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CN111848819A - 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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CN111848819A
CN111848819A CN202010761440.4A CN202010761440A CN111848819A CN 111848819 A CN111848819 A CN 111848819A CN 202010761440 A CN202010761440 A CN 202010761440A CN 111848819 A CN111848819 A CN 111848819A
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antigen receptor
chimeric antigen
ser
gly
leu
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CN202010761440.4A
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汤朝阳
秦乐
吴迪
邓殷健
吴海鹏
王翠花
冯世忠
冯嘉昆
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Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种靶向MSLN的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗Mesothelin单链抗体；所述铰链区为IgG4‑CH3。本发明通过向CAR分子中引入IgG4‑CH3铰链区，构建靶向MSLN的嵌合抗原受体，显著提高了CAR‑T细胞的体外扩增效率，在实体瘤治疗领域具有重要意义。

Description

一种靶向MSLN的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向MSLN的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。
尽管CAR-T细胞疗法已取得了惊人的疗效，但是仍然存在许多阻碍。例如，CAR-T细胞、尤其是CD4+CAR-T细胞的扩增效率还有待提高。在常规的体外培养体系中，CD8+T细胞相较于CD4+T细胞具有更明显的生长优势，体外培养主要获得CD8+T细胞，CD4+T细胞的比例极低。最近研究发现，CAR-T细胞中CD4+和CD8+T细胞的比例对于CAR-T细胞的抗肿瘤活性有很大影响，CAR-T细胞中CD4+T细胞的比例与CAR-T细胞的治疗效果呈正相关，因此为了获得大量的CD4+CAR-T细胞，需要首先分选出CD4+CAR-T细胞和CD8+CAR-T细胞，再通过不同的细胞因子组合分别扩增CD4+CAR-T细胞和CD8+CAR-T细胞，过程繁琐，成本巨大。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种靶向MSLN的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体采用IgG4-CH3铰链区，显著提高了CD4+CAR-T细胞的体外扩增效率，增强了靶向MSLN的CAR-T细胞的杀伤作用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域为抗Mesothelin单链抗体；
所述铰链区为IgG4-CH3。
本发明中，采用IgG4-CH3作为嵌合抗原受体的铰链区，显著提高了CD4+CAR-T细胞的体外扩增效率，增强了CAR-T对MSLN阳性肿瘤细胞的杀伤作用。
优选地，所述抗Mesothelin单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
SQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSGILEQQG。
优选地，所述IgG4-CH3包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
GGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。
优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗Mesothelin单链抗体、IgG4-CH3、CD8α、DAP10、CD3ζ和TLR2串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:3：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSGILEQQGGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKR KPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。
第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
SEQ ID NO:4：
atggcactgcctgtgactgccctgctgctccctctcgcactcctgctgcacgcagcccgcccaagccaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggtggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaaga gcctctccctgtctccgggtaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggcagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞为表达第一方面所述的嵌合抗原受体的CD3+CD4+T细胞和/或CD4+CD8+T细胞。
第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用IgG4-CH3作为嵌合抗原受体的铰链区，显著提高了CAR-T细胞、尤其是CD4+CAR-T细胞的体外扩增效率；
(2)本发明构建的抗MSLN CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞具有显著的清除杀伤作用。
附图说明
图1为CAR分子的结构示意图；
图2A为Meso-H-CAR-T的体外扩增效率，图2B为Meso-CAR-T的体外扩增效率，图2C为WT的体外扩增效率；
图3为CAR-T细胞对胃癌细胞的杀伤功能。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1CAR分子载体的构建
本实施例首先全基因合成铰链区为IgG4-CH3的Meso-H-CAR(SEQ ID NO:4)和铰链区为IgG4的Meso-CAR，并在两端分别添加PmeI和SpeI酶切位点，Meso-H-CAR的示意图如图1所示；
PmeI和SpeI双酶切合成的CAR分子的编码基因以及慢病毒表达载体pwpxld-eGFP，琼脂凝胶电泳回收后进行连接反应；
将构建好的质粒转入大肠杆菌，挑选带有目的质粒的单克隆进行过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，得到重组慢病毒载体。
实施例2慢病毒包装
本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，步骤如下：
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，配制转染试剂，取500μL opti-DMEM至15mL离心管中，加入7.2μL浓度为10μg/μL的PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(4)取500μL opti-DMEM至1.5mL离心管中，取重组慢病毒载体9μg、pMD2.G辅助质粒3μg和psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀，加入到转染试剂中，颠倒混匀，静置20min；
(5)将上述混合液全部加到293T细胞中，孵育6h后，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(6)在更换培养基24h后收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(7)24h后再次收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(9)培养基上清收集完毕后，在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，得到重组慢病毒。
重组慢病毒载体包括含有Meso-H-CAR的编码基因的慢病毒载体和含有Meso-CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体。
实施例3T细胞激活和慢病毒转染
(1)从脐带血中分选出Pan T细胞后，对细胞进行计数，将浓度调整至1×106个/mL，随后向每毫升细胞悬液中加入10μL美天旎TransAct T细胞试剂，激活48小时后更换为新鲜培养基(IMDM培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+IL-2)；
(2)T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞。
本实施例构建的CAR-T细胞分别为Meso-H-CAR-T和Meso-CAR-T，同时设置WT对照组(转染空白对照慢病毒)。
实施例4体外检测CAR-T细胞的扩增
在CAR-T细胞体外培养过程中，细胞密度维持在(0.5～1)×106个/mL培养基的水平，每2天补充一次新鲜培养基，调整细胞密度；每2～3天进行一次细胞计数，流式检测CAR-T细胞的百分比，同时检测CD4+、CD8+CAR-T细胞的比例直到体外培养结束。
如图2A、图2B和图2C所示，体外培养过程中，Meso-H-CAR-T、Meso-CAR-T和WT细胞的数量均得到提高，Meso-CAR-T和WT增加的主要是CD8+T细胞，而Meso-H-CAR-T增加的主要是CD4+T细胞。
实施例5体外检测CAR-T细胞对胃癌细胞的杀伤功能
将实施例3制备的Meso-H-CAR-T、Meso-CAR-T和WT分别与1×104个肿瘤细胞BGC823按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较Meso-H-CAR-T、Meso-CAR-T和WT对BGC823的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图3所示，可以看出，相对于Meso-CAR-T和WT，Meso-H-CAR-T对胃癌细胞的杀伤作用更强。
综上所述，本发明采用IgG4-CH3作为嵌合抗原受体的铰链区，显著提高了CAR-T细胞、尤其是CD4+CAR-T细胞的体外扩增效率；构建的抗MSLN CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞具有显著提高的清除杀伤作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种靶向MSLN的嵌合抗原受体及其应用
<130> 2020
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser
1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser
20 25 30
Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr
50 55 60
Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro
165 170 175
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
180 185 190
Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val
210 215 220
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
245 250 255
Thr Val Leu Ser Gly Ile Leu Glu Gln Gln Gly
260 265
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro
1 5 10 15
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
20 25 30
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
35 40 45
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
50 55 60
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
65 70 75 80
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
85 90 95
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
100 105 110
Leu Ser Pro Gly Lys
115
<210> 3
<211> 769
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Leu Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly
35 40 45
Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser
50 55 60
Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys
65 70 75 80
Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn
85 90 95
Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr
100 105 110
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser
165 170 175
Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly
180 185 190
Ile Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln
210 215 220
Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser
225 230 235 240
Ala Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu
245 250 255
Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly
260 265 270
Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gly Ile Leu Glu Gln Gln Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
405 410 415
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
420 425 430
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
435 440 445
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
450 455 460
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Cys Ala Arg Pro Arg
465 470 475 480
Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly
485 490 495
Arg Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
500 505 510
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
515 520 525
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
530 535 540
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
545 550 555 560
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
565 570 575
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
580 585 590
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
595 600 605
Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn Ile
610 615 620
Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp Val
625 630 635 640
Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys
645 650 655
Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp
660 665 670
Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu
675 680 685
Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe
690 695 700
Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile
705 710 715 720
Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys
725 730 735
Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met Asp
740 745 750
Glu Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys
755 760 765
Ser
<210> 4
<211> 2307
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60
ccaagccagg tacagctgca gcagtcaggt ccaggactcg tgacgccctc gcagaccctc 120
tcactcacct gtgccatctc cggggacagt gtctctagca acagtgctac ttggaactgg 180
atcaggcagt ccccatcgag aggccttgag tggctgggaa ggacatacta caggtccaag 240
tggtataacg actatgcagt atctgtgaaa agtcgaatga gcatcaaccc agacacatcc 300
aagaaccagt tctccctgca gctgaactct gtgactcccg aggacacggc tgtgtattac 360
tgtgcaagag gaatgatgac ttactattac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 420
gtcaccgtct cctcaggaat tctaggatcc ggtggcggtg gcagcggcgg tggtggttcc 480
ggaggcggcg gttctcagcc tgtgctgact cagtcgtctt ccctctctgc atctcctgga 540
gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc agtggcatca atgttggtcc ctacaggata 600
tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaacta caaatcagac 660
tcagataagc agcagggctc tggagtcccc agccgcttct ctggatccaa agatgcttcg 720
gccaatgcag gggttttact catctctggg ctccggtctg aggatgaggc tgactattac 780
tgtatgattt ggcacagcag cgctgctgtg ttcggaggag gcacccaact gaccgtcctc 840
tccggaattc tagaacaaca gggtggcgga ggtagctctg gcggtggatc cggcgggcag 900
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 960
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200
ctgtctccgg gtaaaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 1260
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1320
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1380
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcctgtgcgc acgcccacgc 1440
cgcagccccg cccaagaaga tggcaaagtc tacatcaaca tgccaggcag gggcagagtg 1500
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1560
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1620
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1680
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1740
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1800
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc caggccaaaa ggaagcccag gaaagctccc 1860
agcaggaaca tctgctatga tgcatttgtt tcttacagtg agcgggatgc ctactgggtg 1920
gagaacctta tggtccagga gctggagaac ttcaatcccc ccttcaagtt gtgtcttcat 1980
aagcgggact tcattcctgg caagtggatc attgacaata tcattgactc cattgaaaag 2040
agccacaaaa ctgtctttgt gctttctgaa aactttgtga agagtgagtg gtgcaagtat 2100
gaactggact tctcccattt ccgtcttttt gatgagaaca atgatgctgc cattctcatt 2160
cttctggagc ccattgagaa aaaagccatt ccccagcgct tctgcaagct gcggaagata 2220
atgaacacca agacctacct ggagtggccc atggacgagg ctcagcggga aggattttgg 2280
gtaaatctga gagctgcgat aaagtcc 2307

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域为抗Mesothelin单链抗体；
所述铰链区为IgG4-CH3。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Mesothelin单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IgG4-CH3包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α；
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗Mesothelin单链抗体、IgG4-CH3、CD8α、DAP10、CD3ζ和TLR2串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求5所述的编码基因的慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
8.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有权利要求5所述的编码基因；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞为表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的CD3+CD4+T细胞和/或CD4+CD8+T细胞。
10.一种权利要求8或9所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。
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