CN111893086B

CN111893086B - 胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法

Info

Publication number: CN111893086B
Application number: CN202010549815.0A
Authority: CN
Inventors: 段生宝; 李勇; 王红梅; 丁少华; 陈晔洲; 魏双施; 谢劲松; 王玉珏; 刘杰
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-06-16
Also published as: CN111893086A

Abstract

本发明公开了一种胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法，该胎儿有核红细胞捕获载体通过在蛋白纺丝膜上偶联蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体得到。本发明的方案能特异性捕获胎儿有核红细胞，具有检测敏感性和特异性强的特点，克服了传统方法非特异性结合、包被无序、效率低的缺点；蛋白纺丝膜呈多层孔隙结构，与反应物结合表面积远大于现有载体，同时与血液标本中非特异性成分结合极弱；另外，蛋白纺丝膜蛋白成分对结合的生物活性成分有具有良好的保护作用，稳定性更好。本发明提供提取装置，结构简单，容易制备，原料来源不受限制，成本低廉。本发明提供提取方法，易于操作能避免细胞在操作过程中的损失。

Description

胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法

技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法。

背景技术

胎儿有核红细胞是一种单个核细胞，从孕早期至分娩前，持续稳定的存在于母体的外周血中，包含有胎儿全部的遗传信息，细胞表面具有特异性抗原，同时生存周期短，作为产前检测时不受既往妊娠的影响，因此胎儿有核红细胞被认为是最理想的无创产前诊断胎源性细胞。但母体外周血中胎儿有核红细胞含量极少，因此高效率和高纯度的富集胎儿有核红细胞以供临床检测是研究的重点。

传统的母体外周血中胎儿有核红细胞分离和富集方法主要分为非特异性富集和特异性富集。非特异性富集方法主要是利用细胞本身的物理特性进行富集，例如密度梯度离心法，根据母体细胞与胎儿细胞的理化性质差异，通过介质产生密度梯度，在离心力的作用下使母胎细胞分离。密度梯度离心法虽然操作简单，成本相对低廉，但是分离产物的纯度较低，往往需要与其他方法联用，以提高纯度。

特异性富集是利用细胞表面特异性标志物进行富集，如流式细胞分选技术，其原理是先使用带有荧光素标记的特异性抗体标记细胞，之后通过流式细胞仪以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测，进而将特定细胞从整个细胞群体中筛选出来。流式细胞分选技术分离所得的产物纯度较高，但耗时较长，而且仪器设备昂贵，操作复杂，难以在临床检测中常规使用。

此外，免疫磁珠法是目前在母体外周血中胎儿有核红细胞分离方面广泛使用的细胞分离技术。其原理是将特异性抗体包被在磁珠上，包被磁珠的抗体结合细胞表面或细胞内的特异性抗原，形成具有较高磁响应性的抗原-抗体-磁珠复合物，之后在磁场的作用下分离细胞。相比流式细胞分选技术，该方法操作简单、分离速度快，花费较低，但是常用的微米级磁珠在一定程度上会互相吸引挤压细胞造成了目的细胞的破坏，同时有部分胎儿有核红细胞的表面特异性抗原在其他细胞中也有少量的存在，影响细胞分离的纯度。

非特异性富集方法由于目的细胞本身的理化性质与其他血液细胞存在部分重叠，所以纯度较低，而特异性富集方法往往成本较高，操作复杂，所使用的反应载体的抗原/抗体是非特异性、无序的吸附在载体表面，有效结合量有限，影响检测灵敏度，难以满足临床实际需要，因此本领域迫切需要一种新型的操作简单、成本低廉而又灵敏度高、特异性强的胎儿有核红细胞富集提取方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种胎儿有核红细胞捕获载体，该载体通过在蛋白纺丝膜上偶联蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体得到。

优选的是，所述蛋白纺丝膜包括天然植物蛋白膜、植物蛋白纺丝膜、动物蛋白纺丝膜以及昆虫吐丝膜中的一种或多种。

优选的是，所述胎儿有核红细胞标志物包括CD14、CD36、CD45、CD71、CD147、CD177、GPA以及ε-HbF中的一种或多种。

优选的是，胎儿有核红细胞捕获载体的制备方法包括以下步骤：制备蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体，再将两者通过抗鼠二抗桥连，得到具有捕获胎儿有核红细胞功能的反应载体。

优选的是，所述蛋白纺丝膜的制备方法包括以下步骤：将蛋白纺丝网切割成大小一致的方形，垂直叠加铺设成无纺布基材；然后均匀喷洒水雾，将该无纺布基材置于热压板中间，进行垂直热压，形成孔径50μm～100μm、厚度0.2mm±0.02mm、孔隙率1％～3％的蛋白纺丝膜。

优选的是，所述蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将蛋白纺丝膜抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选分泌特异性抗蛋白纺丝膜抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞，获得稳定的杂交瘤细胞细胞株；然后将该细胞接种至小鼠腹腔并制备腹水，从腹水中提取特异性的蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体。

优选的是，所述胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将胎儿有核红细胞标志物特异性抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选分泌特异性抗病原体抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞，获得稳定的杂交瘤细胞细胞株；然后将该细胞接种小鼠腹腔并制备腹水，从腹水中提取特异性的胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体。

本发明还提供一种胎儿有核红细胞提取装置，包括提取管，所述提取管的底部设置有如上所述的胎儿有核红细胞捕获载体。

优选的是，该胎儿有核红细胞提取装置还包括外壳体，所述提取管设置在所述外壳体内部，所述外壳体上端具有开口，开口上设置有密封盖；

所述外壳体的上端内部设置有环形安装台，所述环形安装台上开设有环形槽，所述提取管的上部外周设置有用于配合插设在所述环形槽内的环形凸起；

所述提取管的底部开设有出口。

本发明还提供一种胎儿有核红细胞提取方法，其采用如上所述的装置进行提取，具体步骤为：

1)将孕妇外周血加入所述提取管中；

2)捕获胎儿有核红细胞、洗涤并去除杂质：通过所述提取管底部的胎儿有核红细胞捕获载体捕获孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，杂质穿过胎儿有核红细胞捕获载体从所述提取管底部底端出口流出；

3)洗脱收集目的胎儿有核红细胞。

本发明的有益效果是：

本发明提供的胎儿有核红细胞捕获载体为通过将天然生物材料加工修饰制备成的具有免疫原性以及良好亲水性的蛋白纺丝膜，通过桥连抗体，能特异性捕获胎儿有核红细胞，克服了传统方法非特异性结合、包被无序、效率低的缺点；

且其具有检测敏感性和特异性强的特点，蛋白纺丝膜呈多层孔隙结构，与反应物结合表面积远大于现有载体，同时与血液标本中非特异性成分结合极弱；另外，蛋白纺丝膜蛋白成分对结合的生物活性成分有具有良好的保护作用，稳定性更好；

本发明提供的胎儿有核红细胞提取装置，结构简单，容易制备，原料来源不受限制，成本低廉，外壳体可使用常规离心管制备；

本发明提供的胎儿有核红细胞提取方法，易于操作，血液标本处理和操作过程简单，可在孕妇外周血中特异性的捕获目的细胞，不需要像现有技术为了提高分离纯度对血液标本进行分离等步骤，避免了稀有细胞在操作过程中的损失。

附图说明

图1为本发明的实施例6中的胎儿有核红细胞提取方法的示意图；

图2为本发明的实施例5中的胎儿有核红细胞提取装置的结构示意图；

图3为本发明的实施例5中的外壳体的俯视图；

图4为本发明的实施例1中的显色比色卡的示意图；

图5为本发明的实施例2中的单克隆抗体SDS-PAGE电泳图谱；

图6为本发明的实施例2中的单克隆抗体ELISA效价检测结果图；

图7为本发明的实施例4中的蛋白纺丝膜偶联抗体的稳定性试验显色结果。

附图标记说明：

1—外壳体；2—提取管；3—胎儿有核红细胞捕获载体；20—密封盖；10—环形安装台；11—环形槽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本实施例提供一种胎儿有核红细胞捕获载体，该载体通过在蛋白纺丝膜上偶联蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体得到。

其中，所述蛋白纺丝膜包括但不限于天然植物蛋白膜、植物蛋白纺丝膜、动物蛋白纺丝膜以及昆虫吐丝膜中的一种或多种。

其中，所述胎儿有核红细胞标志物包括但不限于CD14、CD36、CD45、CD71、CD147、CD177、GPA以及ε-HbF中的一种或多种。

该胎儿有核红细胞捕获载体的制备方法包括以下步骤：制备蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体，再将两者通过抗鼠二抗桥连，得到具有捕获胎儿有核红细胞功能的反应载体：即胎儿有核红细胞捕获载体。

本发明中，通过将天然生物材料加工修饰制备成具有免疫原性以及良好亲水性的蛋白纺丝膜，再经抗鼠二抗桥连抗体，获得能特异性捕获胎儿有核红细胞的反应载体，克服了传统方法非特异性结合、包被无序、效率低的缺点。另外，蛋白纺丝膜呈多层孔隙结构，与反应物结合表面积远大于现有载体，同时与血液标本中非特异性成分结合极弱；且蛋白纺丝膜蛋白成分对结合的生物活性成分有具有良好的保护作用，稳定性更好。

本实施例还以胎儿有核红细胞捕获载体为基础，进一步提供了一种胎儿有核红细胞提取装置及方法。该提取装置结构简单，容易制备，该提取方法操作简便。

以上为本发明的总体构思，以下再提供具体的实施例，以对本发明作进一步说明。

实施例1

蛋白纺丝膜的制备，其包括以下步骤：

1.蛋白纺丝

将植物蛋白丝、动物蛋白丝以及昆虫吐丝经冷冻后碾磨成超短丝或粉体，加入少量的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，充分混匀后纺丝、落丝和牵伸，形成孔径50μm～100μm蛋白纺丝网。

2.机械加工

将蛋白纺丝网切割成大小一致的方形，垂直叠加铺设成无纺布基材；均匀喷洒水雾，将该无纺布基材置于热压板中间，进行垂直热压，形成孔径50μm～100μm、厚度0.2mm±0.02mm、孔隙率1％～3％的蛋白纺丝膜。

3.蛋白纺丝膜检定

对蛋白纺丝膜的孔径、厚度以及孔隙率进行检定，并采用特异性单克隆抗体对其进行间接ELISA检定，ELISA检定步骤如下：在24孔板中，加入蛋白纺丝膜，然后再加入终浓度15μg/ml抗蛋白纺丝膜抗体，室温孵育2h，PBST洗液洗涤3次，然后加入酶标记抗鼠二抗，37℃反应30min后，PBST洗液洗涤5次，加入沉淀性底物TMB显色15min，检测蛋白纺丝膜片显色情况，显色等级≥5即合格。显色比色卡如图4。

实施例2

鼠源单克隆抗体(蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体)的制备，包括以下步骤：

1.小鼠免疫

分别制备蛋白纺丝膜抗原和胎儿有核红细胞标志物，乳化后通过腹腔、背部皮下等途径多点免疫小鼠，共免疫4次，间隔期为10天；融合前2天经鼠尾静脉加强免疫。

2.细胞融合

取免疫后的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，并将小鼠脾细胞和培养好的NS1骨髓瘤细胞混合；采用50％PEG 4000作融合剂，将小鼠脾细胞和NS1骨髓瘤细胞进行融合；融合细胞悬于含20％新生牛血清的选择培养基内培养数日。

3.克隆筛选

将蛋白纺丝膜抗原和胎儿有核红细胞标志物抗原分别进行如下操作：用0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，包被酶标板100μL/孔；4℃过夜；次日用含0.03～0.06％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤5次，控干；加入待检的细胞培养上清，37℃孵育后采用间接ELISA法进行检测。Cutoff值设为阴性对照值的2.1倍，高于Cutoff值为阳性结果。选取检测结果阳性孔内的融合细胞经有限稀释法进行多次单克隆培养。待单细胞生长成亚克隆后再进行测定，阳性克隆扩大后液氮冷冻保存。

4.单抗制备及纯化

培养经克隆筛选的杂交瘤细胞株，注射至经致敏的小鼠腹腔内，每只约10⁶个细胞；观察小鼠腹腔，并在约5～10天内采集小鼠腹水；取小鼠腹水，边搅拌边缓慢加入等比例的饱和硫酸铵溶液，搅拌1h后4℃静置过夜；次日将已沉淀的小鼠腹水离心，收集沉淀并用少量生理盐水溶解；然后采用G-25凝胶层析柱去除其中的硫酸铵；继续采用DEAE-52阴离子交换层析柱纯化单抗，并用不同浓度的NaCl溶液洗脱；分别获得蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体，采用SDS-PAGE电泳和间接ELISA法进行纯化抗体的纯度和效价测定，结果见图5和图6，说明其纯度和效价均获得了很好的结果。

抗鼠二抗的制备：将小鼠的丙种球蛋白免疫山羊、马、驴、家兔或鸡，经一定的免疫程序后，采集动物血清，并提取血清中特异性抗鼠抗体。

实施例3

一种胎儿有核红细胞捕获载体，其制备方法包括以下步骤：

1.蛋白纺丝膜连接胎儿有核红细胞标志物特异性单克隆抗体

将蛋白纺丝膜分别浸泡于终浓度10～30μg/ml的抗蛋白纺丝膜特异性抗体溶液中，4℃过夜；次日用含0.03～0.06％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗液洗涤5次，用间接ELISA法检测，检定合格后再将蛋白纺丝膜浸泡于终浓度10～30μg/ml抗鼠二抗溶液中，4℃过夜；次日用PBST洗涤液洗涤5次后再将其浸泡于终浓度10～30μg/ml的抗胎儿有核红细胞标志物抗原特异性单克隆抗体溶液中，按上述方法孵育洗涤，得到连接胎儿有核红细胞标志物特异性单克隆抗体的蛋白纺丝膜，并用ELISA法检定，步骤如实施例1所述。

2.蛋白纺丝膜切片

将连接胎儿有核红细胞标志物特异性单克隆抗体的蛋白纺丝膜沥干，机械切割、加工制备成7mm±0.1mm的圆形胎儿有核红细胞捕获载体。

实施例4

蛋白纺丝膜偶联抗体效率以及稳定性试验，包括以下步骤：

1.蛋白纺丝膜偶联抗体效率试验

将蛋白纺丝膜剪裁成1cm×1cm的正方形，浸泡于1mL 5μg/ml的抗蛋白纺丝膜特异性抗体溶液中，4℃过夜。次日回收抗体溶液，并检测其蛋白含量。结果显示回收抗体溶液蛋白含量为4.2μg/ml，因此蛋白纺丝膜偶联抗体效率为0.8μg/cm2即800ng/cm2。

2.蛋白纺丝膜偶联抗体稳定性试验

将蛋白纺丝膜偶联抗蛋白纺丝膜特异性抗体后，用含0.03～0.06％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗液洗涤5次，烘干，放置于自封袋内2～8℃保存，定期用ELISA法检测。检测流程如下：加入终浓度15μg/ml抗蛋白纺丝膜抗体，室温孵育2h，PBST洗液洗涤3次，然后加入酶标记抗鼠二抗，37℃反应30min后，PBST洗液洗涤5次，加入沉淀性底物TMB显色15min，检测蛋白纺丝膜片显色情况，结果判定以显色色度≥5为合格。结果如图7所示，结果显示，蛋白纺丝膜偶联抗体后2～8℃保存，抗体活性可稳定保存13个月，说明了本发明的蛋白纺丝膜偶联抗体具有很好的稳定性。

实施例5

一种胎儿有核红细胞提取装置，参照图2-3，包括外壳体1、设置在外壳体1中的提取管2，提取管的底部设置有实施例3获得的胎儿有核红细胞捕获载体3。所述提取管2上端具有开口，呈常规离心管形状，开口上设置有密封盖20；所述外壳体1的上端内部设置有环形安装台10，所述环形安装台10上开设有环形槽11，所述提取管2的上部外周设置有用于配合插设在所述环形槽11内的环形凸起(图中未示出)；所述提取管2的底部开设有小型出口。

实施例6

一种胎儿有核红细胞提取方法，参照图1，其采用实施例4获得的装置进行提取，具体步骤为：

1)将孕妇外周血加入所述提取管中；

3)洗脱收集目的胎儿有核红细胞。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims

1.一种胎儿有核红细胞捕获载体，其特征在于，该载体通过在蛋白纺丝膜上偶联蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体得到；

该载体的制备方法包括以下步骤：制备蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体和胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体，再将两者通过抗鼠二抗桥连，得到具有捕获胎儿有核红细胞功能的反应载体；

其中，所述蛋白纺丝膜为植物蛋白纺丝膜、动物蛋白纺丝膜以及昆虫吐丝膜的组合；

所述蛋白纺丝膜的制备方法包括以下步骤：将蛋白纺丝网切割成大小一致的方形，垂直叠加铺设成无纺布基材；然后均匀喷洒水雾，将该无纺布基材置于热压板中间，进行垂直热压，形成孔径50μm~100μm、厚度0.2mm±0.02mm、孔隙率1%~3%的蛋白纺丝膜；

所述胎儿有核红细胞标志物包括CD14、CD36、CD45、CD71、CD147、CD177、GPA以及ε-HbF中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的胎儿有核红细胞捕获载体，其特征在于，所述蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将蛋白纺丝膜抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选分泌特异性抗蛋白纺丝膜抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞，获得稳定的杂交瘤细胞细胞株；然后将该细胞接种至小鼠腹腔并制备腹水，从腹水中提取特异性的蛋白纺丝膜鼠源单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的胎儿有核红细胞捕获载体，其特征在于，所述胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将胎儿有核红细胞标志物特异性抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选分泌特异性抗病原体抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞，获得稳定的杂交瘤细胞细胞株；然后将该细胞接种小鼠腹腔并制备腹水，从腹水中提取特异性的胎儿有核红细胞标志物鼠源单克隆抗体。

4.一种胎儿有核红细胞提取装置，其特征在于，包括提取管，所述提取管的底部设置有如权利要求1-3中任意一项所述的胎儿有核红细胞捕获载体。

5.根据权利要求4所述的胎儿有核红细胞提取装置，其特征在于，还包括外壳体，所述提取管设置在所述外壳体内部，所述提取管上端具有开口，开口上设置有密封盖；

所述提取管的底部开设有出口。

6.一种胎儿有核红细胞提取方法，其特征在于，其采用如权利要求5所述的装置进行提取，具体步骤为：

1）将孕妇外周血加入所述提取管中；

2）捕获胎儿有核红细胞、洗涤并去除杂质：通过所述提取管底部的胎儿有核红细胞捕获载体捕获孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，杂质穿过胎儿有核红细胞捕获载体从所述提取管底部底端出口流出；

3）洗脱收集目的胎儿有核红细胞。