CN111500587A

CN111500587A - Pgr作为治疗子宫内膜异位症的产品中的用途及其检测pgr的试剂盒

Info

Publication number: CN111500587A
Application number: CN202010292607.7A
Authority: CN
Inventors: 李丽丽; 刘佳利; 黄娅
Original assignee: Hunan Keyu Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Keyu Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了一种用于治疗子宫内膜异位症的蛋白标志物，具体的所述蛋白为PGR。本发明公开了PGR基因在制备在制备治疗子宫内膜异位症的产品中的用途。本发明同时公开了一种治疗子宫内膜异位症的药物组合物和一种评价PGR基因表达水平的试剂盒。本发明的药物组合物对子宫内膜异位症有较好的抑制作用，在子宫内膜异位症治疗中具有重要的参考和现实意义。本发明的试剂盒能够作为PGR基因表达水平的评价手段之一，对PGR作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

Description

PGR作为治疗子宫内膜异位症的产品中的用途及其检测PGR的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种与子宫内膜异位症相关的蛋白及其在子宫内膜异位症中的应用，所述的蛋白为PGR。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

子宫内膜异位症(Endometriosis syndrome，EMS)一种常见妇科疾病，发病部位位于卵巢和腹膜。发病原因是由于输卵管将活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外(如盆腔)的位置导致。在育龄女性中，EMS患病率约为10％-15％，在青春期前和绝经后基本不出现患者。子宫内膜异位症的主要病理变化为异位内膜周期性出血及其周围组织纤维化，形成异位结节。患者易出现痛经、慢性盆腔痛、月经异常和不孕等症状。子宫内膜异位症的病因较复杂，目前研究者们大多认为子宫内膜种植是患病的原因。此外，有文献报道子宫内膜异位症是恶性肿瘤的前兆，会显著增加卵巢癌的发病率。然而，子宫内膜异位症也可做到主动预防：如在适合年龄婚育、药物避孕、防止经血逆流、防止医源性子宫内膜异位症的发生。目前，子宫内膜异位症的治疗手段主要包括药物治疗和手术治疗，治疗药物可以采用镇痛药和激素类药物。然而，这些治疗通常伴随着较大的副作用，往往只能起到短期缓解的作用而不能根治。因此，需要开发新的治疗方法来改善子宫内膜异位症患者的预后。

近年来，表观遗传特征在子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells，ESCs)中的治疗潜力引起了重要的关注，尤其是其与转录因子和信号通路的相互作用成为研究者们关注的重点。有文献报道，孕激素受体(progesterone receptor，PGR)在子宫内膜异位症中可能有一定的作用，但具体的机制并不清楚。这说明孕激素受体在子宫内膜异位症进展中具有巨大的潜在意义。孕激素受体是一种配体依赖转录因子核受体，主要在女性生殖组织和中枢神经系统中表达，其有两种亚型PRA和PRB，也是女性生殖组织的主要调节因子。它的主要作用是通过与同源类固醇激素黄体酮结合，调节基因网络的表达，从而控制内分泌类癌症靶组织的发育、分化、增殖和病理过程。孕激素受体在内分泌依赖性乳腺癌中也起着重要的作用。

在子宫内膜间质细胞中，局部TGF-β1信号可以通过抑制孕激素受体的表达来增强黄体酮的消退，并可能通过抑制DKK(Wnt antagonist Dickkopf-1)来诱导wnt信号来协调与月经相关的组织重构。此外，在亚临床子宫内膜炎和临床子宫内膜炎中均观察到TGIF1(TGF-β-induced factor 1)的表达发生显著改变，提示TGIF1在子宫内膜异位症发展中可能有重要的意义和作用。在子宫肌层细胞中，TGIF为一个潜在的TGF-β信号通路的抑制因子，其能够抑制TGF-β的表达。此外，TGIF1在亚临床子宫内膜炎和临床子宫内膜炎中的表达模式均有显著改变，说明了TGIF1在子宫内膜异位症的发展中可能有重要意义和作用。更重要的是，FBXW7(F-box and WD repeat domain containing 7)能够靶向TGIF1以调节TGF-β信号通路。FBXW7又称为 Sel10、hCDC4或hAgo，以其抑癌作用和包括Notch在内的蛋白酶体介导的癌蛋白降解能力而闻名。FBXW7蛋白为F-box蛋白家族的成员，是SCF E3泛素连接酶(Skp1-Cullin1-F-box)复合物的重要组成部分之一，该复合物通过泛素-蛋白酶体系统促进多种癌蛋白的降解，进而介导细胞生长。值得注意的是，据报道子宫内膜活检中有FBXW7的突变，这表明FBXW7在作为预测子宫内膜癌发生中有重要的潜在应用价值。因此，我们推测孕激素受体可能通过与 TGIF1和FBXW7的相互作用参与了子宫内膜异位症的发生和发展，另外，孕激素受体和/或 FBXW7可能作为子宫内膜异位症的一个检测和/或治疗靶标。本发明通过体内和体外实验从分子机制和应用方面证实了这一推测。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种蛋白标志物在筛选治疗子宫内膜异位症的候选药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种评价该蛋白表达水平的试剂盒。

为了研究与子宫内膜异位症相关的蛋白在子宫内膜异位症中的作用，从而筛选合适的蛋白。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从子宫内膜异位综合症组织中找到了可以作为子宫内膜异位症标志物的PGR。

因此，本发明一方面本发明根据PGR基因的用途，提供了一种PGR基因在制备治疗子宫内膜异位症的产品中的用途。

优选地，本发明所述的PGR基因如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本发明所述的PGR的靶基因为FBXW7。

优选地，本发明所述的PGR抑制FBXW7基因的表达，从而抑制TGF-β信号通路的激活。

再一方面，本发明提供了一种治疗子宫内膜异位症的药物组合物，所述药物组合物包括 PGR基因。

优选地，本发明所述的药物组合物为含有PGR基因的质粒。

再一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测PGR基因表达水平的试剂。

优选地，所述试剂为特异性扩增PGR基因的引物。

优选地，所述特异性扩增PGR基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明通过生物信息学和现有分子生物学的技术手段，从子宫内膜异位症组织中筛选到用于子宫内膜异位症治疗的标志物PGR(PGR在子宫内膜异位症组织中低表达)。在此基础上，本发明一方面提供了一种PGR基因在制备治疗子宫内膜异位症的产品中的用途；再一方面，本发明还提供了一种基于PGR基因的用于治疗子宫内膜异位症的药物组合物；再一方面，本发明还提供了一种检测PGR基因表达水平的试剂盒。本发明的PGR基因及其药物组合物对子宫内膜异位症有较好的抑制作用，在子宫内膜异位症治疗中具有重要的参考和现实意义。另外，本发明提供的检测PGR基因的试剂盒在PGR作为药物组合物应用于子宫内膜异位症治疗时，对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供了很好的帮助，对PGR作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

附图说明

其中*表示P<0.05，具有显著性差异。

图1 PGR在子宫内膜异位症中表达情况。图1A:qRT-PCR检测子宫内膜异位症临床组织PGR mRNA表达情况；图1B:WB检测子宫内膜异位症临床组织PGR蛋白表达情况(*表示与EM 组相比，p<0.05。EM＝54，EME＝86)；图1C:HE染色EMS小鼠子宫内膜病理情况(×400)；图1D:WB检测EMS小鼠PGR蛋白表达情况。

图2 PGR调控TGF-β信号通路。图2A:WB检测子宫内膜异位症临床组织TGF-β信号通路相关蛋白表达情况(*表示与EM组相比，p<0.05。EM＝54，EME＝86)；图2B:WB检测在hESC中影响PGR后TGF-β信号通路相关蛋白表达情况；图2C:Transwell检测各组hESC侵袭能力(×200)；图2D:EDU检测各组hESC增殖能力(×200)；图2E:流式细胞术检测各组细胞凋亡能力。

图3 TGIF1竞争性结合smad2抑制TGF-β信号通路。图3A:qRT-PCR检测子宫内膜异位症临床组织TGIF1mRNA表达情况；图3B：WB检测子宫内膜异位症临床组织TGIF1蛋白表达情况(*表示与EM组相比，p<0.05，EM＝54，EME＝86)；图3C:WB检测在hESC中影响TGIF1 后TGF-β信号通路相关蛋白表达情况；图3D:Transwell检测各组hESC侵袭能力(×200)；图3E:EDU检测各组hESC增殖能力(×200)；图3F:流式细胞术检测各组细胞凋亡能力。

图4 FBXW7泛素连接酶介导TGIF1蛋白降解。图4A:IP实验检测TGIF1与泛素作用；图4B: 蛋白酶体抑制剂MG132处理检测TGIF1蛋白表达；图4C:GEO数据库检测FBXW7差异表达水平；图4D:qRT-PCR检测hESCFBXW7的转染效率；图4E:Co-IP检测FBXW7与TGIF1 相互作用；图4F:影响FBXW7后，蛋白酶体抑制剂MG132处理检测TGIF1蛋白表达；图4G:影响FBXW7后，环已亚胺(CHX)处理检测TGIF1蛋白稳定性的影响。

图5 FBXW7体外调控子宫hESC功能。图5A:Transwell检测各组hESC侵袭能力(×200)；图 5B:EDU检测各组hESC增殖能力(×200)；图5C:流式细胞术检测各组细胞凋亡能力。

图6 PGR蛋白抑制FBXW7的转录水平。图6A:双荧光素酶报告基因检测PGR在FBXW7结合情况；图6B:ChIP实验检测各细胞中PGR在FBXW7启动子区域的结合情况；图6C: qRT-PCR检测各组细胞中FBXW7的表达水平；图6D:WB检测子宫内膜组织中影响PGR蛋白后FBXW7的表达水平；图6E:HE染色检测影响PGR蛋白后Ems子宫内膜组织病理情况 (×400)。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测子宫内膜异位症组织中蛋白的表达水平，发现其中具有明显表达差异的蛋白片段，探讨其与子宫内膜异位症的发生之间的关系，从而为子宫内膜异位症的靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过实验，本发明发现子宫内膜异位症组织中PGR显著性下调，进一步的实验证明，改变PGR的表达水平可以影响子宫内膜异位症的生长，提示PGR可以作为药物靶标用于子宫内膜异位症的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与子宫内膜异位症相关联的基因、基因的片段或变体。

基于发明人的发现，本发明提供了一种PGR基因在制备治疗子宫内膜异位症的产品中的用途以及由此制备的药物组合物和该药物组合物在治疗子宫内膜异位症的应用，所述药物组合物的性质对本发明来说并不重要，只要它含有PGR基因的功能性即可，举例来说，本发明的药物组合物可以是以PGR基因的合成序列构建的重组质粒、其能抑制子宫内膜异位症的自我更新(本发明的优先实施例中有详细介绍)。在此基础上，本发明根据PGR的核苷酸序列，以及PGR在子宫内膜异位症的作用机制(PGR蛋白在子宫内膜异位症中抑制FBXW7的表达，最终导致FBXW7蛋白的转录水平在子宫内膜异位症中下调。表达下降的FBXW7蛋白可以特异性的介导TGIF1蛋白的上调，使其对于Smad2蛋白的竞争性抑制作用增强，导致TGF-β信号通路的抑制，从而抑制子宫内膜异位症。)从而设计出的针对提高PGR的基因表达的试剂或者其他组分，另外还可以设计直接提高FBXW7的基因表达的试剂或其他组分，这些试剂或组分都能起到治疗子宫内膜异位症的作用，都应属于本发明的保护范围之内。例如，本发明提供的可以上调PGR的质粒或下调FBXW7(抑制剂)的质粒。当然，人工直接合成的PGR也属于本专利的范围之内。

本发明的PGR或FBXW7的抑制剂可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗子宫内膜异位症的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

在本发明的实施例中，一种代表性的人PGR基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。本发明的PGR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。另外，本发明的PGR可以通过人工合成的方法或蛋白重组表达的方法获得。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用 RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片 (原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测PGR基因的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测PGR基因的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测PGR基因表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。该试剂盒在PGR作为药物组合物应用于子宫内膜异位症治疗时，用于评价PGR的表达水平，从而对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供帮助，这对PGR作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

在某些实施方案中，所述试剂盒也可以直接检测PGR的含量，所述方法有现有技术中的 ELISA方法、化学发光法等。在本发明的实施中，因篇幅有限，仅提供了werstern blot检测方法。但本领域的技术人员应该明确，使用其他的方法检测PGR的蛋白含量有着本发明重要的技术启示。

在本发明的实施例中，同时公开了一种抑制FBXW7基因的表达药物组合物，从而起到抑制子宫内膜异位症的发生和发展(详见实施例5)。其中，一种FBXW7基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示。因此，本领域的技术人员应当明确，一种抑制FBXW7基因的药物组合物也应在本发明的保护范围之内，如前所述，所述的药物组合物只要能抑制FBXW7基因的表达即在本发明的保护范围之内。在本发明的优选实施例中，优先选择了sh-FBXW7作为药物组合物来抑制FBXW7基因的表达，从而起到抑制子宫内膜异位症的发生和发展(表达下降的FBXW7蛋白可以特异性的介导TGIF1蛋白的上调，使其对于Smad2蛋白的竞争性抑制作用增强，导致TGF-β信号通路的抑制，从而抑制子宫内膜异位症)其中，所述的sh-FBXW7的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。当然，随之用于检测FBXW7的试剂盒也应在本发明的保护范围之内，在本发明的优选实施例中，所使用的试剂盒为qRT-PCR试剂盒；另外，直接检测FBXW7蛋白的表达水平的试剂盒也属于本发明的保护范围之内，所述方法有现有技术中的ELISA方法、化学发光法等。在本发明的实施中，因篇幅有限，仅提供了werstern blot检测方法。但本领域的技术人员应该明确，使用其他的方法检测FBXW7的蛋白含量有着本发明重要的技术启示。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验方法

方法1：研究对象

选择2014年11月到2018年11月在我院医院妇科住院，行腹腔镜或开腹手术，同时经病理证实为EMs(子宫内膜异位综合症)的患者86例，年龄27-48(34.14±4.63)岁。采用美国生育会1997年修订的内异症分期标准(r-AFS)。进行分期，其中I和II期51例、III和35例。另取同期非Ems不孕行腹腔镜检查刮宫送病理患者54例，年龄24-41(32.69±4.04)刮取子宫内膜均由病理证实为正常的子宫内膜，作为正常对照组(EM)。纳入患者月经周期规律，术前6个月未接受激素治疗，排除子宫腺肌症及肿瘤病史者，无严重内科合并症。所有患者对该研究均知情同意，所有患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。

方法2：子宫内膜异位综合症小鼠模型构建及分组

清洁级近交系BALB/c雌性小鼠45只，体质量18～20g，6～8周龄小鼠构建子宫内膜异位综合症(EMs)模型参考此文献。EMs模型制作成功的特征参考此文献。EMS组每天上午尾静脉注射等容积的纯净水、下午灌胃0.5mg/kg戊酸雌二醇；oe-NC组和oe-PGR组每天上午尾静脉注射0.002μg上述培养的oe-NC组细胞和oe-PGR组细胞，下午0.5mg/kg戊酸雌二醇片；sham组每天尾静脉注射等容积纯净水(容积比列按照1ml/100g调配)。在第12d末次给戊酸雌二醇后1h，Sham组腹腔注射等量生理盐水，其余各组腹腔注射缩宫素0.2ml/只诱发扭体反应，观察并记录30min内小鼠扭体潜伏期及扭体次数。以上所有实验经过动物保护和使用委员会批准。

方法3：细胞培养

向中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买子宫内膜细胞(hESC)，分别用含10％小牛血清的DMEM培养液培养，并在培养液中加入1：1混合的青霉素-链霉素液，100U/ml作为终浓度，再置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。用0.25％胰酶进行细胞消化，按1:3的量进行传代。将细胞接种于6孔板内(3×10⁵个/孔)，待到细胞生长融合70％～80％时进行后续实验。将处于对数生长期的子宫内膜间质细胞分为9组：oe-NC组(转染oe阴性无意义对照质粒)、oe-TGIF1(转染oe-TGIF1质粒)、oe-PGR(转染oe-PGR质粒)、sh-NC组(转染sh-NC 阴性无意义对照质粒)、sh1-FBXW7组(转染sh1-FBXW7质粒)、sh2-FBXW7组(转染sh2- FBXW7质粒)、oe-PGR+oe-NC(转染oe-PGR质粒+oe-NC质粒)、oe-PGR+oe-FBXW7(转染oe-PGR质粒+oe-FBXW7质粒)，转染质粒及质粒的荧光标记均委托上海生工生物公司构建。严格按照lipofectamin 2000说明书(11668-019，Invitrogen，New York，California，USA) 进行转染操作。

方法4：qRT-PCR

采用Trizol(15596026，Invitrogen,Car，USA)提取总RNA，使用逆转录试剂盒(RR047A， Takara，Japan)将RNA反转录成cDNA，体系20ul，反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；使用SYBR Premix EX Taq试剂盒(RR420A,Takara)进行加样，样品在实时荧光定量PCR仪(ABI7500,ABI,Foster City，CA，USA)中进行qRT-PCR反应，反应体系：SYBR Mix 9ul，正引物0.5ul，负引物0.5ul，cDNA2ul，RNase Free H2O 8ul。反应条件：95℃10min，95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。每个样品设置三个重复孔。引物由上海生工合成(引物序列见表1)。记录各孔Ct值，以β-actin为内参，采用公式2-ΔΔCt法计算产物相对表达量。ΔΔCt＝(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均 Ct值-对照组管家基因平均Ct值)。

表1 qRT-PCR(荧光定量PCR)引物序列

方法5：Western blot

取各组细胞，加入500μL蛋白裂解液(RIPA，Pierce，Rockford，IL，USA),加入PMSF,(MA0001，美仑生物，大连，中国)；静置于冰上60min。将冷却后的上述溶液转移到1.5mL EP管中，于4℃，12000rpm离心30min。吸取离心后的上清转移到EP管，按照BCA蛋白定量试剂盒(货号BCA1-1KT，Sigma，美国)说明书测定蛋白浓度，每组30ug蛋白用去离子水调至上样体积一致。配置分离胶10％，浓缩胶5％SDS-PAGE变性蛋白电泳胶。将提取的细胞总蛋白混合上样缓冲液后100℃煮5min，后冰浴降温，离心后用微量加样器等量加入各泳道进行电泳分离。电泳条件为：80V,0.5h,100V、1h，后进行15V半干转10min，5％脱脂牛奶-TBST 封闭1h。选取GAPDH(1:500,ab8245,abcam,UK)作为内参，TGIF1抗体(1:5000,ab52955,abcam, UK)、PGR抗体(1:1000,ab194111,abcam,UK)、FBXW7(1:1000,ab109617,abcam,UK)、 TGFβ1(1:1,000,ab31013,abcam,UK)、Smad2(1:1,000,ab33875,abcam,UK)、 p-samd2(1:300；ab216482,abcam,UK)Pai-1(1:1,000,ab66705,abcam,UK)、泛素抗体(3933, CST)4℃孵育过夜，室温下TBST洗涤3次，5min/次。然后用辣根过氧化酶标记的兔二抗(A0208，碧云天，上海，中国)37℃孵育45min，用TBST洗膜，15min×3次。加入ECL发光液显影，SmartView Pro2000(UVCI-2100，Major Science，USA)拍照。利用Quanity One软件进行蛋白条带灰度分析。

方法6：CHIP(Chromatin immunoprecipitation technique，染色质免疫沉淀技术)

用甲醛固定子宫hESC10min以产生DNA-蛋白质交联，超声破碎仪设置为每次超声10s，间隔10s，循环15次来破碎细胞打断染色质成片段(200-500bp)，细胞充分裂解后，取10％体积的全细胞裂解液作为Input，剩下的样品4℃、12000g离心10min收集上清分成两管，分别加入阴性对照兔IgG(ab109489，1：300，Abcam，上海中国)和PGR抗体(UpstateBiotech), 4℃下孵育过夜充分结合。用Pierce protein A/G Magnetic Beads(Thermo,88803)沉淀蛋白和 DNA的复合物，5000g离心1min后丢弃上清，洗涤非特异性复合物，65℃过夜解交联，酚/ 氯仿抽提纯化回收DNA片段然后进行RT-PCR检测。

方法7：CO-IP(co-immunoprecipitation，免疫共沉淀)

使用非变性裂解缓冲液(无锡柏欧美地生物科技有限公司)用蛋白酶抑制剂从细胞中分离总蛋白。加入PGR和FBXW7单克隆抗及IgG进行免疫沉淀反应，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，收集离心后的管底PGR和抗原抗体复合物并定量，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；蛋白变性后跑SDS-PAGE胶，通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带，切下目的蛋白条带及参考基因蛋白条带进行蛋白定量检测，分析相应条带判断PGR和FBXW7 的结合情况。TGIF1泛素化实验，hESC，然后用TGIF1进行免疫沉淀。和随后的抗Ub(3933, CST)和抗TGIF1(1:100,ab52955,abcam,UK)的蛋白质印迹。

方法8：蛋白稳定性检测

为确定TGIF1蛋白的稳定性，使用RIPA裂解液(P0013B，碧云天)将裂解后，使用PNGase F(G5166-50UN，sigma)与裂解液混匀孵育，12000r/min离心，提取蛋白后，并在分析前与 CHX(蛋白质合成抑制剂)一起孵育指定的时间。蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白质合成抑制剂环己酰胺(CHX)购自Sigma(USA)，没有特殊说明的治疗条件是环己酰胺(100mg/ml)和MG132(20mM)。然后，在含有0.1％SDS的RIPA缓冲液中裂解细胞并进行免疫印迹。使用ImageJ对TGIF1的表达水平进行定量并标准化为GAPDH。按0h、1h、2h提取蛋白后进行Westernblot检测TGIF1的表达量，绘制TGIF1降解曲线。

方法9：双荧光素酶报告基因

人工合成FBXW7mRNA 3’-UTR区的靶位点序列(WT)及对WT靶位点进行定点突变后的序列(Mut)。使用限制性内切酶对pGL3-BASIC质粒(广州锐博生物技术有限公司) 进行酶切，再将人工合成的目的基因片段WT和Mut分别插入到pmiR-RB-REPORTTM载体 (广州锐博生物科技有限公司)中，同时转染空质粒作为对照组，测序正确的荧光素酶报告质粒WT、Mut用于后续转染，mut和wt的载体分别和oe-NC或oe-PGR共转至自子宫hESC 中。转染48h后收集并裂解细胞，离心3～5min，取上清液，分别使用荧光素酶检测试剂盒 (RG005，上海碧云天生物技术有限公司，上海，中国)，测定RLU，以萤火虫荧光素酶作为内参，用Renilla荧光素酶测定后得到的RLU值除以用萤火虫荧光素酶测定后得到的RLU值，得到相对荧光值。

方法10：HE染色

分别取每组小鼠4％甲醛固定的异位灶组织24h过夜后，常规脱水1min/次、二甲苯透明 2次，于石蜡包埋机的冷台上冷却。石蜡切片脱蜡至水，苏木素(PT001，购自上海博谷生物科技有限公司，中国，上海)常温染色10min，1％的盐酸酒精分化30s，伊红(0001-H，北京欣华绿源科技有限公司，北京，中国)室温染色1min；酒精梯度(浓度分别为70％、80％、90％、95％、100％)脱水，每个梯度脱水1min；石碳酸二甲苯1min，二甲苯I、II (GD-RY1215-12，上海古朵生物科技有限公司，上海，中国)中各透明2次，每次1min；在通风橱中采用中性树胶封片，最后用蔡司荧光显微镜(PrimoStar iLED，北京博瑞斯科技有限公司，北京，中国)进行拍照观察各组异位灶组织形态学变化。

方法11：Transwell

实验采用24孔板8μm孔径Transwell小室(Corning，USA)，在上室接种200μl细胞；在下室加入含10％胎牛血清的300μl完全培养基(Invitrogen，USA)作为趋化因子，置于37℃、 5％CO₂下进行孵育。实验前在小室铺50μLMatrigel基质胶(Sigma，USA)对滤膜实施包被， 48h后采用上述方法固定与染色。倒置显微镜(XDS-800D，上海蔡康光学仪器有限公司，中国)下计数染色细胞数。随机选取5个视野计数，细胞个数用均数表示。以此评估各组hESC侵袭能力。

方法12：EDU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)

取各组细胞，以1.6×105/孔的密度接种于96孔板中培养48h，按照EDU试剂盒(C10310,Ribobio，广州，中国)说明说进行操作，在每个孔中加入100μL 50μM的EDU， 37℃下培养4h。将细胞用4％甲醛室温下固定15min，并用0.2％Triton X-100室温下处理5min用于透化。PBS洗涤三次，每孔加入100μL

混合物(C10338-2，锐博，广州，中国)，并在室温下温育30min。加入100μL Hoechst33342(锐博，广州，中国)染料染色 30min，在荧光显微镜(奥林巴斯公司，日本东京)下观察拍照。使用Image-Pro Plus(IPP) 6.0软件(MediaCybernetics，Bethesda，MD，USA)计算EdU阳性细胞(红细胞)数。三次重复试验计算平均值。

方法13：流式细胞术

细胞转染48h后分别采用25μg/ml对各组各组转染细胞进行处理24h。采用AnnexinV-FITC/PI双染法试剂盒(556547，上海硕嘉生物技术有限公司，中国)检测各组细胞凋亡情况，实验步骤如下：用去离子水10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer，各组细胞室温2000rpm 离心5min，收集细胞。随后预冷1×PBS重悬，2000rpm离心5-10min，洗涤细胞。之后加入300μL1×Binding Buffer悬浮细胞。加入5μL Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)混匀后，避光室温温育15min。上机流式细胞仪(Cube6，Partec，Germany)前5min加入5μL的PI(碘化丙啶)，冰浴避光5min，激发波长为480nm，530nm检测FITC和大于575nm检测PI。每次实验重复3次。

实施例1：PGR在子宫内膜异位症中低表达

已有文献表明PGR基因在子宫内膜异位症中有差异表达为验证子宫内膜异位症差异表达基因PGR的表达，我们先检测86例Ems患者(EME)和54例同期非Ems患者(EM)子宫内膜组织，分析可知，qRT-PCR和WB结果显示(图1A-B)，与EM组相比，EME组患者子宫内膜组织中PGR表达显著下降(P<0.05)。为了进行后续实验，我们首先检测子宫内膜异位症小鼠造模是否成功。各组移植物生长结果：45只小鼠42只建模成功，建模成功率为 93.33％，其中2只无移植物生长，另外1只死亡。我们首先HE染色检测子宫内膜异位灶的特点，HE染色结果表明(图1C)：Normol组和Sham组小鼠子宫内膜上皮细胞为高柱状或柱状，腺体数量多，腺上皮细胞多为柱状，可见到核下空泡和顶浆分泌。与Normal组相比， EMS组小鼠异位子宫内膜异位灶呈多囊状，囊外壁覆盖一层纤维结缔组织内膜上皮细胞呈低柱状环形或锯齿状生长，个别部位有坏死和炎细胞侵润浸润，内膜间质层变薄，有不同程度纤维化。扭体反应观察结果显示(表2)：与Normol组相比，EMS组出现扭体反应，差异有统计学意义(P<0.05)，而Sham组无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明表明建模成功。为检测在模型小鼠体内PGR的表达情况，我们使用WB检测，结果表明(图 1D)，与Normal组相比，EMS小鼠内膜组织中PGR表达显著降低，差异有统计学意义(P< 0.05)。而Sham组无显著性变化(P>0.05)。

以上结果显示，PGR在子宫内膜异位症中高低表达。

表2各组小鼠扭体反应的比较

注：*表示与Normal组相比，P<0.05

实施例2：PGR抑制TGF-β信号通路，调控子宫内膜异位症

文献表明TGF-β信号通路，在子宫内膜异位症中激活。我们也验证了此结论，在临床组织样本中，检测TGF-β通路相关基因TGF-β1和smad2、Pai-1在表达差异，结果表明(图2A)，与EM组相比，EM组患者子宫内膜组织中TGF-β1和p-smad2、Pai-1表达显著上升(P<0.05)； smad2表达无显著性差异(P>0.05)。我们进一步研究了PGR对TGF-β信号通路的影响，WB 检测影响PGR后，TGF-β信号通路相关基因的表达情况，结果表明(图2B)，与oe–NC相比，oe-PGR组细胞中TGF-β1和p-smad2、Pai-1表达水平显著降低(P<0.05)；smad2表达无显著性差异(P>0.05)。进而研究PGR是否TGF-β信号通路的影响子宫内膜细胞功能。我们首先使用Transwell检测各组hESC侵袭能力(图2C)，结果发现，过表达PGR后，hESC侵袭能力显著降低(P<0.05)。利用EDU检测各组hESC增殖能力，结果发现(图2D)，过表达PGR后， hESC增殖能力显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明(图2E)，过表达PGR后，hESC 凋亡能力显著增加(P<0.05)。上述结果表明，沉默PGR抑制子宫内膜异位hESC增殖及侵袭能力，促进其凋亡能力。

上述结果表明，PGR可抑制TGF-β信号通路的激活,并抑制子宫内膜异位症。

实施例3：TGIF1竞争性结合smad2抑制TGF-β通路缓解子宫内膜异位症

已有研究表明，TGIF1竞争性结合smad2抑制TGF-β信号通路[PMID:20622901]。我们先在临床组织样本中，验证TGIF1表达差异，qRT-PCR结果表明(图3A)与EM组相比， EME组患者子宫内膜组织中TGIF1mRNA表达无显著性变化(P>0.05)。而WB结果表明(图 3B)，与EM组相比，EME组患者子宫内膜组织中TGIF1表达显著下降(P<0.05)。进一步验证，过表达TGIF1后TGFβ通路的表达。WB结果表明(图3C)，与oe-NC组相比，oe-TGIF1 组细胞中Smad2，Pai-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。上述结果表明，过表达TGIF1能抑制TGFβ信号通路的激活。我们进一步研究TGIF1可通过TGFβ信号通路影响EmshESC的功能。Transwell及EDU结果表明(图3D-E)，过表达TGIF1后，hESC侵袭及增殖能力显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)；流式细胞术结果表明(图3F)，过表达TGIF1后，hESC 凋亡能力显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述结果表明，在Ems中，过表达TGIF1可抑制EmshESC增殖及侵袭，同时抑制其凋亡能力。

实施例4：FBXW7泛素连接酶介导TGIF1蛋白降解

上述结果表明在子宫内膜异位症中TGIF1蛋白表达显著降低，但是我们在检测TGIF1的转录水平时发现，qRT-PCR检测结果表明，与EM组相比，EME组患者子宫内膜组织中TGIF1 转录水平无显著性变化。我们猜想TGIF1在Ems中发生泛素化降解。IP实验发现(图4A)， TGIF1与泛素相互作用。蛋白酶体抑制剂MG132处理，随着MG132处理浓度增加，TGIF1的降解的抑制提高(图4B)。结果表明TGIF1在蛋白酶体中被泛素化进而被降解。

通过查阅文献得知FBXW7为调控TGIF1泛素化的连接酶。进而通过GEO dataset数据分析，FBXW7在子宫内膜异位症病人中高表达(图4C)(P<0.05)。我们在hESC转染sh-NC、sh1-FBXW7、sh2-FBXW7载体。为检测沉默效率及过表达效率，qRT-PCR检测各组细胞 FBXW7的表达情况，结果表明(图4D)，与sh-NC相比，sh1-FBXW7、sh2-FBXW7组细胞中 FBXW7表达显著降低，sh2-FBXW7组FBXW7降低更加显著，转染效率符合要求可用于后续实验(P<0.05)。Co-IP实验结果表明(图4E)，蛋白酶体抑制剂MG132处理后，加入FBXW7 后，TGIF1可检测出泛素化条带，说明发生TGIF1泛素化，进而被降解。进一步研究表明蛋白酶体抑制剂MG132处理，沉默FBXW7可抑制TGIF1的降解(图4F)；CHX处理检测 TGIF1蛋白稳定性，结果显示沉默FBXW7对TGIF1的蛋白稳定性显著升高(图4G)。结果表明，在Ems中，FBXW7可作为调控TGIF1泛素化的连接酶，促进其降解。

实施例5：FBXW7体外调控子宫内膜异位症

验证FBXW7体外调控异位子宫内膜异位症hESC的hESC功能。分离模型组子宫hESC，培养分组。Transwell检测各组hESC侵袭能力(图5A)，结果发现，沉默FBXW7后，hESC 侵袭能力显著降低(P<0.05)。利用EDU检测各组hESC增殖能力，结果发现(图5B)，沉默 FBXW7后，hESC增殖能力显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明(图5C)，沉默FBXW7 后，hESC凋亡能力显著增加(P<0.05)。上述结果表明，沉默FBXW7抑制子宫内膜异位hESC 增殖及侵袭能力，促进其凋亡能力。

实施例6：PGR蛋白在Ems中抑制FBXW7的转录水平从而介导体内子宫内膜异位症

为了进一步了解FBXW7的上游调控机制，通过hTFtarget数据库，对FBXW7的上游调控转录因子进行预测，同时，通过DisGeNET数据库，对子宫内膜异位在相关基因进行检索，对子宫内膜异位症相关基因检索结果中得分大于0.1的基因和预测结果取交集(图6A)，最终在交集中获得15个基因，在这15个基因中，我们注意到PGR基因在DisGeNET数据库预测结果中得分最高，并且在hTFtarget数据库预测结果中表明FBXW7基因是转录因子PGR 的靶基因(图6B)。为了验证这一结果，我们通过双荧光素酶报告基因实验，结果表明(图6A)，在FBXW7-promoter-wt中，与oe-NC组相比，oe-PGR组中荧光表达量显著降低(P<0.05),而FBXW7-promoter-mut中无显著性变化(P>0.05)。为进一步研究，我们在内皮细胞中通过ChIP 实验检测PGR在FBXW7启动子区域的结合情况(图6B)，结果显示：PGR antibody组免疫沉淀富集到的FBXW7启动子片段较IgG antibody组显著增多(P<0.05)。PGR蛋白在Ems中是否抑制FBXW7的转录水平。我们通过qRT-PCR检测hESC中FBXW7的转录水平。结果显示(图6C)，与oe–NC组相比，oe-PGR组FBXW7转录水平被抑制，差异具有统计学意义 (P<0.05)；与oe-PGR+oe-NC组相比，oe-PGR+oe-FBXW7组过表达FBXW7可拯救其转录水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。

为检测PGR蛋白抑制FBXW7对子宫内膜异位症的体内影响。我们采用首先采用WB检测子宫内膜组织中影响PGR蛋白后FBXW7的表达水平，结果表明(图6D)：与oe-NC+EMS 组小鼠组织相比，oe-PGR+EMS组组织中FBXW7的蛋白表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果检测各组小鼠子宫内膜异位灶的特点，HE染色结果表明(图 6E)：与oe-NC+EMS组小鼠内膜组织出现类似子宫内膜样的腺体和间质，腺上皮细胞呈现圆柱形状，可以看到腺上皮细胞和间质细胞浸入周围组织。与oe-NC+EMS相比，oe-PGR+EMS 组小鼠子宫内膜，上述病理变化程度显著降低。扭体反应观察结果显示(表3)：与oe-NC+EMS 组相比，oe-PGR+EMS出现扭体反应，差异有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明PGR蛋白在体内抑制FBXW7的表达，进而缓解体内子宫内膜异位症症状。

表3各组小鼠扭体反应的比较

*表示与oe–NC组相比，P<0.05，以上结果均为计量资料，以平均值±标准差表示。两组间采用非配对t 检验，n＝8。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

<110> 湖南省科域生物医药科技有限公司

<120> PGR作为治疗子宫内膜异位症的产品中的用途及其检测PGR的试剂盒

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1172

<212> DNA

<213> PGR核苷酸序列

<400> 1

ctaaactttt tttaatcaag cgtcacatgt tttaatttta ttctatttca tttcattcga 60

ttgatgctaa aatatataat gtgatgattc taagatttag gaaaaataat attatactgg 120

gatatggagt ttctatatat ttacatgaac ctcctttttt tttcttctct gtaggtcgaa 180

aatttaaaaa gttcaataaa gtcagagtta tgagagcact agatgctgtt gctctcccac 240

agccagtggg cattccaaat gaaagccaag ccctaagcca gagattcact tttccaccag 300

gtcaagacat acagttgatt ccaccactga tcaacctgtt agtgagcatt gaaccagatg 360

tgatctatgc aggacatgac aactcaaaac ctgacacctc cagtttttct gattttcact 420

gtaaaatatg ttgagattga aaacattacc ctacttatac ctatttttca gatttatatg 480

tattttcaac attttttata taatccagtc atttttatgg tcactgtatt tttaaatttg 540

ttttgtaggt tttcgaaact tacatattga tgaccagata actctcattc agtattcttg 600

gatgagctta atggtgtttg gtctaggatg gagatcctac aaacacgtca gtgggcagat 660

gctgtatttt gcacctgatc taatactgaa tgagtaagta gtaacttttg ttgtttttgt 720

tattataagt gtacatatag gataattttg aaagttgtat ttcaatagat gatcacatat 780

ttagtgttct tgatatgatg atattaatgt cattttaagt tcttatattc ttccagtgaa 840

ctagaagttt atatgtcctg atactatcaa taacatgatc tctttcctat ataaggtgtt 900

ttttttctag agtcatatat cagaagaaat ctttatatat tttagaaata agtgttataa 960

gttgttaatg tcatcttttt aaacataact gccactttta attgtcttct tacagttcct 1020

ttggaaggac tacgaagtca aacccagttt gaggagatga ggtcaagcta cattagagag 1080

ctcatcaagg caattggttt gaggcaaaaa ggagttgtgt ctagctcaca gcgtttctat 1140

caacttacaa aacttcttga taacttgcat ga 1172

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggagaaggc cgacatcct 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgacgaag gctttgc 17

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> sh-FBXW7

<400> 4

gcaccatgaa tcaggaactt tcaagagaag ttcctgattc atggtgcttt ttt 53

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> sh-FBXW7

<400> 5

gcggcttaat gtagacaggt aagttctcta cctgtctaca ttaagccgaa aaaatgcgca 60

cttaa 65

<210> 6

<211> 2256

<212> DNA

<213> FBXW7核苷酸序列

<400> 6

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60

ttggcaccat gaatcaggaa ctgctctctg tgggcagcaa aagacgacga actggaggct 120

ctctgagagg taacccttcc tcaagccagg tagatgaaga acagatgaat cgtgtggtag 180

aggaggaaca gcaacagcaa ctcagacaac aagaggagga gcacactgca aggaatggtg 240

aagttgttgg agtagaacct agacctggag gccaaaatga ttcccagcaa ggacagttgg 300

aagaaaacaa taatagattt atttcggtag atgaggactc ctcaggaaac caagaagaac 360

aagaggaaga tgaagaacat gctggtgaac aagatgagga ggatgaggag gaggaggaga 420

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ggcttgtacc atgttcagca acaccaacaa cttttgggga cctcagagca gccaatggcc 720

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taaaaatgtt tcagagctgg agtggaccag agaaattgct tgctttagat gaactcattg 840

atagttgtga accaacacaa gtaaaacata tgatgcaagt gatagaaccc cagtttcaac 900

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tgggacatac aggtggagta tggtcatcac aaatgagaga caacatcatc attagtggat 1380

ctacagatcg gacactcaaa gtgtggaatg cagagactgg agaatgtata cacaccttat 1440

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catatgattt tatggtaaag gtgtgggatc cagagactga aacctgtcta cacacgttgc 1680

aggggcatac taatagagtc tattcattac agtttgatgg tatccatgtg gtgagtggat 1740

ctcttgatac atcaatccgt gtttgggatg tggagacagg gaattgcatt cacacgttaa 1800

cagggcacca gtcgttaaca agtggaatgg aactcaaaga caatattctt gtctctggga 1860

atgcagattc tacagttaaa atctgggata tcaaaacagg acagtgttta caaacattgc 1920

aaggtcccaa caagcatcag agtgctgtga cctgtttaca gttcaacaag aactttgtaa 1980

ttaccagctc agatgatgga actgtaaaac tatgggactt gaaaacgggt gaatttattc 2040

gaaacctagt cacattggag agtgggggga gtgggggagt tgtgtggcgg atcagagcct 2100

caaacacaaa gctggtgtgt gcagttggga gtcggaatgg gactgaagaa accaagctgc 2160

tggtgctgga ctttgatgtg gacatgaagt tgccaacttt cttgtacaaa gttggcatta 2220

taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaac 2256

Claims

1.一种蛋白，所述蛋白为PGR，其特征在于，PGR基因在制备治疗子宫内膜异位症的产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PGR基因如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PGR的靶基因为FBXW7。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的PGR抑制FBXW7基因的表达，从而抑制TGF-β信号通路的激活。

5.一种治疗子宫内膜异位症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括PGR基因。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为含有PGR基因的质粒。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测PGR基因表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增PGR基因的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增PGR基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。