CN117866902A - 具有抗il-17a活性的基因修饰干细胞及其制备方法以及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗IL‑17A活性的基因修饰干细胞及其制备方法以及药物组合物。本发明提供了一种抗IL‑17A纳米抗体（IL17Nb）基因修饰的间充质干细胞（IL17Nb‑MSC），所述的IL17Nb‑MSC包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑6所述的HCDR区。本发明所述的基因修饰干细胞能够高表达IgG4和IL‑17Nb，其中IL‑17Nb可以高效阻断IL‑17A/IL17RA的结合，为IL‑17A介导的风湿关节炎、银屑病和银屑病关节炎等多种疾病的治疗提供了新的选择，具有广阔的临床应用前景。

Description

具有抗IL-17A活性的基因修饰干细胞及其制备方法以及药物 组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗IL-17A活性的基因修饰干细胞及其制备方法以及药物组合物。

背景技术

间充质干细胞（MSCs）来源于胚胎发育早期的中胚层，是一种异质性的细胞群体，机体内的MSCs包含自胚胎发育早期及之后不同发育阶段的干细胞及分化后代。人体的组织都含有MSCs，多种组织和器官中MSCs含量丰富，如骨髓、脂肪、牙髓、脐带和胎盘等。MSCs的免疫原性低，并且能够在重复注射后都不被受者的免疫系统识别，这是MSCs用于临床治疗的一个最显著的优势。MSCs还能够分泌很多生物活性分子以及一些免疫调节因子，能够对机体的损伤、炎症等起到修复作用。目前，MSCs被用于治疗多种疾病的临床研究，包括多发性硬化症，心肌梗死，器官移植，肝硬化及肝衰竭，心衰，GVHD，左心室功能失调，白血病及克罗恩病等。

MSCs还是非常理想的基因治疗细胞载体，易被所有临床上普遍应用的病毒载体系统所转染，经过基因修饰的MSCs输注后可以遍布全身，不仅可以发挥干细胞归巢和修复的作用，同时又可大量表达如细胞因子等的目的基因，而且二者具有协同作用，这样可以扩大MSCs治疗的疾病范围，使得病灶部位局部的修复几率大大提高。这些优点使得MSCs成为最具有基因治疗研究和临床治疗应用前景的干细胞之一。

专利CN 112941028 A公开了一种纳米抗体基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用。该间充质干细胞含有、和/或表达、和/或分泌纳米抗体。该间充质干细胞或该间充质干细胞的培养提取物，迁移至目标靶位的同时，使得纳米抗体能够在较短时间精准到达病灶区，提高病灶区纳米抗体的浓度和有效量，并减弱病灶区纳米抗体的衰竭现象，还促进间充质干细胞分泌其他有益成分，提高间充质干细胞介导的细胞免疫治疗，提高免疫相关性疾病的治疗效果。

IL-17A是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，作用于下游效应细胞介导多种生理过程，如炎症反应、凝血过程和骨重塑等，与机体多种疾病密切相关。IL-17A表达过量时将导致脊柱关节炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、炎症性肠病等多种疾病的发生发展。对于这类疾病临床可用的特效药物较少，传统治疗存在起效较慢、依从性差等缺点。鉴于以上基因修饰干细胞的在治疗中的优势，亟需开发一种基因修饰干细胞用于上述疾病的治疗。

本发明人致力于抗IL-17A抗体开发，为便于审查，现对研发项目的技术背景进行简要介绍：

发明人基于筛选出的9个单域抗体（已另案申请），进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合（已另案申请）。

本发明人在上述技术方案的基础上，继续进行技术开发，研发了单域抗体组合基因修饰干细胞技术，基于专利法单一性的相关规定，对3个不同的基因修饰干细胞分别请求保护，本案系基因修饰干细胞技术之一所进行的发明专利申请。

为便于理解本申请，可选地参阅本项目其他专利申请文件。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种含有、表达和/或分泌抗IL-17A抗体的干细胞，其特征在于，所述的抗IL-17A抗体为二价单域抗体，所述的二价单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明中，单域抗体又称纳米抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区。单域抗体为仅有重链的抗体，该抗体天然不包含轻链，衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。

本发明中，抗IL-17A的二价单域抗体即抗IL-17A的双价单域抗体不仅包括完整的二价单域抗体，还包括所述抗IL-17A的二价单域抗体的片段、衍生物和类似物。其中，片段、衍生物和类似物含义相同，均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多肽，或附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与Fc标签形成的融合蛋白）。

本发明中，序列同源性表示两个（核苷酸或氨基酸）序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。在一些实施例中，与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。这些变异形式包括但并不限于：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下（a）-（d）组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：（a）极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；（b）极性带正电残基：His、Arg、Lys；（c）芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；（d）脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。

本发明中的，抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物。由于融合蛋白的不同，这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能，并且表达的重组蛋白既不影响单链抗体的抗原结合能力，也不影响与之融合的蛋白质的生物学特性。

本发明中的，干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。从功能上讲，干细胞是具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。本发明中的干细胞具有以下一些生物学特点：（a）属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记；（b）在机体的数目位置相对恒定；（c）具有自我更新能力；（d）能无限地分裂、增殖，可在较长时间内处于静止状态，干细胞可连续分裂几代；（e）具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞；也具有分化发育的可塑性，在特定环境下，能被诱导分化成在发育上无关的细胞类型，其分化受所处周围微环境（干细胞壁龛）的影响；（f）分裂的慢周期性；（g）干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂，形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂方式，非对称分裂中一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另外一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。

本发明中的，间充质干细胞（MSC）也称为间充质基质细胞，是源自中胚层的非造血成体干细胞的亚群。它们具有自我更新能力和多向分化性，不仅分化为中胚层谱系，如软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞，还分化为外胚层细胞和内胚层细胞。由于没有伦理问题和畸胎瘤形成，MSC是用于治疗免疫疾病和非免疫疾病的细胞疗法的主要干细胞类型。它们可以很容易地从骨髓、脂肪组织、脐带、胎儿肝脏、肌肉和肺中分离，并且可以在体外成功地扩增。此外，MSC具有归巢至受损组织部位的趋势。当MSC外源性递送和系统地给予人和动物时，它们特别地迁移到具有炎症的受损组织部位。炎症指导的MSC归巢涉及几种重要的细胞运输相关分子，包括趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶（MMP）。

本发明中，细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。

本发明从以下几个方面提高细胞培养的成功率（1）无菌操作：胞培养过程中，保持无菌操作是非常重要的。使用无菌技术，包括穿戴适当的实验室衣物、戴手套及口罩、使用无菌操作台或培养箱等设备，以及使用无菌的培养器具和培养试剂，以避免细菌、真菌或其他微生物的污染。（2）培养器具处理：在使用之前，确保培养器具（如培养皿、离心管、试管等）经过适当的清洁和消毒处理。培养皿可以在使用前经过紫外线照射，试管和离心管可以通过高温烘烤或自动清洗程序进行处理。（3）培养基配制：准确配制培养基是保证细胞生长和健康的关键。按照制造商的说明书或实验室的标准操作规程准确称量和混合培养基组分，确保正确的浓度和pH值。（4）细胞密度控制：在进行细胞传代或实验前，根据细胞类型和实验要求确定适当的细胞密度。过低的密度可能导致细胞生长缓慢，而过高的密度可能导致细胞过度拥挤和细胞死亡。（5）培养条件优化：不同细胞类型对培养条件的要求不同，包括培养温度、CO2浓度、湿度和培养基配方等。了解并优化适合特定细胞类型的培养条件，可以提高细胞的成功培养率。（6）细胞检测和鉴定：定期对细胞进行鉴定和检测，确保其纯度和认证。使用但不限于细胞特异性标记物或PCR方法进行鉴定，以避免细胞污染或细胞系混合的情况。（7）冻存备份：定期冻存备份细胞株，以防止细胞的丢失或污染。冻存细胞的方法和条件需要根据细胞类型和实验室的要求来确定。（8）观察和记录：密切观察和记录细胞的生长和状态，包括细胞形态、增殖速率和细胞死亡等。及时发现和处理任何异常现象，如细胞污染或细胞衰老等。

本发明中，核酸构建体，其含有本文发明的抗体的核酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。所述的操作性连接指线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

所述的调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

所述的调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

本发明中，重组载体。具体而言，可将抗体的核酸序列克隆入载体，例如载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体(也称为重组载体)。表达载体可以以病毒载体形式或非病毒形式提供给细胞，优选为非病毒载体。所述表达载体上可含有1个或多个重复的抗体核酸序列。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。

合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。

本发明中，药学上可接受的辅料指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。

一方面，本发明提供了一种经修饰的干细胞，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一抗体，所述的第一抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体；

（2）第二抗体所述的第二抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体。

具体地，所述的第一单域抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-3；

所述的第二单域抗体包含HCDR4、HCDR5和HCDR6；所述的HCDR4、HCDR5和HCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的结构包含：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的结构包含：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8。

具体地，所述的HCDR1-6选自SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列；

所述的FR1-8选自SEQ ID NO.7-14所示的氨基酸序列。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白；

所述的融合蛋白包含结构为：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4-linker-FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8的氨基酸序列。

具体地，所述的HCDR1-6选自SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列；

所述的FR1-8选自SEQ ID NO.7-14所示的氨基酸序列；

所述的linker的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5或6。

又一方面，本发明提供了一种经修饰的干细胞，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的序列包含如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；

（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的序列包含如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白。

具体地，所述的的融合蛋白的序列包含如SEQ ID NO.17。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含下述（1）和（2）：

（1）第一核酸分子；

（2）第二核酸分子。

具体地，所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第二核酸分子编码包含SEQ ID NO: 4-6所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步具体地，所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO: 7-10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第二核酸分子编码包含SEQ ID NO: 11-14所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的第一核酸分子和第二核酸分子之间由编码包含(GGGGS)n所示的氨基酸序列的核苷酸序列连接，其中n为1、2、3、4、5或6。

优选地，所述的连n为3。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含下述（1）和（2）：

（1）第一核酸分子；

（2）第二核酸分子；

所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供了一种干细胞，所述的干细胞包含编码SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

具体地，所述的干细胞还包含、表达和/或分泌能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

进一步具地，所述的生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段为人免疫球蛋白Fc结构域。

进一步优选地，所述的生物活性蛋白或其功能片段为人IgG的Fc结构域，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc结构域。

更一步优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段为人IgG1的Fc结构域。

具体地，所述的干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞。

优选地，所述干细胞为间充质干细胞。

具体地，所述的干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

具体地，所述的干细胞分泌抗白细胞介素抗体。

进一步具体地，所述的干细胞分泌抗白细胞介素17抗体。

更进一步具体地，所述的干细胞分泌抗IL-17A抗体。

又一方面，本发明提供了包含前述的干细胞的细胞培养物。

又一方面，本发明提供了一种提取物，所述的的提取物是从前述的细胞培养物中提取得到的。

具体地，所述的提取物为细胞培养上清、细胞裂解液和/或细胞外泌体。

进一步具体地，所述的细胞上清是指干细胞在其培养过程产生的富含多种细胞因子的原始的未经处理或经简单处理的培养液；

所述的细胞裂解液是指通过超声等方法破碎干细胞，使其释放出其中的可溶性蛋白和细胞中其他可溶性内容物；

所述的细胞外泌体是指一类具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递，直径30-150nm。

又一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含前述的干细胞或细胞培养物或提取物。

具体地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料包括但不限于：赋形剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂、抗氧化剂中的任意一种或多种。

优选地，所述药学上可接受的辅料可选自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。

又一方面，本发明提供了一种试剂盒，包括前述的干细胞或细胞培养物或提取物。

具体地，所述的试剂盒还包括固相载体、检测标记、检测底物和/或缓冲液。

进一步具体地，所述的固相载体可以是一种具有亲和性的材料，可以将特异性抗体固定在表面上。

所述的检测标记可以是酶标记物，所述的酶标记物是一种能够与抗体结合的酶，用于检测抗体与抗原的结合情况。

所述的检测底物可以是酶标记物的反应产物，能够在酶催化下产生可测量的信号。

又一方面，本发明提供了一种前述的干细胞的制备方法，所述制备方法包括：将所述的核酸分子通过病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染导入干细胞。

又一方面，本发明提供了前述的干细胞或细胞培养物或提取物或药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。

具体地，所述的疾病包括但不限于：炎症性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤。

进一步具体地，所述炎症性疾病包括但不限于：桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和/或原发性胆汁性肝硬化；

所述感染性疾病包括但不限于：细菌感染、病毒感染、真菌感染、支原体感染、衣原体感染和/或立克次体感染；

所述自身免疫性疾病包括但不限于：白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症和/或包涵体肌炎；优选地，所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎和/或狼疮性肾炎；

所述神经系统疾病包括但不限于：中枢神经系统感染、脑血管疾病、运动障碍性疾病、周围神经病、和/或神经和肌肉接头及肌肉疾病。

所述的肿瘤包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B 细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病

更进一步具体地，所述的疾病包括类风湿关节炎、银屑病和/或银屑病关节炎。

具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。

进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料包括但不限于：赋形剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂、抗氧化剂中的任意一种或多种。

优选地，所述药学上可接受的辅料可选自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。

又一方面，本发明提供了一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法，所述方法包括以下步骤：

S1：前述的干细胞或细胞培养物或提取物与待测样品相接触；

S2：检测抗原-抗体复合物；

S3：判读结果。

本发明所取得的技术效果：

（1）本发明制备的基因修饰间充质干细胞（IL17Nb-MSC）高表达IgG4，表达量高达6843.33±845.33ng/mL；正常hUC-MSC不表达IgG4。

（2）本发明制备的基因修饰间充质干细胞（IL17Nb-MSC）高表达IL-17Nb，浓度为2212.33±214.65ng/mL；正常的间充质干细胞（hUC-MSC）则不表达IL-17Nb。

（3）本发明制备的基因修饰间充质干细胞（IL17Nb-MSC）细胞分泌的IL-17Nb可以阻断IL-17A/IL17RA的结合，稀释4倍后抑制率高达51%；正常的间充质干细胞（hUC-MSC）无法阻断IL-17A/IL17RA的结合。

附图说明

图1为双价单域抗体（C3-G4）和阳性对照Ixekizumab亲和力ELISA检测结果图。

图2为双价单域抗体（C3-G4）和阳性对照Ixekizumab亲和力检测结果图，其中，图内由上而下分别为25，12.5，6.25，3.13。

图3为双价单域抗体（C3-G4）和阳性对照Ixekizumab阻断功能实验结果图。

图4为双价单域抗体（C3-G4）的稳定性结果。

图5为阳性对照Ixekizumab的稳定性结果。

图6为慢病毒颗粒的转导复数结果图。

图7为慢病毒滴度检测结果。

图8为间充质干细胞FITC通道信号结果图。

图9为间充质干细胞IgG4的表达结果图。

图10为间充质干细胞IL-17Nb的表达结果图。

图11为间充质干细胞阻断IL-17A与IL-17RA结合的阻断率。

图12为实施例9干细胞稳定性实验结果。

图13为实施例10中的小鼠体重变化趋势图，其中，**P<0.01代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异；^##P<0.01代表C3-G4-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异；^&&P<0.01代表C3-G4-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异。

图14为实施例10中的小鼠皮肤照片。

图15为实施例10中的小鼠皮肤临床评分，其中，****P<0.0001代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异；^###P<0.001代表3个治疗组与模型对照组之间存在显著性差异；^&P<0.05代表C3-G4-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异；^@P<0.05代表C3-G4-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异。

图16为实施例10中的小鼠皮肤厚度检测结果，其中，***P<0.001代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异；^##P<0.01代表3个治疗组与模型对照组之间存在显著性差异；^&P<0.05代表C3-G4-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗体的制备

1.1筛选抗IL-17A单域抗体

IL-17A蛋白的制备：将IL-17蛋白（SEQ ID NO.30）C端添加6xHis标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提；将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白；通过SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度。IL-17A抗原蛋白经精纯后，纯度大于90%。

SEQ ID NO:30：

MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA。

发明人采用制备的IL-17A蛋白免疫羊驼和酵母库筛选，分别获得1-C3和2-G4单域抗体。在抗体阻断活性检测中发现，单域抗体虽然能够阻断Human IL-17A蛋白激活下游靶标蛋白，但阻断效果较弱于阳性抗体Ixekizumab。因此，发明人将两种抗不同表位的IL-17A单域抗体串联组成二价抗体，以增强其阻断效果。两种抗IL-17A单域抗体为1-C3和2-G4。

第一单域抗体（1-C3）CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-3；FR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7-10；单域抗体（1-C3）的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；

第二单域抗体（2-G4）CDR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6；FR区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11-14；单域抗体（2-G4）的氨基酸序列为SEQ ID NO.16。

SEQ ID NO. 1：GEDLGYYA；

SEQ ID NO. 2：VTSSGSST；

SEQ ID NO. 3：ASTILLCSDYISAFGT；

SEQ ID NO. 4：GEKLDYFA；

SEQ ID NO. 5：VTSSGSST；

SEQ ID NO. 6：ASTILLCSDYISAFGT；

SEQ ID NO. 7：DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAP；

SEQ ID NO. 8：IAWFRQAPGKEREVVSC；

SEQ ID NO. 9：NYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC；

SEQ ID NO. 10：WGQGTQVTVAS；

SEQ ID NO. 11：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS；

SEQ ID NO. 12：IGWFRQAPGKEREVVSC；

SEQ ID NO. 13：NYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYC；

SEQ ID NO. 14：WGQGTQVTVAS；

SEQ ID NO. 15：

DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAPGEDLGYYAIAWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS；

SEQ ID NO. 16：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGEKLDYFAIGWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS。

1.2制备双价单域抗体（C3-G4）

本发明的双价单域抗体（1-C3-2-G4）简称为双价单域抗体（C3-G4）或C3-G4。

本实施例的双价单域抗体是第一单域抗体（1-C3）通过linker（GGGGSGGGGSGGGGS）与第二单域抗体（2-G4）连接（连接后的氨基酸序列为SEQ ID NO.17；对应的核酸序列为SEQID NO. 18），再连接铰链区（SEQ ID NO.19）和CH区（SEQ ID NO.20）。获得的双价单域抗体（C3-G4）的氨基酸序列为SEQ ID NO.21，对应的核酸序列为SEQ ID NO.22。

1）将上述双价单域抗体（C3-G4）序列（SEQ ID NO.22）进行基因合成，与humanIgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc（IgG1恒定区氨基酸序列SEQ ID NO.26）中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用；

2）从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2 mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130 μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400 μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

3）将上述DNA/ LVTransm复合物加入到30 mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130 rpm培养6-8小时后，加入50 mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

4）连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45 μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体，最终得到双价单域抗体（C3-G4）。

SEQ ID NO. 17：

DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAPGEDLGYYAIAWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGEKLDYFAIGWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS；

SEQ ID NO. 18：

gatgtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcgagcctggggaatctctgaggctctcctgtgcagcccctggagaggatttgggttattacgccatagcctggttccgccaggccccagggaaggagcgtgaggtagtctcatgtgtcacaagtagtggtagtagcacaaactatttaagttccgtgaaggaccgattcaccatctccatagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccgtttattactgtgcgtccactattctcctctgttcagattatatctctgcctttggcacctggggccaggggacccaggtcaccgtcgcctcgggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggttctcaggtgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcagcccgggggatctctgaggctctcgtgtgcagcctctggagagaaattggattattttgccataggctggttccgccaggccccagggaaggagcgtgaggtagtctcatgtgtcacaagtagtggtagtagcacaaactatttaagttccgtgaaggaccgattcaccatctccatagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccatttattactgtgcgtccactattctcctctgttcagattatatctctgcctttggcacctggggccaggggacccaggtcaccgtcgcctcg；

SEQ ID NO. 19：DKTHTCP；

SEQ ID NO. 20：

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

SEQ ID NO. 21：

DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAPGEDLGYYAIAWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVASGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGEKLDYFAIGWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

SEQ ID NO. 22：

gatgtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcgagcctggggaatctctgaggctctcctgtgcagcccctggagaggatttgggttattacgccatagcctggttccgccaggccccagggaaggagcgtgaggtagtctcatgtgtcacaagtagtggtagtagcacaaactatttaagttccgtgaaggaccgattcaccatctccatagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccgtttattactgtgcgtccactattctcctctgttcagattatatctctgcctttggcacctggggccaggggacccaggtcaccgtcgcctcgggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggttctcaggtgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcagcccgggggatctctgaggctctcgtgtgcagcctctggagagaaattggattattttgccataggctggttccgccaggccccagggaaggagcgtgaggtagtctcatgtgtcacaagtagtggtagtagcacaaactatttaagttccgtgaaggaccgattcaccatctccatagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccatttattactgtgcgtccactattctcctctgttcagattatatctctgcctttggcacctggggccaggggacccaggtcaccgtcgcctcggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa；

SEQ ID NO.26：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

实施例2 亲和力检测实验

2.1阳性对照抗体Ixekizumab的制备

（a）基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区（重链可变区序列SEQ ID NO.23，轻链可变区序列SEQ ID NO.24），将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4（IgG4恒定区氨基酸序列SEQ ID NO.25）载体中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc（hIgKc恒定区的氨基酸序列SEQ ID NO. 27）载体中；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

（b）从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重链与轻链表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入50μg 重链和轻链表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入300μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

（c）将上述DNA/ LVTransm复合物加入到100mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀，将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130RPM继续培养。

（d）连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

（e）SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，纯度>95%。

通过阳性对照抗体检测重组抗原结合能力，结果显示阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好，可以用于后续免疫。

Protein A纯化抗体的步骤如下所示：

1）将含有目标抗体的样品加入EP管中，轻轻倒置试管混合。

2）将EP管在室温下混合或在旋转器上孵育，（1-4小时或过夜），可添加 100 mMPMSF以防止蛋白质降解。

3）使用磁分离架收集磁珠并弃去上清液。如有必要，保留上清液进行分析。

4）向EP管中加入1 mL结合/洗涤缓冲液并充分混匀，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液，重复洗涤步骤三遍。

5）向EP管中加入500 μL洗脱缓冲液，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下（约25℃）置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转 EP 管孵育5分钟。

6）使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的EP管中。

7）重复步骤1）和2）两次。

8）向每500 μL洗脱液中加入1/10的中和缓冲液以中和 pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。如果需要，可以通过透析或脱盐进行缓冲液交换。

9）结合/洗涤缓冲液：1×PBS，pH 7.0。

洗脱缓冲液：（1） 0.1 M 甘氨酸，pH 2-3 ；（2） 0.1M NaAc-HAc，pH 3.6。

中和缓冲液：1 M Tris，pH 8.5。

磁珠再生缓冲液：0.1 M NaOH。

SEQ ID NO.23：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO.24：

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIK；

SEQ ID NO.25：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

SEQ ID NO. 27：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

2.2Human IL-17A重组蛋白与对照抗体ELISA结合活性检测

（1）使用无菌CBS稀释IL-17A重组蛋白至终浓度为2μg/mL。取一块新的96孔板，加入100μL /孔4℃包被过夜。

（2）去掉抗原包被液，使用PBST（含0.5%的吐温）洗涤3次。

（3）加入200μL /孔的3%MPBS 37℃封闭2小时；

（4）去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；

（5）阳性对照抗体Ixekizumab使用PBS稀释至10μg/ml，5倍稀释7个点，按100μL /孔加入酶标板中，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

（6）去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；

（7）加入二抗 HRP-ProteinA（Boster，BA1080）1:10000稀释，按100μL /孔加入酶标板中，室温孵育1小时；

（8）去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；

（9）加入100μL /孔TMB显色液；

（10）室温避光孵育15分钟；

（11）加入50μL/孔终止液（2M HCL）；

（12）使用酶标仪读取孔内的OD450值。

结果如表1所示：阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好，可以用于免疫。

表1. Human IL17A与阳性抗体结合活性检测

2.3亲和力检测方法及结果

2.3.1 HRP-Streptavdin进行ELISA检测

将纯化后的单域抗体2ug/mL包被96孔酶标板，加入Biotin-IL-17A-His，起始浓度为10ug/mL，5倍梯度稀释7个点，采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测。检测结果为双价单域抗体（C3-G4）的EC50= 1.231ug/mL，阳性抗体（Ixekizumab）的EC50 =10.06ug/mL，说明了双价单域抗体（C3-G4）可与目标蛋白结合，且结合能力均高于阳性抗体（Ixekizumab）见图1。

2.3.2 ForteBio OCTET R2 仪器测定抗体亲和力

（1）使用ForteBio OCTET R2 仪器测定抗体亲和力，HIS1K传感器（Octet ® ProABiosensors）固化IL7A-His，固化浓度为5ug/mL。

（2）缓冲液为PBST（PBS+0.02% tween20），候选抗体样品稀释至 50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，0nM。

（3）亲和力检测：平衡 60 s，结合 180s，解离 180s，检测温度25℃。

（4）使用ForteBio OCTET R2 系统进行动力学表征分析。

由结果可知，双价单域抗体（C3-G4）的KD = 1.391×10^-9M，阳性抗体（Ixekizumab）的KD=3.910×10^-10M（图2）。

实施例3 阻断功能实验

在96孔板中加入梯度稀释的检测抗体（阳性抗体：Ixekizumab；待检测抗体：双价单域抗体（C3-G4）（由实施例1中的1.2制备），按照10倍梯度稀释抗体，连续稀释10个梯度，终浓度依次为100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，0.001 μg/mL，0.0001 μg/mL，0.00001μg/mL，0.000001 μg/mL，0.0000001 μg/mL，0μg/mL，将稀释好的梯度浓度抗体取50μL加入96孔板中，每个梯度2个复孔。然后再向对应孔中，每孔加入50μL 0.4μg/mL的IL-17A蛋白（终浓度为0.1μg/mL）。混匀后，放置37℃培养箱中，孵育1小时。吸取培养至对数生长期的293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）细胞于96孔板中，每孔接种 2×10⁴个细胞。共培养18h后，每孔加入20μL Bright-GloTM检测试剂，使用Tecan M1000pro酶标仪检测孔内的荧光素酶活性数值。

结果可知，阳性对照Ixekizumab的IC50为2.235nM，双价单域抗体（C3-G4）的IC50为1.192nM，两者均可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（图3）。

实施例4稳定性实验

通过微量差示扫描荧光技术(nanoDSF) 技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50%处于去折叠状态时的温度（T_m）以及开始出现聚集时的温度（T_agg）；热变性T_m、T_onset值和T_agg越高说明抗体蛋白越稳定。

4.1实验步骤

取100 μL前期项目制备的候选抗体以及Ixekizumab（样本浓度大于200 μg/mL），4℃，12000×g，离心10min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。

4.2结果

双价单域抗体（C3-G4）和阳性对照Ixekizumab的稳定性结果见图4-图5，结果显示，双价单域抗体（C3-G4）的T_m1为62.20℃，T_m3为81.58℃，T_onset为47.54℃，T_agg为81.73℃；阳性对照Ixekizumab的T_m1为56.10℃，T_m2为79.84℃，T_onset为47.50℃，T_agg为61.86℃。结果表明双价单域抗体（C3-G4）稳定性明显强于阳性对照Ixekizumab。

实施例5 基因修饰间充质干细胞的制备方法

5.1慢病毒穿梭质粒构建

构建C3-G4:Fc融合蛋白的慢病毒穿梭质粒，将1-C3和2-G4两个候选抗体VHH序列（1-C3和2-G4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15和16所示）通过(GGGGS)₃链接后与IgG4 Fc（IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 29所示）串联的形式构建到慢病毒穿梭质粒上，形成VHH-(GGGGS)₃-VHH-IgG4 Fc序列，处于EF-1alpha启动子下游，从而得到C3-G4:Fc慢病毒穿梭质粒。

SEQ ID NO.28：

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

SEQ ID NO.29：

GCCCCCGAGTTTCTGGGAGGACCTAGCGTCTTTCTGTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACACTGATGATCTCTAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTCGTGGTGGACGTGAGCCAAGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAACCTAGAGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGGCCTCCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAGCCTAGAGAGCCCCAAGTGTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAAAACAACTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAAAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCCCTCTCTCTGAGCCTCGGCAAGTGA。

5.2慢病毒制备

（1）病毒包装前24 h，准备摇瓶，将293F细胞密度调整到1.0×10⁶/mL，每瓶60 mL，将摇瓶置于37℃、5% CO₂、120 rpm摇床上培养，备用。

（2）制备转染试剂/DNA复合物：取7.5 mL 293F培养基至15 mL离心管，加入40µg的C3-G4:Fc慢病毒穿梭质粒，80µg辅助质粒（购自addGene，货号为：12253、12259），移液枪上下吹打充分混匀后，加入360µL转染试剂，立即用1mL移液器上下吹打混匀，室温下静置10min（不超过15 min）

（3）将转染试剂/DNA复合物逐滴加入到前一天准备好的细胞中，边加边晃动摇瓶，充分混匀后将摇瓶置于37℃、5% CO₂、120 rpm摇床上培养。72h后收获上清，8000g低温（2-8℃）离心细胞培养上清液，分别经2.5μm和0.45μm孔径过滤器过滤，得到的浓缩病毒悬液经核酸酶处理掉核酸杂质，再分别经离子交换层析和凝胶过滤层析得到纯化的病毒悬液，分装至病毒分装管中，每管100 µL。贴上标签，标签上写好病毒名称，体积，lot等信息。

5.3慢病毒滴度检测

将293T细胞接种24孔板，过夜培养后，分别加入20uL慢病毒原液、稀释10倍慢病毒液、稀释100倍慢病毒液，继续培养24h，24h后更换新鲜培养基，连续培养9d后，收获细胞，试剂盒（购自Thermo，货号为K0721）提取基因组DNA，用dd H₂O调整质粒模板拷贝数，标曲范围为1×10⁹-1×10³，引物为LTR和WPRE（由苏州金唯智生物科技有限公司合成），按照PCR预混液将2×PCR Mix（购自Applied Biosystems，货号为A25742）、引物、DNA、PCR水（购自Thermo，货号R0582）混匀后加入相应的PCR反应孔中，进行PCR反应。并根据以下公式计算病毒的滴度。

慢病毒滴度=细胞数×拷贝数/病毒体积（mL）×稀释倍数。

慢病毒滴度检测结果见图6，无论慢病毒是原倍还是稀释10倍、100倍，慢病毒滴度在2.2E+7-2.4E+7之间，三组之间无显著差异，因此慢病毒滴度为2.3E+7TU/mL。

5.4基因修饰间充质干细胞制备及感染效率检测

将制备的含有C3-G4:Fc慢病毒，按照MOI=10加入已培养且融合度达70-80%的间充质干细胞（使用酶解法从新生儿脐带中分离，经传代扩增纯化得到P2代间充质干细胞），经37℃、CO₂培养，待细胞密度达100%后，传代，成功得到C3-G4:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞，即感染IL-17Nb的间充质干细胞（简称：IL17Nb-MSC或 C3-G4-MSC，以下实施例统一为：C3-G4-MSC）。

采用MOI试剂盒（厂家：System Biosciences货号：LV961A-1）进行检测，该试剂盒通过检测转导的脐带间充质干细胞中内源性保守取结构（UCR1）和慢病毒载体中特异性WPRE元件的比例以及试剂盒中自带的标准曲线进行比较，进而可以确定慢病毒颗粒的转导复数（MOI）。

将获得的C3-G4-MSC及hUC-MSC按照50000 cell/孔接种24孔板，培养液为DMEM/F12（含10%胎牛血清），贴壁培养24h后，根据说明书操作，提取细胞样本DNA，经PCR得到各样本的CT值，依据标准曲线线性方程计算，得出各样本的MOI值，结果如图7所示，hUC-MSC的值为0，而C3-G4-MSC的MOI值为9.90±0.68，与理论MOI值接近，说明C3-G4:Fc慢病毒成功感染了间充质干细胞。

实施例6流式细胞法检测基因修饰干细胞

将实施例5获得的细胞按1×10⁴/cm²培养至T25细胞培养瓶，待细胞密度达80-90%，加入转运抑制剂（购自BD，货号为555029），经过固定、洗涤、染色FITC-Protein A（购自BOSTER，货号为BA1120）后，上机，检测间充质干细胞FITC通道信号（结果见图8），发现C3-G4-MSC在FITC通道信号阳性率超过50%，而未感染病毒的正常间充质干细胞（hUC-MSC）在FITC通道没有信号，表明C3-G4-MSC感染率达到50%以上。

实施例7 ELISA法检测基因修饰间充质干细胞IgG4、IL-17Nb的表达

将实施例5获得的细胞，按照C3-G4-MSC和hUC-MSC按照1×10⁴个/cm²培养至T25细胞培养瓶，培养液为DMEM/F12（含10%胎牛血清），贴壁培养72小时后收获细胞上清，分装冻存备用。

7.1ELISA法检测基因修饰间充质干细胞IgG4的表达

采用人 IgG4 ELISA Kit（厂家：Thermo，货号：BMS2095）用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白IgG4含量。该试剂盒采用人IgG4固相夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）检测匹配抗体对之间结合的靶标量。IgG4特异性抗体已预先包被在酶标板中，然后将细胞上清液样品、标准品或对照加入这些孔中并与固定（捕获）抗体结合，通过添加二抗形成夹心结构，添加底物溶液与酶-抗体-靶标复合物反应以产生可测量的信号。该信号的强度与原始样本中存在的目标浓度成正比。

将上述细胞上清（稀释25倍）加入IgG4 ELISA试剂盒，检测融合蛋白中IgG4蛋白含量，结果发现，C3-G4-MSC高表达IgG4，表达量高达6843.33± 845.33ng/mL，而正常hUC-MSC不表达IgG4（结果见图9）。

7.2IL-17Nb抗体含量检测

采用IL-17A蛋白结合实验检测IL-17A纳米抗体表达情况，将终浓度为2μg/mL的IL-17A蛋白（由实施例1制备）包被酶标板4℃过夜，BSA封闭后，检测上述的细胞上清。标准品为C3-G4融合蛋白（由实施例1制备），标准曲线浓度范围0-250ng/mL，标准品加入相应的孔中，样品孔加入上述的细胞上清（稀释20倍）孵育1h，然后用HRP标记的Protein A抗体（购自博士德，货号BA1080）作为酶标抗体孵育1h，最后加入TMB避光显色20min，终止后酶标仪检测各孔OD450nm值。实验结果如图10显示，通过IL-17A 结合实验，可以确定C3-G4-MSC高表达IL-17Nb，浓度为2212.33±214.65ng/mL，说明C3-G4-MSC表达的IL-17Nb可以与IL-17A结合，而正常的间充质干细胞（hUC-MSC）则不表达IL-17Nb。

实施例8 ELISA法检测基因修饰间充质干细胞阻断IL-17A与IL-17RA结合的能力

采用ACRO Biosystems公司IL-17A[Biotinylated]:IL-17RA InhibitorScreening ELISA Kit（货号EP-139）试剂盒检测C3-G4-MSC阻断IL-17A与IL-17RA结合的能力。该试剂盒包被IL-17RA，以抗IL-17A的中和抗体为标准品，阻断IL-17RA与生物素化的IL-17A结合，通过检测OD450nm值判断阻断能力的强弱，阻断IL-17A/IL17RA结合能力越强，OD450nm值越低，阻断能力与OD450nm值成反比关系。将实施例7所述的细胞上清，通过IL-17A/IL17RA阻断试剂盒检测上清中IL-17Nb阻断IL-17A/IL17RA结合的能力。

采用以下公式对IL-17A/IL17RA结合抑制率计算：

结合抑制率（%）=[OD450（Positive孔）-OD450（样品孔）]/OD450（Positive孔）×100%

将实施例7所述的细胞上清根据说明书进行4倍稀释后，采用上述ACRO试剂盒检测，结果如图11显示，正常的间充质干细胞（hUC-MSC）无法阻断IL-17A与IL17RA的结合，而C3-G4-MSC细胞分泌的IL-17Nb可以阻断IL-17A与IL17RA的结合，稀释4倍后抑制率高达51%。

实施例9干细胞稳定性研究

根据实施例7中的7.2获得的结果（ELISA法检测IL17Nb的表达），将实施例5（C3-G4基因修饰干细胞制备）中获得的C3-G4-MSC及hUC-MSC细胞以1×10⁴/cm²接种24孔板，分别接种8孔和16孔，过夜培养后，随机选择8孔hUC-MSC更换含终浓度为1000ng/mL的C3-G4纳米抗体（C3-G4纳米抗体即双价单域抗体（C3-G4）由实施例1制备）的完全培养基，继续培养，分别在培养24h、48h、72h和96h收获上清，按照实施例7中的7.2（ELISA法检测IL17Nb的表达）的方法检测上清中IL17Nb的含量。结果如图12所示，随着时间的延长，从24h到96h，hUC-MSC+C3-G4组检测的IL17Nb含量从993±43ng/mL降到了709±39ng/mL，浓度逐渐降低，而C3-G4-MSC可以稳定的表达IL17Nb，随着培养时间的延长，IL17Nb的浓度逐渐增多，由24h的715±37ng/mL到96h的3193±117ng/mL，其中24h和48h，hUC-MSC+C3-G4组与C3-G4-MSC组之间有显著差异（P＜0.01），72h和96h，hUC-MSC+C3-G4与C3-G4-MSC两组之间有极显著差异（P＜0.001）。由结果可以得出，C3-G4-MSC可以稳定、持续的表达分泌IL-17Nb，因此，C3-G4-MSC表达IL17Nb的稳定性优于重组C3-G4蛋白。

实施例10银屑病的动物模型构建方法及构建结果

采用B-hIL17A转基因小鼠通过咪喹莫特（IMQ）涂抹法构建银屑病（Ps）模型构建。所有小鼠背部剃毛后，每天背部涂抹50mg咪喹莫特软膏（明欣利迪，四川明欣药业有限公司），第一次涂抹当天记为D0，持续7天（D6）进行造模；Ps模型组随机分为四组：hUC-MSC治疗组（2x10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab治疗组（1mg/Kg）、C3-G4-MSC治疗组（2x10⁶/只）和模型对照组。药物治疗组于D1和D4皮下给药治疗。实验过程中，每天测量动物体重，观察动物的存活情况和健康状况，并根据皮肤的角化程度、炎性细胞浸润程度对皮肤炎症及相关指标进行临床评分。D7安乐死动物，进行相关检测：收集小鼠造模部分皮肤，利用游标卡尺测量每组动物皮肤厚度。

皮肤评分标准：对动物皮肤（耳部及前后爪）进行评分，根据红斑、鳞屑、厚度进行综合评分，每项指标评分均分为5个等级，为0-5分，其中0分代表无相关症状；1分代表症状轻微；2分表示症状一般；3分表示症状显著；4分表示非常显著或严重，并计算3项指标总分作为最终评分。

动物体重如图13所示，咪喹莫特造模后模型组体重与正常对照组相比显著下降，hUC-MSC治疗和C3-G4-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显；试验终点C3-G4-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组；皮肤照片如图14所示，根据皮肤角质程度、皮屑皮损病变进行的皮肤临床评分如图15所示，IMQ能够引起小鼠皮肤损伤，皮疹和脱屑程度增加，皮肤表皮增厚，组织病理学上可见以角化不全和炎症性白细胞浸润为主的真皮；模型组皮肤临床评分显著升高，而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和C3-G4-MSC后，小鼠皮肤临床评分显著降低，其中C3-G4-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。实验终点进行皮肤厚度检测，如图16所示，发现IMQ可显著增加模型小鼠皮肤厚度，而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和C3-G4-MSC后，小鼠皮肤厚度显著降低，其中C3-G4-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

本发明的C3-G4-MSC能有效用于类风湿关节炎的治疗，经C3-G4-MSC治疗可恢复小鼠体重，降低类风湿关节炎小鼠的足爪厚度，显著降低类风湿关节炎小鼠组织炎细胞浸润、关节滑膜炎和/或血管翳形成、关节软骨破坏，关节腔消失，骨组织融合等症状。以上治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

本发明的C3-G4-MSC还可用于银屑病关节炎的治疗，C3-G4-MSC的治疗科恢复类风湿关节炎小鼠的体重，显著降低皮肤厚度、角化程度、炎性细胞浸润程度，显著降低血清中的IL-6、IL-23和TNF-α等细胞因子。以上治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

Claims (20)

1.一种经修饰的干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一抗体，所述的第一抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体；

（2）第二抗体，所述的第二抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体；

所述的第一单域抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-3；

所述的第二单域抗体包含HCDR4、HCDR5和HCDR6；所述的HCDR4、HCDR5和HCDR6的氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6。

2.一种干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的结构包含：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的结构包含：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8；

所述的HCDR1-6选自SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列；

所述的FR1-8选自SEQ ID NO.7-14所示的氨基酸序列。

3.一种干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白；

所述的融合蛋白包含结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4-linker-FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8的氨基酸序列；

所述的HCDR1-6选自SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列；

所述的FR1-8选自SEQ ID NO.7-14所示的氨基酸序列；

所述的linker的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5或6。

4.一种经修饰的干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌下述（1）和（2）：

（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的序列包含如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；

（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的序列包含如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。

5.一种干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白；

所述的的融合蛋白的序列包含如SEQ ID NO.17。

6.一种干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含下述（1）和（2）：

（1）第一核酸分子；

（2）第二核酸分子；

所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第二核酸分子编码包含SEQ ID NO: 4-6所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的干细胞，其特征在于，所述的第一核酸分子编码包含SEQ IDNO: 7-10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第二核酸分子编码包含SEQ ID NO: 11-14所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

8.一种干细胞，其特征在于，所述的第一核酸分子和第二核酸分子之间由编码包含(GGGGS)n所示的氨基酸序列的核苷酸序列连接，其中n为1、2、3、4、5或6。

9.一种干细胞，其特征在于，所述的干细胞包含下述（1）和（2）：

（1）第一核酸分子；

（2）第二核酸分子；

所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述的第一核酸分子编码包含SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

10.一种干细胞，特征在于，所述的干细胞包含编码SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞还包含、表达和/或分泌能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

12.根据权利要求11所述的干细胞，其特征在于，所述的生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞。

14.根据权利要求12所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

15.根据权利要求10-14任一项所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞分泌抗白细胞介素抗体。

16.根据权利要求15所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞分泌抗白细胞介素17抗体。

17.根据权利要求16所述的干细胞，其特征在于，所述的干细胞分泌抗IL-17A抗体。

18.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-17任一项所述的干细胞。

19.一种权利要求1-17任一所述的干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将所述的核酸分子通过病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染导入干细胞。

20.一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：利要求1-17任一项所述的干细胞与待测样品相接触；

S2：检测抗原-抗体复合物；

S3：判读结果。