CN111411079B

CN111411079B - 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用

Info

Publication number: CN111411079B
Application number: CN202010230370.XA
Authority: CN
Inventors: 程源
Original assignee: Beijing Shihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Shihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2025-12-12
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111411079A

Abstract

本发明涉及一种细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用，所述细胞培养方法包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。本发明的细胞培养方法和细胞培养基可用于多种细胞的体外培养，获得更高纯度、更高活力的目标细胞，所获得的细胞产品可用于临床应用研究。

Description

细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用。

背景技术

目前，常用的细胞体外培养方法大量应用了细胞培养用抗体来结合目标细胞表面的特定受体分子，以达到激活(activating)或是抑制(blocking)信号通路的目的，促使目标细胞定向分化、持续扩增或凋亡。在小规模培养时，通常将这些抗体包被(coating)在培养皿表面，或是交联到磁珠上。在大规模培养时，为了避免冗长的难以控制的包被过程，或是为了节省高昂的磁珠成本、避免引入外源物质，或是出于其他优化工艺的目的，经常会将这些抗体直接加入培养基中。但是，这样获得的终产品普遍存在着纯度较低、活力较低的问题。

目标细胞纯度低，意味着终产品中有过多的其他类型的细胞。这些非目标细胞的功能与目标细胞的不同，其成分通常难以控制，会极大增加科学试验、特别是动物和人体体内试验的复杂程度，严重影响研究的重复性。

同样，在临床治疗应用上出于安全性和有效性考虑，获得尽可能高的纯度和高的活力的细胞制品也是进行细胞治疗所必需的。

发明内容

基于此，有必要提供一种可提高细胞纯度和活力的细胞培养方法。

本发明披露了一种细胞培养方法，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。

本发明还披露了一种改造抗体，所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。

本发明还披露了一种细胞培养基，包含基础培养基和所述改造抗体。

本发明还披露了一种细胞产品，所述细胞产品为根据上述细胞培养方法得到的细胞产品。

本发明还披露了一种上述细胞产品在制备对肿瘤细胞具有杀伤作用的药物和试剂中的应用。

本发明还披露了一种用于癌症治疗的药物，包括上述细胞产品。

本发明还披露了一种用于异体细胞治疗的药物，包括上述细胞产品。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

该发明适用于已建立的细胞培养工艺，对细胞培养用抗体的原有机制没有变动，对培养工艺不需要做大的改动。特别适合目前广泛使用的大规模细胞培养工艺中将细胞培养用抗体直接加入培养基的情况，操作简便。

本发明可以提高细胞培养用抗体在细胞培养体系中的稳定性，同时也提高了抗体的利用率，通过优化培养工艺可以减少原料抗体的使用量。

本发明避免了原代细胞培养中起始原料细胞中的免疫细胞，特别是巨噬细胞、单核细胞和NK细胞等，对目标细胞的ADCP/ADCC作用，提高了目标细胞的活率和最终产量。特别是当培养和扩增的目标细胞就是巨噬细胞、单核细胞和NK细胞等免疫细胞时，终产品中目标细胞的纯度和活力的提升更加明显。

本发明可以提供更高纯度、更高活力的目标细胞产品，扩大了细胞产品在科学研究上的应用面，提高了细胞产品在临床应用上的安全性和有效性。

附图说明

图1为改造实例1中抗人CD16的鼠IgG1单克隆抗体3G8重链的改造示意图；

图2为改造实例1中Protein A柱层析的清洗和洗脱步骤的紫外吸收曲线图；

图3为改造实例1中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；

图4为改造实例2中抗人CD52的人源化的IgG1型Campath-1H单抗重链的改造示意图；

图5为改造实例2中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；

图6为改造实例3中抗人CD3的小鼠IgG2a单抗OKT3的改造示意图；

图7为改造实例3中目标蛋白的还原型SDS-PAGE电泳检测图；

图8为培养实例1中原型抗体OKT3与改造实例3制备的aCD3-SH对T细胞扩增的活力拟合曲线图；

图9为培养实例2中原型抗体OKT3与改造实例3制备的aCD3-SH对NKT细胞扩增的曲线图；

图10为培养实例3中采用改造抗体组扩增获得的细胞与采用原型抗体组扩增获得的细胞的流式细胞分析图；

图11为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对Raji细胞的杀伤试验结果图；

图12为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对BT-474细胞的杀伤试验结果图；

图13为应用实例1中试验组NK细胞产品和对照组NK细胞产品对MCF7细胞的杀伤试验结果图；

图14为应用实例2中两组小鼠体内的肿瘤成像信号强度图；

图15为应用实例3中各组小鼠的存活曲线图；

图16为应用实例3中各组小鼠的肿瘤成像图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

对本发明中涉及的各名词解释如下：

细胞培养用抗体：泛指用于细胞培养过程中使用的抗体。

原型抗体：指的是常用的市售的细胞培养用抗体，尚未经过本发明所涉及的改造。

改造抗体：特指本发明中将原型抗体进行蛋白质改造后的抗体，其与Fc受体的亲和力低于原型抗体与Fc受体的亲和力。

培养体系一般指的是包括培养基、生长因子、细胞培养用抗体、细胞(目标细胞和非目标细胞)、血清(有或无)、抗生素(有或无)、其他添加成分的集合，但并不限于此，根据不同的需要则培养体系的组成也不同。

细胞表面的抗体受体、抗体清除和抗体依赖的杀伤

某些细胞，例如淋巴细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞、血小板、肥大细胞等，其表面表达能结合不同免疫球蛋白同种型(Isotype)的Fc部分的各种受体Fc受体(Fc Receptor，FcR)，包括FcαR、FcγR、FcεR等。其中，FcγR，又分为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，主要与IgG结合。FcγR与不同亚型的人和鼠IgG有着不同的亲和力。通常，对IgG1、IgG3的亲和力高于与IgG2、IgG4的。

在细胞培养过程中，加入培养基中的细胞培养用抗体的浓度会不断降低。这除了与抗体会不断失活(自然降解、被细胞释放的蛋白酶降解、聚合沉淀等过程)、抗体与目标受体结合后内吞(receptor-mediated endocytosis)等因素相关外，还与培养体系中的某些细胞表面表达的Fc受体能够结合并清除这些抗体(FcR dependent endocytosis)有直接关系。

培养用的抗体通常是来源于小鼠杂交瘤筛选获得的IgG1亚型，例如鼠抗人CD3的抗体UCHT1、鼠抗人CD16的抗体3G8、鼠抗人CD28的抗体CD-28。另外，出于提高产量和扩大产品应用方面的考虑，鼠源抗体进行人源化时通常也会选择IgG1亚型，例如来源于大鼠抗人CD52的人源化Campath-1H单抗。这些IgG1抗体的有效浓度在培养体系中快速下降的问题会更加严重。

甚至，抗体在与目标细胞结合后，还会激发某些表达Fc受体的效应细胞的攻击。这包括由表达FcγRII的巨噬细胞来进行的抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(AntibodyDependent Cellular Phagocytosis，ADCP)和由表达FcγRIII的NK细胞来进行的抗体依赖的细胞杀伤(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC)。当培养体系中存在巨噬细胞、单核细胞、NK细胞等免疫细胞时，这类特异性的ADCP/ADCC作用会快速降低目标细胞的活率和纯度。特别是，如果培养的目标细胞就是巨噬细胞、单核细胞、NK细胞等免疫细胞时，这类自我ADCP/ADCC作用会快速降低目标细胞的活率、纯度和活力，并使得目标细胞提前进入耗竭期。

抗体改造原理和方法

IgG上与FcγR结合的部位集中在铰链区(Hinge)和Fc-C_H2结构域，对抗体的改造主要涉及这个区域。改造的方式包括序列替换、点突变、序列插入、序列缺失、糖基化修饰和化学修饰中的一种或多种。

例如将细胞培养用抗体的铰链区和Fc段替换为与Fc受体结合力相对弱的抗体亚型的铰链区和Fc段，或对细胞培养用抗体的铰链区和Fc段上关键结合部位的氨基酸残基进行突变，或是将细胞培养用抗体的互补决定区(Complementarity-Determining Regions，CDR)插入到与Fc受体结合力较弱的其他亚型抗体的骨架上等等。可以理解，上述多种改造手段可以综合使用，例如将细胞培养用抗体的CDR插入到进行了点突变的其他亚型抗体的骨架上。

由于本发明是应用于细胞的体外培养，对改造抗体的选择标准是与用于其他目的(例如治疗抗体用于人体输入)的选择标准不同的。本发明因此提出了更优的改造策略。

序列替换

在一些实施方式中，上述序列替换是将来源于亚型IgG1、IgG3抗体的铰链区和Fc段替换为IgG2或IgG4相应的序列。在一个优选实施方式中，将这些序列替换为IgG4相应的序列。例如将IgG1亚型的抗人CD3的小鼠单抗UCHT1、抗人CD16的小鼠单抗3G8和MEM-154、抗人CD28的小鼠单抗CD-28、抗人CD137的小鼠单抗4C1A9等抗体的铰链区和Fc段替换为鼠IgG4相应的序列。在一个更加优选的实施方式中，将这些序列替换为人IgG4相应的序列。优选地，在进行铰链区和Fc段的替换时，选择IgG1-C_H1-Hinge区域中尽可能靠近C端的一段与IgG4-C_H1-Hinge中的相同的序列开始替换，以尽可能保持C_H1和V_H1的相互作用，维护Fab段的功能。

点突变

在一些实施方式中，上述点突变是将细胞培养用抗体的铰链区和Fc段关键结合部位的一个或多个位点的氨基酸进行突变。

在一些实施方式中，细胞培养用抗体为IgG1亚型，上述点突变是将细胞培养用抗体的第228位、第233位、第234位、第235位、第236位、第239位、第250位、第252位、第254位、第256位、第257位、第311位、第318位、第320位、第322位、第326位、第327位、第329位、第330位、第331位、第332位、第333位、第428位、第433位和第434位氨基酸中的一个或多个位点进行突变。在一些实施方式中，也可对上述位点的临近氨基酸进行突变。

这些位点中，hIgG1的L234和L235的主链和侧链基团都参与了与hFcγRIII的结合，特别是L235的侧链与FcγRIII的疏水相互作用。在一些优选实施方式中，将L235突变为其他氨基酸，特别是带电荷的氨基酸(谷氨酸Glu，天冬氨酸Asp，精氨酸Arg，赖氨酸Lys)或是存在空间位阻的大基团侧链氨基酸(苯丙氨酸Phe等),可以减弱抗体与Fc受体的结合。在一些优选实施方式中，将L234突变为其他氨基酸，特别是影响主链构象的氨基酸(甘氨酸Gly，脯氨酸Pro)，可以减弱抗体与Fc受体的结合。hIgG1的P329参与了与hFcγRIII的结合，特别是与FcγRIII的疏水相互作用。在一些优选实施方式中，将P329突变为其他氨基酸，特别是带电荷的氨基酸或是不带电荷的极性氨基酸(丝氨酸Ser，苏氨酸Thr等)，可以减弱抗体与Fc受体的结合。在一个更加优选的实施方式中，对hIgG1进行L234A、L235R、P329D和A330S突变。

序列插入

在一些实施方式中，上述序列插入是将将来源于亚型IgG1、IgG3抗体的CDR插入到IgG2抗体或IgG4抗体的骨架上。在一个优选实施方式中，将这些CDR插入到IgG4抗体的骨架上。在一个优选实施方式中，将这些CDR插入到进行了其他所述改造了的、与Fc受体的亲和力降低的抗体的骨架上。在一个更加优选的实施方式中，将这些CDR插入到进行了所述点突变改造的IgG1抗体的骨架上。

其他方法

在一些实施方式中，还可以通过其他序列缺失、糖基化修饰和化学修饰等手段达到降低抗体与Fc受体的亲和力的目的。

在一个优选实施方式中，对抗体表达序列进行改造，表达和纯化抗体的Fab片段。

在一个优选实施方式中，对抗体表达序列中的N297进行突变，可以获得重链无糖基化修饰的抗体(Non-Glycosylated Heavy Chain，NGHC)。

在一个优选实施方式中，用糖苷内切酶(Endoglycosidase)对抗体进行处理，可以获得糖基缺失或是糖基重排的抗体。

在一个优选实施方式中，用化学偶联(Conjugation)对抗体进行处理，可以获得侧链修饰或偶联了形成空间位阻基团的抗体。

可以理解，本发明所涉及的改造抗体方法不限于上述序列替换、点突变、序列插入、序列缺失、糖基化修饰和化学修饰这几种，只要是经过蛋白质改造降低了与Fc受体的亲和力且不影响与目标分子的结合力的方法均可。

抗体改造范围

在一些实施方式中，上述细胞培养用抗体为抗CD3抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、抗CD52抗体或抗CD137抗体。例如，鼠抗人CD3的抗体UCHT1、鼠抗人CD16的抗体3G8、鼠抗人CD28的抗体CD-28、鼠抗人CD52的人源化Campath-1H单抗和抗人CD137的小鼠单抗4C1A9等。

在一些实施方式中，改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

可以理解，本发明的改造抗体不限于以上几种，只要是经过蛋白质改造降低了与Fc受体的亲和力的细胞培养用抗体均可。

细胞培养

本发明一个实施方式的细胞培养方法，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；所述改造抗体为将互补决定区以外的区域经过蛋白质改造的细胞培养用抗体，所述改造抗体与Fc受体的亲和力低于未经过蛋白质改造的细胞培养用抗体与Fc受体的亲和力。

在一些实施方式中，细胞类型为淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞、DC细胞、巨噬细胞、单核细胞和血小板中的一种或多种。所述的细胞来源于人血液、组织、手术切除的人实体瘤、腹水。可以是新鲜采集的静脉血、脐带血，也可以是冷冻保存的PBMC细胞。可以理解，细胞类型不限于此，只要培养体系中有部分细胞的表面表达Fc受体皆可。

在一些实施方式中，设计细胞生物学试验以定量检测改造抗体针对特定起始材料细胞群中目标细胞的功能活力，这包括细胞扩增试验、细胞毒性试验、细胞杀伤试验、细胞迁移试验等。在一个具体的实施例中，用改造抗体来刺激人PBMC中T细胞(CD3+)的增殖，定量确定抗体的活力，即半数有效剂量(ED₅₀)。此活力数据可用于其他需要刺激人PBMC中T细胞(CD3+)的细胞培养方法。在一些实施方式中，经过筛选，还可以获得更高活力的改造抗体。

培养基

在一些实施方式中，细胞培养基包含基础培养基和上述改造抗体。在一些优选实施方式中，在定量确定改造抗体的活力后，可配制标准化的培养基或试剂盒以满足特定细胞培养的需求。

细胞产品

在一些实施方式中，细胞产品为根据上述细胞培养方法得到的细胞产品。这包括淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞、DC细胞、巨噬细胞、单核细胞和血小板中的一种或多种。

在一些实施方式中，可以获得T细胞、NKT细胞、NK细胞、CTL细胞、TIL细胞等免疫细胞产品。在一些实施方式中，可以继续细胞转导和培养以获得CAR-T细胞、CAR-NK细胞等细胞产品。

细胞产品应用

在一些实施方式中，上述细胞产品可用于体外细胞杀伤试验、动物体内杀伤试验、人体试验。

在一些实施方式中，上述细胞产品，包括DC细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、CTL细胞、TIL细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞等免疫细胞产品，可以对入侵人体的病毒、被病毒感染转化的宿主细胞、肿瘤细胞进行识别和杀伤，可用于抗病毒治疗和靶向肿瘤治疗。由于外源免疫细胞在经过静脉输入病人体内后首先聚集在肺部，然后是肝部，在一些优选实施方式中，上述免疫细胞产品用于肺癌和肝癌的治疗。

NK细胞表面富表达FcγRIII(CD16)，是ADCC作用的主要效应细胞。在一些实施方式中，NK细胞可与治疗用抗体联合用于ADCC杀伤研究。在一些优选实施方式中，NK细胞产品可与治疗用抗体利妥昔单抗Rituximab联合用于淋巴瘤的治疗。在一些优选实施方式中，NK细胞产品可与治疗用抗体曲妥珠单抗Trastuzumab联合用于乳腺癌和胃癌的治疗。在一些优选实施方式中，NK细胞产品可与治疗用抗体西妥昔单抗Cetuximab联合用于头颈部癌和结直肠癌的治疗。

NK细胞还可以通过非自我或是自失效应(missing-self)来识别和杀伤目标。这种细胞杀伤是非MHC限制性的(Non-MHC-Restricted Cytotoxicity)，不会引起移植物抗宿主病(Graft-versus-Host Disease,GVHD)，因此，NK细胞可应用于异体移植治疗。在一些更加优选的实施方式中，上述高纯度的NK细胞产品和CAR-NK细胞产品用于人同源异体细胞治疗，但可以理解，用于同源异体细胞治疗的细胞产品不限于此。

以下通过具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一、抗体改造

改造实例1

抗人CD16细胞培养抗体的改造

本实施例将表达抗人CD16的鼠IgG1单克隆抗体3G8的V_H-C_H1段序列与表达人IgG4的C_H2-C_H3段序列拼接，然后与抗体3G8的轻链序列一起进行表达和纯化，得到改造抗体aCD16-SH。

选择小鼠IgG1-C_H1上一段(T₂₁₄KVDK₂₁₈)与人IgG4-C_H1上的相同的序列进行抗体序列的拼接，即在T₂₁₄之前的序列为小鼠IgG1-3G8的序列，在K₂₁₈之后的序列为人IgG4的序列。同时使用了人CD33的信号肽序列。

首先，如图1所示，用引物对Primer1-1F/Primer1-1R对鼠3G8抗体重链表达DNA序列进行扩增，获得其V_H-C_H1片段序列(图1A)。然后，用引物对Primer1-2F/Primer1-2R对人IgG4重链表达DNA序列进行扩增，获得其Hinge-C_H2-C_H3片段序列(图1B)。再用重叠PCR(Overlap-PCR)完成2个序列的拼接(图1C)，具体方法为：将纯化的上述2个PCR产物进行等摩尔数混合后，用60℃退火温度进行5个PCR循环反应，加入Primer1-3F和Primer1-2R，用72℃退火温度进行30个PCR循环反应。引物序列如下表所示。

Primer1-1F	ATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggttactctgaaagagtctg
		Primer1-1R	CTCAACTCTcttgtccaccttggtgctgctggc
Primer1-2F	gccagcagcaccaaggtggacaagAGAGTTGAG
		Primer1-2R	GGGCTTGCCGGCCGTCGCACtcatttacccagagacaggga
Primer1-3F	CTATCGATTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACT

纯化获得的PCR产物在经过限制性内切酶EcoRI(GAATTC)和NaeI(GCCGGC)处理后，插入表达质粒(pMD18-T为基础，包含CMV启动子、polyA Tail等表达元件)中，获得表达重链的质粒pM-3G8-HC-M1(图1D)。测序确认pM-3G8-HC-M1序列是正确的。

将用于表达3G8轻链的质粒pM-3G8-LC与上述用于表达改造后3G8重链的质粒pM-3G8-HC-M1进行等摩尔数混合，用线性化聚乙烯亚胺(Polyethylenimine Linear，PEI)共转染处于对数生长期的293F细胞。在37℃、5％CO₂培养5天后，离心收集培养基。用Protein A亲和层析纯化目标抗体蛋白，清洗和洗脱步骤的紫外吸收曲线如图2所示。对样品进行电泳检查，结果如图3所示，其中M为分子量标准(MW Ladder)，Lane 1和2为柱清洗部分的样品，Lane 3和4为洗脱峰的样品。再经过离子交换层析、脱盐柱层析，获得高纯度的抗体产品，命名为aCD16-(3G8-Fab)-(hIgG4-Fc)，简称aCD16-SH，其重链序列见SEQ ID NO.1。

改造实例2

抗人CD52细胞培养抗体的改造

本实施例将表达抗人CD52的人源化的IgG1型Campath-1H单抗的序列进行突变，然后进行表达和纯化，得到改造抗体aCD52-SH。

如图4所示，以表达Campath-1H单抗重链的序列(图4A)为模板，利用引物对Primer2-3F/Primer2-ARR、Primer2-ARF/Primer2-DSR、Primer2-DSF/Primer2-3R分别进行PCR获得3个片段后，再通过重叠PCR进行拼接。引物对序列如下表所示。

如图4B，纯化获得的PCR产物在经过限制性内切酶EcoRI(GAATTC)和NaeI(GCCGGC)处理后，插入表达质粒中，获得表达重链的质粒(pMA-C1H-HC)。序列中完成了L234A、L235R、P329D和A330S突变。测序确认pMA-C1H-HC序列是正确的。

将用于表达Campath-1H轻链的质粒pM-C1H-LC与上述用于表达改造后Campath-1H重链的质粒pMA-C1H-HC进行等摩尔数混合，用PEI共转染处于对数生长期的293F细胞。在37℃、5％CO₂培养5天后，离心收集培养基。经过Protein A亲和层析、离子交换层析、脱盐柱层析，获得高纯度的抗体产品，命名为aCD52-(C1H-Fab)-(FcA)，简称aCD52-SH，其重链序列见SEQ ID NO.2。对产品进行电泳检查，结果如图5所示，其中M为分子量标准(MW Ladder)，Lane 1和2为目标抗体。

改造实例3

抗人CD3细胞培养抗体的改造

本实施例将抗人CD3的小鼠IgG2a单抗OKT3的CDR序列插入到改造实例2的IgG1骨架上，然后进行表达和纯化，得到改造抗体aCD3-SH。

将OKT3轻链和重链的蛋白质序列与hIgG1-kappa(κ)轻链和hIgG1重链的分别进行序列比对(图6A，B)，确认6个CDR序列。化学合成经过密码子优化后的CDR表达DNA序列，通过重叠PCR等基因工程方法进行拼接，获得用于表达轻链的质粒pM-OKT3h-LC(图6C)和包含改造实例2中4个点突变的用于表达重链的质粒pMA-OKT3h-HC(图6D)。

在293F细胞中表达，经过Protein A亲和层析、离子交换层析、脱盐柱层析，获得高纯度的抗体产品，命名为aCD3-(OKT3h-Fab)-(FcA)，简称aCD3-SH，其重链序列和轻链序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。对产品进行电泳检查，结果如图7所示，其中M为分子量标准(MW Ladder)，Lane 1和2为目标抗体。

二、细胞培养和抗体活力检测

培养实例1

T细胞培养及抗人CD3抗体的扩增活力检测

本测试分别用改造实例3中获得的改造抗体aCD3-SH和其原型抗体OKT3来刺激人PBMC中T细胞(CD3+)的增殖，用MTS(CAS#138169-43-4)对细胞进行染色，来定量确定抗体的活力，即半数有效剂量(ED₅₀)。

材料

人静脉血，人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋，LTS1077)，IL-2(北京双鹭，注射用重组人白介素-2)，基础培养基X-VIVO5(Lonza，04-418Q)，完全培养基(X-VIVO5，IL-21000IU/mL)，CellTiter AQueous One Solution(Promega，G3580，即MTS溶液)，OKT3(Takara Bio，T210)。

准备抗体浓度梯度

取96孔平底细胞培养板，在孔内加入100μL完全培养基。用完全培养基稀释抗体至6.40μg/mL，在第1列孔内各加入100μL，混匀。从第1列向第11列孔内做梯度稀释(serialdilution)，即转移100μL，混匀后，继续向下一列转移。最后，每个孔内含100μL完全培养基，并形成了抗体的1:2稀释梯度，从第1列的1.60μg/mL到第11列的1.56ng/mL。

细胞培养

利用白细胞分离液分离人PBMC细胞，用基础培养基调整密度至3E5/mL。在96孔板第1列至第11列孔内各加入100μL细胞悬液，混匀。最后，每个孔内含200μL完全培养基和3E4细胞，并形成了抗体的1:2稀释梯度，从第1列的800ng/mL到第11列的0.781ng/mL。在37℃、5％CO₂培养5天。

数据采集和处理

每个孔内加入20μL MTS溶液。将平板放入细胞培养箱中继续培养6小时。用酶标仪读取490nm吸收光值。对读数取均值，再扣除空白(Blank，即第12列读数的均值)。以抗体浓度/OD做semi-log曲线，用4参数拟合方法(Four Parameter Logistic Regression)计算ED₅₀。

结果讨论

aCD3-SH的ED₅₀为18.9ng/mL(图8，空心圆圈)，原型抗体OKT3的ED₅₀为130ng/mL(图8，实心圆)，说明目标细胞T细胞对aCD3-SH更加敏感。同时，在饱和抗体浓度下，aCD3-SH的最大扩增信号也明显强于OKT3的。结果显示，改造抗体aCD3-SH明显具有更高的激发T细胞扩增的活力。

培养实例2

NKT细胞培养及抗人CD3抗体的扩增活力检测

本测试分别用改造实例3中获得的改造抗体aCD3-SH和其原型抗体OKT3来刺激人PBMC中NKT细胞(CD3+CD56+)的增殖，通过对细胞计数来比较活力。

材料

人静脉血，基础培养基GT-T551(TaKaRa，WK551T)，扩增培养基(GT-T551，IL-21000IU/mL)，细胞培养瓶T75(CORNING，430720)/T175(CORNING，431080)，IFN-γ(上海凯茂，注射用重组人干扰素γ伽玛)。

细胞培养和检测方法

利用白细胞分离液分离人PBMC细胞，用基础培养基调整细胞密度至2E6/mL，置于培养瓶内。在37℃、5％CO₂培养2小时，以使单核细胞贴壁。收集悬浮细胞，用基础培养基调整细胞浓度至1E6/mL。加入重组人IFN-γ(1000IU/mL)。在37℃、5％CO₂培养24小时。加入抗人CD3抗体(30ng/mL)和IL-2(1000IU/mL)，继续培养48小时。按照1:1体积比例添加扩增培养基，继续培养48小时。之后每隔48小时取样计数，用扩增培养基调整细胞密度至0.7E6/mL，继续培养。培养至第12～20天收获细胞，计数。

结果讨论

在一个为期12天的试验中，志愿者1(Donor 1)的PBMC在使用aCD3-SH时可以扩增146.9倍(图9A，空心圆圈)，而使用OKT3时可以扩增50.4倍(图9A，实心圆)。在对志愿者2(Donor 2)PBMC的19天扩增试验中，分别是491倍和251倍(图9B)。结果显示，改造抗体aCD3-SH具有更高的激发NKT细胞扩增的活力。

培养实例3

NK细胞特异性扩增和纯度检测

本测试取志愿者提供的血样，分离PBMC后平均分为2份，分别用改造获得的改造抗体aCD3-SH、aCD16-SH和aCD52-SH(试验组)和原型抗体OKT3、aCD16-3G8和Campath-1H(对照组)进行培养，并刺激人PBMC中NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的增殖，通过对细胞成分分析来比较抗体组的功能。

材料

人静脉血，基础培养基X-VIVO15(Lonza，04-418Q)，扩增培养基(X-VIVO15，IL-21000IU/mL)，人血清(Genimi，100-512)。

细胞培养和检测方法

分离PBMC细胞，用基础培养基调整细胞密度到1E6/mL。加入试验组或对照组抗体、IL-2(1000IU/mL)、人血清(5％)。在37℃、5％CO₂培养72小时。加入等体积的扩增培养基，继续培养48小时。之后每隔48小时取样计数，用扩增培养基稀释细胞至0.7E6/mL，继续培养。培养至第14天收获细胞，用荧光抗体PerCP Mouse Anti-Human-CD3(BD Biosciences，552851)、APC-Cy7 Mouse Anti-Human-CD16(BD Biosciences，557758)、PE Mouse Anti-Human-CD56(BD Biosciences，555516)进行流式细胞检测。

结果讨论

试验组扩增获得的细胞中CD3-CD56+的NK细胞占比为97.6％(图10A)，高于对照组获得的71.8％(图10B)。在这群细胞中，CD3-CD16+CD56+的NK细胞占比分别是96.2％(图10C)和71.7％(图10D)。那么，在总细胞群中，利用试验组扩增获得的CD3-CD16+CD56+的NK细胞可达到总细胞的93.9％，优于用对照组获得的51.5％。结果显示，利用试验组抗体获得的NK细胞产品的纯度更高。

三、细胞产品应用

应用实例1

NK细胞产品对肿瘤细胞的体外杀伤活力检测

本测试用培养实例3中的试验组扩增获得的NK细胞产品(试验组)和对照组扩增获得的NK细胞产品(对照组)分别对淋巴瘤细胞系Raji、乳腺癌细胞系BT-474、乳腺癌细胞系MCF7进行直接杀伤和ADCC杀伤试验，通过对终产品活力分析来比较改造抗体和原型抗体的活力。

材料：Raji细胞(ATCC，CCL-86)，BT-474细胞(ATCC，CRL-3247)，MCF7细胞(ATCC，HTB-22)，检测试剂盒CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega，G1780)，培养基RPMI 1640(ThermoFisher，11879020)，利妥昔单抗Rituximab，曲妥珠单抗Trastuzumab。

检测方法

传代培养肿瘤细胞，收集细胞后用培养基调整密度到1E5/mL，在96孔板的各孔内加入100μL。收集NK细胞，用培养基调整密度到1E5/mL或是5E5/mL，在相应的孔内加入100μL。利妥昔单抗Rituximab用培养基浓度调整到2mg/mL，在相应的孔内加入5μL。曲妥珠单抗Trastuzumab用培养基浓度调整到2mg/mL，在相应的孔内加入5μL。按试剂盒说明书准备细胞自发释放孔(仅含Raji、BT-474、MCF7或NK一种细胞)、靶细胞最大释放孔(仅含Raji、BT-474或MCF7细胞一种细胞)、体积校正孔(不含任何细胞)。

准备对靶细胞杀伤试验孔(Raji+NK、BT-474+NK、或是MCF7+NK)、ADCC杀伤试验孔(Raji+NK+Rituximab，BT-474+NK+Trastuzumab，MCF7+NK+Trastuzumab)。其中，对Raji细胞的杀伤试验加入1E5/mL的NK细胞100μL，即E/T＝1:1。而对BT-474和MCF7的杀伤试验加入5E5/mL的NK细胞100μL，即E/T＝5:1。在37℃、5％CO₂培养3小时。向靶细胞最大释放孔、体积校正孔中加入20μL裂解液(Lysis Solution)。继续培养45分钟。

从每孔转移50μL上清至另一新的96孔板中，按检测试剂盒方法配制底物溶液，每孔加入50μL底物溶液(Substrate Solution)，避光室温孵育30min后每孔加入50uL反应停止溶液(Stop Solution)。在读板机(Molecular Devices，SpectraMax M5 MicroplateReaders)上读取490nm吸收光值。

杀伤率计算公式如下：

杀伤比例＝(杀伤试验信号–效应细胞自发释放信号–靶细胞自发释放信号)/(靶细胞最大释放信号–靶细胞自发释放信号)×100％

结果讨论

对Raji细胞的杀伤试验结果如图11所示。可以看到，NK细胞对Raji细胞在E/T＝1:1时已有基础直接杀伤，但两组的杀伤率相差不大。在加入Rituximab后，NK细胞被激活，试验组NK的杀伤率从14.7％提升到85.0％。对照组NK同样也被激活，但仅从12.5％提升至56.2％，与试验组的有明显差距。ADCC杀伤是特异性的，在加入Trastuzumab时，NK细胞不会被激活，两组NK细胞在这种条件下的直接杀伤率相差不大。

对BT-474和MCF7细胞的杀伤试验结果如图12和图13所示。可以看到，试验组NK细胞对BT-474细胞的杀伤率与对照组的相比，无论是直接杀伤还是ADCC杀伤，都明显占优。同样，试验组NK细胞对MCF7细胞的杀伤率与对照组的相比，无论是直接杀伤还是ADCC杀伤，都明显占优。

应用实例2

NK细胞产品对肿瘤细胞的动物体内直接杀伤活力检测

本测试用培养实例3中的试验组扩增获得的NK细胞产品在小鼠Raji-Luc血液瘤模型上进行体内杀伤试验，来确定NK细胞的体内活力。

材料

NSG小鼠(6-8周龄)，Raji-Luc细胞(含稳定转染荧光素酶的Raji细胞)。

检测方法

传代培养Raji-Luc细胞，收集细胞后用PBS调整密度至5E6/mL，经尾静脉注射100μL至每只NSG小鼠体内。48小时后将小鼠根据体重随机分为2组，分别经尾静脉注射生理盐水100μL(对照组)和NK细胞1E7(试验组)。在体内成像仪(PerkinElmer，IVIS Lumina LT InVivo Imaging System)上测量肿瘤生长情况，收集成像信号图和信号强度。

结果讨论

在一个为期19天的试验中，对照组小鼠的平均成像信号强度增长到了9.16E6 p/sec/cm²/sr，而试验组的到了1.63E6 p/sec/cm²/sr，为对照组的17.8％(图14)。结果显示，NK细胞具有明显的体内杀伤活力。

应用实例3

NK细胞产品对肿瘤细胞的动物体内ADCC杀伤活力检测

本测试用培养实例3中的试验组扩增获得的NK细胞产品和治疗用抗体在小鼠Raji-Luc血液瘤模型上进行体内ADCC杀伤试验，来确定NK细胞的体内活力。

材料

NSG小鼠(6-8周龄)，Raji-Luc细胞(含稳定转染荧光素酶的Raji细胞)，利妥昔单抗Rituximab。

检测方法

按照应用实例2的方法建立小鼠Raji-Luc血液瘤模型后，分为4组，分别注射生理盐水(G1，空白组)、利妥昔单抗(G2)、NK细胞(G3)和联合用药(G4，即同时输入利妥昔单抗和NK细胞)。继续饲养，定期测量肿瘤生长情况，观察动物生长和生存状态。

结果讨论

从各组小鼠的存活结果(图15)和肿瘤影像结果(图16)中可看到，来源于肿瘤细胞的荧光信号逐渐上升，小鼠逐渐死亡。G1组在26天达到中位生存期，在30天时全部死亡。G2组中，在51天达到中位生存期，在75天试验结束时尚有2只存活。G3组中，在75天时有3只存活。G4组在61天最后一次成像检测时6只皆存活，在75天时有5只存活。

在整体存活率和肿瘤成像信号的比较上，联合用药组的治疗效果数据都明显优于空白组和单独用药组的。说明利妥昔单抗与本发明得到的NK细胞联合使用时的体内ADCC杀伤作用明显。

应用实例4

NK细胞产品在肝细胞癌治疗上的临床研究

本研究选择晚期肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)患者，输入按照培养实例3中扩增方法来制备的NK细胞产品，观察病人的短期和长期反应，来初步探索采用同源异体高纯度人NK细胞治疗方案的安全性与有效性。

材料

NK细胞经过收集和清洗后配制为细胞制品，细胞活率大于90％，NK细胞纯度大于90％。

研究方法

意向病人在通过入选和排除筛查后，开始1-2个NK细胞治疗疗程，每个疗程间隔1-3月。每个疗程包含2次NK细胞治疗，间隔5～10天。每次治疗输入1～2E9个NK细胞，输入前后记录病人体征变化和主述。第一个疗程结束后开始随访，直至治疗后2年或病人因各种原因退出本研究。

结果讨论

在一个通过了临床试验伦理审查委员会审查的临床试验中，有33人进行共计38个疗程的治疗。NK细胞输入后，多数病人没有不适症状，少数病人(4人次，占总数5.3％)有发热反应，退热处理后第二天恢复。结果显示，本发明得到的高纯度的NK细胞产品可以保证同源异体细胞治疗的安全性，同时有潜力解决病人免疫力低下的困境。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京时合生物科技有限公司

<120> 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 2

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

65 70 75 80

Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Arg Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Asp Ser Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Arg Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Asp Ser Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

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100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

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130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养体系中添加改造抗体；

其中，所述改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述改造抗体的轻链为抗人CD16的鼠IgG1单克隆抗体3G8的轻链；

或所述改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述改造抗体的轻链为抗人CD52的人源化的IgG1型Campath-1H单抗的轻链；

或所述改造抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述改造抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述培养体系中有部分细胞的表面具有Fc受体。

2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，表面具有Fc受体的所述细胞选自淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞、DC细胞、巨噬细胞和单核细胞中的一种或多种。