CN111419829B - 和厚朴酚在抑制猪链球菌或其生物被膜中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了和厚朴酚在抑制猪链球菌或其生物被膜中的用途。本发明发现和厚朴酚或其药学上可接受盐具有抑制猪链球菌及其生物被膜的形成或杀灭成熟的生物被膜内的猪链球菌的作用。本发明利用标准微量稀释法测定了和厚朴酚对猪链球菌MIC值，结果发现，和厚朴酚对猪链球菌的抑制MIC值接近抗生素MIC值。本发明利用高通量静态生物被膜系统法构建的体外生物被膜模型通过结晶紫法和扫描电镜研究发现亚抑菌浓度和厚朴酚能减少猪链球菌生物被膜形成并破坏猪链球菌生物被膜立体结构。本发明公开了由和厚朴酚为主要活性成分的抑制猪链球菌或其生物被膜的药物组合物，其安全性好，不存在药物残留、细菌耐药性、变态反应及消化道出血等问题。

Description

和厚朴酚在抑制猪链球菌或其生物被膜中的用途

技术领域

本发明涉及和厚朴酚的新药理用途，尤其涉及和厚朴酚或其药学上可接受盐在抑制猪链球菌或猪链球菌生物被膜中的新用途，属于和厚朴酚的新药理用途领域。

背景技术

猪链球菌病是一种全球范围内影响严重的人畜共患传染病。其中尤以荚膜血清2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2SS2)病原菌传染性和致病性最强，被世界动物卫生组织列为B群动物疫病，中国将其列为2类动物疫病，给养猪业和公共卫生安全带来巨大的危害。猪链球菌感染不但可致猪急性败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎和急性死亡，尤为严重的是还可以感染人，引起人的关节炎和中毒性休克综合征甚至危及生命。临床上分离的毒性SS2菌株可以形成生物被膜(Biofilm,BF)，生物被膜可通过形成致密的三维群落结构保护菌体对抗宿主的吞噬清除作用和抗生素杀菌作用，以实现猪链球菌对宿主的持续感染，这也是猪链球菌难治愈和反复发作的主要原因。BF是指细菌为了适应外部环境的变化而被自身分泌的胞外基质包裹形成的一种有别于浮游菌的特殊结构。形成BF后相比浮游菌相同条件下治疗会更困难10-1000倍。

目前，临床分离的猪链球菌在自然界中主要以群体的方式-即BF形式存在，BF是由胞外多聚物(extracellular polymeric substance,EPS)和基质网(matrix)包被的高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物。与单细胞浮游细菌不同，形成群体生物菌落表现出一系列新的生物学特征并具有更强的适应外界环境的能力。猪链球菌BF的形成是一个动态过程，细菌首先完成定植和粘附，经历生长期后达到成熟，成熟的生物被膜内部结构近似原始的循环系统，在微菌落间存在输水通道，运输新陈代谢所必须的酶与养料并把代谢产物和废物排出体外。成熟后的生物被膜由于营养物质等原因会从定植表面脱落并破裂，使细菌恢复到浮游菌状态，到达BF的播散期。浮游菌继续完成黏附、生长、分裂、分化这一过程，开始进入下个生物被膜形成周期。具有三维结构的菌落系统类似高等生物的发育周期也是导致细菌产生抗药性和感染性疾病难以治愈的重要原因。

被生物被膜包围的细菌称为被膜菌(biofilm bacteria)，游离与生物被膜之外独立生长的细菌称为浮游菌(planktonic bacteria)，被膜菌与浮游菌在形态学上存在着显著差异。普通抗生素可以直接杀灭生物被膜表面的浮游菌，但由于生物被膜的屏障保护作用，使得抗生素难以到达被膜内部起到效果。此外，被膜内细菌氧气供应不足和代谢产物累积，从而使细菌生长缓慢，对抗菌药物不敏感，是细菌产生耐药性的主要原因。同时，细菌生物被膜侵袭机体之后，不断释放抗原诱导机体产生特异性抗体，胞外基质(EPS)起着物理屏障和将细菌与机体免疫系统隔离的作用，从而使自然杀伤细胞、吞噬细胞、特异性抗体、溶菌酶、致敏性T细胞等对细菌的免疫作用丧失。

综上所述，猪链球菌形成生物被膜后导致细菌产生抗药性和感染性疾病难以治愈。目前，干预猪链球菌生物被膜形成的常用药物有红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素和阿司匹林。但是抗生素及非甾体类抗菌药物只能杀灭浮游菌，并不能真正杀灭被膜菌，长期应用后，还会出现药物残留、细菌耐药性、变态反应及消化道出血等问题，亟待需要研制能够有效干预猪链球菌生物被膜且不存在这些副作用的药物。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够有效抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜的药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明人经过实验发现和厚朴酚或其药学上可接受盐具有抑制猪链球菌及其生物被膜的形成或杀灭成熟的生物被膜内的猪链球菌的作用。

本发明人按照美国临床实验室国家标准委员会(NCCLS)推荐的标准微量稀释法测定和厚朴酚或其药学上可接受盐对猪链球菌最小抑菌浓度(Minimum inhibitoryconcentration，MIC)实验发现，MIC值为1.6μg/ml～3.2μg/ml，已经接近甚至低于普通抗生素的MIC，这表明和厚朴酚具备直接开发成抑制猪链球菌或猪链球菌生物被膜药物的能力。

为了研究和厚朴酚或其药学上可接受盐抑制猪链球菌生物被膜的作用，本发明人首先采用高通量静态生物被膜系统法(high-throughput static culture system)体外构建了猪链球菌生物被膜模型，再通过结晶紫法和扫描电镜研究了和厚朴酚或其药学上可接受盐对猪链球菌生物被膜的抑制作用；结果发现，亚抑菌浓度的厚朴酚或其药学上可接受盐作用于猪链球菌ATCC700794生物被膜后，与对照相比，1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC和厚朴酚或其药学上可接受盐作用下可减少猪链球菌生物被膜形成(P<0.05)，这说明厚朴酚或其药学上可接受盐具有很好的抑制猪链球菌生物被膜形成的作用；通过扫描电子显微镜观察1/2MIC厚朴酚或其药学上可接受盐干预猪链球菌ATCC700794生物被膜立体结构，空白对照组猪链球菌呈现为大量单细胞菌落聚集体，可形成密集浮游菌细胞致密堆积的呈一定厚度的层状结构，而1/2MIC处理组只有少量细菌黏附于盖玻片表面，立体结构消失，这表明和厚朴酚或其药学上可接受盐干预猪链球菌生物被膜形成。

本发明的另一目的是提供一种抑制抑制猪链球菌或猪链球菌生物被膜的药物组合物，该药物组合物是以和厚朴酚或其药学上可接受盐为主要活性成分或唯一成分，加入药剂学可接受的辅料或载体制成的药物组合物。

所述的载体或辅料是指药剂学领域常规的载体或辅料，这类载体包括但并不限于稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂或/和表面活性剂中的任何一种或多种；例如：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、淀粉、微晶纤维素粉剂及上述(但并不限于)组合。另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂；药物制剂应与给药方式相匹配。

所述药物组合物的剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、注射剂或口服液。

所述药物组合物为单元剂型，每个单元剂型中活性成分和厚朴酚或其药学上可接受盐的含量约为药物组合物总重量的0.01％～10％。

所述药物组合物可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。

所述药物组合物中和厚朴酚或其药学上可接受盐安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约5微克/千克体重-约1毫克/千克体重。

所述和厚朴酚或其药学上可接受盐是天然中草药提取或化学合成；其中，所述和厚朴酚的化学结构式为式I所示；所述和厚朴酚或其药学上可接受盐的化学结构式为式Ⅱ所示。

其中，M为钾(K)或钠(Na)。

本发明中所述的猪链球菌包含猪或人或其他哺乳动物感染的猪链球菌，较佳的为血清型2-型猪链球菌。

本发明首次发现和厚朴酚或其药学上可接受盐在抑制猪链球菌感染方面的全新功能：高浓度的和厚朴酚或其药学上可接受盐可以诱导猪链球菌细胞凋亡，直接杀灭猪链球菌；低浓度的和厚朴酚或其药学上可接受盐则可有效抑制猪链球菌及其生物被膜形成，破坏猪链球菌立体结构，和厚朴酚或其药学上可接受盐可有效抑制猪链球菌及其生物被膜形成。

本发明发现和厚朴酚或其药学上可接受盐抑制猪链球菌MIC值为1.6-3.2μg/ml，有效剂量已经接近抗生素的MIC，具备直接开发成药物的能力。

本发明具有广阔的潜在应用前景，可直接利用含有和厚朴酚的中草药厚朴开发中药治疗猪链球菌感染，还可利用和厚朴酚或其药学上可接受盐直接开发抑制猪链球菌生物被膜的药物，安全性好，不会出现药物残留、细菌耐药性、变态反应及消化道出血等严重问题，为猪链球菌的感染提供了新的治疗方法。

附图说明

图1为不同时间体外构建猪链球菌生物被膜形成能力。

图2为不同亚抑菌浓度和厚朴酚对猪链球菌生物被膜形成能力影响。

图3扫描电子显微镜观察1/2MIC和厚朴酚对猪链球菌生物被膜的影响结果；(A)扫描电镜观察猪链球菌阳性对照生物被膜形成效果；(B)为扫描电镜观察1/2MIC亚抑菌浓度处理后猪链球菌生物被膜形成效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1实验材料

1.1实验菌株

猪链球菌ATCC700794购自美国标准菌种收藏中心。

1.2实验试剂

和厚朴酚购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司

2溶液配制和统计分析方法

和厚朴酚母液的配制：用分析天平准确称量一定量的和厚朴酚并溶于40％乙醇溶液中，浓度为100mg/mL，分装于1.5mL的EP管中，每管50μL。取1mL药物。将药物过0.22μm的有机相滤膜，在用40％乙醇溶液倍比稀释。供测量MIC使用。

THB液体培养基：称取酵母粉0.6g，氯化钠0.4g，碳酸钠0.5g，牛肉膏1g，葡萄糖2g放入锥形瓶中，加入200毫升蒸馏水，超声溶解，用5mol/L的盐酸调节PH至7.2左右，115℃高压蒸汽灭菌15分钟。(在使用前加入血清)

TSB液体培养基：称取酪蛋白胨3.4g，大豆木瓜蛋白酶消化物0.6g，氯化钠1g，磷酸二氢钾0.5g放入锥形瓶中，加入200毫升蒸馏水，超声溶解，用5mol/L的盐酸调节PH至7.0左右，煮沸，加入0.5g葡糖糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，115℃高压蒸汽灭菌15分钟。

菌液的配制：用500mL锥形瓶配制200mL的液体培养基，进行高压灭菌后，烘干后冷却至室温，备用。取在-20℃下保存ATCC700794猪链球菌，在超净台中的点燃的酒精灯附近进行，分别用接种环蘸取菌液接种，培养于两个加入适量液体培养基的5mL玻璃试管中，空白对照管只加入适量THB液体培养基，标记接种的菌种和接种日期后，放入37℃恒温培养箱中培养12h。以相同接种方法对猪链球菌进行传代纯化培养几代后，即可备用。将传代猪链球菌用0.9％氯化钠溶液稀释，用麦氏比浊法对菌液浓度确定为1.0×10⁸CFU/mL，再将菌液稀释1000倍，最终菌液浓度为1.0×10⁵CFU/mL，备用。

统计学数据分析：本实验数据采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理与分析，数据以表示，采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较(P<0.05为差异性显著)。

实验例1和厚朴酚对猪链球菌MIC值测定实验

参照结晶紫染色法测定生物被膜形成能力：利用96孔组织培养板采用用高通量静态生物被膜系统法(high-throughput static culture system)体外构建了猪链球菌生物被膜模型，在595nm处测定OD值。

测定结果为图1所示，猪链球菌在72h时可形成稳定的生物被膜，体外构建猪链球菌生物被膜成功，在595nm处测定OD值为0.3719，可用于后续和厚朴酚抑制猪链球菌生物被膜实验。

和厚朴酚对猪链球菌MIC测定：取96孔板，在超净台的无菌条件下，在第2～4列的第1～8孔中，每孔加入200μL稀释过的菌液；在每行的第一个孔中加入200μL处理好的和厚朴酚溶液，采用微量倍比稀释法，一直稀释到第8个孔，最后一个孔混匀后弃去200μL。选择3个空余孔只加入200μL稀释的猪链球菌溶液作为对照，将96孔板盖好，放37℃恒温培养箱中培养，24h后观察结果，无菌的药物浓度即为药物抑制细菌最低浓度MIC。

测定结果为表1所示，在和厚朴酚浓度1.96μg/mL时，猪链球菌生长受到抑制，由此确定和厚朴酚对猪链球菌的MIC为1.96μg/mL，和厚朴酚对猪链球菌有优良抑菌效果，其MIC已经接近甚至超过普通抗生素的MIC。最小抑菌浓度(Minimum inhibitoryconcentration，MIC)是指能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。如果测定MIC值越小，说明该药物抑制细菌的能力越大，药效越强。和厚朴酚对猪链球菌的MIC为1.96μg/mL，已经接近甚至超过普通抗生素的MIC，说明和厚朴酚具备直接开发成治疗猪链球菌病药物潜力。

表1和厚朴酚对S.suis最小抑菌浓度(MIC)测定结果(μg/ml)

注：“－”表示细菌生长抑制，培养液清亮；“+”表示细菌生长，培养液浑浊

实验例2和厚朴酚对猪链球菌生物被膜形成能力影响的测定实验

和厚朴酚药物的配制：由上述MIC试验所得MIC值，用已过滤的40％乙醇配制浓度为10MIC的和厚朴酚药物1000μL，并用无菌滤膜过滤，备用。取5个EP管，分别标记好MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC。向各管中加入500μL的40％乙醇。向第一管中再加入500μL的10MIC和厚朴酚药物，充分混匀后吸取500μL加入第二管中，然后依次类推进行微量倍比稀释，分别得500μL的浓度为10×MIC、10×1/2MIC、10×1/4MIC、10×1/8MIC、10×1/16MIC的和厚朴酚药物。

和厚朴酚对猪链球菌生物被膜的形成影响：在96孔板第二排第二孔开始的四个孔内，加入180μL猪链球菌菌液，在第二孔内加入20μL的MIC管中的和厚朴酚药物，在第三孔中加入20μL的1/2MIC管中的和厚朴酚药物，第四孔内加入20μL的1/4MIC管的和厚朴酚药物，以此类推，得到浓度分别为MIC，1/2MIC，1/4MIC，1/8MIC，1/16MIC的和厚朴酚药物。在第八孔中加入200μL的菌液做阳性对照，在第九孔加入200μL的THB培养基做阴性对照。每个浓度做6组平行对照，在边孔加入200μL的生理盐水，盖好盖子，37℃，50rmp摇床上孵育72h。将形成了生物被膜的96孔板倒置于滤纸上，以除去菌液，然后将96孔板浸入磷酸缓冲液中，以除去未粘附的细菌，多余液体通过倒置96孔板于滤纸上除去，加入200μL的99％的甲醇固定30min后风干，再加入200μL的1％的结晶紫溶液染色30min，流水冲洗后风干，再加入200μL的33％冰醋酸置于振荡器震荡，10min以释放生物被膜中的结晶紫。酶标仪595nm处测定OD值。

测定结果如图2所示，猪链球菌ATCC700794可在体外形成成熟生物被膜，在亚MIC浓度和厚朴酚(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC)作用下可减少猪链球菌生物被膜形成(P<0.05)，随着和厚朴酚浓度的减小，干预猪链球菌生物被膜能力减弱，1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和厚朴酚干预猪链球菌生物被膜形成的作用明显，1/16MIC和厚朴酚(0.00.0156mg/mL)干预细菌生物被膜能力减弱明显。经过SPSS软件分析，每个浓度的OD值与空白对照存在显著性差异，P<0.05。实验结果表明说明猪链球菌对猪链球菌的生物被膜有明显的干预或抑制作用(图2)。

实验例3扫描电镜观察和厚朴酚对猪链球菌形态学影响实验

在无菌条件下从TSB琼脂平板上挑取猪链球菌ATCC700794单菌落，接种于无菌的TSB液体培养基中，在恒温培养箱中37℃培养到对数期后，稀释猪链球菌菌液使其浓度为1×10⁵CFU·mL^-1，取2mL稀释后的猪链球菌菌液加到6孔组织培养板内。将盖玻片加入到6孔组织培养板内，然后向6孔组织培养板内加入1/2MIC和厚朴酚药物，在37℃恒温培养箱中静止培养，在24h取出盖玻片。设立阴性对照组。盖玻片用灭菌PBS冲洗，以去除浮游细菌，于4℃冰箱中用戊二醛固定1h，然后用PBS冲洗两次，每次10min，依次再用50％、70％和90％乙醇脱水一次，每次15min，然后用100％乙醇脱水二次，每次15min，最后100％乙醇与叔丁醇1:1；纯叔丁醇各一次后，每次15min，用冷冻干燥仪对样品进行干燥4h。样品表面在真空条件下镀一层厚150A的金属膜，扫描电子显微镜下观察生物被膜形成情况。

扫描电子显微镜下观察结果如图3所示，通过扫描电子显微镜观察1/2MIC和厚朴酚抑制猪链球菌ATCC700794生物被膜；图A为空白对照组的生物被膜，图B为1/2MIC和厚朴酚处理后的生物被膜。从图A中可以看出未经和厚朴酚处理组的猪链球菌ATCC700794强烈黏附于盖玻片表面，形态不同于游离菌的大面积的猪链球菌落聚集体，猪链球菌单细胞致密堆积构成三维立体结构；从图B可以看出，猪链球菌ATCC700794经1/2MIC和厚朴酚处理后，只有少量细菌黏附于盖玻片表面，呈现表面浮游菌的存在状态，生物被膜立体结构消失，表明和厚朴酚对猪链球菌生物被膜具有很好的抑制作用。

Claims (3)

1.和厚朴酚或其药学上可接受盐在制备抑制猪链球菌生物被膜药物中的用途；所述猪链球菌为血清型2-型猪链球菌，所述的药物用于治疗猪链球菌感染。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述和厚朴酚药学上可接受盐为和厚朴酚二钠盐、和厚朴酚二钾盐或其他可溶性盐类。

3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的猪链球菌为猪、人或其他哺乳动物感染的猪链球菌。