上述本发明的第一实施方式的原理，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
步骤(a)：与信号-产生机构的培养及信号检测
首先，在一个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的信号-产生机构一同培养所要分析的试样后，利用单一类型的检测器来检测所产生的信号。由上述信号-产生机构产生的信号不被单一类型的检测器区别。
在一个反应容器中，根据本发明被检测的上述靶核酸序列的数量包括3、4、5、6、7、8、9及10个以上的靶核酸序列，但并不限定与此。
借助相应的信号-产生机构检测各个上述至少3个靶核酸序列。各个上述至少3个靶核酸序列具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同的检测温度。
根据一实例，针对靶核酸序列分被配的上述检测温度相互具有至少2℃、3℃、4℃、5℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、15℃或20℃的差异。
上述靶核酸序列中的一个具有相对最高检测温度。为了检测具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列，使用可在上述相对最高检测温度下提供信号的信号-产生机构。
检测温度不仅是能够产生针对具有上述检测温度的靶核酸序列的信号，而且还是可产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度。在各个不同检测温度下进行上述检测。
根据一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个是以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，针对上述各个靶核酸序列的信号-产生机构是基于二聚物的形成产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，基于与靶核酸序列及与上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚物形成产生上述信号。根据一实例，基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生上述信号。
根据本发明的一实例，针对上述各个靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号-产生机构。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，上述检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，基于上述检测寡核苷酸的切割产生上述信号。根据一实例，通过检测寡核苷酸的切割以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式产生上述信号。
根据一实例，以依赖于上述检测寡核苷酸切割的方式的信号产生方法用于具有上述至少3个靶核酸序列中的上述相对最高检测温度的靶核酸序列。
根据本发明的一实例，这么对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对其余上述靶核酸序列的信号-产生机构是基于二聚物的形成的信号-产生机构。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对其余上述靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
根据本发明的一实例，在上述介导寡核苷酸的切割中放出片段，上述片段介导二聚物的形成或者在捕捉寡核苷酸中介导基于上述片段的延伸的检测寡核苷酸的切割。
根据本发明的一实例，上述至少3个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被上述单一类型的检测器区别。
根据本发明的一实例，在上述信号-产生机构以依赖于二聚物的形成的方式产生信号的情况下，基于上述二聚物的Tm值选择上述检测温度。
根据本发明的一实例，在上述信号-产生机构以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，任意选择上述检测温度。根据本发明的一实例，基于上述检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构可提供相对最高检测温度。
根据一实例，考虑到可由上述信号-产生机构产生信号的温度范围，预先确定针对靶核酸序列的检测温度。
根据一实例，考虑到可借助用于检测各个靶核酸序列的信号-产生机构产生信号的温度范围，预先确定针对上述各个靶核酸序列的检测温度。考虑到在检测温度中不重叠的检测温度范围及重叠的检测温度方位，可预先确定上述检测温度。
上述特定检测温度下的检测不仅用于检测针对具有上述检测温度的靶核酸序列的信号，而且还用于检测针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号。上述相对最高检测温度下的检测用于检测针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号。
例如，在上述靶核酸序列包含三个靶序列，在72℃、60℃及50℃的检测温度分别分配于上述三个靶序列的情况下，上述50℃的温度下的检测不仅包括针对具有50℃检测温度的靶核酸序列的信号的检测，而且还包括针对分别具有70℃及60℃检测温度的靶核酸序列的信号的检测。
本发明的特征之一是，通过在不同检测温度下检测表示上述至少3个靶核酸序列存在的信号，来以区别的方式确定上述至少3个靶核酸序列的存在。
步骤(b)：确定至少3个靶核酸序列的存在
在完成信号的检测后，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定至少3个靶核酸序列的存在。
根据一实例，为了确认在特定检测温度下检测出的信号是否包含根据具有上述特定检测温度的靶核酸序列提供的信号，而利用在高于上述特定检测温度的检测温度下检测出的信号，并以对在上述特定检测温度下检测出的信号进行分析的方式确定靶核酸序列的存在。
在至少3个靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在的情况下，根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。在上述检测温度中，上述特定检测温度为相对最高检测温度的情况下，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定上述靶核酸序列的存在。
根据一实例，上述差异包含以对在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号进行数学处理的方式获得的差异。
根据一实例，在高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号的情况下，考虑到在高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。这种实例可通过利用因信号的存在及不存在而引起的差异来确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。
例如，假设靶核酸序列包含4个靶序列，并且72℃、60℃、50℃及40℃的检测温度分别分配于上述靶序列，则在上述步骤(a)中，在60℃、50℃及40℃的检测温度下检测出信号。在确定具有上述40℃检测温度的靶核酸序列的存在的情况下，利用在高于上述特定检测温度(40℃)的1个以上的检测温度(60℃或50℃)下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异，来确定具有上述特定检测温度(40℃)的靶核酸序列。更明确地，为了确定具有40℃检测温度的靶核酸序列的存在，可使用在60℃的温度下检测出的信号及在40℃的温度下检测出的信号之间的差异、在50℃的温度下检测出的信号及在40℃的温度下检测出的信号之间的差异或上述2个差异。
可通过如上所述的方式确定具有其他检测温度(即，60℃及50℃)的靶核酸序列的存在。
上述术语“在高于特定检测温度的一个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异”包括在2个检测温度下的信号之间获得的差异。上述信号中的一个为在高于上述特定检测温度的检测温度中检测出的信号，另一个为在上述特定检测温度下检测出的信号。在高于上述特定检测温度的检测温度2个以上的情况下，可获得两个以上的差异。
上述术语“在一个以上的检测温度下检测出的信号及在特定检测温度下检测出的信号之间的差异”不仅包括在2个检测温度下检测出的信号之间的差异，而且还包括利用2个检测温度之间的差异及在其他检测温度下检测出的信号获得的差异。
择一性地，根据一实例，利用对在高于上述特定检测温度(60℃)的一个以上的检测温度(72℃)下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异，从而定具有特定检测温度(60℃)的靶核酸序列的存在。在高的上述检测温度(72℃)下未检测出信号的情况下，为了计算上述差异，可使用背景信号。
根据一实例，在高于上述特定检测温度(60℃)的检测温度(72℃)下未检测出信号的情况下，考虑到在高于上述特定检测温度(60℃)的检测温度(72℃)下未检测出信号，利用在上述特定检测温度(60℃)下检测出的信号来确定具有上述特定检测温度(60℃)的靶核酸序列的存在。
假设，若在上述最高检测温度(72℃)下检测出信号，则可确定为具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列存在。
根据一实例，在上述至少3个靶核酸序列中确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在的情况下，利用下一个高于上述特定检测温度的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，利用上述差异的步骤包括利用对在下一个高于上述特定检测温度的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异的步骤。
根据一实例，在下一个高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号的情况下，利用上述差异的步骤包括考虑到在第一个高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号的情况而利用在上述特定检测温度下检测出的信号的步骤。
例如，在确定具有上述40℃检测温度的靶核酸序列的存在情况下，利用在下一个高于上述特定检测温度(40℃)的检测温度(50℃)下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，为了确定在上述50℃及40℃检测温度下检测出的信号是否表示具有上述50℃及40℃检测温度的靶核酸序列的存在，而需要基准值。
根据本发明的一实例，根据用于获得上述差异的方法，为了分析上述获得的差异是否表示具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，可使用阈值。
根据本发明的一实例，根据用于获得上述差异的方法，能够以利用获得的上述差异本身的方式确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。例如，为了直接利用差异本身，在获得上述差异的过程中预先反映阈值。
根据本发明的一实例，为了确定靶核酸序列的存在而使用基准值。
在特定实例中，可通过基准值表示基于具有高于特定检测温度的检测温度的靶核酸序列提供的上述特定检测温度及高于上述特定检测温度的检测温度下的信号的差异。
在特定实例中，针对基于具有高于特定检测温度的检测温度的靶核酸序列提供的上述特定检测温度及对在高于上述特定检测温度的检测温度下的信号互不相同的情况的基准值与针对上述2个信号相同的情况的基准值相比，差异可以为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、12％、15％、20％或30％以上。
在特定实例中，针对具有高于从2个检测温度下的信号计算出的上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的基准值与针对上述2个信号相同的情况的基准值相比，当差异为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、12％、15％、20％或30％以上时，可将针对具有高于特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的基准值使用于确定具有上述特定低温检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，当为了确定是否使用基准值而进行上述比较时，基于信号的除法计算上述基准值。根据一实例，为了确定是否使用上述基准值而计算基准值的方法可与为了检测上述靶核酸序列而计算基准值的方法相同或不同。
根据一实例，在高于特定检测温度的检测温度下检测出针对多个靶核酸序列的信号的情况下，通过考虑针对多个靶核酸序列的以改变的检测温度下的信号变化的图案来使用针对多个靶核酸序列的基准值。
根据一实例，当具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列存在时，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在而使用上述基准值。
存在具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的情况包括在高于上述特定检测温度的检测温度下检测出显著信号的情况，上述显著信号用于表示具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，当具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列不存在时，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，而选择性地使用上述基准值。
存在具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的情况包括仅检测出具有与背景信号类似的强度的信号的情况。
针对上述靶核酸序列的全部组合或一部分选择性地组合可预先准备上述基准值。根据本发明的一实例，上述基准值为从上述组合获得的检测温度下的信号之间的差异。
根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号的充分的反应条件下获得基准值。例如，为了获得针对2个靶核酸序列的组合的基准值，可选择与与上述各个靶核酸序列的含量相同的条件，以提供针对各个靶核酸序列的饱和信号。根据本发明的一实例，在上述基准值计算过程中获得的上述信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内选择上述基准值或者参照上述特定范围来选择上述基准值。
考虑到用于获得差异的方法及实际检测结果，为了确定在上述试样中获得的差异的显著性，可使用上述基准值。为了在试样中获得上述差异可使用上述基准值，由此，上述基准值参与确定靶核酸序列的存在的过程。
根据本发明的一实例，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法中利用如下地获得的上述基准值中的至少1个基准值，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的所有组合，(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度以及上述特定检测温度下检测信号后，(iii)通过求出在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
在根据本发明检测至少3个靶核酸序列的情况下，可通过与为了信号检测而选择的2个检测温度的多种组合一同考虑靶核酸序列的多种组合来获得多种基准值。
根据本发明的一实例，从具有上述最高检测温度的靶核酸序列到具有上述最低检测温度的靶核酸序列，按它们的检测温度顺序确定上述靶核酸序列的存在，根据确定靶存在的方法适合地选择基准值。
在上述例中，为了获得用于确定具有上述特定检测温度(40℃)的靶核酸序列的存在的基准值，与信号-产生机构培养具有高于上述特定检测温度(40℃)的检测温度(60℃及50℃)的靶核酸序列的全部组合(即，具有上述60℃检测温度的靶核酸序列、具有上述50℃检测温度的靶核酸序列及具有上述60℃及50℃检测温度的靶核酸序列的组合)，不仅在高于上述特定检测温度(40℃)的1个以上的检测温度(60℃及50℃)检测信号，而且还在上述特定检测温度(40℃)下检测信号，然后，利用在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号来获得上述信号之间的差异。根据相同的方法，获得用于确定具有其它检测温度(即，60℃及50℃)的上述靶核酸序列的存在的基准值。
择一性地，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，上述方法还利用如下地获得的基准值中的至少1个基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的全部组合，(ii)在下一个高于上述特定检测温度的检测温度及上述特定检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在下一个高于上述特定检测温度的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来获得基准值。
在上述例中，为了获得用于确定具有上述特定检测温度(40℃)的靶核酸序列的存在的基准值，与用于产生信号的信号-产生机构培养具有高于上述特定检测温度(40℃)的检测温度(60℃及50℃)的靶核酸序列的全部组合(即，具有上述60℃检测温度的靶核酸序列、具有上述50℃检测温度的靶核酸序列及具有上述60℃及50℃检测温度的靶核酸序列的组合)，在下一个高于上述特定检测温度(40℃)的检测温度(50℃)下及在上述特定检测温度(40℃)下均检测信号之后，使用下一个高于上述特定检测温度的检测温度(50℃)下检测出的信号及在在上述特定检测温度(40℃)下检测出的信号之间的差异来获得上述信号之间的差异。通过相同的方法获得用于确定具有其他检测温度(即，60℃及55℃)的上述靶核酸序列的存在的基准值。
根据本发明的一实例，通过计算在高于上述特定检测温度的1个检测温度及上述检测温度下检测出的信号之间的比率或差异，来获得上述基准值。根据本发明的一实例，通过计算针对在高于上述特定检测温度的1个检测温度下检测出的信号的在上述特定检测温度下检测出的信号的比率来获得上述基准值。根据本发明的一实例，通过计算针对在上述特定检测温度下检测出的信号的在高于上述特定检测温度的1个检测温度下检测出的信号的比率来获得上述基准值。
根据一实例，在利用用于确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的基准值来获得阈值的情况下，可利用从多种组合的靶核酸序列获得的基准值中的特定基准值或一部分基准值来获得上述阈值。例如，当分析为在具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列中不存在1个靶核酸序列时，为了确定上述阈值而使用从不包含1个靶核酸序列的上述靶核酸序列的组合获得的基准值。
在一实例中，在检测至少3个靶核酸序列的情况下，为了确认具有特定检测温度的靶核酸序列的存在，在预先准备包含除了具有上述特定检测温度的靶核酸序列之外的靶核酸序列的组合标准试样之后，获得基准值。考虑到上述基准值，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在而获得阈值。
根据一实例，利用在上述特定检测温度下检测出的信号的步骤包括获得用于确定具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的存在的限定值的步骤，利用上述差异的步骤包括获得用于确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在的限定值的步骤。
根据本发明的一实例，利用上述差异的步骤包括获得用于确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在的限定值的步骤，当(i)对在高于上述特定检测温度的1个检测温度中检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号进行数学处理或者(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下未检测出信号时，考虑到在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下未检测出信号，利用在上述特定检测温度下检测出的信号获得上述限定值。
根据本发明的一实例，首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方式进行上述步骤(b)。
根据一实例，上述1个反应容器还包括至少1个附加装置，上述至少1个附加装置分别包括用于检测除了上述至少3个靶核酸序列之外的靶核酸序列的额外的至少3个信号-产生机构，在上述容器相互区别由至少3个信号-产生机构的各个装置产生的上述信号，借助不同的类型的检测器分别检测上述信号。
根据本发明的一实例，上述靶核酸序列包含核苷酸变异(尤其，核苷酸多态性)。
IV.利用不同检测温度及解链分析检测2个靶核酸序列
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，包括：步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的2个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度下进行上述检测；步骤(b)，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，进行对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析；以及步骤(c)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，在上述步骤(b)中，利用解链分析结果确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
步骤(a)：与信号-产生机构的培养及信号检测
首先，在在一个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的信号-产生机构一同培养所要分析的试样后，利用单一类型的检测器检测所产生的信号。由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别。
借助相应的信号-产生机构检测各个靶核酸序列。上述2个靶核酸序列的一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度。
根据本发明的一实例，通过利用不同的检测温度的实时检测方法检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，通过解链分析检测具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
虽然在上述相对较高检测温度下进行上述步骤(a)中的检测，但是在上述相对较低检测温度下不进行上述步骤(a)中的检测。
在进行解链分析期间，选择可产生信号的信号发生机构用于具有相对较低检测温度的靶核酸序列。
根据一实例，由于上述解链分析的信号-产生机构利用二聚物的杂交及变性，因而可根据上述步骤(a)的反应条件产生信号。
根据一实例，用于针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列产生信号的信号-产生机构需要构成为在上述相对较高检测温度下不产生信号。
在本发明的第四实施方式中，用于产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号的信号发生机构可根据反应条件在上述步骤(a)中产生信号或不产生信号。即使在特定反应条件下产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号，也由于在上述步骤(a)中的相对较高检测温度下进行信号检测，因而不会检测出上述产生的信号。
可在上述步骤(b)中产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号，并别被检测，因而并不需要在上述步骤(a)中产生上述信号。
根据一实例，用于上述解链分析的信号-产生机构不包括基于标记的探针或基于二聚物的切割产生信号的机构。上述解链分析利用杂交物的Tm值，因而需要排除所检测出的上述杂交物的切割。当进行切割时，有可能不会生成解链峰或者大大减少检测敏感度。并且，基于切割的信号在实时检测方法中有可能成为假阳性信号。
在至少可产生针对具有上述相对较高检测温度的信号的条件下进行上述步骤(a)。
根据一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个是以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，基于靶核酸序列及与上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚物形成产生上述信号。根据一实例，借助以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生上述信号。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构。根据一实例，在靶核酸序列与检测寡核苷酸杂交后，通过上述检测寡核苷酸的切割来产生上述信号。根据一实例，基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物来产生上述信号。
根据一实例，针对上述各个靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
根据一实例，以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式的信号产生用于具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列。
尤其，由于如下的理由，利用依赖于针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的检测寡核苷酸的切割的方式的信号产生非常有利，(i)可在相对宽的检测温度范围内选择检测温度；(ii)与杂交接近法相比可选择更高的温度；以及(iii)可通过选择适合的信号-产生机构及反应条件(例如，选择无法产生无切割且杂交的信号的信号-产生机构或者选择使大部分的检测寡核苷酸被切割的条件)，在解链分析过程中不提供信号。
以依赖于上述二聚物的形成(例如，分子信标)的方式产生信号的信号-产生机构也可通过基于依赖于反应条件的5’-核酸酶的切割来提供信号。只要是为了产生基于切割的信号而使用上述信号-产生机构，则可将上述信号-产生机构可视为提供基于切割的信号的信号-产生机构。
根据一实例，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于二聚物的形成的信号-产生机构。
根据一实例，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，上述2个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被单一类型的检测器区别。
在与用于产生信号的两个信号-产生机构一同培养(反应)之后，利用单一类型的检测器来检测上述产生的信号。在可产生针对具有相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的相对较高检测温度下进行上述检测。
步骤(b)：解链分析
然后，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下进行针对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析。
在本说明书中为了说明的便利性，仅对在完成上述步骤(a)中的检测后进行上述步骤(b)的内容进行说明。需要理解的是，考虑到本发明的根本原理，可在进行上述步骤(a)中的检测之前进行上述步骤(b)。因此，在上述步骤(a)的检测之前进行上述步骤(b)的过程也属于本发明的范围。
上述步骤(b)可通过本发明所属技术领域的普通技术人员公知的多种解链分析过程来进行。在不特别明示的情况下，在本说明书中所使用的术语“解链分析(stringency)”以不仅包括狭义的解链分析且还包括杂交分析的意义来使用。狭义的解链分析是指在根据温度调节增加的在严格条件下检测二聚物的解离(dissociation)的方法。狭义的杂交分析是指在根据温度调节减少的严格的条件下检测二聚物的结合(association)的方法。在不特别明示的情况下，在本说明书中所使用的术语“解链曲线(melting curve)”或“解链峰曲线(melting peak curve)”以包括从狭义的解链分析获得的解链曲线或解链峰曲线且还包括从杂交分析获得的杂交曲线或杂交峰曲线的意义来使用。解链曲线或杂交曲线可如现有技术，例如，通过在美国专利第6174670号及第5789167号、Drobyshev等、Gene 188:45(1997)；Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002)；Livehits等，J.Biomol.Structure Dynam.11:783(1994)；以及Howell等，Nature Biotechnology 17:87(1999)中说明的方法来得到。例如，解链曲线或杂交曲线可由利用杂交严格度(stringency)的参数的输出信号(output signal)变化的图表绘制(graphic plot)或显示(display)构成。输出信号能够直接对杂交参数进行绘图。典型地，例如，解链曲线或杂交曲线在Y-轴具有表示二聚物结构的程度(即，杂交程度)的荧光，在X-轴具有绘图有杂交参数。
参照在美国专利第8039215号的公开的内容记述解链(杂交)曲线分析及解链(杂交)峰分析。
上述解链分析利用“Tm”值。在本说明书中所使用的术语“Tm”意味着双链核酸分子的集合(population)的一半被解离为单链分子的解链温度。根据杂交的核苷酸的长度及G/C含量确定Tm值。可通过Wallace rule(R.B.Wallace等，Nucleic Acids Research,6:3543-3547(1979))及nearest-neighbor方法(SantaLucia J.Jr.等,Biochemistry,35:3555-3562(1996))；Sugimoto N.等，Nucleic Acids Res.,24:4501-4505(1996))等的现有方法计算出Tm值。
根据一实例，通过以增加温度的方式检测(狭义的解链分析)所产生的信号来进行上述步骤(b)。择一性地，通过以减少温度的方式检测(狭义的杂交分析)所产生的信号来进行上述步骤(b)。
根据一实例，适用于上述解链分析的信号-产生机构还包括在规定范围的温度下从二聚物的形成产生信号的任何机构。并且，在用于实时检测方法的信号-产生机构中，作为替代解链分析的方式，还使用基于检测寡核苷酸的杂交产生信号的机构。
根据一实例，利用以依赖于二聚物的形成的方式产生信号的信号-产生机构来进行上述步骤(b)。尤其，利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生信号的信号-产生机构来进行上述步骤(b)。
基于以依赖于上述介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号可通过包括探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法(WO 2012/096523)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交-解链方法(WO 2013/115442)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交-解链方法(PCT/KR2013/012312)的多种方法产生。上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交-解链方法及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交-解链方法相当于分别利用解链分析的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法、利用解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交-解链方法及利用解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交-解链方法。在上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，为了在上述步骤(b)中的解链分析而利用借助切割不产生信号的方法。
在以前的专利文献中也记载了上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交-解链方法及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交解链方法。
通过上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法进行的步骤(a)～步骤(b)包括如下的步骤。
包括：步骤(a)，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，从上述探测和标记寡核苷酸放出的片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来进行延伸反应，通过使与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有可通过(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度、(ⅲ)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度调节的Tm值；步骤(e)，通过在规定范围的温度下对上述延伸二聚物进行解链，来提供表示上述延伸二聚物的存在的靶信号，根据(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的至少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间插入于上述延伸二聚物内的标记、(ⅲ)在上述延伸反应期间插入于上述延伸二聚物内的标记和与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(ⅳ)插入标记(intercalating label)提供上述信号；以及步骤(f)，通过检测上述信号来检测延伸二聚物，上述延伸二聚物的存在表示靶核酸序列的存在。
在这种情况下，上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸解链方法还包括以在反复循环之间包含变性的方式反复进行上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分的而步骤。在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法的步骤(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于靶核酸序列的扩增的引物组。在这种情况下，上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸解链方法还包括以在反复循环之间包含变性的方式反复进行上述步骤(a)～步骤(f)的全部或一部分的步骤。
通过上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法进行的本发明的步骤(a)步骤～步骤(b)包括如下的步骤。
包括：步骤(a)，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，从上述探测和标记寡核苷酸放出的片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来进行延伸反应，通过使与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸形成延伸二聚物；步骤(e)，通过检测在规定范围的温度下以依赖于上述延伸链的存在的方式产生的信号来进行解链分析。
步骤(c)：确定靶核酸序列的存在
最后，利用在上述步骤(a)中检测出的信号来确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，利用上述步骤(b)中的解链分析结果来确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
根据本发明的一实例，上述靶核酸序列包含核苷酸变异(尤其，核苷酸多态性)。
当组合用于实时检测且基于切割产生信号的信号-产生机构和用于解链分析且基于以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生信号的信号-产生机构时，可获得本发明的预料不到的结果。在这种情况下，为了解链分析，应排除参与二聚物的形成且借助切割直接产生信号的信号-产生机构。
值得注目的是，以组合作为实时过程的基于切割产生信号的信号-产生机构(例如，TaqMan方法)及作为解链分析的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法的方式实施本发明，从而提供非常优秀的结果。
根据一实例，利用在上述步骤(a)中检测出的信号的步骤包括获得用于确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的限定值的总部后。
根据本发明的一实例，上述靶核酸序列包含核苷酸变异(尤其，核苷酸多态性)。
V.利用不同检测温度及解链分析检测至少3个靶核酸序列
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用检测温度分析及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，包括：步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，通过检测温度分析检测上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度以及高于上述检测温度的1个以上的检测温度均进行上述检测；步骤(b)，为了在上述至少3个靶核酸序列中确定除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，对上述步骤(a)的培养结果物进行解链分析；以及步骤(c)，(i)根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定上述靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的存在，当在上述至少3个靶核酸序列的上述一部分靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，则根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)在上述步骤(b)中，根据解链分析的结果确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在。
本发明基于上述的本发明的第一实施方式至第四实施方式的原理，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
步骤(a)：与信号-产生机构的培养及信号检测
首先，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养所要分析的试样后，利用单一类型的检测器检测所产生的信号。由上述至少3个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别。
上述靶核酸序列中的一个具有相对最高检测温度。可在相对最高检测温度下提供信号的信号-产生机构用于检测具有相对最高检测温度的靶核酸序列。
在本发明中，通过上述检测温度分析检测至少3个靶核酸序列中的一部分，并且通过解链分析检测至少3个靶核酸序列中的剩余部分。
语句“至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列”中术语“一部分(some)”包括1个以上。在不明确明示的情况下，在本说明书中所使用的术语“检测温度分析(detectiontemperature analysis)”是指包括用于检测靶核酸序列的在不同检测温度下的检测的实时检测。
用于产生针对通过上述解链分析进行分析的靶核酸序列的信号的信号-产生机构可根据反应条件在上述步骤(a)中产生信号或不产生信号。可在上述步骤(b)中产生针对通过上述解链分析进行分析的靶核酸序列的信号，并被检测出，因此并不需要在上述步骤(a)中产生上述信号。
上述至少3个靶核酸序列需要分别利用具有不同检测温度的信号-产生机构。
根据一实例，由于用于上述解链分析的信号-产生机构利用二聚物的杂交及变性，因而可根据在上述步骤(a)中的反应条件来产生信号。
根据一实例，在适合产生针对通过上述检测温度分析检测的靶核酸序列的至少1个信号的条件下进行上述步骤(a)。
根据一实例，在考虑检测温度后，选择通过上述检测温度分析所要分析的靶核酸序列。尤其，首先选择具有上述最高检测温度的靶核酸序列之后，按检测温度顺序选择一部分序列。
根据一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个是以依赖于二聚物的形成的方式产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，针对上述各个靶核酸序列的信号-产生机构是通过二聚物的形成产生信号的信号-产生机构。
根据一实例，基于靶核酸序列及与上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚物的形成产生上述信号。根据一实例，基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生上述信号。
根据本发明的一实例，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
根据一实例，信号-产生机构中的至少1个是以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构。根据一实例，上述检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交之后，通过上述检测寡核苷酸的切割，来产生上述信号。根据一实例，以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式通过检测寡核苷酸的切割来产生上述信号。
根据一实例，以依赖于上述检测寡核苷酸的切割的方式的信号产生仅使用于上述至少3个靶核酸序列中的具有相对最高检测温度的靶核酸序列。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对其他靶核酸序列的信号-产生机构是基于二聚物的形成的信号-产生机构。
根据本发明的一实例，针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对其他靶核酸序列的信号-产生机构是基于以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式的二聚物的形成产生信号。
例如，通过TaqMan方法产生针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号，通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法或探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法产生针对其他靶核酸序列的信号。
根据本发明的一实例，上述至少3个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被上述单一类型的检测器区别。
在一个反应容器中，根据本发明被检测的上述靶核酸序列的数量包括3、4、5、6、7、8、9及10个以上的靶核酸序列，但并不限定与此。
与产生信号的至少3个信号-产生机构一同培养(反应)试样之后，利用单一类型的检测器检测上述产生的信号。根据一实例，通过检测温度分析检测上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度及高于上述检测温度的1个以上的检测温度下进行上述检测。
根据一实例，在为了进行上述检测温度分析所需的全部检测温度下检测信号。
利用单一类型的检测器检测上述产生的信号。上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同的检测温度。上述检测温度是不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号，而且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度。
根据一实例，通过上述检测温度分析检测出的靶核酸序列具有高于通过上述解链分析检测出的靶核酸序列的检测温度的检测温度。
步骤(b)：解链分析
在上述至少3个靶核酸序列中，为了确定除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下进行针对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析。
在本说明书中，为了说明的便利性，仅对在完成上述步骤(a)中的检测后进行上述步骤(b)的内容进行说明。需要理解的是，考虑到本发明的根本原理，可在进行上述步骤(a)中的检测之前进行上述步骤(b)。因此，在上述步骤(a)的检测之前进行上述步骤(b)的过程也属于本发明的范围。
根据一实例，利用以依赖于二聚物的形成的方式产生信号的信号-产生机构来进行上述步骤(b)。尤其，根据基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-解链方法进行上述步骤(b)。
步骤(c)：确定靶核酸序列的存在
最后，利用在上述步骤(a)中检测出的信号及在上述步骤(b)中的解链分析结果来确定试样内上述至少3个靶核酸序列的存在。
利用在上述步骤(a)中检测出的信号来确定在上述靶核酸序列中一部分靶核酸序列的存在。在上述至少3个靶核酸序列的上述一部分靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在的情况下，根据在高于上述特定检测温度的一个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述特定检测温度为上述检测温度温度中的相对最高检测温度的情况下，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的上述靶核酸序列的存在。
根据一实例，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述方法中利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的所有组合，(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度及上述特定检测温度下检测信号之后，(iii)通过求出在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来获得基准值。
择一性地，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述方法中还利用如下地获得的基准值，即，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的所有组合，(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度及上述特定检测温度下检测信号之后，(iii)通过求出在下一个高于上述特定检测温度的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来获得基准值。
根据一实例，为了获得针对通过上述检测温度分析检测出的靶核酸序列的信号或基准值之间的的差异，当需要针对通过上述解链分析检测出的靶核酸序列的检测温度下的信号检测时，可在针对通过上述解链分析检测出的靶核酸序列的检测温度下收集信号。
根据上述步骤(b)中的解链分析的结果确定在通过上述检测温度分析确定的上述至少3个靶核酸序列中的除了一部分靶核酸序列之外的靶核酸序列的存在。
根据本发明的一实例，首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方式进行上述步骤(b)。
根据一实例，确定基于上述检测温度分析的靶核酸序列的存在的步骤可利用于确定基于上述检测温度分析的靶核酸序列的存在(例如，用于选择基准值)。
在以实时方式检测上述至少3个靶核酸序列的情况下，基于切割的信号产生仅用于一个靶核酸序列。为了其他靶核酸序列，为了改善分析的效率及准备度(readiness)，可使用基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法。
根据本发明的一实例，上述靶核酸序列包含核苷酸变异(尤其，核苷酸多态性)。
VI.利用多个检测温度检测靶核酸序列的试剂盒
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的试剂盒，包括：(a)2个信号-产生机构，用于检测上述2个靶核酸序列，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个序列具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个序列具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下均进行上述检测；以及(b)说明书，记载有被命名为利用不同检测温度的试样内2个靶核酸序列的检测的实时方式I的本发明的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度分析试样内核酸序列核苷酸多态性基因型的试剂盒，包括：(a)信号-产生机构，用于检测核苷酸多态性等位基因，借助相应的信号-产生机构检测各个上述核苷酸多态性等位基因，上述核苷酸多态性等位基因中的一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较高检测温度，另一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性基因的信号以及具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下进行上述检测；以及(b)说明书，记载有被命名为利用不同检测温度的核苷酸多态性基因型分析的实时方式II的本发明的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度检测试样内至少3核酸序列试剂盒，包括：(a)至少3个信号-产生机构，用于检测上述至少3个靶核酸序列，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个不同检测温度下进行上述检测，以及(b)说明书，记载有被命名为利用不同检测温度的试样内至少3个靶核酸序列的检测的实时方式III的本发明的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度及解链分析检测试样内至少2个靶核酸序列的试剂盒，包括：(a)2个信号-产生机构，用于检测上述2个靶核酸序列，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度下进行上述检测，针对具有上述相对较高检测温度的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于形成二聚物的信号-产生机构；以及(b)说明书，记载有被命名为利用不同检测温度及解链分析的2个靶核酸序列的检测的实时方式IV的本发明的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的试剂盒，包括：(a)至少3个信号-产生机构，用于检测上述3个靶核酸序列，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，通过检测温度分析检测上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度及高于上述检测温度的一1以上的检测温度下进行上述检测，针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对剩余上述靶核酸序列的信号-产生机构是基于二聚物的形成的信号-产生机构；以及(b)说明书，记载有被命名为利用检测温度及解链分析的试样内至少3个靶核酸序列的检测的实时方式V的本发明的方法。
为了实施本发明而制备本发明的试剂盒，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
上述的本发明的所有试剂盒可选择性地包含缓冲液、脱氧核糖核酸聚合酶辅助因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸等的用于进行靶扩增聚合酶链式反应(例如，聚合酶链式反应)所需的试剂。选择性地，上述试剂盒还可包含多种多核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂及用于抑制脱氧核糖核酸聚合酶活性的抗体。并且，上述试剂盒可包含进行阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。在特定反应中所使用的试剂的最佳量可由本发明所属技术领域的普通技术人员容易地确定。上述试剂盒的组成成分可存在于独立的容器或者多个组成成分可存在于1个容器内。
用于记述或实施本发明的方法的说明书可存储于适合的存储介质。例如，说明书可印刷于纸及塑料等的基板。在再一实例中，说明书能够以存在于只读储存器(CD-ROM)及软盘等的适合的计算机可读存储介质的电子存储数据文件方式存在。在另一实例中，在上述试剂盒内不包括实质的说明书，只是提供从远程数据源通过互联网等获得说明书的机构。上述实例中的一例是包含可浏览说明书的网址和/或可下载说明书的网址的试剂盒。
VII.利用多个检测温度检测靶核酸序列的存储介质及装置
在以下记述的存储介质、装置及计算机程序用于在计算机中实施本发明，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
在本发明的再一实施方式中，本发明提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法，上述利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法包括：步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个序列具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个序列具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度；以及步骤(b)，根据所接收的上述信号确定上述2个靶核酸序列的存在，(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在高于上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
根据一实例，当具有相对较高检测温度的靶核酸序列存在时，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，使用具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值。
根据本发明的一实例，具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值存储于计算机可读存储介质。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质包含在运行本方法期间输入上述基准值的指示。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质还包含指示，上述指示运行用于获得上述基准值的方法的处理器。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，运行用于确定试样内2个靶核酸序列的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质，上述决定试样内2个靶核酸序列的方法包括：步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，利用单一类型的检测器检测所产生的上述信号，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度；以及步骤(b)，根据所接收的上述信号确定上述2个靶核酸序列的存在，(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在高于上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，运行用于确定试样内2个靶核酸序列的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质。
根据本发明的一实例，上述计算机程序包含具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的基准值。根据本发明的一实例，上述计算机程序包含在运行本方法期间输入上述基准值的指示。根据本发明的一实例，上述计算机程序还包含指示，上述指示运行用于获得上述基准值的方法的处理器。
在借助上述处理器实施上述方法的情况下，通过启动上述程序指示来使处理器运行上述的本发明的方法。上述程序指示可包含用于接收第一信号及第二信号的指示，并且可包含利用所接收的上述信号来确定上述2个靶核酸序列的存在的指示。
可在处理器实施上述的本发明的方法，例如，可在位于独立计算机(stand-alonecomputer)、与网络相连接的计算机(network attached computer)或实时聚合酶链式反应设备等数据收集装置(data acquisition device)的处理器中实施上述的本发明的方法。
上述计算机可读存储介质包括刻录光盘(CD-R)、只读储存器(CD-ROM)、数字多功能光盘(DVD)、闪存存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘、通用串行总线(USB)、磁带、迷你光碟(MINIDISC)、非易失性存储卡、电可擦只读存储器(EEPROM)、光盘(CD)、光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、系统存储器及web服务器等多种存储介质。
与上述信号相关的数据(例如，强度、扩增循环数及检测温度)可通过几个设备来接收。例如，上述数据可借助位于聚合酶链式反应数据收集装置的处理器收集。在进行收集期间可实时提供提供上述数据或者可储存于存储器单元或缓冲区，在完成实验后可在处理器厅上述数据。类似地，通过与上述收集装置的网络连接(例如，局域网(LAN)，虚拟专用网络(VPN)、互联网及内联网)或直接连接(例如，通用串行总线、其它直接有线连接或无线连接)向独立计算机系统等额外的系统提供上述数据或者可向光盘、数字多功能光盘、软盘、便携式硬盘或独立计算机系统等便携式介质提供上述数据。类似地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网，无线通信网络)向服务器系统提供上述数据集。在上述相对较高检测温度下检测出上述信号的情况下，在接收或收集上述数据后，在上述数据分析过程中提供从用于确定靶核酸序列的存在的信号之间的差异获得的加工信号。上述处理器通过处理与上述信号相关的接收的数据，来提供反应在上述2个检测温度下的信号之间的差异的加工信号。例如，上述处理器通过处理所接收的上述数据来获得针对在上述相对较高检测温度下检测出的信号的在在上述相对较低检测温度下检测出的信号的比率。
用于实现运行本发明的处理器的指示可包含在逻辑系统。虽然可向便携式硬盘、通用串行总线、软盘、光盘及数字多功能光盘等的任何软件存储介质提供上述指示，但是可进行下载且可存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着随机存取存储器、只读存储器等其他存储器)。用于运行本发明的计算机代码可运行为如C、C++、Java、VisualBasic、VBScript、JavaScript、Perl及XML等多种代码语言。并且，多种语言及协议可利用于基于本发明的数据和命令的外部及内部存储和传送。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置，上述利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置包括：(a)计算机处理器；以及(b)与上述计算机处理器耦合的计算机可读存储介质。
根据一实例，上述装置还包含：反应容器，可收容试样及信号-产生机构；温度调节机构，用于调节上述反应容器的温度；和/或单一类型的检测器，可检测借助上述信号-产生机构产生的信号。
根据一实例，上述计算机处理器仅不使上述单一类型的检测器检测上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的由信号-产生机构产生的信号，而且还可计算在上述相对较高检测温度下检测出的信号及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异。上述处理器可被设置成1个处理器进行两种行为的结构，即，可进行2个检测温度下的检测及计算上述差异的命令。择一性地，处理器单元可被设置成2个处理器分别进行两种行为的结构。
上述装置的第一个必要的特征为上述装置具有处理器，上述处理器用于可检测在上述2个检测温度下产生的信号。根据一实例，当上述信号与上述靶核酸序列的扩增一同产生时，上述装置包括处理器，上述处理器用于能够在每次扩增循环中检测在上述2个检测温度下产生的信号。
上述装置的第二个必要的特征为上述装置具有处理器，上述处理器通过对在上述2个检测温度下检测的信号进行处理来获得上述信号之间的差异。根据一实例，上述信号之间的差异通过数学处理表示为数字值。
根据一实例，上述处理器能够以在用于检测靶核酸序列的现有装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)设置软件的方式实现。根据一实例，上述装置可在至少2个检测温度下检测信号，并且包括对至少2个检测结果进行数学处理的处理器。
在本发明的另一实施方式中，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内至少3个靶核酸序列的存在，上述利用不同检测温度对确定试样内至少3个靶核酸序列的存在的方法包括：步骤(a)，接收在至少3个检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个不同检测温度下进行上述检测；以及步骤(b)，根据所接收的信号确定上述至少3个靶核酸序列的存在，在上述至少3个靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，根据在高于特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定上述靶核酸序列的存在。
根据本发明的一实例，基准值存储于计算机可读存储介质。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质包含在运行上述方法期间输入上述基准值的指示。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质还包含实现处理器的指示，上述处理器运行用于获得上述基准值的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，上述计算机程序运行进行用于利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的上述方法的处理器且存储于计算机可读存储介质或用于存储于计算机可读存储介质。
在本发明的再一实施方式中，本发明提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度对试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型进行分析的方法，上上述利用不同检测温度对试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型进行分析的方法包括：步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述核苷酸多态性等位基因，上述核苷酸多态性等位基因中的一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较高检测温度，另一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性基因的信号以及具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度；以及步骤(b)，根据所接收的信号之间的差异确定核苷酸多态性基因型。
根据本发明的一实例，针对由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子和/或由具有上述低温检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子和/或杂合子的基准值存储于上述计算机可读存储介质。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质包含在运行上述方法期间输入上述基准值的指示。根据本发明的一实例，上述计算机可读存储介质还包含实现处理器的指示，上述处理器运行用于获得上述基准值的方法。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，上述计算机程序运行用于利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的上述方法的处理器且存储于计算机可读存储介质或用于存储于计算机可读存储介质。
根据本发明的一实例，上述计算机程序包含对由具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子和/或由具有上述低温检测温度的核苷酸多态性等位基因形成的纯合子和/或杂合子的基准值。根据本发明的一实例，上述计算机程序包含在运行上述方法期间输入上述基准值的指示。根据本发明的一实例，上述计算机程序还包含用于运行处理器的指示，上述处理器进行用于获得上述基准值的方法。
在本发明的再一实施方式中，本发明提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法，上述利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法包括：步骤(a)，均接收用于确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在的上述相对较高检测温度下的信号及用于确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的从规定范围的温度下的解链分析的信号，借助相应的信号-产生机构检测上述各个靶核酸序列，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助上述相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助上述相应的信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度是能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度是能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在上述规定范围的温度下进行解链分析；以及步骤(b)，根据所接收的上述信号确定2个靶核酸序列的存在，根据在上述相对较高检测温度下的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，根据从上述解链分析的信号确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，上述计算机程序运行用于利用不同检测温度及解链分析检测试样内的2个靶核酸序列的上述的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质或用于存储于计算机可读存储。
在本发明的再一实施方式中，本发明提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，上述利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法包括：步骤(a)，(i)为了确定上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列的存在，接收上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列的检测温度及高于上述检测温度的1个以上的检测温度下的信号，以及(ii)为了确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在，接收从在规定范围的温度下的解链分析的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度是不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，通过分析检测温度来检测上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度及高于上述检测温度的1个以上的检测温度下进行上述检测，为了确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在而进行上述规定范围的温度下的解链分析；以及步骤(b)，(i)借助所接收到的上述信号确定上述靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的存在，其中，在上述至少3个靶核酸序列的上述一部分靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在的情况下，根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，当上述特定检测温度为上述检测温度中的相对最高检测温度时，借助在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)借助从上述解链分析的信息确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供计算机程序，上述计算机程序运行利用检测温度分析及解链分析来检测试样内至少3个靶核酸序列的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质或用于存储于计算机可读存储介质。
对本发明的特征及优点进行归纳如下：
(a)在利用不同检测温度的本发明中，即使在一个反应容器中仅用单一类型的标记，也能够以现有的实施方式检测多个靶核酸序列。在现有技术中，在完成靶扩增后，通过解链分析检测多个靶核酸序列。与此不同地，由于本发明在靶扩增后无需解链分析，从而大大缩短分析时间。
(b)有趣地是本发明人确认到，在利用信号-产生机构产生针对靶核酸序列的信号的情况下，(i)根据信号发生机构的类型，在特定温度下可调节信号的检测，(ii)在已选择的2个检测温度下检测信号时，在上述2个检测温度下检测的信号根据特定特定图案变化。本发明人将其适用于靶核酸序列的检测，从而实现了本发明。
(c)在利用不同检测温度的本发明中，通过使用借助以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物来提供信号的信号-产生机构(例如，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法)可诱导意外的效果。第一，在利用基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法等介导寡核苷酸的方法中，可容易调节形成的二聚物的Tm值，从而可容易地选择检测温度。第二，当与利用用于靶扩增的具有5’-核酸酶活性的聚合酶一同利用在从与靶核酸序列杂交的探针直接提供信号的方法时，上述探针有可能被上述5’-核酸酶活性切割，由此可对信号的解释产生影响。如上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法，利用介导寡核苷酸的方法通常利用基于5’-核酸酶活性的介导寡核苷酸的切割，因此，最终通常不产生与信号的解释相关的这些问题。最后，如基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法，在利用介导寡核苷酸的方法中，由于上述二聚物具有与靶核酸序列无关的序列，因而可形成具有特定Tm值的二聚物。与此不同地，在利用与靶核酸序列直接杂交的探针的方法中，由于所形成的二聚物中的至少1条链包含与靶核酸序列互补的序列，因此在靶核酸序列上存在变异的情况下，可形成具有未意图的Tm值的二聚物。
(d)在以实时方式利用不同检测温度来检测多个靶核酸序列的本发明的一实例中，通过组合(i)针对1个靶核酸序列的以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构(例如，TaqMan方法)及(ii)针对其他靶核酸序列的借助以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物提供信号的信号-产生机构(例如，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法)可诱导意外的效果。
为了上述检测寡核苷酸的切割，利用上述检测寡核苷酸的切割的方法通常利用具有5’-核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)。在通过检测探针的直接杂交产生信号的现有方法(例如，分子信标方法、杂交探针方法或Hybeacon方法)中，上述检测探针被具有5’-核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)切割的可能性非常高。上述检测探针的切割有可能导致因检测探针的消耗而引起的敏感度减少(例如，杂交探针方法)，并且在利用切割-依赖性信号转导的方法中可导致假阳性信号(例如，分子信标方法)。被标记的引物方法(例如，日出方法或蝎形方法)不存在如上述探针方法针对切割的问题，但是存在为了调节检测温度而需要调节扩增产物本身的Tm值的缺点。对比值，由于上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法利用与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割，因此不受基于具有5’-核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)的影响。并且，上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法可容易地调节形成的二聚物的Tm值，从而可容易地选择检测温度。
(e)对一部分靶利用实时检测，对其他靶利用解链分析，从而在1个反应容器中检测多个靶核酸序列的本发明的一实例中，可选择适合于待分析的靶核酸序列的特性的信号-产生机构，由此能够以更效率的方式检测多个靶核酸序列。
(f)在利用实时检测及解链分析来检测多个靶核酸序列的本发明的一实例中，作为针对以实时方式检测出的靶核酸序列的信号-产生机构，以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构(例如，TaqMan方法)能够以进一步提高的便利性及效率检测多个靶核酸序列。在TaqMan方法等利用检测寡核苷酸的切割的方法中会发生检测探针的切割，在这种情况下，在完成实时反应后，在解链分析中不存在可产生信号的二聚物，由此，可容易选择针对通过解链分析检测出的其他靶核酸序列的Tm值。
(g)在通过实时检测及解链分析检测多个靶核酸序列的本发明的一实例中，(i)针对一个靶核酸序列的以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号-产生机构(例如，TaqMan方法)及(ii)针对其他靶核酸序列的借助以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物提供信号的信号-产生机构(例如，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法)的组合可诱导意外的效果。
根据利用靶核酸序列及检测寡核苷酸之间的杂交的现有技术，存在因探针切割而引起的敏感度减少(包括在解链分析中的敏感度减少)及因切割而引起的假阳性产生等严重的问题。本发明完全脱离这些问题，在上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，可容易调节为了检测而使用的二聚物的Tm值，由此可容易选择为了实时检测而使用的检测温度及为了解链分析而使用的峰Tm值。
通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明，在所附的发明要求保护范围中所公开的本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：基于包括不同温度下的信号检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的两个靶检测
本发明人利用1个检测通道及不同温度下的信号检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应进行了在1个反应容器中可否检测两个靶核酸的实验。
为了上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌(NG，Neisseria gonorrhoeae)的基因组脱氧核糖核酸及砂眼衣原体(CT，Chlamydiatrachomatis)的基因组脱氧核糖核酸作为靶核酸序列使用。
为了检测砂眼衣原体及淋球菌，而使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应。在靶存在的情况下，探测和标记寡核苷酸被切割，并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚物(二聚物捕捉和模板化寡核苷酸)。通过上述延伸二聚物的形成提供信号，在延伸二聚物-形成温度下测定信号，从而可获得扩增曲线。
在本实施例中，考虑到信号发生机构，选择“72℃”作为用于砂眼衣原体的信号检测温度，选择“60℃”作为用于淋球菌的信号检测温度。根据上述砂眼衣原体或淋球菌的存在所生成的延伸二聚物具有基于其序列及长度得到调节的可调节的Tm值。在本实施例中，上述延伸二聚物的序列及长度被设计成在72℃的温度下形成上述二聚物来提供信号。另一方面，针对淋球菌的上述延伸二聚物的序列及长度被设计成在60℃的温度下形成上述二聚物来提供信号，但是在72℃的温度下不形成上述二聚物并被解离，从而提供不同的信号。在72℃的检测温度下，产生针对上述砂眼衣原体的信号并检测出信号。在60℃的检测温度下，不仅产生针对上述砂眼衣原体的信号，而且还产生针对上述淋球菌的信号被并检测出。
上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸以防止其的延伸的方式被碳间隔区阻断。上述捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端由荧光报道分子(CAL Fluor Red610)标记以及在其模板化部位由猝灭分子(BHQ-2)标记(序列4及序列8)。
准备了分别包含砂眼衣原体、淋球菌、砂眼衣原体及淋球菌的混合物及无靶的对照组的4个反应管。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列2)
NG_PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(序列3)
NG_CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3’(序列4)
砂眼衣原体_F 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3’(序列5)
CT_R 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3’(序列6)
CT_PTO 5’-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3’(序列7)
CT_CTO 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3’(序列8)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或者10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列3)、1pmole的的捕捉寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸(序列4)，5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列5)及5pmole的下游引物(序列6)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)以及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司(Bio-Rad))，并在50℃的温度下反应5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下变性30秒钟、在60℃的温度下变性60秒钟、在72℃的温度下变性30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。
如图1A所示，在沙眼衣原体存在的情况下(管(1)及管(3))，在72℃的温度下检测出了信号。在仅存在淋球菌的情况下(管(2))，在60℃的温度下检测出了信号，但是在72℃的温度下未检测出信号。在靶核酸不存在的情况下(管(4))未检测出信号。图1A的结果示出，在作为相对较高检测温度的72℃的温度下产生针对具有上述相对较高检测温度的沙眼衣原体的信号，但是未产生对淋球菌的信号。因此，可知如下：利用上述相对较高检测温度下的信号检测可确定具有上述相对较高检测温度的沙眼衣原体的存在。并且在管(2)中，通过利用因上述相对较高检测温度下的信号的不存在及相对较低检测温度下的上述信号的存在而引起的差异，可确定具有上述相对较低检测温度的淋球菌的存在。
为了试验在从具有上述相对较高检测温度的沙眼衣原体的信号存在的情况或不存在的情况下是否也可检测具有上述相对较低检测温度的淋球菌的存在，而利用多种接近法计算了在上述相对较高检测温度及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异(图1B～图1E)。
上述图1B示出72℃及60℃的温度下的端点的RFU值的比率(所有RFU值来源于装置软件中的“基线扣除曲线拟合(baseline subtracted curve fit)”分析数据，并被送出)。仅存在沙眼衣原体时(管(1))的比率为1.2，但是砂眼衣原体及淋球菌均存在时(管(3))的比率为2.1。并且，仅存在淋球菌时(管(2))的比率及无任何靶核酸时(管(4))的比率分别为36.7及0.7。为了确定淋球菌的存在或不存在，而适用阈值1.5。根据上述阈值，在管(2)及管(3)中确认淋球菌的存在，并确认到在管(1)及管(4)中无淋球菌。考虑从仅包含砂眼衣原体的最终-比率(End-Raio)来确定上述阈值。如管(2)，在确定为具有相对较高检测温度的砂眼衣原体不存在的情况下，代替阈值1.5，可独立设定针对相对较低检测温度下的上述信号。
在利用72℃及60℃的温度下的信号的其他接近法中，在各个循环中计算72℃及60℃的温度下的荧光信号的比率，并对循环绘图上述比率(为了绘图而处理的所有RFU值来源于装置软件中的无基线扣除(no baseline subtraction)”分析数据，并被送出)。为了确定淋球菌的存在或不存在使用了阈值0.1。以考虑从仅包含砂眼衣原体的管的比率绘图的方式确定上述阈值。如图1C所示，在管(2)及管(3)中确认淋球菌的存在，Ct值分别为32.90及33.18。在管(1)及管(4)中未获得Ct值。在每个循环中，从72℃的温度下的荧光强度中扣除60℃的温度下的荧光强度，由此代替计算比率的方式，并且为了检测靶，针对循环，可对上述结果进行绘图。
在利用在相对较高检测温度下表示砂眼衣原体的存在的信号来检测具有上述相对较低检测温度的淋球菌的另一方法中，为了在各个管中分析在60℃的温度下获得的信号，而适用个别阈值。在72℃的温度下检测出信号的情况下，通过72℃的温度下的各个End-RFU乘以阈值(1.5)来从上述管计算针对60℃的温度下的信号的个别阈值。考虑从仅包含砂眼衣原体的管的最终-比率(参照图1B)来确定上述阈值(1.5)。在72℃的温度下未检测出信号的情况下，根据阈值的通常的设定方法，通过考虑背景信号、敏感度及信号变化或装置的误差范围，从上述管选择60℃的温度下的对信号的个别阈值来利用。在本实施例中，用于60℃的温度下的信号的个别阈值被确定为“200”。
如图1D及图1E所示，根据60℃的温度下的个别阈值，在管(2)及管(3)中确认上述淋球菌的存在，尤其，Ct值分别获得了31.32及35.83。在管(1)及管(4)中无法求出对淋球菌的Ct值。
这种结果表示如下：在包含2个温度下的信号检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法中，(i)上述相对较高检测温度下的信号检测可检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下获得的信号可利用于检测具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
因此，可利用包含1个检测通道及不同的温度下的信号检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，来在1个反应容器中检测2个靶核酸。
实施例2：基于包括不同温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的2个靶检测
本发明人利用包含1个检测通道及不同温度下的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应进行了在1个反应容器中可否检测两个靶核酸的实验。
为了上游引物和下游引物的延伸、TaqMan探针的切割及探测和标记寡核苷酸片段的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及砂眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸作为靶核酸序列使用。
为了检测砂眼衣原体，而使用了TaqMan实时聚合酶链式反应。若存在砂眼衣原体，则TaqMan探针被切割而放出标记的片段。可通过测定从上述标记的片段的信号来获得扩增曲线。为了检测淋球菌，而使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法。
在本实施例中，考虑到信号发生机构，选择“72℃”作为用于砂眼衣原体的信号检测温度，选择“60℃”作为用于淋球菌的信号检测温度。根据上述淋球菌的存在所生成的延伸二聚物具有基于其序列及长度得到调节的可调节的Tm值。在本实施例中，上述延伸二聚物的序列及长度被设计成在60℃的温度下形成上述二聚物来提供信号，但是在72℃的温度下不形成上述二聚物并被解离，从而提供不同的信号。在72℃的检测温度下，产生针对上述砂眼衣原体的信号并检测出信号。在60℃的检测温度下，不仅产生针对上述砂眼衣原体的信号，而且还产生针对上述淋球菌的信号并被检测出。
TaqMan探针在其5’-末端由荧光报道分子标记(CAL Fluor Red610)以及在其的3’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记(序列9)。上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端以防止其延伸的方式被碳间隔区阻断。上述捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端由成猝灭分子(BHQ-2)标记以及在其模板化部位由荧光报道分子(CAL Fluor Red610)标记(序列4)。
准备了分别包含砂眼衣原体、淋球菌、砂眼衣原体及淋球菌的混合物及无靶的对照组的4个反应管。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列2)
NG_PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(序列3)
NG_CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3’(序列4)
CT_F 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3’(序列5)
CT_R 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3’(序列6)
CT_P 5’-[Cal Fluor Red610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3’(序列9)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或者10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、10pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、5pmole的探测和标记寡核苷酸(序列3)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列4)、10pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列5)及12pmole的下游引物(序列6)、1pmole的TaqMan探针(序列9)以及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl最终体积进行了实时聚合酶链式反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司Bio-Rad)，并在50℃的温度下反应5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下变性30秒钟、在60℃的温度下变性60秒钟、在72℃的温度下变性30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。
如图2A所示，在沙眼衣原体存在的情况下(管(1)及管(3))，在72℃的温度下检测出了信号。在仅存在淋球菌的情况下(管(2))，在60℃的温度下检测出了信号，但是在72℃的温度下未检测出信号。在靶核酸不存在的情况下(管(4))未检测出信号。图2A的结果示出，在作为相对较高检测温度的72℃的温度下产生针对具有相对较高检测温度的沙眼衣原体的信号，但是未产生对淋球菌的信号。因此，如下识别：利用上述相对较高检测温度下的信号检测至少可确定具有上述相对较高检测温度的沙眼衣原体的存在。并且在管(2)中，通过利用因上述相对较高检测温度下的信号的不存在及相对较低检测温度下的上述信号的存在而引起的差异，可确定具有上述相对较低检测温度的淋球菌的存在。
为了试验在从具有上述相对较高检测温度的沙眼衣原体的信号存在的情况或不存在的情况下是否也可否检测具有上述相对较低检测温度的淋球菌的存在，而利用多种接近法计算了在上述相对较高检测温度及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异(图2B～2E)。
上述图2B示出72℃及60℃的温度下的端点的RFU值的比率(所有RFU值来源于“基线扣除曲线拟合(baseline subtracted curve fit)”分析数据来送出)。仅存在沙眼衣原体时(管(1))的比率为1.1，但是砂眼衣原体及淋球菌均存在时(管(3))的比率为1.8。并且，仅存在淋球菌时(管(2))的比率及无任何靶核酸时(管(4))的比率为分别1278.0及1.0。为了确定淋球菌的存在或不存在，而适用阈值1.2。根据上述阈值，在管(2)及管(3)中确认淋球菌的存在，并确认到在管(1)及管(4)中无淋球菌。考虑从仅包含砂眼衣原体的最终-比率(End-Raio)来确定上述阈值。择一性地，如管(2)，在有可能确定为具有相对较高检测温度的砂眼衣原体不存在的情况下，代替阈值1.2，可独立设定针对相对较低检测温度下的上述信号。
在利用72℃及60℃的温度下的信号的其他接近法中，在各个循环中计算72℃及60℃的温度下的荧光信号的比率，并对循环绘图上述比率(为了绘图而处理的所有RFU值来源于无基线扣除(no baseline subtraction)”分析数据来送出)。为了确定淋球菌的存在或不存在使用了阈值0.1。以考虑从仅包含砂眼衣原体的管的比率绘图的方式确定上述阈值。如图2C所示，在管(2)及管(3)中确认淋球菌的存在，Ct值分别为37.88及37.20。在管(1)及管(4)中未获得Ct值。在每个循环中，从72℃的温度下的荧光强度中扣除60℃的温度下的荧光强度，由此代替计算比率的方式，并且为了检测靶，针针对循环，可对上述结果进行绘图。
在利用在相对较高检测温度下表示砂眼衣原体的信号来检测具有上述相对较低检测温度的淋球菌的存在的另一方法中，为了在各个管中分析在60℃的温度下获得的信号，而适用个别阈值。在72℃的温度下检测出表示沙眼衣原体的存在的信号的情况下，通过72℃的温度下的各个End-RFU乘以阈值(1.2)来从上述管计算针对60℃的温度下的信号的个别阈值。考虑从仅包含砂眼衣原体的管的最终-比率(参照图2B)来确定上述阈值(1.2)。在72℃的温度下未检测出信号的情况下，根据阈值的通常的设定方法，通过考虑背景信号、敏感度及信号变化或装置的误差范围，从上述管选择在60℃的温度下的对信号的个别阈值来利用。在本实施例中，用于60℃的温度下的信号的个别阈值被确定为“200”。
如图2D及图2E所示，根据60℃的温度下的个别阈值，在管(2)及管(3)中确认上述淋球菌的存在，尤其，Ct值分别获得了36.21及37.07。在管(1)及管(4)中无法求出对淋球菌的Ct值。
这种结果表示如下：在包含2个温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法中，(i)在上述相对较高检测温度下的信号检测可检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)在上述相对较高检测温度及上述相对较低检测温度下获得的信号可利用于检测具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列。
因此，可利用包含在1个检测通道及不同的温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，来在1个反应容器中检测2个靶核酸。
实施例3：基于实时聚合酶链式反应及解链分析的两个靶检测
本发明人利用在1个检测通道及实时聚合酶链式反应和解链分析的组合进行了在1个反应容器中可否检测两个靶核酸的实验。
为了上游引物和下游引物的延伸、TaqMan探针的切割、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及砂眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸作为靶核酸序列使用。
为了检测砂眼衣原体，而使用了TaqMan实时聚合酶链式反应，为了检测淋球菌使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸解链分析。若存在砂眼衣原体，则TaqMan探针被切割而放出标记的片段。若存在淋球菌，则探测和标记寡核苷酸被切割并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，并形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚物(二聚物捕捉和模板化寡核苷酸)。
在实时聚合酶链式反应过程中，为了仅检测借助TaqMan探针的切割产生的荧光信号，而且由于延伸二聚物被解离而无法形成二聚物，因而在从借助探测和标记寡核苷酸切割及延伸形成的上述延伸二聚物不产生信号的温度下进行上述荧光信号检测。为了在解链过程中获得根据淋球菌的存在形成的表示延伸二聚物的存在的解链峰，而测定了信号。
TaqMan探针在其5’-末端由荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记以及在其3’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记(序列9)。上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其延伸的方式被碳间隔区阻断。上述捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记以及在其模板化部位由荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记(序列4)。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕捉、模板化寡核苷酸及TaqMan探针的序列如下。
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列2)
NG_PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(序列3)
NG_CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3’(序列4)
CT_F 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3’(序列5)
CT_R 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3’(序列6)
CT_P 5’-[Cal Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3’(序列9)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或者10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、10pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、5pmole的探测和标记寡核苷酸(序列3)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列4)、10pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列5)及12pmole的下游引物(序列6)、1pmole的TaqMan探针(序列9)以及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl最终体积进行了实时聚合酶链式反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司)，并在50℃的温度下反应5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟、并以在95℃的温度下变性30秒钟、在60℃的温度下变性60秒钟、在72℃的温度下变性30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的72℃的温度下进行了信号的检测。上述反应之后在55℃的温度下使上述管反应5分钟，从55℃至95℃以0.5℃的间隔提高温度的期间测定荧光信号来进行了解链曲线分析。
如图3所示，在CT存在的情况下(管(1))，虽然在实时聚合酶链式反应期间获得了扩增曲线，但是在解链分析中未观察到解链峰。在淋球菌存在的情况下(管(2))，虽然在实时聚合酶链式反应期间未获得扩增曲线，但是在解链分析中观察到具有预计的Tm值(66℃)的根据淋球菌的存在而形成的解链峰延伸二聚物的解链峰。在CT及淋球菌存在的情况下(管(3))，实时聚合酶链式反应过程及解链分析过程中均观察到信号。在靶核酸不存在的情况下(管(4))未观察出任何信号。
这种结果表示通过实时聚合酶链式反应及解链分析的组合仅使用1个检测通道也可检测多个靶核酸。
实施例4：基于包含在不同温度下的信号检测的实时聚合酶链式反应的核苷酸多态性基因型分析
本发明人对包含不同温度下的信号检测的实时聚合酶链式反应可否适用于在1个反应容器中利用1个检测通道的核苷酸多态性基因型分析进行了试验。
为了上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将MTHFR(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸的野生型(C)纯合子、突变型(T)纯合子及杂合子作为靶核酸序列使用。
为了检测MTHFR(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸的野生型(C)等位基因及突变型(T)等位基因，而使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应。若靶等位基因存在，则探测和标记寡核苷酸被切割，并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚物(二聚物捕捉和模板化寡核苷酸)。通过上述延伸二聚物的形成提供信号，在延伸二聚物-形成温度下测定信号，从而可获得扩增曲线。
在本实施例中，考虑到信号发生机构，选择“72℃”作为用于野生型(C)等位基因的信号检测温度，选择“55℃”作为用于突变型(T)等位基因的信号检测温度。根据上述野生型(C)等位基因或突变型(T)等位基因的存在所生成的延伸二聚物具有基于其序列及长度得到调节的可调节的Tm值。在本实施例中，针对上述野生型(C)等位基因的延伸二聚物的序列及长度被设计成在72℃的温度下形成上述二聚物来提供信号。另一方面，针对上述突变型(T)等位基因的延伸二聚物的序列及长度被设计成在55℃的温度下形成上述二聚物来提供信号，但是在72℃的温度下不形成上述二聚物并被解离，从而不提供信号。在72℃的检测温度下，产生对上述野生型(C)等位基因的信号并检测信号。在55℃的检测温度下，不仅发生针对上述野生型(C)等位基因的信号，而且产生针对上述突变型(T)等位基因的信号，并检测出。
上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其的延伸的方式被碳间隔区阻断。上述捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记以及在其模板化部位由荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记(序列13及序列15)。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
M677_F 5’-CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIIGAGGCTGACC-3’(序列10)
M677_R 5’-CAAGTGATGCCCATGTCGGIIIIIGCCTTCACAA-3’(序列11)
M677_W_PTO 5’-GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[C3 spacer]-3’(序列12)
M677_W_CTO 5’-[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(Cal Fluor Red 610)]TCTTCTAACGTCGGGACC[C3 spacer]-3’(序列13)
M677_M_PTO 5’-ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA[C3 spacer]-3’(序列14)
M677_M_CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(Cal Fluor Red 610)]ATTCTGCGAATCGACGT[C3 spacer]-3’(序列15)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(1ng的MTHFR(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸的野生型(C)纯合子、1ng的MTHFR(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸的突变型(T)纯合子或1ng的MTHFR(C677T)人类基因组脱氧核糖核酸的杂合子)、5pmole的上游引物(序列10)、5pmole的下游引物(序列11)、分别3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列12及序列14)、分别1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列13及序列15)及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司)，并在50℃的温度下反应5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下变性30秒钟、在60℃的温度下变性60秒钟、在72℃的温度下变性30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。
如图4A所示，在野生型(C)纯合子存在的情况下(管(1))或在杂合子存在的情况下(管(3))，在72℃及55℃的温度下检测出了信号。在突变型(T)纯合子存在的情况下(管(2))，在55℃的温度下检测出了强的信号，但是在72℃的温度下检测出微弱的信号。在靶不存在的情况下(管(4))未检测出任何信号。
上述图4B示出72℃及60℃的温度下的端点的RFU值的比率(全部RFU值来源于”基线扣除曲线拟合分析数据来送出)。在野生型(C)纯合子存在时(管(1))的比率为1.2，但是在杂合子存在时(管(3))的比率为1.9。这种上述2个比率之间的差异表示在包含杂合子的管中突变型(T)等位基因与野生型(C)等位基因一同存在。另一方面，在突变型(T)纯合子的情况下(管(2))，由于在72℃的温度下的RFU值低，因而从突变型(T)纯合子获得的比率相对非常高。若考虑在杂合子中野生型等位基因及突变型等位基因以1：1的比率存在的事实，则在突变型纯合子存在的情况下，可知在上述72℃的温度下检测出的微弱的信号为假阳性信号。根据用于核苷酸多态性基因型分析的本发明的方法，可确定上述比率值是否在上述相对较高检测温度下的错误信号。
这种结果表示在不同温度下包含信号检测的实时聚合酶链式反应可适用于利用1个检测通道的核苷酸多态性基因型分析，从上述相对较高检测温度及相对较低检测温度下的上述信号获得的差异可用于核苷酸多态性基因型分析。
实施例5：基于包含不同温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的多个靶检测
本发明人利用包含1个检测通道及不同温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应进行了在一个反应容器中可否检测三个靶核酸的实验。
为了上游引物和下游引物的延伸、TaqMan探针的切割、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、砂眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸及生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸作为靶核酸序列使用。
为了检测生殖支原体，而使用了TaqMan实时聚合酶链式反应。为了检测砂眼衣原体及淋球菌，而使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应。
在本实施例中，考虑到信号发生机构，选择“95℃”作为用于生殖支原体的信号检测温度，选择“72℃”作为用于砂眼衣原体的信号检测温度，选择“72℃”作为用于淋球菌的信号检测温度。在本实施例中，上述砂眼衣原体或淋球菌的延伸二聚物的序列及长度被设计成在72℃或60℃的温度下形成上述二聚物来提供信号，但是在95℃的温度下不形成上述二聚物并被解离，从而不提供信号。在72℃的检测温度下，不仅产生针对上述生殖支原体的信号，而且还产生针对上述CT的信号并被检测出。并且，60℃的检测温度下，不仅产生针对上述生殖支原体及CT的信号，而且还产生针对上述NG的信号并被检测出。
TaqMan探针在其5’-末端由荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记以及在其3’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记(序列18)。上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸以防止其的延伸的方式被碳间隔区阻断。上述捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端由猝灭分子(BHQ-2)标记以及在其模板化部位由荧光报道分子(CAL Fluor Red610)标记(序列4及序列8)。
准备了分别包含淋球菌、沙眼衣原体体、生殖支原体、淋球菌及砂眼衣原体的混合物、淋球菌及生殖支原体的混合物、沙眼衣原体及生殖支原体的混合物、淋球菌、砂眼衣原体及生殖衣原体的混合物及无靶的对照组的8个反应管。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及TaqMan探针的序列如下。
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列2)
NG_PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(序列3)
NG_CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3’(序列4)
CT_F 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3’(序列5)
CT_R 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3’(序列6)
CT_PTO 5’-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3’(序列7)
CT_CTO 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3’(序列8)
MG-F 5’-AAAACCCACGGAAATGATGAGAIIIIIATTGGTTCTAC-3’(序列16)
MG-R 5’-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTGIIIIICTGATAAAAG-3’(序列17)
MG-P 5’-[CAL Fluor Red 610]GAGTTCTTTCAAGAACAGCAAGAGGTGT[BHQ-2]-3’(序列18)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、分别10pg的淋球菌和沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、分别10pg的淋球菌和生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物、分别10pg的沙眼衣原体和生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物、分别10pg的淋球菌、沙眼衣原体及生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及5pmole的游引物(序列2)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列3)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列4)、5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列5)及5pmole的下游引物(序列7)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)、5pmole的用于生殖支原体的靶扩增的上游引物(序列16)及5pmole的下游引物(序列17)、1pmole的TaqMan探针(序列18)及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl最终体积进行了实时聚合酶链式反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司)，并在50℃的温度下反应5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，，并且以在95℃的温度下变性30秒钟且在60℃的温度下变性60秒钟，在72℃的温度下变性30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃及95℃的温度下进行了信号的检测。
如图5A、图5B及图5C所示，在管(3)、管(5)、管(6)及管(7)中，在95℃的温度下检测出的信号至少可确定具有相对最高检测温度(95℃)的生殖支原体地存在。
利用因上述相对最高检测温度(95℃)下的信号的不存在及上述相对中间检测温度(relatively middle detection temperature；72℃)下的信号的存在引起的差异可确定在管(2)及管(4)中具有上述相对中间检测温度(72℃)的沙眼衣原体的存在。
尤其，利用因上述相对中间检测温度(72℃)下的信号的不存在及上述相对最低检测温度(60℃)下的信号的存在引起的差异可确定在管(1)中具有上述相对最低检测温度(60℃)的淋球菌的存在。
为了调查在一个反应容器中可否确认与其他靶一同存在的沙眼衣原体或淋球菌，而通过End-RFUs(End-△RFU)的减法计算在上述95℃、72℃及60℃的温度下检测的信号之间的差异。
图5D表示在95℃及72℃的温度下利用端点的RFU值计算的End-△RFUs(全部RFU值来源于装置的软件中的“基线扣除曲线拟合(baseline subtracted curve fit)”分析数据来送出)。为了确定沙眼衣原体的存在而适用阈值“300”。考虑从不包含砂眼衣原体的管(管(1)、管(3)及管(5))的End-△RFUs来确定上述阈值。根据上述阈值确定了在管(2)、管(4)、管(6)及管(7)中沙眼衣原体的存在。
图5E表示在72℃及60℃的温度下利用端点的RFU值计算的End-△RFUs(全部RFU值来源于在装置的软件中的“基线扣除曲线拟合(baseline subtracted curve fit)”分析数据来送出)。为了淋球菌的存在适用阈值“800”。考虑从不包含淋球菌的管(管(2)、管(3)及管(6))的End-△RFUs来确定上述阈值。根据上述阈值确定了在管(1)、管(4)、管(5)及管(7)中淋球菌的存在。
这种结果表示如下：在包含3个温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法中，(i)在上述相对较高检测温度下的信号检测可检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)为了确认具有低于上述最高检测温度的检测温度的靶核酸序列，可使用从在不同的上述检测温度下的信号获得的差异。
因此，可利用包含一个检测通道及不同的温度下的信号检测的TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，来在1个反应容器中检测多个靶核酸。
本发明涉及以下实施方案：
1.一种利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较高的检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均进行上述检测；以及
步骤(b)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定2个靶核酸序列的存在，(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在上述相对较高检测温度检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
2.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
3.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
4.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
5.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
6.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。
7.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构信号-产生机构。
8.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被单一类型的检测器区别。
9.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述差异包含对在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异。
10.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在上述相对较高检测温度下未检测出信号的情况下，考虑到在上述相对较高检测温度下未检测出信号，根据在上述相对较低检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
11.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列存在的情况下，在上述利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法中，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在而利用基准值。
12.根据实施方案11所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在上述利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法中利用基准值，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与用于检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构一同培养具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均检测信号之后，(iii)通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
13.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述1个反应容器还包括至少1个附加装置，上述至少1个附加装置分别包括用于检测除了上述2个靶核酸序列之外的靶核酸序列的额外的2个信号-产生机构，在上述容器相互区别由2个信号-产生机构的各个装置产生的上述信号，借助不同类型的检测器分别检测上述信号。
14.根据实施方案1所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2个靶核酸序列包含核苷酸变异，上述2个靶核酸序列中的一个包含上述核苷酸变异中的一种类型，另一个包含核苷酸变异中的另一类型。
15.根据实施方案14所述的利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述核苷酸变异为单核苷酸多态性。
16.一种利用不同检测温度分析试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养包含含有上述单核苷酸多态性位点的核算序列的试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述核苷酸多态性等位基因，上述核苷酸多态性等位基因中的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号以及针具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性等位基因的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均进行上述检测；以及
步骤(b)，根据上述步骤(a)中的在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定核苷酸多态性基因型。
17.一种利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个不同检测温度下进行上述检测；以及
步骤(b)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定至少3个靶核酸序列的存在，当确定具有上述至少3个靶核酸序列中的特定检测温度的靶核酸序列的存在时，根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定上述靶核酸序列的存在。
18.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方式进行上述步骤(b)。
19.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
20.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
21.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
22.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
23.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对最高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对剩余上述靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。
24.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对最高温检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，对剩余上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
25.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述至少3个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被单一类型的检测器区别。
26.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述差异包含对在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异。
27.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，在高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号的情况下，考虑到在高于上述特定检测温度的检测温度下未检测出信号，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在。
28.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，当具有高于上述特定加测温度的检测温度的靶核酸序列存在时，在上述利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法中，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在而利用至少1个基准值。
29.根据实施方案28所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，为了确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法中利用上述基准值中的至少1个基准值，(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的所有组合，(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度以及上述特定检测温度下检测信号后，(iii)通过求出在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
30.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述1个反应容器还包括至少1个附加装置，上述至少1个附加装置分别包括用于检测除了上述3个靶核酸序列之外的靶核酸序列的额外的3个信号-产生机构，在上述容器中相互区别由至少3个信号-产生机构的个装置产生的上述信号，借助不同类型的检测器分别检测上述信号。
31.根据实施方案17所述的利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
32.一种利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的2个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度下进行上述检测；
步骤(b)，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，进行对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析；以及
步骤(c)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，在上述步骤(b)中，利用解链分析结果确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
33.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
34.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
35.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
36.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
37.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。
38.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
39.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被单一类型的检测器区别。
40.根据实施方案32所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
41.一种利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，通过检测温度分析检测上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度以及高于上述检测温度的1个以上的检测温度均进行上述检测；
步骤(b)，为了在上述至少3个靶核酸序列中确定除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，对上述步骤(a)的培养结果物进行解链分析；以及
步骤(c)，(i)根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定上述靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的存在，当在上述至少3个靶核酸序列的上述一部分靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，则根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)在上述步骤(b)中，根据解链分析的结果确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在。
42.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方式进行上述步骤(c)。
43.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
44.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
45.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。
46.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
47.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对最高温检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对剩余上述靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。
48.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对最高温检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对剩余上述靶核酸序列的信号-产生机构为利用以依赖于与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚物的信号-产生机构。
49.根据实施方案41所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
50.一种利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包括：
(a)2个信号-产生机构，用于检测上述2个靶核酸序列；以及
(b)说明书，记载实施方案1至15中的任一项所述的方法。
51.一种利用不同检测温度分析试样内核酸序列核苷酸多态性基因型的试剂盒，其特征在于，包括：
(a)信号-产生机构，用于检测核苷酸多态性等位基因；以及
(b)说明书，记载实施方案16中所述的方法。
52.一种利用不同检测温度检测试样内至少3核酸序列试剂盒，其特征在于，包括：
(a)至少3个信号-产生机构，用于检测上述至少3个靶核酸序列；以及
(b)说明书，记载实施方案17至31中的任一项所述的方法。
53.一种利用不同检测温度及解链分析检测试样内至少2个靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包括：
(a)2个信号-产生机构，用于检测上述2个靶核酸序列；以及
(b)说明书，记载实施方案32至40的中任一项所述的方法。
54.一种利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包括：
(a)至少3个信号-产生机构，用于检测上述3个靶核酸序列；以及
(b)说明书，记载实施方案41至49中任一项所述的方法。
55.一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法，上述计算机可读存储介质的特征在于，上述利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法包括：
步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个序列具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个序列具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度；以及
步骤(b)，根据所接收的上述信号确定上述2个靶核酸序列的存在，(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在高于上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
56.一种利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置，其特征在于，包括：
(a)计算机处理器；以及
(b)实施方案55所述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
57.一种计算机程序，运行用于确定试样内2个靶核酸序列的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质，上述计算机程序的特征在于，上述决定试样内2个靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，利用单一类型的检测器检测所产生的上述信号，上述2个靶核酸序列中的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度；以及
步骤(b)，根据所接收的上述信号确定上述2个靶核酸序列的存在，(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在高于上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。
58.一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度对试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型进行分析的方法，上述计算机可读存储介质的特征在于，上述利用不同检测温度对试样内核酸序列的核苷酸多态性基因型进行分析的方法包括：
步骤(a)，接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述核苷酸多态性等位基因，上述核苷酸多态性等位基因中的一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较高检测温度，另一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的核苷酸多态性基因的信号以及具有上述相对较高检测温度的核苷酸多态性基因的信号的温度；以及
步骤(b)，根据所接收的信号之间的差异确定核苷酸多态性基因型。
59.一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内至少3个靶核酸序列的存在，上述计算机可读存储介质的特征在于，上述利用不同检测温度对确定试样内至少3个靶核酸序列的存在的方法包括：
步骤(a)，接收在至少3个检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个不同检测温度下进行上述检测；以及
步骤(b)，根据所接收的信号确定上述至少3个靶核酸序列的存在，在上述至少3个靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，根据在高于特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定上述靶核酸序列的存在。
详细记述了本发明的优选实例，可进行根据本发明的原理的变形及修改，这对本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的，本发明的范围可根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案定义。
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<400> 7
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<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-CTO
<400> 8
gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-P
<400> 9
catcagaagc tgtcattttg gctgcg 26
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(22)
<223> n指脱氧肌苷
<400> 10
ccaccccgaa gcagggannn nngaggctga cc 32
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n指脱氧肌苷
<400> 11
caagtgatgc ccatgtcggn nnnngccttc acaa 34
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-W-PTO
<400> 12
ggtcccgacg ttagctcccg cagacacctt ctccttc 37
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-W-CTO
<400> 13
cctcggtgcc acgccatcgg ttcttctaac gtcgggacc 39
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-M-PTO
<400> 14
acgtcgattc gcactcccgc agacaccttc tccttcaa 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M677-M-CTO
<400> 15
tttttttttt tttttttttt tattctgcga atcgacgt 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MG-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> n指脱氧肌苷
<400> 16
aaaacccacg gaaatgatga gannnnnatt ggttctac 38
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MG-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(30)
<223> n指脱氧肌苷
<400> 17
ctcgttaatt tacctattcc attttgnnnn nctgataaaa g 41
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MG-P
<400> 18
gagttctttc aagaacagca agaggtgt 28

Claims (20)

1.一种计算机可读存储介质，包含构造处理器用于执行利用不同检测温度确定试样内两种靶核酸序列的存在的方法的指示，所述方法包括：
(a)接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，其中借助相应的信号-产生装置检测各个上述靶核酸序列，其中所产生的信号通过使用单一类型的检测器进行检测；其中所述两种靶核酸序列中的一种具有借助相应的信号-产生装置确定的所述相对较高的检测温度，另一种具有借助相应的上述信号-产生装置确定的所述相对较低的检测温度，上述相对较高的检测温度为能够针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列产生信号的温度，上述相对较低检测温度为能够针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列产生信号以及针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列产生信号的温度；以及
(b)根据所接收的上述信号确定上述两种靶核酸序列的存在情况，其中(i)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)根据在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，其利用基准值，其中(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与用于检测具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构一同培养具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列，(ii)在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均检测信号，(iii)然后通过求出在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获得上述基准值。
2.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中在伴随核酸扩增的信号扩增过程中检测在相对较高检测温度下的信号和在相对较低检测温度下的信号。
3.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中在没有核酸扩增的信号扩增过程中检测在相对较高检测温度下的信号和在相对较低检测温度下的信号。
4.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中每个靶核酸序列的信号产生装置是以依赖于双链体形成的方式产生信号的信号产生装置。
5.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中每个靶核酸序列的信号产生装置是通过依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成双链体的信号产生装置。
6.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中具有相对较高检测温度的所述靶核酸序列的信号产生装置是通过裂解检测寡核苷酸而产生信号的装置，以及用于具有相对较低检测温度的靶核酸序列的信号产生装置是通过形成双链体而产生信号的装置。
7.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中具有相对较高检测温度的所述靶核酸序列的信号产生装置是通过裂解检测寡核苷酸而产生信号的装置，以及用于具有相对较低检测温度的靶核酸序列的信号产生装置是通过依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的裂解的方式形成双链体而产生信号的装置。
8.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中所述两个信号生成装置包括相同的标签，并且来自所述标签的信号不通过所述单一类型的检测器来区分。
9.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中所述差异包括通过对在所述相对较高检测温度下检测到的信号和在所述相对较低检测温度下检测到的信号进行数学处理而获得的差异。
10.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中当在所述相对较高检测温度下没有检测到所述信号时，通过在所述相对较低检测温度下检测到的信号来确定具有所述相对较低检测温度的所述靶核酸序列的存在，并考虑在所述相对较高检测温度下没有检测到信号。
11.根据权利要求1所述的计算机可读存储介质，其中所述两个靶核酸序列包含核苷酸变异，并且所述两个靶核酸序列之一包含一种类型的核苷酸变异，而另一个包含另一类型的核苷酸变异。
12.一种利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置，其特征在于包括：
(a)计算机处理器；以及
(b)权利要求1所述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
13.一种计算机可读存储介质，其中包含构造处理器用于执行利用不同检测温度对试样内核酸序列进行单核苷酸多态性基因分型的方法的指示，其中所述方法包含：
(a)接收在相对较高检测温度下检测出的信号以及在相对较低检测温度下检测出的信号，其中借助相应的信号-产生机构检测各个上述单核苷酸多态性等位基因，上述单核苷酸多态性等位基因中的一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较高检测温度，另一个基因具有借助相应的上述信号-产生机构确定的上述相对较低检测温度，其中上述相对较高检测温度为能够针对具有上述相对较高检测温度的单核苷酸多态性等位基因产生信号的温度，上述相对较低检测温度为能够针对具有上述相对较低检测温度的单核苷酸多态性等位基因产生信号以及针对具有上述相对较高检测温度的单核苷酸多态性等位基因产生信号的温度；以及
(b)通过所接收的信号之间的差异确定单核苷酸多态性基因型，其利用至少1个基准值，其中一个基准值通过下述获得：(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与用于检测具有上述相对较高检测温度的单核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养由具有上述相对较高检测温度的单核苷酸多态性等位基因形成的纯合子，(ii)在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均检测信号，然后(iii)获得在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异；另一个基准值通过下述获得：(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养由具有上述相对较高检测温度的单核苷酸多态性等位基因和具有上述相对较低检测温度的单核苷酸多态性等位基因两者构成的杂合子，(ii)在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均检测信号，(iii)然后获得在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异；又一个基准值通过下述获得：(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与用于检测具有上述相对较低检测温度的单核苷酸多态性等位基因的信号-产生机构一同培养由具有上述相对较低检测温度的单核苷酸多态性等位基因形成的纯合子，(ii)在上述相对较高检测温度以及上述相对较低检测温度下均检测信号，然后(iii)获得在上述相对较高检测温度下检测出的信号以及在上述相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异。
14.一种计算机可读存储介质，其中包含构造处理器以执行利用不同检测温度确定试样内至少3种靶核酸序列的存在的方法的指示，其中所述方法包括：
(a)接收在至少3个检测温度下检测出的信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3种靶核酸序列中的每一个，其中所述至少3种靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，其中检测温度为不仅能够针对具有所述检测温度的靶核酸序列产生信号，且还能够针对具有比所述检测温度更高的检测温度的靶核酸序列产生信号的温度，其中由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在各个所述不同检测温度下进行上述检测；以及
(b)根据所接收的信号确定上述至少3种靶核酸序列的存在情况，其中在上述至少3个靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，根据在高于特定检测温度的1个或更多个检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，其利用多个基准值中的至少1个基准值，其中该多个基准值通过(i)在与上述步骤(a)中的反应容器不同的其他反应容器中与相应的信号-产生机构一同培养具有高于上述特定检测温度的检测温度的靶核酸序列的所有组合，(ii)在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度以及上述特定检测温度下检测信号，(iii)然后求出在高于上述特定检测温度的1个或更多个检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异；其中在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高的检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定靶核酸序列的存在。
15.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中通过首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在，然后以降低的方式依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在来执行步骤(b)。
16.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中每个所述靶核酸序列的信号产生装置是以依赖于双链体形成的方式产生信号的信号产生装置。
17.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中用于具有相对最高检测温度的所述靶核酸序列的信号产生装置是通过切割检测寡核苷酸的信号产生装置，并且用于其他靶核酸序列的信号产生装置是通过形成双链体而产生信号的装置。
18.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中所述至少三个信号产生装置包括相同的标签，并且来自所述标签的信号不被所述单一类型的检测器区分。
19.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中所述差异包括通过对在高于所述特定检测温度的一个或多个检测温度下检测到的信号和在所述特定检测温度下检测到的信号进行数学处理而获得的差异。
20.根据权利要求14所述的计算机可读存储介质，其中当在高于所述特定检测温度的检测温度下没有检测到所述信号时，通过在所述特定检测温度下检测到的信号确定具有所述特定检测温度的所述靶核酸序列的存在，并考虑在高于所述特定检测温度的检测温度下没有检测到信号。
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