CN111718914B

CN111718914B - 蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN111718914B
Application number: CN201910160207.8A
Authority: CN
Inventors: 秦峰; 张小敏; 刘升学
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN111718914A

Abstract

本发明公开了一种蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用。本发明提供了ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在调控植物抗旱性中的应用；ZmTIP1蛋白为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明ZmTIP1转入拟南芥或玉米，得到转基因植物，转基因植物的抗旱性高于未转基因的受体植物，表明ZmTIP1及其编码的蛋白有抗旱的功能，在提高植物抗旱性的育种和研究中具有重要意义。

Description

蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

在植物整个生育期内，影响其正常生长和发育的因素很多，其中干旱是影响和限制植物生长发育的主要逆境因子，严重时会导致植株大面积死亡甚至绝收。在全球耕地面积逐渐减少和干旱灾害发生日益频繁的今天，通过提高作物的抗旱性能来提高或者保持粮食产量具有重大意义。培育抗旱作物新品种是农业科学技术领域研究的主要目标之一。

传统的育种技术具有周期长、盲目性高和工作量大等缺点，而且通过传统育种来提高粮食产量已经发展到一定瓶颈。近年来，随着植物分子生物学和遗传学等学科的发展以及植物抗逆分子机制的深入研究，通过基因工程的方法向植物中导入抗逆相关基因来提高作物的抗逆性已经变得日趋成熟。

玉米(Zea mays L.)作为我国广泛种植的重要的粮食作物，克隆玉米抗旱基因、改良玉米抗旱性并提高玉米产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用。

第一方面，本发明要求保护ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在调控植物抗旱性中的应用。

所述相关生物材料可为能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述ZmTIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

第二方面，本发明要求保护ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在调控植物根毛发育中的应用。

所述相关生物材料为能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在前文第一方面和第二方面中，所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物抗旱性提高；所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物抗旱性降低。所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物根毛长度增长；所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物根毛长度减短。

第三方面，本发明要求保护ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在制备具有棕榈酰基转移酶活性的产品中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法，为方法A或方法B或方法C或方法D：

方法A：一种培育抗旱性提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法B：一种培育抗旱性降低的植物品种的方法，可包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法C：一种培育根毛长度增长的植物品种的方法，可包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法D：一种培育根毛长度减短的植物品种的方法，可包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法，为方法E或方法F或方法G或方法H：

方法E：一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmTIP1蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法F：一种培育抗旱性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中ZmTIP1蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性降低。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法G：一种培育根毛长度增长的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmTIP1蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛长度增长。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法H：一种培育根毛长度减短的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中ZmTIP1蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛长度减短。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第五方面，本发明要求保护一种对棕榈酰基转移酶缺失突变体进行表型回复的方法。

本发明所提供的对棕榈酰基转移酶缺失突变体进行表型回复的方法，可包括向所述棕榈酰基转移酶缺失突变体中导入能够表达ZmTIP1蛋白的核酸分子的步骤。所述ZmTIP1蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

其中，所述棕榈酰基转移酶缺失突变体可为棕榈酰基转移酶缺失的酵母突变体或棕榈酰基转移酶缺失的植物突变体(如拟南芥突变体)。在本发明的一个实施例中，所述棕榈酰基转移酶缺失的酵母突变体具体为酵母棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体菌株akr1；所述棕榈酰基转移酶缺失的植物突变体具体为拟南芥棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体tip1-3。

在所述各方法中，向受体植物中导入能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子可通过向所述受体植物中导入含有所述ZmTIP1蛋白的编码基因的重组表达载体实现。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在本发明中，当所述受体为植物时，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子或Zmubi1启动子。更加具体的，所述重组载体为将所述ZmTIP1蛋白的编码基因插入到pGKX载体的多克隆位点(如Sma I和Sac I，位于35S启动子下游)后得到的重组质粒(命名为pGZ)。或者所述重组载体为将所述ZmTIP1蛋白的编码基因插入到pSB11载体的多克隆位点(如Sma I，位于Zmubi1启动子下游)与pSB1载体重组后得到的重组质粒(命名为pSBIII-ZmTIP1^MO17)。当所述受体为酵母时，所述重组字体具体为将所述ZmTIP1蛋白的编码基因插入到pYES2/NTA载体的多克隆位点(如Hind III和BamH I)后得到的重组质粒。

在上述方法中，将所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

在上述各方面中，所述“能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子”为所述ZmTIP1蛋白的编码基因。

进一步地，所述ZmTIP1蛋白的编码基因可为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述ZmTIP1蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述ZmTIP1蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在本发明中，所述抗旱性可体现在如下任一：

1)在干旱胁迫下所述转基因植物的根毛长度长于所述受体植物；

2)在干旱胁迫下所述转基因植物的苗期存活率高于所述受体植物；

3)在干旱胁迫下所述转基因植物的产量高于所述受体植物。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物；所述双子叶植物可为十字花科植物；

更进一步地，所述禾本科植物可为玉米；所述十字花科植物可为拟南芥。

实验证明，将来源于玉米(Zea mays L.)的基因ZmTIP1转入拟南芥或玉米，得到转基因植物，转基因植物的抗旱性高于未转基因的受体植物，表明ZmTIP1及其编码的蛋白有抗旱的功能，在提高植物抗旱性的育种和研究中具有重要意义。

附图说明

图1为不同单体型编码的ZmTIP1蛋白的棕榈酰基转移酶活性。A为ZmTIP1能互补酵母棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体表型；B为两种基因型编码的ZmTIP1蛋白能互补拟南芥tip1-3根毛发育缺陷的表型；C为35S:ZmTIP1/tip1-3转基因拟南芥根毛长度统计。B和C中的11、13、17以及4、9、24表示不同的转化事件或转基因株系。

图2为T₃代转ZmTIP1拟南芥植株的根毛发育和干旱表型。A为不同浓度PEG8000模拟干旱条件下，35S:ZmTIP1转基因拟南芥的根毛长度观察；B为根毛长度的测量区域示意图；C为荧光定量PCR检测35S:ZmTIP1转基因拟南芥ZmTIP1基因的相对表达量；D为不同浓度PEG8000模拟干旱条件下，35S:ZmTIP1转基因拟南芥的根毛长度统计；E为35S:ZmTIP1转基因拟南芥干旱表型；F为35S:ZmTIP1转基因拟南芥复水后存活率统计。

图3为T₃代转ZmTIP1玉米和ZmTIP1突变体的根毛发育表型。A为Ubi：ZmTIP1转基因玉米长度观察；B为荧光定量PCR检测Ubi:ZmTIP1转基因玉米ZmTIP1基因的相对表达量；C为Ubi:ZmTIP1转基因玉米根毛长度统计；D为ZmTIP1突变体的基因型鉴定；E为RT-PCR鉴定ZmTIP1突变体中ZmTIP1基因的表达量；F为ZmTIP1突变体的根毛长度观察；G为ZmTIP1突变体的根毛长度统计。

图4为T₃代转ZmTIP1玉米和ZmTIP1突变体经干旱处理并复水后的存活率统计结果。A为Ubi:ZmTIP1转基因玉米干旱表型分析；B为ZmTIP1突变体的干旱表型分析；C为Ubi:ZmTIP1转基因玉米复水后存活率统计；D为ZmTIP1突变体复水后存活率统计。

图5为T₃代转ZmTIP1玉米和ZmTIP1突变体的田间干旱表型统计结果。A为田间不同干旱处理条件下，Ubi:ZmTIP1转基因玉米株高统计；B为田间不同干旱处理条件下，Ubi:ZmTIP1转基因玉米散粉时间统计；C为田间不同干旱处理条件下，Ubi:ZmTIP1转基因玉米散粉和吐丝间隔时间统计；D为田间不同干旱处理条件下，Ubi:ZmTIP1转基因玉米单株产量统计；E为田间正常浇水和干旱处理条件下，ZmTIP1突变体株高统计；F为田间正常浇水和干旱处理条件下，ZmTIP1突变体散粉时间统计；G为散粉和吐丝间隔时间统计；H为田间正常浇水和干旱处理条件下，ZmTIP1突变体单株产量统计。

图6为ZmTIP1蛋白的亚细胞定位观察。A为35S:ZmTIP1-GFP转基因拟南芥亚细胞定位观察；B为ZmTIP1蛋白定位于高尔基体、反式高尔基网络和液泡前体。

图7为ZmTIP1蛋白调节ZmCPK28蛋白亚细胞定位结果。A为ZmCPK28蛋白及其突变体ZmCPK28-C3A-GFP、ZmCPK28-C4A-GFP、ZmCPK28-C3&4A-GFP在玉米原生质体中的亚细胞定位观察。B为Western Blot检测ZmCPK28-GFP、ZmCPK28-C3&4A-GFP蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位(T表示总蛋白；S表示胞质蛋白；P表示膜蛋白)；C为在玉米原生质体中，用ZmTIP1-GFP免疫共沉淀ZmCPK28-Myc。

各图中，*表示与WT结果相比在P＜0.05差异显著；**表示与WT结果相比在P＜0.01差异极显著。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pGKX和pGK-CsGFP：记载在文献“Qin F,Sakuma Y,Tran LS,Maruyama K,Kidokoro S,et al.(2008)Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function asRING E3ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive geneexpression.Plant Cell 20:1693-1707”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株：记载在文献“Scholthof HB,Alvarado VY,Vega-Arreguin JC,Ciomperlik J,Odokonyero D,et al.(2011)Identification of anARGONAUTE for antiviral RNA silencing in Nicotiana benthamiana.Plant Physiol156:1548-1555”中。公众可从中国科学院植物研究所获得；

载体pBI121：记载在文献“Qin F,Kakimoto M,Sakuma Y,Maruyama K,Osakabe Y,et al.(2007)Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response todrought and heat stresses in Zea mays L.Plant J 50:54-69”中。公众可从中国科学院植物研究所获得；

根癌农杆菌GV3101菌株：记载在文献“Jing Y,Zhang D,Wang X,Tang W,Wang W,et al.(2013)Arabidopsis chromatin remodeling factor PICKLE interacts withtranscription factor HY5to regulate hypocotyl cell elongation.Plant Cell 25:242-256”中。公众可从中国科学院植物研究所获得；

哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana(Columbia ecotype))：记载在文献“Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K(1994)A novel cis-acting element in anArabidopsis gene is involved in responsiveness to drought,low-temperature,orhigh-salt stress.Plant Cell 6:251-264”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

根癌农杆菌LBA4404菌株：记载在文献“Ishida,Y.,Hiei,Y.&Komari,T(2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize.Nat.Protoc.2：1614-1621”中。公众可从中国科学院植物研究所获得；

玉米自交系A188：记载在文献“Ishida,Y.,Hiei,Y.&Komari,T(2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize.Nature Protocol.2：1614-1621”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

载体PSB 1和PSB 11：记载在文献“Komari et al(1996)Vectors carrying twoseparate T-DNAs for cotransformation of higher plants mediated byAgrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free fromselection markers.The Plant Journal.10(1),165-174”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

玉米自交系B73：记载在文献“Schnable,P.S.et al(2009)The B73maize genome:complexity,diversity,and dynamics.Science 326：1112-1115”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

玉米自交系MO17：记载在文献“Song et al.,(2017)Transcriptomics andAlternative Splicing Analyses Reveal Large Differences between Maize LinesB73and Mo17in Response to Aphid Rhopalosiphum padi Infestation.Front PlantSci.10；8-1738”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

拟南芥棕榈酰基转移酶基因缺陷变体tip1-3和酵母棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体菌株akr1：记载在文献“Hemsley et al.,(2005)The TIP GROWTH DEFECTIVE1S-AcylTransferase Regulates Plant Cell Growth in Arabidopsis.The Plant Cell 17；2554–2563”中。公众可从中国科学院植物研究所获得。

酵母表达载体pYES2/NTA：Invitrogen公司产品，产品目录号V8252--20。

酵母AH109：Clontech公司产品，货号Cat.No.630489。

玉米ZmTIP1基因的两个突变体(MT1和MT2)：由Maize Genetics CooperationStock Center免费提供，MT1在网站上的编号为UFMu-06452，MT2在网站上的编号为UFMu-03169。

玉米自交系W22记载在文献“Springer et al.,(2018)The maize W22genomeprovides a foundation for functional genomics and transposon biology.Naturegenetics 50(9):1282-1288”中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

玉米自交系CIMBL55记载在文献“Wang et al.,(2016)Genetic variation inZmVPP1contributes to drought tolerance in maize seedlings.Nature genetics 48(10):1233-41”中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、蛋白ZmTIP1及其编码基因的获得

1、蛋白ZmTIP1及其编码基因克隆

取耐旱型玉米自交系CIMBL55和敏感型玉米自交系MO17种子，28℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到营养土或营养液中培养1周，取全株幼苗于液氮中速冻、研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，引物F1和R1为引物进行PCR扩增。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到1920bp的PCR扩增产物。

经过测序，源自敏感型玉米自交系MO17的PCR产物具有SEQ ID No.3的第164-2083位所示核苷酸，源自耐旱型玉米自交系CIMBL55的PCR产物具有SEQ ID No.4的第164-2083位所示核苷酸。将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的基因命名为ZmTIP1，该基因编码的蛋白命名为ZmTIP1。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为不同基因型，SEQ ID No.3编码SEQ IDNo.1所示蛋白，SEQ ID No.4编码SEQ ID No.2所示蛋白。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中，第1-163位为5’非编码区，第164-2083位为编码序列，第2084-2800位为3’非编码区。

上述的引物序列如下：

F1：5’-ATGGCGTCGGAGATCGAG-3’；

R1：5’-TCACAATGGGATAAGAGACC-3’。

2、重组载体pGZ的构建

将ZmTIP1^MO17基因的编码序列(SEQ ID No.3的第164-2083位)和ZmTIP1^CIMBL55基因的编码序列(SEQ ID No.4的第164-2083位)的两端分别添加酶切位点SacI和SmaI的识别序列，然后进行SacI和SmaI双酶切，酶切产物与经同样双酶切的pGKX载体骨架大片段相连，得到对应两种ZmTIP1基因型的两个重组载体pGZ。重组载体pGZ中启动ZmTIP1基因的启动子为35S启动子。

3、重组根癌农杆菌的获得

将重组载体pGZ转化根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，获得含有重组载体pGZ的重组农杆菌X(提取质粒，测序验证该质粒为pGZ，则该重组农杆菌为阳性克隆)。同时设置向根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株中转入pGKX空载体的对照。

4、转ZmTIP1拟南芥的获得

将重组农杆菌X用花芽浸泡法转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥和棕榈酰基转移酶基因缺陷变体tip1-3，收获T1代种子；将T1代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选并将抗性苗种植收种，获得T2代种子；将T2代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选，挑选卡那霉素抗性分离比符合3:1的卡那霉素抗性苗种植，为T2代转ZmTIP1拟南芥。

提取T2代转ZmTIP1拟南芥植株RNA，反转录得到cDNA为模板，以拟南芥中的基因Actin2为内参，引物为FC1和RC1。用特异引物F2和R2对ZmTIP1基因的表达量进行检测，上述引物的序列如下：

F2：5’-AATGGGAATGATACAGATGACAAGT-3’；

R2：5’-TTGGCTATGAGGTTTTGAGTTTGCT-3’；

FC1：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

RC1：5’-AGACACACCATCACCAGAATCC-3’。

选取ZmTIP1基因表达量较高的阳性T2代转ZmTIP1拟南芥收种，获得T3代转种子，将T3代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选得到不再产生卡那霉素抗性分离的纯合T3代ZmTIP1转基因株系。

T1代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。

实验同时设置用转入pGKX空载体的根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株替代重组农杆菌X的空载对照。

上述花芽浸泡法的具体步骤如下：

取重组农杆菌X接种于含有50mg/L卡那霉素、和5mg/L四环素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600为0.8，25℃、4000转/分钟离心1分钟，除去上清液，用重悬溶液(溶剂为水，溶质蔗糖和silwet77的浓度分别为50g/L、0.02％(体积百分含量)重悬菌体，获得侵染液。用移液器将侵染液点在花蕾及生长点，用薄膜覆盖，保湿2天后，置于正常条件下生长，收获种子。

5、ZmTIP1能互补酵母棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体表型

以耐旱型玉米自交系CIMBL55和敏感型玉米自交系MO17的cDNA为模板，特异引物F1和R1(序列同上)进行PCR扩增，将目的基因(ZmTIP1^MO17基因的编码序列：SEQ ID No.3的第164-2083位；ZmTIP1^CIMBL55基因的编码序列：SEQ ID No.4的第164-2083位)克隆并通过HindIII和BamHI酶切位点连入酵母表达载体pYES2/NTA中分别转化酵母棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体菌株akr1(含有报告基因URA)，以转化空载体pYES2/NTA为阴性对照，未转化的野生型酵母AH109为阳性对照，通过半乳糖诱导目标基因的表达，用SC-URA液体培养基30℃和37℃过夜摇菌至菌液OD600＝2.2～2.4，取少量菌液在显微镜下观察酵母细胞的形态。

结果如图1中A所示，酵母akr1突变体在30℃和37℃条件下，细胞呈现黏连、伸长的表型，而转化ZmTIP1^MO17和ZmTIP1^CIMBL55的酵母细胞形态正常，与酵母野生型AH109细胞形态相近，表明两种基因型编码的ZmTIP1蛋白均能恢复酵母akr1突变体的表型。

进一步将ZmTIP1^MO17和ZmTIP1^CIMBL55的编码区(CDS)片段构建到拟南芥过表达载体pGKX上，通过农杆菌介导转化拟南芥棕榈酰基转移酶基因缺陷突变体tip1-3，获得T₃代纯合种子，在MS+3％Sucrose固体平板上生长6天观察拟南芥根毛长度。同时设置野生型拟南芥和转入pGKX空载体的拟南芥(空载对照)作为对照。

结果如图1中B和C所示，与拟南芥野生型相比，tip1-3突变体根毛显著变短，而两种基因型35S:ZmTIP1^MO17、35S:ZmTIP1^CIMBL55转基因植株根毛长度均可恢复至野生型水平。转入pGKX空载体的拟南芥(空载对照)根毛长度与拟南芥野生型基本一致，无统计学差异。

以上结果表明：两种基因型编码的ZmTIP1蛋白均具有棕榈酰基转移酶活性，且在根毛发育中发挥重要作用。

实施例2、蛋白ZmTIP1及其编码基因的功能研究

一、过表达ZmTIP1基因提高拟南芥抗旱性

取按照实施例1步骤4获得的T₃代转ZmTIP1^MO17拟南芥株系(TL1和TL14，转化受体是拟南芥哥伦比亚生态型)、转ZmTIP1^CIMBL55拟南芥株系(TL8和TL9，转化受体是拟南芥哥伦比亚生态型)、野生型拟南芥Col和转入pGKX空载体的拟南芥(空载对照)。在1/2MS+0.5％Sucrose固体培养基中依次添加0g/L、100g/L和150g/L的PEG8000，见光6天后用NiKon体式显微镜进行拍照(图2中A)，并用Image J软件进行根毛长度的测定，每个株系至少测定25株的500-600根根毛，图2中B中箭头所示区域为测定根毛长度的主根区域。与野生型相比，在未处理和不同浓度的PEG处理条件下，过表达ZmTIP1^MO17和ZmTIP1^CIMBL55植株的根毛长度显著长于野生型(空载对照拟南芥根毛长度与野生型相比基本一致，无统计学差异)，表明转录水平上提高两种基因型ZmTIP1基因的表达量均能显著增加拟南芥根毛的长度(图2中C和D)。进一步在装有100g营养土的钵中，正常条件下生长25天后，进行干旱处理(即停止浇水)，约停水13天后，Col的莲座叶严重干枯而TL1和TL14和TL8和TL9株系莲座叶严重萎蔫时复水。复水3天后统计各株系植株的存活率(将表现为能正常生长的植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于30株，取平均值进行统计分析。

结果如表1、图2中E和F所示，可以看出，在干旱处理后，两种基因型T₃代转ZmTIP1拟南芥株系的存活率显著高于野生型拟南芥(空载对照拟南芥存活率与野生型相比基本一致，无统计学差异)。

表1转ZmTIP1拟南芥植株经干旱处理后的存活率(％)结果

株系	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					Col	26.25	15.625	21.4	21.09±5.3
TL1	93.75	97.92	92.71	94.79±2.75
					TL14	100	83.93	85.42	89.78±8.88
TL8	100	88.39	93.75	94.04±5.80
					TL9	100	95.54	100	98.51±2.58

注：*表示与CK结果相比在P＜0.05差异显著，**表示与CK结果相比在P＜0.01差异极显著。

二、转ZmTIP1玉米和ZmTIP1突变体的抗旱性评价

1、重组载体pSBIII的构建

将ZmTIP1^MO17基因的编码序列(SEQ ID No.3的第164-2083位)通过Sma I酶切位点连入pSB 11载体(位于Zmubi1启动子下游)，保持载体上其余序列不变，将连入目标片段后的pSB 11载体与pSB 1载体重组后得到重组载体pSBIII-ZmTIP1^MO17。同时构建将没有连入目标片段的pSB 11载体与pSB1载体重组后得到重组载体pSBIII。

2、重组根癌农杆菌的获得

将重组载体pSBIII-ZmTIP1^MO17转化根癌农杆菌LBA4404菌株，获得含有重组载体pSBIII的重组农杆菌Y(提取质粒，测序验证该质粒为pSBIII-ZmTIP1^MO17，则该重组农杆菌为阳性克隆)。

同时设置向根癌农杆菌LBA4404菌株中转入pSBIII空载体的对照。

3、转基因玉米的获得

将重组农杆菌Y用农杆菌介导的玉米遗传稳定转化法转化玉米自交系A188，得到T₀代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)。

提取T₀代转ZmTIP1玉米叶片RNA，反转录得到cDNA，用特异引物F3和R3扩增进行PCR鉴定，得到T0代转ZmTIP1玉米。

上述引物的序列如下：

F3：5’-TATGCCATGACTACGACAG-3’；

R3：5’-CCGATCTAGTAACATAGATGACTACC-3’。

阳性T₀代植株自交后获得T₁代种子；T₁代植株再用同样的方法PCR鉴定后获得阳性植株，自交后获得T₂代种子。以同样的PCR鉴定方法鉴定出阳性单株并自交获得T3代纯合株系，T2代植株分离比符合3:1，且T3代PCR鉴定至少24株为阳性的单株可作为纯合株系。对纯合株系进行繁种获得T3和T4代种子用于后续的干旱表型试验。

提取T₃代转ZmTIP1玉米的RNA，反转录得到cDNA，用特异引物F2和R2对基因ZmTIP1的cDNA进行qPCR定量，以玉米的基因ZmUbi2为内参，引物为FC2和RC2，以A188为对照。

上述引物的序列如下：

F2：5’-AATGGGAATGATACAGATGACAAGT-3’；

R2：5’-TTGGCTATGAGGTTTTGAGTTTGCT-3’。

FC2：5’-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3’；

RC2：5’-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3’。

结果如图3中B所示，T3代转ZmTIP1玉米ML1、ML3、ML5和ML9的ZmTIP1表达量明显高于野生型玉米，表明T3代转ZmTIP1玉米ML1、ML3、ML5和ML9为阳性转基因玉米。

上述T₀代表示转化当代所长成的植株；T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，以此类推。

实验同时设置用转入pSBIII空载体的根癌农杆菌LBA4404菌株替代重组农杆菌Y的空载对照。

上述农杆菌介导的基因转化法的具体步骤如下：

重组农杆菌Y接种于含有50mg/L壮观霉素的YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5。取玉米幼胚放置于装满保存液的2mL离心管，46℃热处理3min，4℃、2000转/分钟离心10分钟。将准备好的重组农杆菌加入处理好的幼胚，22℃黑暗培养3天，转移到新的培养基上28℃黑暗培养7-10天。通过不同浓度草胺膦筛选，最后转移到分化培养基上，分化后转移到生根培养基上培养，一定大小后移入营养土中。

4、玉米ZmTIP1基因突变体的获得

玉米ZmTIP1基因的两个突变体(MT1和MT2)以及野生型W22种子均由MaizeGenetics Cooperation Stock Center免费提供，该突变体分别由Mu转座子插入ZmTIP1基因启动子区和第一个内含子区形成，将突变体种子播种于温室，提取叶片DNA，突变体MT1用特异引物F4和R4进行PCR扩增鉴定，突变体MT2用特异引物F1和R4扩增鉴定，野生型W22用特异引物F6和R6扩增鉴定，将鉴定出的突变体与W22杂交得到F1代种子，再用同样的PCR鉴定方法鉴定出杂合突变体后与W22回交两次后得到BC2F1代种子，经PCR鉴定出杂合单株进行自交获得BC2F2代种子，将BC2F2代种子播种于田间，取叶片提取DNA，经PCR鉴定出纯合的突变体单株进行自交获得BC2F3代纯合突变体种子用于后续的表型试验(图3中D)。提取BC2F3纯合突变体单株的根部RNA，反转录得到cDNA，用特异引物F7和R7对基因ZmTIP1的cDNA进行半定量，以玉米的基因ZmUbi2为内参，引物为FC2和RC2，以野生型W22为对照，结果如图3中E所示，突变体MT1和MT2的ZmTIP1基因几乎不表达。

上述引物的序列如下：

F4：5’-GGTGCTCAACAGACCCTACTC-3’；

R4：5’-AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC-3’。

F6：5’-AAAATCCTAGTTACGCACCG-3’；

R6：5’-CATAAACCAGCTCCGAAA-3’。

F7：5’-CCACGCGCTTCAGTGGGCCGCA-3’；

R7：5’-CACCGTTCTGCTGCGAAACT-3’。

上述引物中，W表示A或T；Y表示T或C。

5、ZmTIP1参与玉米根毛发育的表型分析

选取大小一致饱满的A188、转入pSBIII空载体的玉米A188、ML1、ML3、ML5和ML9玉米种子，10％H₂O₂消毒20min，用蒸馏水冲洗干净后，用饱和硫酸钙浸泡6-8小时，放在湿润的滤纸上在28℃催芽2～3d。挑选出芽一致的种子转移至25cm×25cm的PH5.7的Agar平板上，竖直培养4天后，用Olympus fluorescence microscope SEX16显微镜对玉米根毛进行拍照，并用Image J软件测定根毛长度。试验设重复三次，每次重复每个株系至少观察20株植物的600-700个根毛，取平均值进行统计分析。

结果如图3中A和C所示，萌发7天后，4个转基因株系的根毛长度显著长于野生型(空载对照玉米根毛长度与野生型相比基本一致，无统计学差异)。

用上述方法对野生型W22、突变体MT1和MT2的根毛进行拍照并测定根毛长度，取平均值进行统计分析。

结果如图3中F和G所示，萌发7天后，ZmTIP1突变体的根毛长度显著短于野生型。

6、ZmTIP1参与玉米抗旱的表型分析

将播种7天的T₃代转ZmTIP1玉米株系(ML1、ML3、ML5和ML9)及野生型玉米A188植株和转入pSBIII空载体的玉米A188，转移到装有2Kg营养土的钵中，正常条件下生长10天后，进行干旱处理(即停止浇水)约20天，待转基因植株的叶片萎蔫程度与野生型有显著差异时，进行复水，复水7天后统计各株系植株的存活率(将叶色正常且能正常生长的植株定义为存活植株，将表现为叶片焦枯且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)。实验设3次重复，每次重复各株系的植株数不少于30株，取平均值进行统计分析。

结果如表2、图4中A和C所示，可以看出，干旱处理20天，T₃代转ZmTIP1转基因玉米叶片干枯程度小于野生型玉米，存活率显著高于野生型玉米(空载对照玉米存活率与野生型相比基本一致，无统计学差异)。

表2转基因玉米植株经干旱处理后的存活率(％)结果

株系	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					WT	30.56	32.78	27.78	30.37±2.50**
ML1	70.00	69.44	50.00	63.15±11.39**
					ML3	71.67	50.00	60.00	60.56±10.84**
ML5	80.00	66.67	70.56	72.41±6.86**
					ML9	94.44	90.00	81.67	88.70±6.49**

注：**表示与WT结果相比在P＜0.01差异极显著。

用于上述同样的方法对W22、MT1和MT2进行存活率的统计，结果如表3、图4中B和D所示，可以看出，干旱处理20天后，ZmTIP1突变体MT1和MT2的叶片干枯程度小于野生型玉米，存活率显著低于野生型玉米。

表3突变体植株经干旱处理后的存活率(％)结果

株系	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					WT	63.88	51.38	50.00	55.09±7.65**
MT1	16.67	22.22	31.48	23.46±7.48**
					MT2	25.93	25.00	33.33	28.09±4.57**

注：**表示与WT结果相比在P＜0.01差异极显著。

因此，ZmTIP1蛋白编码基因的表达量与玉米苗期抗旱性明显相关，降低ZmTIP1基因表达量可显著降低苗期存活率，而提高ZmTIP1基因表达量可显著提高玉米苗期存活率，增加玉米抗旱性。

7、ZmTIP1玉米和ZmTIP1突变体的田间干旱表型分析

在大田实验条件下，检测WT、ML1、ML3、ML5和ML9在干旱处理条件下的耐受性。本实验中设置3种处理，命名为WW(正常浇水)、MD(轻度干旱)和SD(严重干旱)。WW处理在整个生育期灌溉充足的水以确保玉米能够正常生长，MD处理在播种后21天停止水分供应，但在玉米抽雄起浇水一次；SD处理播种后21天停止水分供应直至玉米收获。分别对株高、散粉时间(DTA)、散粉吐丝间隔(ASI)和单株产量进行统计。实验设4次重复，每次重复各株系的植株数不少于10株，取平均值进行统计分析。

结果如图5中A、B、C和D所示，在正常浇水条件下，除ML1和ML5的散粉时间较野生型提前之外，其它农艺性状均与WT无显著差异。在轻度干旱条件下，仅转基因株系ML1的株高显著高于野生型，散粉时间较野生型提前，4个转基因株系的ASI均显著小于野生型，单株产量显著高于野生型。在严重干旱条件下，转基因株系ASI均值小于野生型，单株产量的均值高于野生型，但未达到显著水平。

以上述方法，对野生型WT、突变体ML1和ML2设置WW和MD两个处理，分别对株高、散粉时间(DTA)、散粉吐丝间隔(ASI)、和单株产量进行统计。

结果如图5中E、F、G和H所示，在正常浇水条件下，除ML1的产量低于野生型外，其余性状均与WT无显著差异。但在轻度干旱条件下，仅ML2的株高显著低于野生型，2个突变体的单株产量均值均显著低于野生型。

上述结果表明，在植物中过表达蛋白ZmTIP1的编码基因，可以增加单株产量、提高植物的抗旱性，而降低蛋白ZmTIP1的编码基因的表达量可显著降低单株产量。

实施例3、ZmTIP1蛋白亚细胞定位的研究

1、重组载体的构建

将SEQ ID No.3的第164-2082位所示的ZmTIP1插入载体pGK-CsGFP的SmaI和SacI间(位于35S启动子下游)，保持载体上其余序列不变，得到的重组载体命名为pGK-CsGFP-ZmTIP1。

2、重组根癌农杆菌的获得

将连有SEQ ID No.3的第164-2082位所示的ZmTIP1序列的pGK-CsGFP-ZmTIP1载体转化根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株，获得含有该重组载体的重组农杆菌Y(提取质粒，测序验证该质粒为含有ZmTIP1的重组pGK-CsGFP-ZmTIP1质粒，则该重组农杆菌为阳性克隆)。

3、转35S:ZmTIP1-GFP拟南芥的获得

将重组农杆菌Y用花芽浸泡法转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥收获T1代种子；将T1代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选并将抗性苗种植收种，获得T2代种子；将T2代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选，挑选卡那霉素抗性分离比符合3:1的卡那霉素抗性苗种植，为T2代转ZmTIP1-GFP拟南芥。

提取T2代转ZmTIP1-GFP拟南芥植株RNA，反转录得到cDNA为模板，以拟南芥中的基因Actin2为内参，引物为FC1和RC1。用特异引物F2和R2对ZmTIP1基因的表达量进行检测，上述引物的序列如下：

F2：5’-AATGGGAATGATACAGATGACAAGT-3’；

R2：5’-TTGGCTATGAGGTTTTGAGTTTGCT-3’；

FC1：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

RC1：5’-AGACACACCATCACCAGAATCC-3’。

选取ZmTIP1基因表达量较高的阳性T2代转ZmTIP1-GFP拟南芥收种，获得T3代转种子，将T3代种子用含有30mg/L卡那霉素的MS培养基筛选得到不再产生卡那霉素抗性分离的纯合T3代ZmTIP1-GFP转基因株系。

实验同时设置用转入pGK-CsGFP空载体的根癌农杆菌GV3101+pSoup菌株替代重组农杆菌Y的空载对照

4、ZmTIP1蛋白亚细胞定位观察

将T3代纯合ZmTIP1-GFP转基因株系播种于MS平板上，见光5天后，用Leica TCSSP5荧光显微镜观察转基因株系ZmTIP1蛋白的亚细胞定位情况，结果如图6中A所示，ZmTIP1蛋白不仅定位于细胞质膜，并且在细胞质中呈点状分布。为进一步确定ZmTIP1蛋白在胞质的具体定位，将ZmTIP1-GFP纯合株系与融合RFP标签的拟南芥转基因株系WAVE 2R(液泡前体，prevacuolar compartment/PVC)、WAVE 3R(标记反式高尔基网络，trans-Golgi/TGN/EE)、Wave 9R(标记液泡膜，Tonoplast)和WAVE 22R(标记高尔基体，Golgi)进行杂交获得F1代种子，将F1代种子播种于MS平板，见光5天后，用confocal microscope(olympus FV1000MPE,488nm for GFP and 543nm for RFP)进行共定位观察，结果如图6中B所示，ZmTIP1蛋白与PVC、Golgi和TGN/EE均共定位，而与Tonoplast不共定位。综上所述，ZmTIP1蛋白定位于细胞质膜、高尔基体、反式高尔基网络和液泡前体。

5、ZmTIP1蛋白调节ZmCPK28蛋白的质膜定位

将T3代3个独立的ZmTIP1-GFP转基因株系以及对照pGK-CsGFP转基因株系播种于MS平板，22℃见光培养10天，取将6～8g植物材料通过研钵充分研磨粉碎，加入7ml 2×Extration Buffer(50mM Na-Phosphate，pH7.4；150mM NaCl；1mM DTT，1×proteaseinhibitor cocktail tablets；0.1％Nonidet P-40)继续研磨(冰上操作)5min，转入15ml离心管充分震荡混匀1min，13,000g、4℃离心20min。将上清转入1.5ml离心管中(约6～8个)，每管加入15μL用2×Extration Buffer预清洗3次的Anti-GFP mAb-Magnetic beads(MBL)，4℃混合器结合2h。用磁力架将Beads全部收集下来，用2×Extration Buffer清洗3～4遍，去除非特异结合的蛋白，然后用不含有NP-40的2×Extration Buffer清洗3～4遍。最后用100μL含有0.1M Gly-HCl(pH3.0)的Elution buffer洗脱后并迅速加入1/10体积的1M Tris-HCl(pH6.7)中和蛋白，以免蛋白变性，将洗脱液交由中国农业大学质谱平台进行互作蛋白检测，最终将3个转基因株系同时检测到的蛋白定为可能的互作蛋白。其中AtCPK21(Calcium-Dependent Protein Kinase 21,At4g04720)被多次重复检测到，其在玉米中的同源基因ZmCPK28(GRMZM2G 168706)的N端氨基酸序列MGSCCS中含有两个保守的半胱氨酸残基，已有研究表明这两个保守半胱氨酸残基能够被棕榈酰基转移酶修饰进而影响目标蛋白的亚细胞定位。

将ZmCPK28-GFP以及突变这两个保守半胱氨酸残基的ZmCPK28-C3A-GFP、ZmCPK28-C4A-GFP和ZmCPK28-C3&4A-GFP构建至pSB11载体上，将这4个重组载体分别转化玉米W22以及ZmTIP1突变体MT1和MT2的原生质体，用Leica TCS SP5荧光显微镜进行亚细胞定位观察。

结果如图7中A所示，ZmCPK28蛋白主要定位于质膜，而在胞质的定位非常微弱。将其N端的单个半胱氨酸突变体后，部分ZmCPK28蛋白的定位由细胞膜转移到了细胞质，若将两个半胱氨酸全部突变，ZmCPK28蛋白主要定位于细胞质，而在质膜的定位极其微弱。与此相一致，在ZmTIP1突变体MT1和MT2中，ZmCPK28蛋白主要定位于胞质。为进一步验证ZmCPK28蛋白的定位结果，进一步提取原生质体总蛋白，分离出细胞膜(P)和细胞质组分(S)蛋白，用Western Blot检测ZmCPK28的定位模式，结果如图7中B所示，在野生型W22中，ZmCPK28主要定位于质膜，将两个保守的半胱氨酸残基突变体后，ZmCPK28蛋白的定位转移至细胞质，同样在ZmTIP1突变体MT2中，ZmCPK28蛋白主要定位于细胞质，仅少量的蛋白定位于细胞膜。

为进一步确认ZmTIP1是否与ZmCPK28存在互作，将ZmCPK28蛋白融合Myc标签，ZmTIP1蛋白融合GFP标签后，构建至载体pGKX上，并将pGKX载体上的35S启动子替换为Zmubi1启动子，转化玉米B73原生质体。

结果如图7中C所示，ZmTIP1与ZmCPK28蛋白存在互作。

综上所述，ZmTIP1蛋白可能通过棕榈酰化修饰ZmCPK28，影响其亚细胞定位。

<110> 中国农业大学

<120> 蛋白ZmTIP1在调控植物抗旱性中的应用

<130> GNCLN190306

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 639

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 1

Met Ala Ser Glu Ile Glu Val Leu Glu Asp Thr Thr Thr Ser Ser Thr

1 5 10 15

Ser Leu Val Ala Ala Ala Ser Thr Val Pro Ser Leu Ala Glu Gly Ala

20 25 30

Glu Ala Pro Ala Glu Asp Asp Ser Leu Lys Asn Asp Val Tyr Thr Ala

35 40 45

Ala Ala Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Leu Gln Arg Leu Val Glu Gly Glu

50 55 60

Gly Arg Pro Val Thr Glu Pro Asp Gly Gly Gly Tyr His Ala Leu Gln

65 70 75 80

Trp Ala Ala Leu Asn Asn Arg Val Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Leu Glu

85 90 95

His Gly Ala Asp Ile Asn Ala Val Asp His Thr Gly Gln Thr Ala Leu

100 105 110

His Trp Ser Ala Val Arg Gly His Ile Gln Val Ala Glu Leu Leu Leu

115 120 125

Lys Glu Gly Ala Lys Val Asp Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala

130 135 140

Thr His Val Ala Ala Gln Tyr Gly Gln Thr Ala Phe Ile Tyr His Ile

145 150 155 160

Val Ala Lys Trp Asn Ala Asp Pro Asp Ile Pro Asp Asn Asp Gly Arg

165 170 175

Ser Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly Phe Ala Asp Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Leu Leu Phe Leu Asp Ala Tyr Arg Gly Arg Gln Asp Lys Glu Gly

195 200 205

Cys Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Ile Arg Gly Asn Leu Glu Ala Cys

210 215 220

Thr Val Leu Val Gln Val Gly Lys Lys Asp Asp Leu Met Val Lys Asp

225 230 235 240

Lys Thr Gly Leu Thr Pro Ala Gln Leu Ala Ala Asp Lys Asn His Arg

245 250 255

Gln Val Ala Phe Phe Leu Asp Asn Ala Arg Arg Val His Gly Lys Gly

260 265 270

Cys Gly Ala Asn Thr Arg Phe Gly Lys Leu Ser Lys Leu Gly Leu Ala

275 280 285

Pro Leu Leu Trp Cys Thr Ile Ile Gly Met Leu Ile Thr Tyr Thr His

290 295 300

Ser Val Ile Ser Gly Gln Tyr Ala Met Thr Thr Thr Ala Pro Phe Gly

305 310 315 320

Ile Phe Ala Trp Ser Gly Val Phe Leu Ala Thr Ala Gly Leu Val Met

325 330 335

Phe Tyr Lys Cys Ser Arg Lys Asp Pro Gly Tyr Ile Asn Ile Asn Ala

340 345 350

Arg Gly Ser Gln Asn Gln Arg Asp Asp Glu Pro Leu Leu Lys Met Glu

355 360 365

Leu Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser Gly Asn Trp Ser Gln Leu Cys Ile

370 375 380

Thr Cys Lys Ile Val Arg Pro Val Arg Ser Lys His Cys Ser Thr Cys

385 390 395 400

Asp Arg Cys Val Glu Gln Phe Asp His His Cys Pro Trp Val Ser Asn

405 410 415

Cys Ile Gly Lys Lys Asn Lys Trp Glu Phe Phe Met Phe Leu Thr Leu

420 425 430

Glu Val Phe Ala Met Ile Ile Thr Gly Ser Ala Ala Ile Ile Arg Ile

435 440 445

Val Arg Asp Pro Asn Ser Pro Ser Ser Phe Gly Ala Trp Ile His Tyr

450 455 460

Ser Ala Phe Gln His Pro Gly Val Val Ser Phe Leu Ala Leu Asp Cys

465 470 475 480

Phe Leu Phe Phe Gly Val Ala Val Leu Thr Val Val Gln Ala Ser Gln

485 490 495

Ile Ala Arg Asn Ile Thr Thr Asn Glu Met Ala Asn Ser Met Arg Tyr

500 505 510

Ala Tyr Leu Arg Gly Pro Gly Gly Arg Phe Arg Asn Pro Tyr Asp His

515 520 525

Gly Ile Arg Lys Asn Cys Ser Asp Phe Leu Leu Asn Gly Tyr Asn Glu

530 535 540

Asp Thr Glu Arg Leu Glu Gln Thr Leu Pro Thr Asp Glu Glu Met Gly

545 550 555 560

Met Ile Gln Met Thr Ser Ala Val Ser Gln Gln Asn Gly Asp Asn His

565 570 575

Leu His His Gly Asn Gly Thr Asp His Ser Cys Ala Val Ser Gln Ala

580 585 590

Asn Ser Lys Pro His Ser Gln Val Gly Ser Ser Gln Cys Cys Asp His

595 600 605

Ser Lys Arg Thr Asp Arg Thr Pro Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly

610 615 620

Arg Asn Ser Ala Ser Arg Gln Tyr Val Arg Ser Leu Ile Pro Leu

625 630 635

<210> 2

<211> 639

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Ala Ser Glu Ile Glu Val Leu Glu Asp Thr Thr Thr Ser Ser Thr

1 5 10 15

Phe Leu Val Ala Ala Ala Ser Thr Val Pro Ser Ala Ala Glu Gly Ala

20 25 30

Glu Ala Pro Ala Glu Asp Asp Ser Leu Lys Asn Asp Val Tyr Thr Ala

35 40 45

Ala Ala Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Leu Gln Arg Leu Val Glu Gly Glu

50 55 60

Gly Arg Pro Val Thr Glu Pro Asp Gly Gly Gly Tyr His Ala Leu Gln

65 70 75 80

Trp Ala Ala Leu Asn Asn Arg Val Ala Ala Ala Gln Tyr Ile Leu Glu

85 90 95

His Gly Ala Asp Ile Asn Ala Val Asp His Thr Gly Gln Thr Ala Leu

100 105 110

His Trp Ser Ala Val Arg Gly His Ile Gln Val Ala Glu Leu Leu Leu

115 120 125

Lys Glu Gly Ala Lys Val Asp Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala

130 135 140

Thr His Val Ala Ala Gln Tyr Gly Gln Thr Ala Phe Ile Tyr His Ile

145 150 155 160

Ile Ala Lys Trp Asn Ala Asp Pro Asp Ile Pro Asp Asn Asp Gly Arg

165 170 175

Ser Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly Phe Ala Asp Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Leu Leu Phe Leu Asp Ala Tyr Arg Gly Arg Gln Asp Lys Glu Gly

195 200 205

Cys Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Ile Arg Gly Asn Leu Glu Ala Cys

210 215 220

Thr Val Leu Val Gln Val Gly Lys Lys Asp Asp Leu Met Val Lys Asp

225 230 235 240

Lys Thr Gly Leu Thr Pro Ala Gln Leu Ala Ala Asp Lys Asn His Arg

245 250 255

Gln Val Ala Phe Phe Leu Asp Asn Ala Arg Arg Val His Gly Arg Gly

260 265 270

Cys Gly Ala Asn Thr Arg Phe Gly Lys Leu Ser Lys Leu Gly Leu Ala

275 280 285

Pro Leu Leu Trp Cys Thr Ile Ile Gly Met Leu Ile Thr Tyr Thr His

290 295 300

Ser Val Ile Ser Gly Gln Tyr Ala Met Thr Thr Thr Ala Pro Phe Gly

305 310 315 320

Ile Phe Ala Trp Ser Gly Val Phe Leu Ala Thr Ala Gly Leu Val Met

325 330 335

Phe Tyr Lys Cys Ser Arg Lys Asp Pro Gly Tyr Ile Asn Ile Asn Ala

340 345 350

Arg Gly Ser Gln Asn Gln Arg Asp Asp Glu Pro Leu Leu Lys Met Glu

355 360 365

Leu Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser Gly Asn Trp Ser Gln Leu Cys Ile

370 375 380

Thr Cys Lys Ile Val Arg Pro Val Arg Ser Lys His Cys Ser Thr Cys

385 390 395 400

Asp Arg Cys Val Glu Gln Phe Asp His His Cys Pro Trp Val Ser Asn

405 410 415

Cys Ile Gly Lys Lys Asn Lys Trp Glu Phe Phe Met Phe Leu Thr Leu

420 425 430

Glu Val Phe Ala Met Ile Ile Thr Gly Ser Ala Ala Ile Ile Arg Ile

435 440 445

Val Arg Asp Pro Asn Ser Pro Ser Ser Phe Gly Ala Trp Ile His Tyr

450 455 460

Ser Ala Phe Gln His Pro Gly Val Val Ser Phe Leu Ala Leu Asp Cys

465 470 475 480

Phe Leu Phe Phe Gly Val Ala Val Leu Thr Val Val Gln Ala Ser Gln

485 490 495

Ile Ala Arg Asn Ile Thr Thr Asn Glu Met Ala Asn Ser Met Arg Tyr

500 505 510

Ala Tyr Leu Arg Gly Pro Gly Gly Arg Phe Arg Asn Pro Tyr Asp His

515 520 525

Gly Ile Arg Lys Asn Cys Ser Asp Phe Leu Leu Asn Gly Tyr Asn Glu

530 535 540

Asp Thr Glu Arg Leu Glu Gln Thr Leu Pro Thr Asp Glu Glu Met Gly

545 550 555 560

Met Ile Gln Met Thr Ser Ala Val Ser Gln Gln Asn Gly Asp Asn His

565 570 575

Leu His His Gly Asn Gly Thr Asp His Ser Cys Ala Val Ser Gln Ala

580 585 590

Asn Ser Lys Pro His Ser Gln Val Gly Ser Ser Gln Cys Cys Asp His

595 600 605

Ser Lys Arg Thr Asp Arg Thr Pro Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly

610 615 620

Arg Asn Ser Ala Ser Arg Gln Tyr Val Arg Ser Leu Ile Pro Leu

625 630 635

<210> 3

<211> 2800

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 3

cttccctctc gttctccgct tccgcctccg cctccggcca cgagtcacca gggaagggac 60

aaacgcacaa aatcaacgaa cgcccagcgc ccagtcaaac actacccctt cctccctccc 120

ccctcgccgc ctccccggac cccgccccga ccccaccgaa cccatggcgt cggagatcga 180

ggtgctcgag gacaccacca cctcctcgac ttccctcgtc gcggccgcgt ccacagtccc 240

ttctctcgcg gagggcgcgg aggcgccggc ggaggacgac tcgctgaaga acgacgtgta 300

caccgcggcg gcgtacggcg atctggagaa gctgcagcga ctggtggagg gggagggccg 360

cccagtcacc gagcccgacg gcgggggcta ccacgcgctt cagtgggccg cactcaacaa 420

ccgcgttgcc gccgcgcagt acatccttga gcatggagca gacataaatg ctgtggatca 480

cactggacaa acagcacttc actggagtgc tgtacgtggt catattcaag ttgctgaact 540

acttctgaaa gaaggagcta aggtggatgc tactgattta tacgggtatc aggccacgca 600

tgttgcagca cagtatggtc agactgcatt catttaccac attgttgcaa aatggaatgc 660

tgatccagat atccctgata atgatggaag gagcccttta cactgggctg cttataaggg 720

atttgcagac tccatacggc ttcttttgtt tttggatgct tataggggac ggcaagacaa 780

agaaggttgt actccattac attgggctgc tattcggggg aatcttgagg catgcactgt 840

cttagttcag gttggcaaaa aggatgattt gatggtgaaa gacaaaactg gcttaactcc 900

agcacagctt gctgccgata agaatcatcg gcaagttgca tttttcctcg acaatgctag 960

aagggtacac ggcaaaggat gtggtgcgaa caccagattt gggaaattgt caaaattagg 1020

gctcgctcct cttctttggt gcaccattat tggcatgctt attacataca cacactctgt 1080

tatatcagga caatatgcca tgactacgac agcaccattt gggatattcg catggtcagg 1140

agtttttctt gcaactgctg gcttggtcat gttctataaa tgtagcagga aagatccagg 1200

ttacatcaac ataaatgcaa ggggctcgca aaatcaaagg gatgatgaac cgttgctgaa 1260

gatggagtta gaaaatcctg cacttctttc tggcaactgg tcacaacttt gtataacctg 1320

caaaatagtc agacctgttc gttcaaaaca ttgttctaca tgtgatcgct gcgtggagca 1380

gtttgaccac cactgccctt gggtatctaa ttgcatagga aagaagaaca aatgggaatt 1440

cttcatgttc ctcactctag aagtttttgc aatgatcatt actggctctg ctgccattat 1500

aagaattgta agagatccaa attctccatc atcctttggt gcttggattc attattctgc 1560

gtttcagcat cctggggtgg tttcatttct cgcattggat tgttttcttt tctttggtgt 1620

tgcagttctt acagttgttc aagcatcaca gatagcaagg aacattacaa caaatgagat 1680

ggcaaactcc atgagatatg catacctcag aggcccaggt ggcagattca ggaatccgta 1740

tgatcatggg attcgcaaga actgctctga cttcttgtta aatggataca atgaggacac 1800

tgaacggcta gagcagacat tgcccactga tgaggaaatg ggaatgatac agatgacaag 1860

tgcagtttcg cagcagaacg gtgacaatca tttacatcat ggtaatggca ctgaccatag 1920

ttgcgctgtt tcacaagcaa actcaaaacc tcatagccaa gtgggttcgt ctcagtgttg 1980

tgaccacagt aagaggactg ataggacacc gttgggccta ggattgggcc ttggacgaaa 2040

cagtgcgtcc cggcagtatg ttcggtctct tatcccattg tgatccatca tttggcgatc 2100

atgtgtttgt ttgactgtag attggatttg ttcacttatt ctgttatacg tgcccttgac 2160

atggttcacc atggctgggc agggttaacg ttattgtgcc atgagctccg gaatactaag 2220

atatatctgg tgttgtagtt tagcgttgaa ctcagagaag ttgaaggtaa cgacctggtt 2280

tgcgagtatc agctgatcag cagtctggaa tcagagagtt tgtgcagaaa atgtaagagt 2340

tatggactca tggcagatgc agtagcatga gatgtcttca gaattgttgt gtacatcagg 2400

ttcggtggta cccccattgt ttagcgtgat acgagtttgg aaaaaaaaaa agtagtcgta 2460

aattgagaaa attgtaaatt gattagtaag ctcactgcaa cactagctgt tttcctagtt 2520

ttcattcatt tttgggtctg gttattgtta tgaaccacgg aaagaatttt cggttttcgg 2580

gtatgggtac ctcagttata tttggtctgg ttatggtact tactggtggt gcatgtttgt 2640

gtgagtgctt agagtttagg ctatggccat cagatcatgt atatgactat atgactgtgt 2700

aaaacactgt tttttatctg attgtgtaaa acagtgtttt tgtatcgtac actattgttt 2760

tatagattga agtttaaaat aagagatgtg aatgagtaag 2800

<210> 4

<211> 2800

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 4

cctcaacctt ccctctcgtt ctccgcctcc gcctccggcc acgagtcacc agggaaggga 60

caaacgcaca aaatcaacga acgcccagcg cccagtcaaa cactacccct tcctccctcc 120

ccctcgccgc ctccccggac cccgccccga ccccaccgaa cccatggcgt cggagatcga 180

ggtgctcgag gacaccacca cctcctcgac tttcctcgtc gcggccgcgt ccacagtccc 240

ttctgccgcg gagggcgcgg aggcgccggc ggaggacgac tcgctgaaga acgacgtgta 300

caccgcggcg gcgtacggcg atctggagaa gctgcagcgg ctggtggagg gggagggccg 360

cccagtcacc gagcccgacg gcgggggcta ccacgcgctc cagtgggccg cactcaacaa 420

ccgcgttgcc gccgcgcagt acatccttga gcatggagca gacataaatg ctgtggatca 480

cactggacaa acagcacttc actggagtgc tgtacgtggt catattcaag ttgctgaact 540

acttctgaaa gaaggagcta aggtggatgc tactgattta tatgggtatc aggccacaca 600

tgttgcagca cagtatggtc agactgcatt catttaccac attattgcaa aatggaatgc 660

tgatccagat atccctgata atgatggaag gagcccttta cactgggctg cttataaggg 720

atttgcagac tccatacggc ttcttttgtt tttggatgct tataggggac ggcaagacaa 780

agaaggttgt actccattac attgggctgc tattcggggg aatcttgagg catgcactgt 840

cttagttcag gttggcaaaa aggatgattt gatggtgaaa gacaaaactg gcttaactcc 900

agcacagctt gctgccgata agaatcatcg gcaagttgca tttttcctcg acaatgctag 960

aagggtacac ggcagaggat gtggtgcgaa caccagattt gggaaattgt caaaattagg 1020

gctcgctcct cttctttggt gcaccattat tggcatgctt attacataca cacactctgt 1080

tatatcagga caatatgcca tgactacgac agcaccattt gggatattcg catggtcagg 1140

agtttttctt gcaactgctg gcttggtcat gttctataaa tgtagcagga aagatccagg 1200

ttacatcaac ataaatgcaa ggggctcgca aaatcaaagg gatgatgaac cgttgctgaa 1260

gatggagttg gaaaatcctg cacttctttc tggcaactgg tcacaacttt gtataacctg 1320

caaaatagtc agacctgttc gttcaaaaca ttgttctaca tgtgatcgct gcgtggagca 1380

gtttgaccac cactgccctt gggtatctaa ttgcatagga aagaagaaca aatgggaatt 1440

cttcatgttc ctcactctag aagtttttgc aatgatcatt actggctctg ctgccattat 1500

aagaattgta agggatccaa attctccatc atcctttggt gcttggattc attattctgc 1560

gtttcagcat cctggggtgg tttcatttct cgcattggat tgttttcttt tctttggtgt 1620

tgcagttctt acagttgttc aagcatcaca gatagcaagg aacattacaa caaatgagat 1680

ggcaaactcc atgagatatg catacctcag aggcccaggt ggcagattca ggaatccgta 1740

tgatcatggg attcgcaaga actgctctga cttcttgtta aatggataca atgaggacac 1800

tgaacggcta gagcagacat tgcccactga tgaggaaatg ggaatgatac agatgacaag 1860

tgcagtttcg cagcagaacg gtgacaatca tttacatcat ggtaatggca ctgaccatag 1920

ttgcgctgtt tcacaagcaa actcaaaacc tcatagccaa gtgggttcgt ctcagtgttg 1980

tgaccacagt aagaggactg ataggacacc gttgggccta ggattgggcc ttggacgaaa 2040

cagtgcgtcc cggcagtatg ttcggtctct tatcccattg tgatccatca tttggcgatc 2100

atgtgtttgt ttgactgtag attggatttg ttcacttatt ctgttatacg tgcccttgac 2160

atggttcacc atggctgggc agggttaaac gttgttgtgc catgagctcc ggaatactaa 2220

gatatatctg gtgttgtagt ttagcgttga actcagagaa gttgaaggta acgacctggt 2280

ttgcgagtat cagctgatca gcagtctgga atcagagagc ttgtgcagaa aatgtaagag 2340

ttatggactc atggcagatg cagtagcatg agatgtcttc agaattgttg tgtacacatc 2400

aggttctgtg gtacccccat tgtttagcgt gatacgagtt tgggaaaaaa aagtagtcgt 2460

aaattgagga aattgtaaat tgattagtaa gctcactgca acactagctg ttttcctagt 2520

tttcattcat ttttgggtct ggttattgtt atgaaccacg gaaagaatat ttggttttcg 2580

ggtatgggta cctcagttat atttggtctg gttatggtac ttactggtgg tgcatgtttg 2640

tgtgagtgct tagagtttag gctatggcca gcagatatgt atatgaccgt gtaaaacact 2700

gtttttgtat tgtagactat tattttatag attggagttt aaaataggag atgtgaatga 2760

gtaatctact agagatgtcc ttaggacact gttgttacaa 2800

Claims

1.ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在调控植物抗旱性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述ZmTIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1 或SEQ ID No.2的蛋白质；

（A2）与（A1）所限定的氨基酸序列具有99%以上同源性且具有相同功能的来源于玉米的蛋白质；

（A3）在（A1）-（A2）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物抗旱性提高；所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物抗旱性降低。

3. ZmTIP1蛋白或其相关生物材料在调控植物根毛发育中的应用；

所述ZmTIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1 或SEQ ID No.2的蛋白质；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物根毛长度增长；所述ZmTIP1蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物根毛长度减短。

5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子。

6.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为十字花科植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为玉米；所述十字花科植物为拟南芥。

9.一种培育植物品种的方法，为方法A或方法B或方法C或方法D：

方法A：一种培育抗旱性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

方法B：一种培育抗旱性降低的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

方法C：一种培育根毛长度增长的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

方法D：一种培育根毛长度减短的植物品种的方法，包括使受体植物中ZmTIP1蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述ZmTIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的蛋白质；

10.一种培育转基因植物的方法，为方法E或方法F或方法G或方法H：

方法E：一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmTIP1蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高；

方法F：一种培育抗旱性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中ZmTIP1蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性降低；

方法G：一种培育根毛长度增长的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmTIP1蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛长度增长；

方法H：一种培育根毛长度减短的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中ZmTIP1蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛长度减短；

所述ZmTIP1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的蛋白质；

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：能够表达所述ZmTIP1蛋白的核酸分子为所述ZmTIP1蛋白的编码基因；

所述ZmTIP1蛋白的编码基因是SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子。

12.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为十字花科植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为玉米；所述十字花科植物为拟南芥。