CN109946457A - 一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A‑胶体金标记物，硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线，单克隆抗体A由编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，单克隆抗体B由编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生。本发明的试纸条使用双单抗检测，检测快速、灵敏度高且特异性强，检测结果清晰易于判断，整个检测过程无需任何仪器、操作人员无需任何专业培训；试纸条的使用操作简单，适于现场诊断使用。

Description

一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrheavirus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落。PED最初爆发于英国，随后在包括我国在内的世界多个地区爆发流行。我国自2010年下半年以来，中国华南、华东和华北部分省份出现了严重的仔猪腹泻流行，造成大量哺乳仔猪的死亡，PED对世界养猪业造成了持续的影响，并导致严重的经济损失。鉴于PED的严重危害，建立一种灵敏快速高效的PEDV诊断方法十分必要。

目前检测猪流行性腹泻病毒的方法有免疫电镜法、免疫荧光法、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和RT-PCR法。免疫电镜法具有简便、直观、快速和定性正确等优点，由于需要电镜设备，不适合于大规模诊断和临床诊断。免疫荧光法该方法具有较高的准确性和特异性，但是操作繁琐，需要特殊的仪器设备。微量血清中和试验操作繁琐，试验操作中的一些人为因素对结果影响较大。酶联免疫吸附试验操作相对简单，但也需要仪器设备。其中RT-PCR法尽管此法敏感性和特异性都很好，但由于需要特殊的仪器设备，目前只适合于实验室诊断，不适合于临床诊断。

胶体金免疫层析分析(Gold-immunochromatography assay，GICA)是近年发展起来的一种以胶体金为标记物，通过抗原抗体免疫学反应对样本中的生物大分子进行定性分析的免疫学分析技术。该技术操作简单快速，不需要任何仪器，操作人员也不需专业的技术培训，可以满足临床诊断的需求。

中国专利申请号201310317343.6，一种用于检测猪流行性腹泻病毒的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用，此发明的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗PEDV单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，所述的硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线以及兔抗PEDV S蛋白多克隆抗体包被的检测线。该发明中的检测线使用的是兔抗PEDV S蛋白多克隆抗体，其非特异性强，测试灵敏性相对较弱。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，适于现场诊断使用，试纸条的使用操作简单、检测快速、灵敏度高且特异性强，检测结果清晰易于判断，整个检测过程无需任何仪器、操作人员无需任何专业培训。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫和吸水纸，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述聚氯乙烯底板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别粘贴有所述胶体金结合垫、吸水纸，所述胶体金结合垫上粘贴有所述样品垫；所述胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物，与所述胶体金结合垫相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线，与所述吸水纸相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有山羊抗鼠IgG的质控线；

所述单克隆抗体A由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10，地址是中国. 武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCC NO:C201905；

所述单克隆抗体B由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11，地址是中国. 武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCC NO:C201904。

胶体金颗粒与所述单克隆抗体A因静电吸附而形成牢固结合；当含有猪流行性腹泻病毒的待测样本加到样品垫上后，通过毛细作用向前移动，猪流行性腹泻病毒与单克隆抗体 A形成特异性结合，从而将猪流行性腹泻病毒与单克隆抗体A-胶体金标记物结合在一起，使得猪流行性腹泻病毒上带上标记；继续向前移动至检测线后，被标记的猪流行性腹泻病毒聚集在检测线上而显色，使用者肉眼即可识别检测结果。

本发明采用编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体A、单克隆抗体B，特异性强、敏感性高、同质性高，使用本发明制备的试纸条，检测结果的一致性、准确性、重复性高。

优选地，所述单克隆抗体A-胶体金标记物的具体制备步骤为：在胶体金中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边磁力搅拌边滴加所述单克隆抗体A，搅拌40min后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌40min后分装于离心管中，10000r/min离心30min，弃去上清液；将离心分离出的沉淀加入0.01mol/L、pH值为 9.0的Tris缓冲液中重悬，即得到抗猪流行性腹泻病毒的所述单克隆抗体A-胶体金标记物。

优选地，编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞由纯化的猪流行性腹泻病毒筛选得到；猪流行性腹泻病毒的纯化具体包括以下步骤：

S301.将猪流行性腹泻病毒液反复冻融3次，在2～8℃条件下，12000r/min离心10分钟，收集猪流行性腹泻病毒上清液；

S302.在体积为V的所述猪流行性腹泻病毒上清液中一边加入硫酸铵一边持续搅拌，搅拌完成后2～8℃沉淀过夜；每100mL猪流行性腹泻病毒上清液中加入42.5g硫酸铵；

S303.将步骤S302中沉淀过夜后的猪流行性腹泻病毒上清液12000r/min离心10分钟，弃去上清并将离心分离出的沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S304.将步骤S303中得到的重悬病毒混合液在0.85％的氯化钠溶液中、2～8℃下透析，中途换液3次；透析之后在2～8℃条件下，以27000r/min离心2小时并弃去上清，沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S305.制备质量浓度为20％、35％、45％和60％的不连续梯度的蔗糖溶液，将步骤S304 中得到的重悬病毒混合液加在20％蔗糖界面上；在2～8℃条件下，以35000r/min离心90 分钟，收集20％层～35％层界面之间的病毒液，－20℃保存备用。

采用不连续梯度分布的蔗糖溶液实现猪流行性腹泻病毒的纯化，保证后续单克隆抗体 A、单克隆抗体B制备的纯度，从而提高胶体金试纸条的检测准确性。

优选地，所述单克隆抗体A-胶体金标记物按10μL/cm的速度喷于所述胶体金结合垫上。

优选地，所述检测线的制备方法为：将包含浓度为0.5mg/mL的所述单克隆抗体B按0.8μL/cm的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。

优选地，所述质控线的制备方法为：将包含浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG按0.8μL/cm 的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。

优选地，所述检测线与质控线之间的距离为5mm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)特异性强，采用抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体制备单克隆抗体A-胶体金标记物、单克隆抗体B的检测线，降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性、试纸条检测的灵敏度与准确性；

2)操作简单，检测过程无需任何仪器、操作人员无需任何专业培训；

3)适于现场诊断使用，检测快速且检测结果清晰易于判断。

附图说明

图1为本发明一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条的结构示意图；

图2为本发明一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条中胶体金的吸收光谱；

图3为本发明一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条检测后的显示示意图，其中 A为阳性结果示意图，B为阴性结果示意图，C为无效结果示意图；

图4为本发明一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条敏感性检测结果；

图5为本发明一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条特异性检测结果；图中：1、聚氯乙烯底板；2、硝酸纤维素膜；3、样品垫；4、胶体金结合垫；5、吸水纸；6、检测线；7、质控线。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1、抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A、单克隆抗体B的制备

(1)杂交瘤细胞的选择

猪流行性腹泻病毒(PEDV)的纯化，包括以下步骤：

S301.将猪流行性腹泻病毒液反复冻融3次，在2～8℃条件下，12000r/min离心10分钟，收集猪流行性腹泻病毒上清液；

S302.在体积为V的所述猪流行性腹泻病毒上清液中一边加入硫酸铵一边持续搅拌，搅拌完成后2～8℃沉淀过夜；每100mL猪流行性腹泻病毒上清液中加入42.5g硫酸铵；

S303.将步骤S302中沉淀过夜后的猪流行性腹泻病毒上清液12000r/min离心10分钟，弃去上清并将离心分离出的沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S304.将步骤S303中得到的重悬病毒混合液在0.85％的氯化钠溶液中、2～8℃下透析，中途换液3次；透析之后在2～8℃条件下，以27000r/min离心2小时并弃去上清，沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S305.制备质量浓度为20％、35％、45％和60％的不连续梯度的蔗糖溶液，将步骤S304 中得到的重悬病毒混合液加在20％蔗糖界面上；在2～8℃条件下，以35000r/min离心90 分钟，收集20％层～35％层界面之间的病毒液，－20℃保存备用。

选择杂交瘤细胞，具体为：

用纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，共免疫三次，免疫剂量为100μg/只，免疫间隔时间为14天。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0进行融合。用纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为筛选抗原检测杂交瘤细胞上清，筛选阳性的融合细胞，通过筛选和亚克隆得到2株可以稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即杂交瘤细胞(编号为10F10)、杂交瘤细胞(编号为4A11)。

杂交瘤细胞(编号为10F10)、杂交瘤细胞(编号为4A11)分泌的单克隆抗体A、单克隆抗体B特异性强、敏感性高，抗体亚类为IgG1。

杂交瘤细胞(编号为10F10)保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCC NO:C201905。

杂交瘤细胞(编号为4A11)保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2019年1月14日，保藏编号为CCTCC NO:C201904。

(2)单克隆抗体的制备

选用8周龄以上BALB/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，先给每只小鼠腹腔注射0.3mL弗氏不完全佐剂。收集生长良好的编号杂交瘤细胞(编号为10F10)，1000r/min 离心5min，弃去上清液，将沉淀重悬于无血清培养液中，并调整细胞密度为(2～5)×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔注射1mL细胞悬液；接种细胞悬液后7～12d，可见小鼠腹部明显膨大，收集腹水；将腹水3000r/min离心15min，小心吸去上层油脂后，取出中间的淡黄色腹水，分装，备用。

将收集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法纯化，具体步骤如下：

1)每1mL腹水加入4mL醋酸缓冲液(0.06mol/L，pH值为4.5)，并用1mol/L的 NaOH溶液调节pH至4.5；

2)随后加入辛酸33μL并搅拌30分钟，静置2小时后在12000r/min下离心10分钟，弃去沉淀，将上清液用NaOH溶液调节pH值至7.4；

3)缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵的终浓度为45％，继续搅拌30分钟，在2～8℃下静置2小时；

4)最后，以12000r/min离心30分钟，弃去上清液，并用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)将沉淀重悬后透析过夜，直至检测不到NH₄ ⁺和SO₄ ^2-，随后移出溶液，10000r/min离心15min，收集上清液即得到单克隆抗体A。

采用同样的方法，使用杂交瘤细胞(编号为4A11)制备单克隆抗体B。

2、抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金，具体步骤为：

1)在已硅化的瓶子中入120mL注射用水，再加入1.0mL 1％(w/v)氯金酸，放在电炉上加热至完全沸腾；

2)迅速一次加入2.8mL的1.05％(w/v)柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液变成酒红色；

3)停止加热后室温(20～25℃)下自然冷却；

4)最后用注射用水定容至100mL，即得到胶体金。制备的胶体金外观呈清亮透明的酒红色，通过分光光度计扫描后的结果如图2所示，胶体金在450～600nm处光谱，最大吸收波长为520nm；通过电镜观察，胶体金的颗粒大小均匀。

(2)单克隆抗体A-胶体金标记物的制备

于广口瓶中加入100mL的胶体金，0.2mol/L碳酸钾调节pH至8.0后，边磁力搅拌边滴加抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A，搅拌40min后再加入10％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌40min后分装于50mL离心管中， 10000r/min离心30min，弃去上清液，加入10mL重悬液(0.01mol/L pH 9.0Tris缓冲液) 中，即得到本发明所述的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物。

3、胶体金结合垫的制备

(1)配制包被液

0.05mol/L、pH值为9.0的Tris缓冲液、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP K40)、3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)吐温20搅拌均匀后滤纸过滤，即得包被液A。

(2)胶体金结合垫的制备

将玻璃纤维素膜浸泡在包被液A中30min，37℃烘箱中烘干，即得胶体金结合垫。

4、胶体金结合垫上喷涂抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物

将单克隆抗体A-胶体金标记物喷涂于处理过的胶体金结合垫上，单克隆抗体A-胶体金标记物的喷量为10μL/cm；喷涂完成后，于37℃烘箱中烘干2小时，裁切成宽0.5cm条状备用。

5、喷涂检测线和质控线

(1)配制包被液

0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)、1.0％(w/v)海藻糖、1.0％(w/v) 山梨醇、0.3％(w/v)吐温20、搅拌均匀后0.22μm滤膜过滤，即得包被液B。

(2)检测线和质控线的制备

将硝酸纤维素膜2非点样面粘贴于聚氯乙烯底板1上，硝酸纤维素膜2的型号具体为 Millipore HF135；将抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B用上述包被液B稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜2上作为检测线；单克隆抗体B的浓度为0.5mg/mL，喷量为0.8μL/cm。

喷涂在硝酸纤维素膜2上的质控线为羊抗鼠IgG(购于武汉三鹰生物技术有限公司) 浓度为1.5mg/mL，喷量为0.8μL/cm。

检测线和质控线的距离是5mm，喷涂完成后于37℃烘箱中烘干2小时备用。

6、吸水纸的处理

将吸水纸浸泡在缓冲液(0.05mol/L的Tris-Cl，pH值为9.0)中30min，37℃烘箱中烘干，裁切成宽为1.8cm条状备用。

7、试纸条的制备

如图1所示，在聚氯乙烯底板1上粘贴上述步骤5中制备的硝酸纤维素膜2；将步骤4中制备的喷涂抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物的胶体金结合垫4粘贴在硝酸纤维素膜2的上方，覆盖硝酸纤维素膜2上1～3mm；胶体金结合垫4与硝酸纤维素膜2上的检测线6相邻；吸水纸5粘贴在硝酸纤维素膜2的上方，覆盖硝酸纤维素膜2 上1～3mm；吸水纸5与硝酸纤维素膜2上的质控线7相邻；样品垫3粘贴在胶体金结合垫4的上方，覆盖胶体金结合垫4上1～3mm；用切条仪把胶体金试纸条切成3.6mm宽的试纸条后和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。

应用例

1、胶体金试纸条的应用

(1)待测样品的预处理

取少量猪粪便加入到1mL的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，制成混悬液，充分混匀后静置5min，保留上清液或者离心分离保留上清液。

(2)检测

分别取上清液约120μL滴在本发明所述的胶体金试纸条上，5min后观察结果；检测结果的判定依据为：在质控线7、检测线6上均出现红色时，为阳性结果，即样本中含有猪流行性腹泻病毒，如图3中的A所示；质控线7出现红色、检测线6不出现红色为阴性结果，即样本中不含有猪流行性腹泻病毒，如图3中的B所示；若质控线7未出现红色线，则试纸无效，如图3中的C所示。图3中C表示质控区，T表示检测区。

试验例

1、胶体金试纸条的敏感性

将0.1mL的TCID₅₀为10^6.5的猪流行性腹泻病毒液用0.01mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍后取120μL 滴在胶体金试纸条上，5min后观察结果，如图4所示。

由图4所示的结果可知：猪流行性腹泻病毒液被稀释至256倍时，检测结果为阳性；稀释至512倍时，检测结果为阴性。

2、胶体金试纸条的特异性

将猪蓝耳病病毒液、猪圆环病毒液(2型)、猪瘟病毒液、猪传染性胃肠炎病毒液、猪轮状病毒液、细胞培养物、0.01mol/L、pH值为7.4的PBS、阴性猪粪便混悬液(猪粪便取少量加入到1mL的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，制成混悬液，充分混匀后静置 5min或者离心取上清)，取约120μL滴在胶体金试纸条上，5min后观察结果，如图5所示。

由图5所示的结果可知：检测结果均呈现阴性。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫和吸水纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜粘贴在所述聚氯乙烯底板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别粘贴有所述胶体金结合垫、吸水纸，所述胶体金结合垫上粘贴有所述样品垫；所述胶体金结合垫上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体A-胶体金标记物，与所述胶体金结合垫相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体B的检测线，与所述吸水纸相邻的所述硝酸纤维素膜上喷涂有山羊抗鼠IgG的质控线；

所述单克隆抗体A由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为10F10的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞10F10，保藏编号为CCTCC NO:C201905；

所述单克隆抗体B由保藏在中国典型培养物保藏中心的编号为4A11的杂交瘤细胞分泌产生，分类命名为分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞4A11，保藏编号为CCTCC NO:C201904。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体A-胶体金标记物的具体制备步骤为：在胶体金中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边磁力搅拌边滴加所述单克隆抗体A，搅拌40min后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌40min后分装于离心管中，10000r/min离心30min，弃去上清液；将离心分离出的沉淀加入0.01mol/L、pH值为9.0的Tris缓冲液中重悬，即得到抗猪流行性腹泻病毒的所述单克隆抗体A-胶体金标记物。

3.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，编号为10F10的杂交瘤细胞、编号为4A11的杂交瘤细胞由纯化的猪流行性腹泻病毒筛选得到；猪流行性腹泻病毒的纯化具体包括以下步骤：

S301.将猪流行性腹泻病毒液反复冻融3次，在2～8℃条件下，12000r/min离心10分钟，收集猪流行性腹泻病毒上清液；

S302.在体积为V的所述猪流行性腹泻病毒上清液中一边加入硫酸铵一边持续搅拌，搅拌完成后2～8℃沉淀过夜；每100mL猪流行性腹泻病毒上清液中加入42.5g硫酸铵；

S303.将步骤S302中沉淀过夜后的猪流行性腹泻病毒上清液12000r/min离心10分钟，弃去上清并将离心分离出的沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S304.将步骤S303中得到的重悬病毒混合液在0.85％的氯化钠溶液中、2～8℃下透析，中途换液3次；透析之后在2～8℃条件下，以27000r/min离心2小时并弃去上清，沉淀用体积为3％V、浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS重悬；

S305.制备质量浓度为20％、35％、45％和60％的不连续梯度的蔗糖溶液，将步骤S304中得到的重悬病毒混合液加在20％蔗糖界面上；在2～8℃条件下，以35000r/min离心90分钟，收集20％层～35％层界面之间的病毒液，－20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体A-胶体金标记物按10μL/cm的速度喷于所述胶体金结合垫上。

5.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线的制备方法为：将包含浓度为0.5mg/mL的所述单克隆抗体B按0.8μL/cm的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。

6.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述质控线的制备方法为：将包含浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG按0.8μL/cm的速度喷于所述硝酸纤维素膜上。

7.根据权利要求1所述的一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线之间的距离为5mm。