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CN103570813B - 与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用 - Google Patents

与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用 Download PDF

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CN103570813B CN201210261882.8A CN201210261882A CN103570813B CN 103570813 B CN103570813 B CN 103570813B CN 201210261882 A CN201210261882 A CN 201210261882A CN 103570813 B CN103570813 B CN 103570813B
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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。实验证明，转化了本发明所提供的植物抗逆性相关基因Gh01399后得到的过量表达的拟南芥植株与未转基因的野生型拟南芥植株相比，抗逆性显著提高。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白Gh01399及其编码基因为人为控制植物中抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆植物中发挥重要的作用。

Description

与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种与植物抗逆性相关蛋白Gh01399及其编码基因与应用，特别涉及一种与植物抗盐性和/或抗旱性相关的蛋白Gh01399及其编码基因与应用。
背景技术
棉花是我国重要的纤维作物，在国民经济中占有重要地位。但是我国棉花种植区大部分处于干旱（如新疆棉区）和半干旱地区（如黄河流域棉区），目前干旱已经成为棉花生产的主要限制因素之一。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱和盐胁迫等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。如植物可以通过激素代谢调节防止水分的过度散失，保持细胞的膨压，从而保持细胞的生长、气孔开放和光合作用等生理过程的正常进行。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物能够直接参与植物的胁迫应答，或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。
茉莉酸及其衍生物（JAs）是一类重要的植物内源性抗逆信号分子，茉莉酸类物质介导的信号转导途径在植物的生长发育、抗逆以及衰老过程中起着重要的作用。茉莉酸信号通路包括两个重要过程：茉莉酸的生物合成和茉莉酸信号的转导，而目前对茉莉酸信号通路的研究主要是胁迫方面的研究。SCFCOI1-JAZ-MYC2（TF）是植物茉莉酸信号途径的3个核心环节。
因此，发现新的与植物抗逆性相关的茉莉酸信号途径调节蛋白，将为人为控制植物中抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆植物中发挥重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，名称为Gh01399，来源于陆地棉（GossypiumhirsutumL.），是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
序列2由216个氨基酸组成。
为了便于Gh01399蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（a）中的Gh01399蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的Gh01399蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。
编码所述Gh01399蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Gh01399蛋白的基因（命名为Gh01399）；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的第217-867位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述Gh01399蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Gh01399蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列1由1253个核苷酸组成，由216bp的5’非编码区（5’-UTR），651bp的蛋白质编码区（序列1的第217-867位），以及386bp的3’非编码区（3’-UTR）组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述Gh01399基因转录的启动子具体为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA1300载体的多克隆位点处插入所述Gh01399基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为KpnI和XbaI。
所述表达盒由能够启动所述Gh01399基因表达的启动子，所述Gh01399基因，以及转录终止序列组成。
所述Gh01399蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）或a3）中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）调控植物抗逆性；
a2）选育抗逆性植物品种；
a3）调控茉莉酸信号途径。
在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗逆性具体为提高植物的抗逆性。
所述选育抗逆性植物品种的方法，具体可包括将所述Gh01399蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
在所述调控茉莉酸信号途径中的应用，具体可体现在提高由茉莉酸诱导的抗逆性基因的表达中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
该方法包括将编码所述Gh01399蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗逆性提高。
在本发明的一个实施例中，所述抗逆性提高，具体体现在在逆境胁迫条件下，所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下b1）-b3）中至少一种特点：
b1）根长更长；
b2）与所述逆境胁迫前相比叶绿素含量的减少量更小；
b3）与所述逆境胁迫前相比脯氨酸的积累倍数更大。
所述Gh01399蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述Gh01399蛋白的基因（即Gh01399基因）是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的第217-867位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述Gh01399蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Gh01399蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
所述Gh01399基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在本发明中，上述所有的抗逆性均可为抗盐性，和/或抗旱性，和/或抗病性，和/或抗虫性。所述抗病性具体可为抗黄萎病；所述抗虫性具体可为抗白粉虱。所述逆境胁迫可为盐胁迫，和/或干旱胁迫，和/或病害胁迫，和/或虫害胁迫。所述病害胁迫具体可为黄萎病胁迫；所述虫害胁迫具体可为白粉虱胁迫。
所述植物可为双子叶植物，或单子叶植物，具体可为拟南芥、棉花、大豆、油菜等双子叶植物，或是水稻、小麦等单子叶植物。
本发明的Gh01399基因可被NaCl诱导表达。对转化本发明所提供的植物抗逆性相关基因Gh01399后得到的过量表达的拟南芥植株进行逆境生理实验，证明转入Gh01399基因后，提高了拟南芥的抗逆性。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白Gh01399及其编码基因为人为控制植物中抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆植物中发挥重要的作用。
附图说明
图1为Gh01399基因受到盐胁迫时的诱导表达。其中，CK表示未作任何处理的对照组，sal表示盐胁迫处理组。
图2为pCAMBIA1300-Gh01399重组表达载体的构建流程图。
图3为T4代转Gh01399基因拟南芥植株的PCR检测结果。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道WT为野生型拟南芥阴性对照；泳道P为pCAMBIA1300-Gh01399重组表达载体阳性对照；泳道ox-1至ox-8为8个鉴定阳性的T4代转Gh01399基因拟南芥植株。
图4为盐胁迫条件下T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥表型观察结果。其中，1表示鉴定阳性的T4代转Gh01399基因拟南芥植株ox-1；2表示鉴定阳性的T4代转Gh01399基因拟南芥植株ox-2；3表示野生型拟南芥阴性对照。
图5为盐胁迫条件下T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥根长比较结果。
图6为盐胁迫处理后T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥叶绿素含量测定结果。
图7为盐胁迫处理后T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥叶绿素含量较胁迫处理前的减少量。
图8为盐胁迫处理后T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥脯氨酸含量测定结果。
图9为盐胁迫下T4代转Gh01399基因拟南芥和野生型拟南芥脯氨酸积累倍数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与植物抗逆性相关的基因Gh01399的获得
以3-6片真叶幼苗期陆地棉（GossypiumhirsutumL.）品种TM-1幼苗为实验材料，采用改良的CTAB法提取总RNA，反转录得其全基因组cDNA，作为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增。
引物1：5’-ATGTTTGGTTCACCGGAATA-3’（序列1的第217-236位）
引物2：5’-CTATCCCTTTCTCTTCTCGA-3’（序列1的第848-867位的反向互补序列）
PCR扩增体系（50μl）：MgCl2（25mM）2μl，10×Buffer5μl，dNTPMixture（10μM）4μl，Easy-AHigh-FidelityPCRCloningEnzyme（5U/μl）1μl，反转录反应液5μl（0.25μg），上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，ddH2O补足至50μl。
反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，得到PCR产物进行测序鉴定，表明该PCR产物片段具有序列表中序列1的第217-867位核苷酸序列，然后通过5’RACE和3’RACE的方法获得cDNA全长序列，将其命名为Gh01399。Gh01399基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，cDNA全长1253bp，该序列包括216bp的5’非编码区（5’-UTR），651bp的蛋白质编码区（序列1的第217-867位），以及386bp的3’非编码区（3’-UTR）。该序列可编码216个氨基酸的蛋白质（序列2），预测蛋白质分子量为23.6kD，等电点（pI）8.17。TargetP软件预测基因表达产物为细胞质定位；无跨膜螺旋；蛋白质功能域预测发现包含2个功能域：TIFYdomain和CCT_2domain
因此，预测Gh01399能编码一个茉莉酸信号途径中的调节蛋白，从而在棉花耐旱中起到作用。
实施例2、Gh01399在盐胁迫下的表达模式分析
将在28℃恒温培养箱中培养至3-6片真叶的陆地棉（GossypiumhirsutumL.）品种TM-1幼苗，小心拔出进行胁迫处理。在150MmNaCl水溶液中分别处理1、3、6、24h后，提取幼苗总RNA，总RNA纯度与质量都较高，每个样品RNA的A260/A280都在1.8-2.1之间，浓度在1.0μg/μl以上。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，28SrRNA与18SrRNA条带非常清晰，表明所提取的RNA样品能用于RT-PCR反应。
以棉花看家基因18SrRNA为内参，作为衡量模板量的对照，通过RT-PCR分析Gh01399基因在不同胁迫时间的表达。同时设置未经任何处理的陆地棉（GossypiumhirsutumL.）品种TM-1作为对照（CK）。实验重复三次，结果取平均值。
用于扩增Gh01399基因编码区的引物：
引物1：5’-ATGTTTGGTTCACCGGAATA-3’（序列1的第217-236位）
引物2：5’-CTATCCCTTTCTCTTCTCGA-3’（序列1的第848-867位的反向互补序列）
用于扩增18SrRNA基因的引物：
上游引物：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’
下游引物：5’-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3’
结果如图1所示，从图中可以看出，NaCl胁迫处理时，Gh01399基因的mRNA迅速积累并在胁迫3h时达到最大值，NaCl胁迫6h后，Gh01399的转录本开始下降。
实施例3、转Gh01399基因拟南芥的获得及其功能验证
一、转Gh01399基因拟南芥的获得
1、Gh01399基因重组表达载体pCAMBIA1300-Gh01399的构建
以上述实施例1扩增得到的Gh01399基因（序列1）为模板，以含有KpnⅠ和XbaI酶切位点的引物Gh01399-Xba-F和Gh01399-Kpn-R进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段回收并纯化，将其连接到pMD-19Tsimple（TaKaRaCode：D104A）载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
Gh01399-Xba-F：5′-GCTCTAGAATGTTTGGTTCACCGGAATATACAT-3′（下划线为XbaⅠ位点，其后的序列为序列1的第217-241位）
Gh01399-Kpn-R：5′-GGGGTACCCTATCCCTTTCTCTTCTCG-3′（下划线为KpnI位点，其后的序列为序列1的第849-867位的反向互补序列）
测序结果表明，扩增出的片段具有序列1中的自5’端第217-867位所示的核苷酸序列。提取测序结果正确的克隆中的质粒，命名为pMD19-Gh01399，用KpnⅠ和XbaI酶切pMD19-Gh01399，回收约651bp的Gh01399基因编码区片段，同时用限制性内切酶KpnⅠ和XbaI双酶切pCAMBIA1300载体（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MCV033），回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的约651bp的Gh01399基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行KpnⅠ和XbaI酶切鉴定。将经过双酶切鉴定得到大小约为651bp目的条带的重组质粒送样测序验证。将经测序表明在载体pCAMBIA1300的KpnⅠ和XbaI酶切位点间插入了序列表中序列1的第217-867位所示的Gh01399基因片段，证明质粒构建正确，将其命名为pCAMBIA1300-Gh01399。在重组表达载体pCAMBIA1300-Gh01399中，启动所述Gh01399基因转录的启动子为35S启动子，该重组表达载体的构建流程图如图2所示。
2、转Gh01399基因拟南芥的获得
MSⅠ配方：NH4NO333000mg/L、KNO338000mg/L、CaCl2·2H2O8800mg/L、MgSO4·7H2O7400mg/L、KH2PO43400mg/L。
MSⅡ配方：KI166mg/L、H3BO31240mg/L、MnSO4·4H2O4460mg/L、ZnSO4·7H2O1720mg/L、Na2MoO4·2H2O50mg/L、CuSO4·5H2O5mg/L、CoCl2·6H2O5mg/L。
Fe盐配方：FeSO4·7H2O5560mg/L、Na2-EDTA·2H2O7460mg/L。
B5V配方：肌醇20000mg/L、ⅣB烟酸100mg/L、盐酸吡哆醇（维生素B6）100mg/L、盐酸硫胺素（维生素B1）100mg/L、甘氨酸400mg/L。
将上述步骤1构建好的重组表达载体pCAMBIA1300-Gh01399通过冻融法（参考HolstersM,DEWAELED,DEPICKERA,etal.TransfectionandtransformationofAgrobacteriumtumefaciens.等Mol.Gen.Genet.1978,183:181-187）转入农杆菌LBA4404（Takara公司，产品目录号为D9115）。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。同时设置转入pCAMBIA1300空载体的对照。将经鉴定表明含有Gh01399基因（PCR目的条带大小约为651bp）的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA1300-Gh01399；将转入pCAMBIA1300空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA1300。
引物1：5’-ATGTTTGGTTCACCGGAATA-3’（序列1的第217-236位）
引物2：5’-CTATCCCTTTCTCTTCTCGA-3’（序列1的第848-867位的反向互补序列）
采用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1300-Gh01399（或LBA4404/pCAMBIA1300）转化拟南芥品种野生哥伦比亚生态型Col-0。具体如下：用加有0.01%(v/v)TritonX-100的10%(v/v)NaClO水溶液对拟南芥种子进行消毒处理10min，然后在超净工作台中用灭菌水清洗6次。再将其播种到添加3.0%（w/v）蔗糖、0.8%（w/v）琼脂粉的MS培养基，将其放在4℃进行春化，3~4天之后可将拟南芥幼苗移到人工气候室培养，培养环境设置为22℃、70%的相对湿度，光强为150μmolm-2s-1，光周期为12h光照/12h黑暗，一周之后移苗：培养用土是草炭土（或花卉营养土）与蛭石按（1:1）的比例混合而成的。移苗前将装有上述培养土的花盆放入有水的塑料箱中，使水通过花盆底部的小孔上渗，待花盆中的培养土湿透后即可移苗。移苗结束后，用保鲜膜覆盖培养，4d后揭膜。四周后进行转化，用LB三抗培养基（在LB培养基中添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素、终浓度为50μg/ml的链霉素、终浓度为25μg/ml的利福平）将菌液摇至OD600=1.2，5000rpm离心5min，弃上清，加菌体悬浮液（MSⅠ：25mL/L；MSⅡ：5mL/L；Fe盐：5mL/L；B5V：5mL/L；蔗糖50g/L；灭菌后加入200μL/Lsilwet-77；调pH至5.7）悬浮至OD600=0.8，将整个花序浸泡到菌液中45s，避光保存24h（隔一周待长出新花序可再转化），然后正常培养到收获种子（T0）。将收获的种子在含有30μg/mL的潮霉素的抗性平板上进行抗性筛选，获得T1代抗性种子。将收获的T1代种子在含有30μg/mL的潮霉素的抗性平板上进行抗性筛选，获得T2代抗性种子。依此类推，得到T4代转基因植株。
进一步对T4代的转基因拟南芥苗进行PCR检测，以转基因拟南芥苗的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为引物1：5’-ATGTTTGGTTCACCGGAATA-3’（序列1的第217-236位）2：5’-CTATCCCTTTCTCTTCTCGA-3’（序列1的第848-867位）。同时设置未转基因的野生型拟南芥作为阴性对照（WT），设置pCAMBIA1300-Gh01399重组表达载体作为阳性对照（P）。
PCR检测结果如图3所示，不同的转基因株系均扩增得到了长度约为651bp的片段。而用同样的引物对转空载体的拟南芥对照植株和野生型拟南芥植株进行PCR检测，均未得到上述扩增片段。此结果表明，所检测的8个（图3泳道ox-1至ox-8）转Gh01399基因株系均为阳性，依次命名为ox-1至ox-8。。
二、转Gh01399基因拟南芥的耐盐性鉴定
以步骤一获得的T4代转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）幼苗为实验材料，以根长和叶绿素含量在盐胁迫处理过程中的生理学变化，对比野生型拟南芥，研究转基因拟南芥的耐盐性。
1、转Gh01399基因拟南芥表型观察
以野生型拟南芥为对照（WT），待转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）和野生型对照植株在MS培养基中生长至7天左右时，将其转移至添加有150mMNaCl的MS培养基，胁迫处理10天后观察植株的表型，所述表型涉及植株长势、根长等因素。同时设置T1代转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥作为另一对照（CK）。实验重复三次，结果取平均值。
表型观察结果如图4所示，T4代转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）与野生型对照植株相比，明显长势较好，根长较长。进一步对根长进行测量统计，结果如图5和表1所示，T4代转Gh01399基因拟南芥ox-1和ox-2根长分别可达26.6mm和27.67mm，明显长于野生型对照植株21.33mm，可见转Gh01399基因植株对盐胁迫的耐受能力明显好于野生型对照植株。另外，T1代转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥植株的检测结果与野生型拟南芥对照植株一致，无显著差异。
表1T1代转基因拟南芥盐胁迫下根长统计结果单位：mm
重复1 重复2 重复3 平均
ox-1 24.6 25.6 29.6 26.6
ox-2 27 30 26 27.67
WT 25 20.6 18.4 21.33
2、转Gh01399基因拟南芥幼苗叶绿素含量测定
生长4周的转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）用350mMNaCl浇灌处理，72小时后采用丙酮浸提法测定其叶绿素含量，并以盐胁迫处理前，即0h的检测结果值作为基值计算叶绿素含量变化。同时设置未转基因的野生型拟南芥植株（WT）和转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥（CK）作为对照。实验重复三次，结果取平均值。
结果如图6、图7和表2所示，在盐胁迫下转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）的叶绿素减少量明显小于野生型拟南芥，说明Gh01399基因的转入，增强了盐胁迫下拟南芥的持绿性。另外，T1代转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥植株的检测结果与野生型拟南芥对照植株一致，无显著差异。随着水分逆境的发展，叶绿体结构受到破坏，叶绿素含量下降，从而使植物光合受到非气孔性抑制是植物受到胁迫的重要生理表现。逆境胁迫下转基因拟南芥的叶绿素含量的减少量明显小于野生型，说明逆境胁迫对转基因拟南芥植株的伤害小于野生型拟南芥。
表2T1代转基因拟南芥盐胁迫下叶绿素减少量统计结果单位：%
重复1 重复2 重复3 平均
ox-1 12.1 18.91 14.60 15.20
ox-2 8.78 2.99 0.38 4.05
WT 28.02 28.52 10.68 22.41
3、转Gh01399基因拟南芥幼苗脯氨酸含量测定
生长4周的转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）用350mMNaCl浇灌处理，72小时后采用酸性水合茚三酮法测定其脯氨酸含量，并以盐胁迫处理前，即0h的检测结果值作为基值计算脯氨酸含量变化。同时设置未转基因的野生型拟南芥植株（WT）和转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥（CK）作为对照。实验重复三次，结果取平均值。
结果如图8、图9和表3所示，在盐胁迫下转Gh01399基因拟南芥（ox-1和ox-2）的脯氨酸积累倍数明显高于野生型拟南芥。另外，T1代转入pCAMBIA1300空载体的拟南芥植株的检测结果与野生型拟南芥对照植株一致，无显著差异。由于脯氨酸所具有的对生物膜结构的保护作用有关，所以转Gh01399基因株系的脯氨酸含量的积累有利于植物在胁迫下的自我保护作用。
表3T1代转基因拟南芥盐胁迫下脯氨酸积累倍数统计结果
重复1 重复2 重复3 平均
ox-1 8.09 5.44 5.03 6.19
ox-2 1.89 6.34 5.63 4.62
WT 1.54 5.75 3.06 3.45

Claims (10)

1.蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)或2)所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列1的第217-867位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。
9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或7或8所述的重组表达载体或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在如下a1)或a2)中的应用：
a1)调控植物抗盐性中的应用；
a2)选育抗盐植物品种；
所述植物为拟南芥或棉花。
10.一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高；
所述植物为拟南芥或棉花。
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