CN104173324A - 和厚朴酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了和厚朴酚在制备抑制葡萄球菌生物被膜的药物中的应用，利用药物敏感性实验分别测定和厚朴酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物被膜的抑制效果，再通过绘制杀菌曲线、结晶紫半定量法进一步验证和厚朴酚的抑制效果。另外，通过对细胞间多糖黏附素（PIA）合成和胞外DNA（eDNA）释放的影响及其对编码纤连蛋白结合蛋白基—fnbA和fnbB转录水平的考察，说明和厚朴酚对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜生长具有良好的作用。

Description

和厚朴酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的应用

技术领域

本发明属生物医药领域，具体涉及和厚朴酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的应用。

背景技术

细菌引发的感染已成为感染性疾病的主要原因之一, 具有耐药性和难治性的特点, 而且还可以对抗机体的免疫清除作用, 对人类和动物的健康造成很大的危害, 也给人们生活的其他方面带来了越来越严重的影响, 引起了基础和临床研究的极大关注。细菌生物被膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落。细菌生物被膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上，包括自来水管道，工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官，据专家估计几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物被膜。特别是生物医学材料如静脉插管、人工心脏瓣膜、人工关节表面均易形成生物被膜。据报道，生物被膜可提高细菌对杀菌剂的抵抗能力50-5000倍。葡萄球菌属细菌生物被膜已成为引起很多严重感染久治不愈和反复发作的重要原因之一。更重要的是约65%的人类细菌性感染是由生物被膜引起的。因此寻找一种可以有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜生长，并且可以安全使用的物质具有重大作用和意义。

厚朴酚及其异构体和厚朴酚是由一苯丙素的侧链和另一苯丙素的苯核聚合而成的二聚体，称之谓新木脂素，在樟科植物中发现较多，为中药厚朴抗菌消炎的有效成分。

发明内容

本发明的目的是为解决葡萄球菌属细菌生物被膜引起很多严重感染久治不愈和反复发作的问题，而提供一种抑制葡萄球菌生物被膜的药物，和厚朴酚。

和厚朴酚在制备抑制葡萄球菌生物被膜的药物中的应用；

所述的葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。

和厚朴酚在制备治疗感染葡萄球菌久治不愈和反复发作疾病的药物中的应用。

本发明提供了和厚朴酚在制备抑制葡萄球菌生物被膜的药物中的应用，利用药物敏感性实验分别测定和厚朴酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物被膜的抑制效果，再通过绘制杀菌曲线、结晶紫半定量法进一步验证和厚朴酚的抑制效果。另外，通过对细胞间多糖黏附素（PIA）合成和胞外DNA（eDNA）释放的影响及其对编码纤连蛋白结合蛋白基—fnbA和fnbB转录水平的考察，说明和厚朴酚对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜生长具有良好的作用。

附图说明

图1时间―杀菌曲线实验结果；(◆)空白; (                                                ) 4 μg/ml ; (▲) 8μg/ml; () 16 μg/ml () 32μg/ml；

图2纸片扩散法实验结果；

图3结晶紫半定量实验结果；

图4 PIA实验结果；

图5 eDNA实验结果；

图6 fnbA和fnbB转录水平检测实验结果。

具体实施方式

本发明中受试菌包括：9株临床株，以及1株对照用质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213。

天然化合物和厚朴酚，分子式为C₁₈H₁₈O₂，分子量为266.33，其化学结构为：

和厚朴酚

实施例1

微量稀释法药物敏感性实验：用MHB培养基将和厚朴酚贮存液稀释倍比稀释，每孔100 μL加入96孔板。将过夜培养的取菌液用MHB 培养基稀释至OD600为0.4（相当于5×10⁸ CFU/mL），并进一步稀释至浓度为10⁶ CFU/mL。每孔加100 μL菌悬液，以MHB 作阴性对照，不加药物的菌悬液为阳性对照。混合均匀后放37℃温箱静置培养，24 h后观察结果。能抑制细菌生长的最低浓度为菌株的MIC值，将每孔的细菌吹打均匀后倒入MHA平板，不长菌的最低浓度为MBC值，试验重复3次，取中位数为最终值。和厚朴酚对金黄色葡萄球菌悬浮菌（见表1）

实施例2

平板擦拭法药物敏感性实验：固体TSB培养平板挑单菌落入含5 mL TSB的试管中，放入37 ℃摇床中180 r/min过夜培养；取菌液用TSB（含0.5%葡萄糖）培养基稀释至 OD600为0.4（相当于5×10⁸ CFU/mL），并进一步稀释至浓度为10⁵ CFU/mL；在96孔板中每孔小心加入200 μL稀释菌液，放入37 ℃温箱中静置培养 24h。形成生物被膜后，弃去悬液，每孔加入250 μL PBS 轻轻洗去游离的细菌，将药物用 TSB培养基连续两倍稀释（0.0625～512 μg/mL）后加入各孔。在 37 ℃ 培养24 h。弃去悬液，用 PBS洗1次，加入250 μL PBS，将生物被膜吹打均匀后，每孔中取10 μL 涂于TSA上，37 ℃培养24 h。与对照孔菌量相同或少于对照孔（对照孔加入PBS）的最低药物浓度为最小抑制生物被膜生长浓度（MBIC），未见细菌生长的最小药物浓度为最小杀生物被膜浓度（MBBC）。实验重复 3 次。生物被膜的药物敏感性试验（见表1）。

   

 实施例3

纸片扩散法实验：用灭菌棉签将细菌涂布到平皿培养基上，将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片有规律的贴到平皿培养基表面。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。当药物浓度增加时，抑菌圈也明显增大（见图2）。

实施例4

时间―杀菌曲线实验：临床耐药金黄色葡萄球菌 SA56以1:100接种至5mL LB培养液，于37℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期期。在紫外分光光度计600nm处测定菌液OD值，以LB液体培养基稀释并调整菌液浓度至OD值为0.4（以血细胞计数板计数，约相当于5×10⁸细胞/mL），将此菌液稀释1000倍，得到浓度为5×10⁵细胞/mL的菌液。上述菌液各分5份，每份8mL菌液，分别加入和厚朴酚4、8 16、32 μg/mL、空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5%，37℃，200 rpm振荡培养。分别于0、3、6、24和48h后，所有菌液中各取100μL，再用0.9%生理盐水10倍系列稀释，从不同稀释倍数的菌液中各取10μL均匀涂布于琼脂固体培养基表面。平皿于37℃真菌培养箱中培养24h后计数菌落数目，计算活菌落数目（CFU），以log₁₀ CFU/mL对时间作曲线。随着药物浓度的增加和时间的增长，细菌菌落数逐渐减少，并绘制成时间―杀菌曲线（见图一）。

实施例5

结晶紫半定量实验：将金黄色葡萄球菌在含有 0.5%葡萄糖的 TSB 培养基（TSBg）中过夜培养并作200倍稀释，按每孔100 μL加入96孔板，将和厚朴酚倍比稀释，以培养基为空白对照，每孔加入100 μL，37 ℃培养24 h；PBS洗去浮游菌，加入Bouin's固定液固定 1h；PBS洗3次，加入1%结晶紫染色30min，用自来水洗去浮色；待膜干后，每孔用 200 μL乙醇:丙酮=80:20（v/v）溶解，于570nm波长下检测。试验以TSB液体培养基作为空白对照，同一试验重复测定3次。通过结晶紫染色方法，可明显观察到被膜的减少，并通过酶标仪测定吸光度进行定量（见图三）。

实施例6

PIA提取与检测：平板挑取单菌落至5 mLTSB 培养基，放入 37 ℃摇床中180 r/min过夜培养；取菌液用TSB培养基适当稀释稀释至OD600为0.4（相当于 5×10⁸ CFU/mL），并进一步稀释至浓度为10⁶ CFU/mL，加入6孔板，每孔2 mL; 用TSB培养基将和厚朴酚倍比稀释后加入6孔板，以培养基为空白对照，37 ℃培养24 h；用 3 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)/g（湿重）重悬生物被膜，100 ℃水浴5 min，10000 r/min离心1 min，取上清。加入蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃水浴2 h。取10 μL点样，点样过程保持NC膜湿润，4℃封闭过夜。加入辣根过氧化物酶连接的小麦麦胚凝集素（WGA-HRP），37℃孵育1 h。取出膜用1×TBST溶液平缓摇动洗膜15min×2次，再用1×TBS洗膜，15min×1 次。ECL发光液显色。细胞间粘附素（PIA）采用圆点印迹法，结果表示当浓度增加时，圆点颜色越淡（见图五）。

实施例7

eDNA 提取与检测：培养生物被膜，加入0.5mol/L EDTA 预冷1h；用700 μL 50mmol/LTEN 缓冲液（Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl）重悬生物被膜，用酶标仪检测OD600细菌浓度，转入预冷的离心管中，4 ℃，18000 r/min离心5min；将上清转入新的离心管，加入300 μL TE缓冲液，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）；4℃，12000 r/min 离心10 min，取上清，用氯仿：异戊醇（24:1）再次萃取；取水相，加入3倍体积的冷乙醇和1/10体积的醋酸钠，混匀后-20℃过夜；4℃，18000r/min 离心20min，去上清，用70%冷乙醇洗涤，空气中风干后，加入20 μLTE缓冲液溶解；用 NanoDrop2000 分光光度计检测A260/A280的吸光度比，eDNA的相对表达量用单位生物被膜内eDNA的含量表示。对胞外DNA进行定量分析，药物浓度增加，胞外DNA随之减少（见图四）。

实施例8

编码基因转录水平考察：将金黄色葡萄球菌在LB液体培养基中过夜培养，吸取50 μL菌液于5 mL LB中于37 ℃，200rpm条件下培养至OD600达到2.0。收集菌泥提取RNA并作荧光实时定量PCR，gyrB作为内参。引物见表2。

表2 引物序列

通过real-time RT-PR结果显示，药物浓度增加，控制被膜形成的基因含量越少，被膜形成的越少（见图六）。

上述实验参照文献(Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2009) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically–eighth edition, Approved Standard M7-A8. CLSI, Wayne, PA, USA.); (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;Approved Standard-Tenth Edition. CLSI document M02-A10. USA.); （Hendry ER, Worthington T, Conway BR, Lambert PA (2009) Antimicrobial efficacy of eucalyptus oil and 1,8-cineole alone and in combination with chlorhexidine digluconate against microorganisms grown in planktonic and biofilm cultures. Journal of Antimicrob Chemother, 64(6), 1219–122.）; (O'Neill, E., Pozzi, C., Houston, P., Smyth, D., Humphreys, H., et al. (2007) Association between Methicillin Susceptibility and Biofilm Regulation in Staphylococcus aureus Isolates from Device-Related Infections. Journal of Clinical Microbiology,45(5), 1379-1381.) (Jeffrey B. Kaplan, Era A. Izano, Prerna Gopal, et al. (2012). Low Levels of β-Lactam Antibiotics Induce. Extracellular DNA Release and Biofilm Formation n Staphylococcus aureus. Color Atlas of Medical Bacteriology, 3(4), e00198–12.)和 (O'Neill, E., Humphreys, H. and James P. O’Gara. (2009c). Carriage of both the fnbA and fnbB genes and growth at 37°C promote FnBP-mediated biofilm development in meticillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates. Journal of Medical Microbiology, 58 (Pt 4), 399–402.)方法。

Claims (3)

1.和厚朴酚在制备抑制葡萄球菌生物被膜的药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。

3.和厚朴酚在制备治疗感染葡萄球菌久治不愈和反复发作疾病的药物中的应用。