[go: up one dir, main page]

CN111593116A - 一种复发性流产生物标志物及其应用 - Google Patents

一种复发性流产生物标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111593116A
CN111593116A CN202010557587.1A CN202010557587A CN111593116A CN 111593116 A CN111593116 A CN 111593116A CN 202010557587 A CN202010557587 A CN 202010557587A CN 111593116 A CN111593116 A CN 111593116A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circrna
hsa
rsa
htr8
svneo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010557587.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杜美蓉
王松存
李梦蝶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Original Assignee
Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University filed Critical Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority to CN202010557587.1A priority Critical patent/CN111593116A/zh
Publication of CN111593116A publication Critical patent/CN111593116A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种复发性流产生物标志物及其应用，属于生物医学技术领域，该用于诊断复发性流产的环状RNA为hsa_circRNA_100737，其在人早孕期RSA绒毛组织中高表达，通过miR‑28‑5p调控IL‑34的表达，通过miR‑28‑5p‑IL‑34轴影响滋养细胞的增殖、侵袭、成管功能；本发明拟以正常早孕与RSA绒毛组织中差异表达hsa_circRNA_100737为切入点，探讨hsa_circRNA_100737对滋养细胞生物学行为的影响及其机制，研究hsa_circRNA_100737调控滋养细胞功能是否会影响母胎免疫耐受，以期解析RSA发病机制，为RSA等疾病的防治提供新的思路。

Description

一种复发性流产生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种复发性流产生物标志物及其应用。
背景技术
复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指发生3次或3次以上妊娠28周前的胎儿丢失。RSA发生的原因非常复杂、多样，且其发生风险随着流产发生次数的增加而升高，对母婴的健康、家庭和社会的和谐造成了不容小觑的影响。RSA的病因复杂，包括遗传因素、解剖异常、免疫功能异常、感染因素、血栓前状态及社会心理因素等。即便是在辅助生殖技术飞速发展的今天，仍缺乏对之有效的防治策略。做好RSA的防治已经成为目前生殖医学领域中迫切需要解决的问题，而解析引发RSA的分子机制是寻找RSA早期预测与防治的关键，具有重要的理论和临床意义。
成功妊娠是一个极其复杂的生理过程，妊娠时母体与胎儿之间必然存在着复杂的分子对话机制，而母胎界面又是母-胎交互对话的关键部位，该部位主要由三类细胞组成：蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)来源于母体，它是蜕膜的主要细胞，能够分泌多种酶类、激素、细胞因子，调节胎盘的发育和胚泡的着床，并且能作为免疫潜能细胞，参与抗原提呈，在母胎界面发挥重要的免疫调节作用。蜕膜免疫细胞(decidual immune cell,DIC)，它是母胎免疫耐受的细胞基础，通过产生大量的细胞因子和表达特殊的活化标志来发挥与外周不同的免疫调控作用，形成母胎界面特有的免疫微环境。并且蜕膜免疫细胞能调控滋养细胞的生长、分化、侵袭来维持正常的妊娠。来源于胚胎的滋养细胞(trophoblasts，Tros)是唯一直接与母体接触的胎儿细胞，它能够侵袭至母体蜕膜深部，参与子宫螺旋动脉的重铸，胎盘的发育。它携带有父系HLA抗原，却未引起母体对胚胎的免疫排斥，说明滋养细胞是母胎免疫调节和母胎交互对话中的重要角色。而一旦滋养细胞的功能异常，如增殖、侵袭不全，会导致蜕膜螺旋动脉重铸不良，只能到达浅层(蜕膜层)，无法到达肌层，部分血管平滑肌细胞和内皮细胞未完全消失，螺旋动脉管腔未完全扩大，最终导致胎盘灌注不良。滋养细胞功能异常也会引起与DIC、DSC的交互对话异常，母胎免疫调节紊乱，从而发生不良妊娠结局如RSA、子痫前期(Preeclampsia,PE)。
近年来环状RNA(circular RNA)以其独特的环状结构和生物学功能引起了国内外学者的关注。真核生物中主要有两种环状RNA：外显子反向剪切形成的环状RNA(circRNA)和环状内含子RNA(ciRNA)。目前研究最多的环状RNA(circRNA)，通过其前体mRNA的外显子反向剪切，3'末端和5'末端共价结合形成的闭合环状非编码RNA。由于缺乏5’帽结构和3’端的poly(A)尾(外切核酸酶的结合位点)，因此能一定程度抵抗外切核酸酶，在特定组织、细胞中具有稳定的结构和表达。环状RNA具有许多重要的生物学功能，如作为microRNA(miRNA)的海绵调控靶基因的表达；调节自身基因编码转录；与蛋白质相互作用；翻译多肽或蛋白质等。研究证实circRNA参与多种自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展。胚胎植入和肿瘤发生有许多相似之处，然而，关于circRNA在妊娠中的作用研究较少，多集中于在PE患者中的表达变化。干扰circRNA_3286可抑制永生化人早孕绒毛外滋养层细胞HTR8/Svneo的侵袭；CircTRNC18可抑制滋养细胞的迁移和上皮-间质转化，提示circRNA参与调控滋养细胞功能。已有研究表明早孕期正常妊娠绒毛与RSA绒毛circRNA的表达谱不同：Qian等对RSA患者和正常早孕者的绒毛组织进行了circRNA微阵列分析，发现RSA患者绒毛中有335个circRNA表达上调，259个circRNA表达下调。RSA中circRNA的异常表达因何而起，异常表达的circRNA通过何种方式参与RSA的发生发展，目前没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种复发性流产生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
本发明通过circNet、circBank、miRTarBase、clipSearch等多个数据库分析，结合课题组前期正常早孕与RSA患者绒毛组织的RNA-Seq数据，按照circRNA与mRNA在RSA病人中同时上调或下调，筛选到hsa_circRNA_101319、hsa_circRNA_100737、hsa_circRNA_104804等5个目标环状RNA。经RT-qPCR验证，本发明发现hsa_circRNA_100737在RSA患者绒毛组织中显著上调，且真实存在；过表达hsa_circRNA_100737后，HTR8/SVneo的侵袭、增殖、成管能力被抑制，提示hsa_circRNA_100737调控滋养细胞生物学行为可能在RSA的发生发展中具有重要作用。
因此，本发明拟以正常早孕妊娠与RSA绒毛组织中差异表达hsa_circRNA_100737为切入点，探讨hsa_circRNA_100737对滋养细胞生物学行为产生影响及其机制，进一步研究hsa_circRNA_100737调控滋养细胞功能是否影响母胎免疫耐受，以期能够获得RSA发病机制，为RSA等疾病的防治提供新的思路。
为此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于诊断复发性流产的环状RNA，所述环状RNA为hsa_circRNA_100737。
所述hsa_circRNA_100737来源于第11号染色体上的Tollip基因，由Tollip基因的第2-5外显子反向环化而成。
进一步地，所述hsa_circRNA_100737在人早孕期RSA绒毛组织中高表达。
进一步地，所述hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p调控IL-34的表达，通过miR-28-5p-IL-34影响滋养细胞的增殖、侵袭、成管功能。
本发明还提供一种上述的环状RNA作为诊断复发性流产的生物标志物。
本发明还提供一种治疗复发性流产的药物，包括抑制或沉默hsa_circRNA_100737表达的物质。
本发明公开了以下技术效果：
本发明表明，cirRNA100737在人早孕期RSA绒毛中高表达，异常调控滋养细胞的功能，并导致蜕膜免疫细胞表型异常，突破母胎免疫耐受，在RSA发生发展中起重要作用：(1)hsa_circRNA_100737在RSA患者绒毛真实高表达；LPS能上调滋养细胞中hsa_circRNA_100737的表达。(2)hsa_circRNA_100737与miR-28-5p结合，调控IL-34的表达，通过miR-28-5p-IL-34轴抑制滋养细胞的侵袭、增殖、与HUVEC的成管能力。(3)IL-34对蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞表型无直接影响，能够直接调控蜕膜巨噬细胞向M1型极化，不影响M2型相关分子的表达；但IL-34参与了滋养细胞对DIC的训导。(4)hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴异常调控滋养细胞功能，导致蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞功能紊乱，并且使巨噬细胞向M1型极化，破坏母胎界面免疫耐受微环境。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1为早孕和RSA患者绒毛中的hsa_circRNA_100737表达差异图；
图2为hsa_circRNA_100737的验证与反向连接位点；
图3为hsa_circRNA_100737在正常早孕及RSA滋养细胞中的定位；
图4为hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo中的表达及定位；
图5为不同外界刺激对HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737表达的调节；
图6为过表达或干扰hsa_circRNA_100737对HTR8/SVneo生物学行为的影响；
图7为hsa_circRNA_100737对IL-34的表达调控；
图8为hsa_circRNA_100737通过影响miR-28-5p-IL-34轴来调控HTR8/SVneo的生物学行为。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，一般按照试剂商所建议的条件与步骤进行，下列实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，一般均为商购或通过常规标准方法制备。
本发明中收集的样本均通过复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准并且获得了患者本人的同意。
人早孕期(7-12周)正常流产绒毛组织、RSA绒毛组织取自复旦大学附属妇产科医院黄浦院区计划生育门诊手术室。正常妊娠入选标准：既往无自然流产和异常生育史；本次妊娠无阴道流血、无发热、无腹痛及其他明显不适；术前检查无阴道感染及其他；超声检查示原始心管搏动(+)且未见双侧附件肿块、宫腔积液及其他异常。RSA标准：指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上妊娠24周前的胎儿丢失。排除感染、发热、染色体异常、解剖畸形、外伤等。以上两类人群均没有过敏病史和过敏性家族史。
将上述收集的绒毛组织放置于装有10ml DMEM高糖培液和100ul抗生素的50ml离心管中，放于制冷保温盒中保存。一小时内回到实验室进行滋养细胞分离、提组织RNA、提组织蛋白等。
实施例1hsa_circRNA_100737在正常早孕绒毛和复发性流产绒毛中的表达及调节
1、实验方法
1.1提取HTR8/SVneo、绒毛组织RNA
1)将收集的绒毛组织倒入装有无菌PBS的培养皿中，用眼科镊尽量去除血块、绒毛膜及粗的绒毛干，收集绒毛柱。将收集的绒毛组织称重，每25mg加入1ml Triozol,于组织匀浆器中充分匀浆2min，4℃、4000rpm×10min离心，取上清液放进干净的1.5ml EP管中，进行步骤3。
2)吸去6孔板/12孔板中处理好的HTR8/SVneo的上清，用PBS轻柔地洗3次，去除多余液体。加入1ml Triozol，温和吹打十余下，使细胞充分裂解，再将液体转移至1.5ml EP管中，进行步骤3。
3)加200ul氯仿，上下颠倒几十次，室温静置15min，待分层后，4℃、12000rpm×10min。
4)小心吸出上层水相，至另一干净的1.5mlEP管中，加入500ul异丙醇，快速上下颠倒几十次，室温静置10min。随后4℃、12000rpm×10min，弃上清。
5)加入1ml预冷的75％乙醇，漩涡振荡10s后，4℃、12000rpm×5min，弃上清。
6)将EP管至于通风橱内，室温晾干5-10min，加入20ul DEPC水，使沉淀溶解。
7)用Nanodrop仪器检测RNA总浓度、纯度(A260/A280＝1.8-2.0)。
1.2逆转录、Real Time-quantitative PCR(RT-qPCR)
1)根据Takara逆转录说明书(RR036A)进行逆转录反应
根据以下配方配制逆转录反应液。为了控制损失量，先将以下试剂按实际管数+2预混，再分别加入到每管中。反应条件37℃×15min，85℃×5s，4℃保存。
Figure BDA0002544843950000051
*进行circRNA逆转录时，不加入Oligo dT Primer，用ddH2O补齐至10ul，其他试剂使用量不变。
2)根据翌圣逆转录试剂盒进行real-time PCR反应
引物序列如下表(由上海生物工程股份有限公司合成)：
Figure BDA0002544843950000052
Figure BDA0002544843950000061
根据下列组份配制PCR反应液。为了控制损失量，减少分装的误差，先将以下组分按实际管数+2预混，再分别加入到每管中。反应体系:
Figure BDA0002544843950000062
反应程序:预变性95℃5min-【变性95℃10s-退火/延伸60℃30s】40个循环-4度
1.3荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)检测hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo和绒毛组织上的表达和定位
HTR8/SVneo：
1)细胞处理：提前一天将细胞爬片至于12孔板中，每孔加入1×105/ml HTR8/SVneo，于37℃、5％CO2培箱中培养24h。
2)细胞爬片固定：在孔板中加入1ml 4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3×5min。
3)预杂交：滴加预杂交液37°恒温箱1h。
4)探针稀释：hsa_circRNA_100737FISH探针用杂交液稀释，稀释比例为1：100(hsa_circRNA_100737FISH探针信息如下：5’FITC-accgatgtacacctgtgatgggca-3’FITC)
5)杂交：去除预杂交液，每孔加杂交液200ul(含有探针hsa_circRNA_100737)，37℃孵育避光过夜。
6)杂交后洗涤：2×SSC，37℃洗10min，1×SSC，37℃洗2×5min，0.5×SSC 37°洗10min。若非特异杂交体较多，背景较脏可以增加甲酰胺洗涤。
7)DAPI复染核：滴加DAPI染液(1：1000PBS稀释)，以没过爬片为准。避光孵育1min，PBS冲洗3×5min。用小针头取出孔板中的爬片，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。
8)镜检拍照：爬片于共聚焦显微镜下观察并拍照。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm)。
绒毛组织切片:
1)将绒毛组织石蜡切片提前放入62℃烤箱烤片2h。
2)脱蜡至水：依次将切片放入1号二甲苯15min-2号二甲苯15min-无水乙醇5min-85％乙醇3min-75％乙醇3min-55％乙醇3min，放入DEPC水中摇床洗涤3min。
3)抗原修复：先将抗原修复液在微波炉高火煮沸5分钟，再放入切片中火15min，室温自然冷却。
4)消化：用免疫组化笔画圈包围整个组织，滴加适量蛋白酶K(20ug/ml)，没过组织即可，37℃消化8min。纯水冲洗1次后PBS洗3次×5min。
5)接下来根据HTR8/SVneo细胞步骤3-8。
1.4RNA核质分离实验检测hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo中的核质比例
1)吸去小培瓶中HTR8/SVneo的上清，用PBS轻柔地洗3次，去除多余液体。
2)向小培瓶中加入500ul胞浆提取缓冲液，置于冰上5-10min充分裂解。
3)枪头吹打十几下后转移到干净的1.5ml EP管中，漩涡震荡15s，37℃14000rpm×5min。
4)小心吸出上清液至新的1.5ml EP管中。新、旧EP管均加入1ml Trizol，温和吹打十余下，使细胞充分裂解。
5)加200ul氯仿，上下颠倒几十次，室温静置15min，待分层后，4℃、12000rpm×10min。
6)小心吸出上层水相，至另一干净的1.5mlEP管中，加入500ul异丙醇，快速上下颠倒几十次，室温静置10min。随后4℃、12000rpm×10min，弃上清。
7)加入1ml预冷的75％乙醇，漩涡振荡10s后，4℃、12000rpm×5min，弃上清。
8)将EP管至于通风橱内，室温晾干5-10min，加入20ul DEPC水，使沉淀溶解。
9)用Nanodrop仪器检测RNA总浓度、纯度(A260/A280＝1.8-2.0)。
1.5提取HTR8/SVneo中的gDNA(根据QIAGEN提DNA试剂盒)
1)提前一天将细胞爬片置于6孔板中，每孔加入4×105/ml HTR8/SVneo，于37℃、5％CO2培箱中培养24h。
2)弃去上清液，PBS洗3次后，0.25％胰酶消化45s，加入2ml含10％FBS完全培养基轻柔吹打。收集至15ml离心管，1500rpm×5min，去上清，加入200ulPBS重悬，移至2mlEP管中。
3)加入40μl QIAGEN蛋白酶K和200ul Buffer AL，漩涡震荡15s，56℃水浴锅孵育10min。
4)瞬时离心5s后，在样本中加入200ul无水乙醇，漩涡震荡15s。
5)将(4)中得混合物加入到QIAamp Mini spin柱中，8000rpm×1min，弃去液体。
6)向QIAamp Mini spin柱加入500ul Buffer AW1，8000rpm×1min，弃去液体。
7)向QIAamp Mini spin柱加入500ul Buffer AW2,14000rpm×3min，弃去底部管子和液体，将QIAamp Mini spin柱放到新的干净的1.5ml EP管中。
8)向QIAamp Mini spin柱加入200ul Buffer AE，室温静置1min，8000rpm×1min，保留液体。
9)在Nanodrop仪器上检测DNA浓度和纯度(A260/A280＝1.7-1.9)。
1.6琼脂糖凝胶电泳验证hsa_circRNA_100737真实存在
1)称取0.3g琼脂糖置于50ml的离心管中，加入30ml 1×TBE，再将离心管置于装有50ml水的玻璃烧杯中。
2)将玻璃烧杯放入微波炉中，高火5min，形成1％的琼脂糖液体。
3)用清水清洗制胶板后，在制胶板的固定位置放好梳子。
4)在煮沸的琼脂糖胶液加入3ul 1×核酸染料，小心混匀后倒入制胶板上，室温下静置30min直至琼脂糖胶液完全凝固。
5)将凝胶放入电泳槽内，并在电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液至没过凝胶。
6)将2ul 5×上样缓冲液和10ulDNA样品混合充分，依次在胶板上加入DNAmarker、预混的DNA样品。
7)通电电压100V，使样品由黑色的负极向红色的正极移动，当溴酚蓝移动至胶板一半位置以下时(约40-60min)，停止电泳。
8)取出琼脂凝胶在凝胶成像系统用紫外线照射观察，并拍照保存。
1.7 RNase R处理HTR8/SVneo总RNA后，RT-qPCR、琼脂糖凝胶电泳检测hsa_circRNA_100737、Tollip、GAPDH的表达变化
1)取2.5ug HTR8/SVneo总RNA至1.5mlEP管中，加入10ul reaction buffer和10U的RNase R(20U/ul)，37℃水浴30min。
2)72℃水浴10min使RNase R失活。
3)再根据上述RT-qPCR、琼脂糖凝胶电泳步骤进行检测。
1.8不同外界刺激对HTR8/SVneo表达hsa_circRNA_100737的影响
将5×104/孔的HTR8/SVneo种植于12孔板中，在37℃、5％CO2培箱中培养24h后换无血清培液饥饿12h。再重新换成含10％FBS的F12完全培养基后分别用0.1-100ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，1-10000ng/ml地塞米松(dexamethasone,DEX)、1-1000ng/ml去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、50-200nM低氧模拟剂(CoCl2)、低氧小室处理48h。RT-qPCR检测hsa_circRNA_100737的表达变化。
2、统计分析
本部分数据采用SPSS15.0及Graphpad Prism 7.0软件进行统计处理。根据每组数据内容是否符合配对及方差齐性、正态分布等采用Mann-Whitney秩和检验、One-WayANOVA、配对t检验分析。统计分析结果以mean±SEM(均数±标准差)表示。P<0.05为结果有统计学意义。
3、结果
3.1正常早孕绒毛组织和RSA绒毛组织中circRNAs的表达
本发明首先通过多个数据库，并结合前期正常早孕与RSA患者绒毛组织的RNA-Seq数据，按照circRNA与mRNA在RSA病人中同时上调或下调原则，筛选出5个目标circRNAs，继而进行RT-qPCR验证发现hsa_circRNA_100737在早孕和RSA患者绒毛中的表达差异最大，如图1所示。
3.2验证hsa_circRNA_100737的真实存在与反向连接位点
为了进一步验证hsa_circRNA_100737真实存在，本发明通过RT-PCR琼脂糖凝胶电泳发现hsa_circRNA_100737能在cDNA中被反向引物扩增，而在gDNA中不被扩增，如图2A，并且通过Sanger测序检测PCR产物，验证了hsa_circRNA_100737的反向连接位点，如图2B。RNase R处理后Tollip(hsa_circRNA_100737对应的线性RNA)和GAPDH表达量明显下降，hsa_circRNA_100737的表达量没有明显变化，进一步说明了hsa_circRNA_100737的存在及其具有比线性RNA更加稳定的特性，如图2C、D。
3.3 Hsa_circRNA_100737在正常早孕及RSA滋养细胞中的定位
由于circRNA在细胞中的位置不同发挥的作用也不同，因此本发明检测了绒毛组织中hsa_circRNA_100737的定位。FISH结果表明hsa_circRNA_100737大部分位于正常早孕及RSA滋养细胞的胞质中，如图3A。并且hsa_circRNA_100737在正常早孕各类滋养细胞中均有表达：绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast，EVT)表达最高，合体滋养细胞(syncytiotrophoblast，ST)其次，细胞滋养细胞(cytotrophoblast，CT)表达最少，如图3B。
3.4 Hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo中的表达及定位
本发明进一步在HTR8/SVneo中检测hsa_circRNA_100737的表达和定位，FISH实验表明hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo中有表达，且大部分位于胞质。同时核质分离实验也显示hsa_circRNA_100737大部分位于胞质(75％)，少量位于胞核(25％)，如图4A、B。由于原代滋养细胞提取量较少，细胞转染困难，后续部分实验本发明用永生化人绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo代替原代滋养细胞。
3.5不同外界刺激对HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737表达的调节
从上述结果可知hsa_circRNA_100737在RSA绒毛组织中高表达，且真实存在，本发明进一步探讨滋养细胞中hsa_circRNA_100737表达上调的可能原因。由于母体应激状态，母-胎界面促炎因子释放增多都将会导致RSA的发生。因此猜测LPS，与应激相关激素(DEX、NE)、过度缺氧等可能会影响滋养细胞hsa_circRNA_100737的表达。本发明将HTR8/SVneo饥饿处理12h后，用不同浓度的LPS、DEX、NE、低氧模拟剂及低氧小室处理48h，利用RT-qPCR检测HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737的水平。发现除了LPS能上调HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737的的表达，如图5A，其余刺激对hsa_circRNA_100737几乎没有影响，如图5B-D。
4、结论
本发明收集的RSA病人首先排除了遗传因素、解剖结构的异常、免疫功能异常、感染等因素，并且将年龄、流产次数、用药状态控制变量。将研究重心聚焦于正常绒毛组织与RSA绒毛组织中circRNA的表达差异，以及这种差异对滋养细胞的功能是否有影响。本发明通过查阅文献、分析多个数据库，结合前期正常早孕与RSA患者绒毛组织的RNA-Seq数据，按照circRNA与mRNA在RSA病人中同时上调或下调，筛选到hsa_circRNA_101319、hsa_circRNA_100737、hsa_circRNA_104804等5个目标circRNA。经RT-qPCR验证，发现hsa_circRNA_100737在RSA患者绒毛组织中显著上调，且真实存在，说明了hsa_circRNA_100737的高表达可能与RSA等妊娠结局高度相关。
由于原代绒毛外滋养细胞提取困难，细胞量较少，细胞脆弱，难以承受后续转染实验带来的伤害，并且hsa_circRNA_100737在各滋养细胞上的表达如下：绒毛外滋养细胞表达最高，合体滋养细胞其次，细胞滋养细胞最少。故本发明部分内容用永生化的人绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo代替原代绒毛外滋养细胞。HTR8/SVneo来源于人正常早孕期胎盘(6-12周)：原代绒毛外滋养细胞被分离纯化后继续培养5-15代，获得母代HTR8细胞，再将人猿病毒40T抗原基因(SV40 Tag)转染至母代HTR8细胞中，使其具有永生化的特性，最后获得HTR8/SVneo。本发明证明了HTR8/SVneo中也有hsa_circRNA_100737的表达，并且它的定位与滋养细胞中的相同(若定位不同，发挥的功能不同)。
从上述结果可知hsa_circRNA_100737在RSA绒毛组织中高表达，且真实存在，本发明进一步探讨滋养细胞中hsa_circRNA_100737表达上调的可能原因。革兰氏阴性菌细胞壁上的LPS，能通过与Toll样受体结合，在炎症反应和先天免疫中发挥重要作用。正常妊娠时，母胎界面处于Th2型偏移，而LPS引起促炎因子增加，使母胎免疫耐受状态失衡，导致RSA。LPS导致小鼠胚胎吸收率增加，促进小鼠外周单核细胞及蜕膜免疫细胞表达促炎因子TNF-α、INFγ、IL-1β。孕妇体内与应激相关的激素升高也会导致流产的发生。高剂量的DEX能增加小鼠的胚胎吸收率,使胎盘重量、直径减小,降低了孕激素、17β-雌二醇水平。妊娠早期绒毛外滋养细胞侵入子宫间质及子宫的螺旋动脉，形成细胞栓样团块，阻止妊娠前几周母体血液过多向胎儿运输，因此妊娠前期母胎界面处于相对缺氧的状态，但持续的过度缺氧对妊娠是不利的。因此本发明用不同浓度的LPS，DEX，NE，低氧模拟剂及低氧小室处理HTR8/SVneo，发现HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737的表达随LPS浓度增加而升高，但不受DEX，NE，低氧模拟剂浓度变化的影响。
综上，本发明证实了RSA绒毛中高表达circRNA10073及其真实存在，并且发现hsa_circRNA_100737主要位于滋养细胞的胞质中。进一步研究表明LPS可上调HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737的表达。这为探讨RSA发病提供新的方向，为探究RSA的发病机制打下基础。
实施例2Hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴负调控滋养细胞生物学行为
1、实验方法
利用数据库、生信分析等预测绒毛中hsa_circRNA_100737-miR-28-5p-IL-34互作网络。收集正常早孕绒毛和RSA绒毛，RT-qPCR、Western Blot检测miR-28-5p、IL-34、IL-34受体(CSF1R)的表达水平。双荧光素酶实验验证hsa_circRNA_100737和miR-28-5p、miR-28-5p和IL-34的相互作用。FISH实验检测hsa_circRNA_100737、miR-28-5p在HTR8/SVneo和绒毛组织上的共定位。在HTR8/SVneo细胞中逐层干扰或过表达hsa_circRNA_100737-miR-28-5p-IL-34轴，流式细胞术检测MMP9、ki67的表达，Transwell侵袭实验检测HTR8的侵袭能力，EdU细胞增殖实验检测HTR8/SVneo的增殖能力，小管实验检测HTR8/SVneo或其上清对HUVEC的成管能力影响，Western blot检测HTR8/SVneo中IL-34活化的下游信号通路，以期分析hsa_circRNA_100737对滋养细胞增殖、侵袭、成管能力的调控及机制。
2、结果
过表达或干扰HTR8/SVneo中的hsa_circRNA_100737，能抑制或促进HTR8/SVneo增殖、侵袭、与HUVEC的成管能力，如图6所示，其中A为RT-qPCR检测hsa_circRNA_100737过表达/干扰效率，B、C为过表达/干扰hsa_circRNA_100737后，能够降低/升高HTR8/SVneo中侵袭分子基质金属蛋白酶9(MMP9)，增殖抗原ki67(ki67)的水平，D表明过表达/干扰了HTR8/SVneo中的hsa_circRNA_100737，能够抑制/促进HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力，E表示过表达/干扰hsa_circRNA_100737对Tollip(hsa_circRNA_100737的对应线性RNA)的表达没有影响，确保HTR8/SVneo生物学行为的改变来源于hsa_circRNA_100737。
IL-34及其受体CSF1R在RSA绒毛中的表达高于正常绒毛组织，如图7A、B。Hsa_circRNA_100737的表达升高/降低会导致HTR8/SVneo中IL-34的表达升高/降低，如图7C、D。
外源性加入IL-34能够抑制HTR8/SVneo的增殖、侵袭及其与HUVEC的成管能力，而加入IL-34或CSF1R的中和性抗体后，能够逆转IL-34对HTR8/SVneo生物学行为的抑制作用，IL-34可以通过活化HTR8/SVneo内Erk1/2及p-38/MAPK信号通路抑制滋养细胞的增殖，同时活化Erk1/2信号通路抑制滋养细胞的侵袭。证实hsa_circRNA_100737可能通过IL-34调控HTR8/SVneo的生物学行为。
Hsa_circRNA_100737和miR-28-5p在HTR8/SVneo和绒毛组织上存在共定位，且两者相互结合。过表达/干扰miR-28-5p，能够促进/抑制HTR8/SVneo增殖、侵袭、与HUVEC成管能力；并且过表达或干扰miR-28-5p能够逆转过表达或干扰hsa_circRNA_100737表达的改变对HTR8/SVneo增殖、侵袭与HUVEC成管能力产生的影响，证明了hsa_circRNA_100737通过影响miR-28-5p的功能来调控HTR8/SVneo的生物学行为。
MiR-28-5p能与IL-34相互结合。并且过表达/干扰miR-28-5p，HTR8/SVneo中IL-34的表达相应下降/升高。给予外源性IL-34或IL-34中和性抗体、CSF1R的中和性抗体，能够逆转过表达或干扰miR-28-5p对HTR8增殖、侵袭、与HUVEC成管能力产生的影响，证明了IL-34是miR-28-5p的下游靶基因，miR-28-5p通过影响IL-34的表达来调控HTR8/SVneo的生物学行为。
Hsa_circRNA_100737通过影响miR-28-5p-IL-34轴来调控HTR8/SVneo的生物学行为。Western blot实验表明在HTR8/SVneo中过表达/干扰miR-28-5p后，IL-34的蛋白水平下降/升高，如图8A，且双荧光素酶实验证实了miR-28-5p和IL-34两者相结合，如图8B。流式细胞术、成管实验显示miR-28-5p-oe组/miR-28-5p-RNAi组相较ctrl组来说，MMP9、ki67水平、HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力升高/降低，接着分别加入IL-34(100ng/ml)/anti-IL-34(1000ng/ml)或anti-CSF1R(1000ng/ml)后，发现MMP9、ki67水平、HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力恢复了，让图8C、D。说明IL-34是miR-28-5p的靶基因，且miR-28-5p通过IL-34影响HTR8/SVneo生物学行为。
在HTR8/SVneo中过表达/干扰hsa_circRNA_100737，发现MMP9、ki67水平、HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力降低/升高，分别再加入miR-28-5p-oe/miR-28-5p-RNAi后，MMP9、ki67水平、HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力又上升高/下降(较hsa_circRNA_100737-oe组/hsa_circRNA_100737-RNAi组)，接着继续分别加入IL-34(100ng/ml)/anti-IL-34(1000ng/ml)或anti-CSF1R(1000ng/ml)，发现MMP9、ki67水平、HTR8/SVneo与HUVEC的成管能力又发生逆转(降低/升高)，如图8E、F。因此证实了hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34来影响HTR8/SVneo的生物学行为。
3、结论
实施例2证实了hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴抑制HTR8/SVneo的增殖和侵袭，及其与HUVEC的成管能力，而IL-34通过自身受体CSF1R，激活Erk1/2通路抑制HTR8/SVneo的侵袭，激活Erk1/2、p-38通路抑制HTR8/SVneo的增殖。意味着hsa_circRNA_100737可能是RSA的新的生物学标志物，为防治RSA带来了新的策略和靶标。
实施例3Hsa_circRNA_100737-miR-28-5p-IL-34调控滋养细胞功能进而影响母-胎免疫耐受
1、实验方法
用外源性的IL-34直接处理蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞，或用IL-34处理后的HTR8/SVneo上清与蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞共培养；流式细胞术检测各组细胞的转录因子、细胞因子及功能性分子的水平。
上调或下调HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737-miR-28-5p-IL-34轴，再取其上清与蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞共培养，流式细胞术检测免疫细胞的转录因子、细胞因子及功能性分子的水平。
2、结果
IL-34直接处理蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞，T细胞表型功能无明显变化，巨噬细胞表达更多的CD80、TNF-α等M1相关细胞因子。HTR8/SVneo上清可诱导免疫细胞呈现免疫耐受表型，释放更多的抑炎性因子，更少的促炎性因子。但IL-34处理后的HTR8/SVneo上清使蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞表达更多的Th1型转录因子、细胞因子，更少的Th2型转录因子、细胞因子、共刺激抑制分子，并使蜕膜巨噬细胞向M1型极化。
过表达HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴能够降低CD4+T细胞中Tim-3、IL-4水平、升高INF-γ、T-bet水平；干扰HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴能够升高CD4+T细胞中Tim-3、IL-4水平。过表达HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴能够升高CD8+T细胞中INF-γ、T-bet水平；过表达HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴能够降低巨噬细胞中CD163、CD206、pSTAT6，升高CD80、CD86水平；干扰hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴能够升高巨噬细胞细胞中CD163、CD206，降低CD86。
3、结论
实施例3表明，hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p-IL-34轴使滋养细胞的功能异常，从而促进蜕膜CD4+T细胞、蜕膜CD8+T细胞产生更多的促炎分子，更少的抑炎性分子，并且使巨噬细胞向M1极化，破坏母胎界面母胎免疫耐受状态。并且IL-34能够直接调控蜕膜巨噬细胞向M1型极化，分泌促炎性因子。但hsa_circRNA_100737与IL-34虽同样能抑制滋养细胞增殖、侵袭、成管的功能，但对母胎界面的免疫细胞调节及细胞因子释放仍有一定区别。可能是由于过表达hsa_circRNA_100737后增加的IL-34的量与直接外源性加入100ng/ml IL-34仍有一定区别，以及滋养细胞中hsa_circRNA_100737可能存在其他靶标同时影响滋养细胞功能，从而调节母胎免疫耐受微环境。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于诊断复发性流产的环状RNA，其特征在于，所述环状RNA为hsa_circRNA_100737。
2.根据权利要求1所述的用于诊断复发性流产的环状RNA，其特征在于，所述hsa_circRNA_100737在人早孕期RSA绒毛组织中高表达。
3.根据权利要求1所述的用于诊断复发性流产的环状RNA，其特征在于，所述hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p调控IL-34的表达，通过miR-28-5p-IL-34轴影响滋养细胞的增殖、侵袭、成管功能。
4.一种权利要求1-3任一项所述的环状RNA作为诊断复发性流产的生物标志物。
5.一种治疗复发性流产的药物，其特征在于，包括抑制或沉默hsa_circRNA_100737表达的物质。
CN202010557587.1A 2020-06-18 2020-06-18 一种复发性流产生物标志物及其应用 Pending CN111593116A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010557587.1A CN111593116A (zh) 2020-06-18 2020-06-18 一种复发性流产生物标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010557587.1A CN111593116A (zh) 2020-06-18 2020-06-18 一种复发性流产生物标志物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111593116A true CN111593116A (zh) 2020-08-28

Family

ID=72184774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010557587.1A Pending CN111593116A (zh) 2020-06-18 2020-06-18 一种复发性流产生物标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111593116A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961913A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 山东大学第二医院 lncRNA在复发性流产诊治中的应用
CN113106154A (zh) * 2021-04-16 2021-07-13 上海市第一妇婴保健院 Prmt3在诊断或治疗复发性自然流产中的应用
CN114047336A (zh) * 2021-12-13 2022-02-15 大连医科大学 一种用于辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424963A (zh) * 2018-06-12 2018-08-21 山东省医学科学院基础医学研究所 血清中circ_0079591作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用
CN108707659A (zh) * 2018-06-12 2018-10-26 山东省医学科学院基础医学研究所 血清中LncRNA作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424963A (zh) * 2018-06-12 2018-08-21 山东省医学科学院基础医学研究所 血清中circ_0079591作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用
CN108707659A (zh) * 2018-06-12 2018-10-26 山东省医学科学院基础医学研究所 血清中LncRNA作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961913A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 山东大学第二医院 lncRNA在复发性流产诊治中的应用
CN112961913B (zh) * 2021-02-05 2021-10-22 山东大学第二医院 lncRNA在复发性流产诊治中的应用
CN113106154A (zh) * 2021-04-16 2021-07-13 上海市第一妇婴保健院 Prmt3在诊断或治疗复发性自然流产中的应用
CN113106154B (zh) * 2021-04-16 2022-10-25 上海市第一妇婴保健院 Prmt3在诊断或治疗复发性自然流产中的应用
CN114047336A (zh) * 2021-12-13 2022-02-15 大连医科大学 一种用于辅助诊断复发性流产的生物标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuan et al. PCOS follicular fluid derived exosomal miR-424-5p induces granulosa cells senescence by targeting CDCA4 expression
Baczyk et al. Complex patterns of GCM1 mRNA and protein in villous and extravillous trophoblast cells of the human placenta
US10400282B2 (en) Methods employing circulating DNA and miRNA as biomarkers for female infertility
Li et al. Analysis of pregnancy outcomes in patients with recurrent implantation failure complicated with chronic endometritis
Li et al. miR‐21 and Pellino‐1 Expression Profiling in Autoimmune Premature Ovarian Insufficiency
Salmasi et al. MicroRNAs, endometrial receptivity and molecular pathways
CN111593116A (zh) 一种复发性流产生物标志物及其应用
Szuszkiewicz et al. Early steps of embryo implantation are regulated by exchange of extracellular vesicles between the embryo and the endometrium
Cheng et al. NLRP3 promotes endometrial receptivity by inducing epithelial–mesenchymal transition of the endometrial epithelium
Wang et al. LncRNA‐GAS5 related to the processes of recurrent pregnancy loss by regulating Th1/Th2 balance
Zhang et al. Exosomal microRNAs in tubal fluid may be involved in damage to tubal reproductive function associated with tubal endometriosis
Ye et al. miR-146a-5p improves the decidual cytokine microenvironment by regulating the toll-like receptor signaling pathway in unexplained spontaneous abortion
Liu et al. miR-466 and NUS1 regulate the AKT/nuclear factor kappa B (NFκB) signaling pathway in intrauterine adhesions in a rat model
Zhang et al. Long non-coding RNA PWRN1 affects ovarian follicular development by regulating the function of granulosa cells
Gholipour et al. Investigation of the effect of seminal plasma exosomes from the normal and oligoasthenoteratospermic males in the implantation process
CN111500587A (zh) Pgr作为治疗子宫内膜异位症的产品中的用途及其检测pgr的试剂盒
Huang et al. Circular RNA SESN2 aggravates gestational trophoblast cell damage induced by high glucose by binding to IGF2BP2
CN120843665A (zh) circ_0005704及其相关生物元件在原因不明复发性自然流产诊治中的应用
Xu et al. MicroRNA-338-3p helps regulate ovarian function by affecting granulosa cell function and early follicular development
CN117965712B (zh) T-5224在制备逆转卵巢衰老药物中的应用
CN117683883B (zh) miR-126-5p在不明原因复发性自然流产诊治中的应用
Pan et al. Non-coding RNAs: the architects of placental development and pregnancy success
Xu et al. MIR503HG silencing promotes endometrial stromal cell progression and metastasis and suppresses apoptosis in adenomyosis by activating the Wnt/β‑catenin pathway via targeting miR‑191
Zhang et al. lncRNA CLRN1-AS1 reduces adhesion ability of human trophoblasts via CXCL10/CXCL11
Wang et al. A decade of discovery: the stunning progress of premature ovarian insufficiency research in China

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200828