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CN111317731A - 9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物制备fto抑制剂及其治疗作用 - Google Patents

9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物制备fto抑制剂及其治疗作用 Download PDF

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CN111317731A
CN111317731A CN201811607418.3A CN201811607418A CN111317731A CN 111317731 A CN111317731 A CN 111317731A CN 201811607418 A CN201811607418 A CN 201811607418A CN 111317731 A CN111317731 A CN 111317731A
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CN
China
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substituted
unsubstituted
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fto
carboxyl
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Application number
CN201811607418.3A
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王红胜
罗海彬
吴旭年
凌钰怡
吴德燕
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Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
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Abstract

本发明涉及如下通式I作为以FTO为靶点的疾病的药物中的用途，本发明提供了一种9‑(2‑羧基苯基)呫吨类化合物制备FTO抑制剂的用途，具体地，本发明公开一种具有如下式(I)所示的9‑(2‑羧基苯基)呫吨类化合物及其衍生物及其药学上可以接受的盐制备FTO抑制剂或治疗与FTO相关的疾病的药物组合物的用途。

Description

9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物制备FTO抑制剂及其治疗作用
技术领域
本发明涉及药物学领域，尤其是具有通式I结构的化合物在FTO抑制剂方面的应用。
背景技术
FTO又称肥胖相关蛋白(Fat Mass and Obesity-Associated Protein)，其于2007年最先被发现是与肥胖有着密切关系的蛋白(Science，2007，316(5826)：889-94)。体内FTO基因变异的人，如果两个副本均变异，其肥胖的几率会比那些无变异副本的人高出70％之多。如果FTO基因只有一个副本变异，与无变异副本的人相比，肥胖的几率也要高出30％。
随着对FTO的深入研究，FTO为RNA去甲基化酶，在RNA甲基化的过程中起着非常重要的调控作用(Nat Chem Biol.2011，7(12)：885-7)。N6甲基腺苷(m6A)是mRNA中的丰度最高的化学修饰，广泛存在于病毒、绝大部分真核细胞如酵母、昆虫、职务及哺乳动物细胞中(Cell.2017， 169(7)：1187-1200)。作为非血红素Fe(II)和α-KG依赖的双加氧酶的AlkB家族成员，FTO可作用于单链RNA上的m6A，从而实现体内外mRNA特异性去甲基化作用。
FTO介导的氧化脱m6A甲基作用的发现可能开启RNA可逆性化学修饰对生物调控作用的深入研究。进一步研究表明，FTO可通过调控m6A影响mRNA的转录、剪切、核转位、翻译、降解等生物学功能从而参与疾病的发生发展(Science.2016，352(6292)：1408-12)。研究表明，病毒RNA可通过 m6A修饰引发抗病毒先天免疫的宿主模式识别受体的检测从而增强自身抗性(Cell Host Microbe.2017， 22(6)：830)并调控自我复制能力(Nat Immunol.2017，18(10)：1094-1103)。作为RNA去甲基化酶，FTO 可通过调控ATRA等下游基因从而促进白血病进一步恶化(Cancer Cell.2017，31(1)：127-141)。其活性抑制可有效抑制肿瘤的恶性转化及体内进展(Cell.2018，172(1-2)：90-105)。以上结果提示FTO对人类重要疾病如肥胖、病毒感染、及肿瘤发生发展等有着重要调控作用。
FTO与人类的健康密切相关，而关于FTO抑制剂的报道却非常少。因此，以FTO为靶点的抑制剂开发及优化，将对FTO功能的研究及相关疾病的治疗起到极大的推进作用。
发明内容
本发明提供一类特异性靶向抑制FTO作用的抑制剂。
本发明的第一方面，提供了一种如下式(I)所示的化合物，及其药学上可以接受的盐的用途：
Figure BSA0000176616070000021
其中：
X＝O或NH；
各个R1各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6 环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
各个R2各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6 环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
各个R3各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6 环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
n、m及t均选自以下整数：0、1、2、3、4
以上化合物均用于选自下组的用途：(1)FTO蛋白抑制剂的组合物；(2)制备治疗FTO相关疾病的药物组合物；(3)及体外作为FTO抑制剂的作用。
在另一优选例中，
各个R1各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；
各个R2各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；
各个R3各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；；
n是选自下组的整数：0、1、2、3、4；
和/或m是选自下组的整数：0、1、2、3、4、5；
和/或t是选自下组的整数：0、1、2、3、4、5。
在另一优选例中，
各个R1各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基；
各个R2各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基；
各个R3各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基；
在另一优选例中，所述化合物为选自下列化合物中的一种化合物：
Figure BSA0000176616070000041
在另一优选例中，所述的式(I)化合物选自下组：FTO-01、FTO-02、FTO-03、FTO-04、FTO-05、 FTO-06、FTO-07、FTO-09、FTO-08。
在另一优选例中，所述抑制剂组合物用于体外非治疗性地抑制FTO蛋白的活性。
在另一优选例中，在所述抑制剂组合物中，式(I)化合物作为活性成分，且所述活性成分用于选择性抑制FTO蛋白活性。
在另一优选例中，所述的FTO蛋白抑制剂不对选自下组的ALKB家族蛋白产生抑制作用： ALKBH2、ALKBH3、ALKBH5，或其组合。
在另一优选例中，所述的FTO蛋白抑制剂不对除FTO蛋白外的其他ALKB家族蛋白产生抑制作用。在另一优选例中，所述的抑制包括抑制FTO作用于DNA底物的活性和/或FTO作用于RNA底物的活性。
在另一优选例中，所述的疾病选自下组：肥胖、细菌或病毒感染、癌症、代谢综合征(metabolic syndrome、MS)、2型糖尿病(Type 2 diabetes、T2D)、心血管疾病(CVD)、高血压、及中风等。
本发明的第二方面，提供了一种用于选择性抑制FTO蛋白的抑制剂组合物，所述的抑制剂含有(a) 抑制有效量的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐，和(b)任选的药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的载体为液体，且所述的式(I)化合物在所述组合物中的浓度为≤300μM，较佳地为≤100μM，更佳地为≤25μM。
本发明的第三方面，提供了一种式(I)化合物的用途，
Figure BSA0000176616070000051
其中，各基团的定义如上文中所述；
其特征在于，用于体外非治疗性地抑制FTO蛋白的活性。
在另一优选例中，所述的抑制是选择性抑制FTO蛋白活性。
在另一优选例中，所述的选择性抑制FTO蛋白的活性是指不对选自下组的ALKB家族蛋白产生抑制作用：ALKBH2、ALKBH3、ALKBH5，或其组合；较佳地，所述的选择性抑制FTO蛋白的活性是指不对除FTO蛋白外的其他ALKB家族蛋白产生抑制作用。
在另一优选例中，所述的抑制包括抑制FTO作用于DNA底物的活性和/或FTO作用于RNA底物的活性。
本发明的第四方面，提供了一种如式I化合物的用途，
Figure BSA0000176616070000052
其中，各基团的定义如上文中所述；
其特征在于，所述的式I化合物用于治疗与FTO蛋白表达量相关的疾病；较佳地，所述的疾病为FTO蛋白表达过量或活性过高所导致的疾病。
在本发明范围内中，本发明的所述各技术特征和在下文实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
具体实施方式
本研究发现结构如通式I化合物的这类化合物能够选择性地抑制FTO蛋白的活性，而与此同时对与FTO同属的AlkB家族的其他成员没有抑制作用，这说明该类化合物可选择性抑制FTO。基于上述发现，发明人完成了本发明。
具体实例
下面将参考附图描述本发明示范性的实施方式，以帮助理解本发明。
实施例
实验实施例1：基于分子动力学模拟的高通量虚拟筛选
本虚拟筛选基本流程为构建药效团模型-分子对接-分子动力学模拟-MM/PBSA能量计算-活性测试(附图1)。由于小分子抑制剂在FTO蛋白中有不同的结合位点，本发明中构建了两个药效团模型，所用的晶体结构分别为PDB号：4CXW、4CXX和4CXY；PDB号：4ZS2。使用这两个药效团模型分别对商业数据库SPECS(http：//www.specs.net)的约20万个化合物进行初筛，再进行分子对接，通过打分函数和分子构象的合理性进一步筛选。然后进行分子动力学模拟和MM/PBSA能量计算，最后通过能量值打分选出并购买了26个候选化合物，经活性测试得到2个活性化合物。
实验实施例2：9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物的化学制备。
FTO-02的制备
Figure BSA0000176616070000061
间苯二酚1.21g，邻苯二甲酸酐741mg和甲基磺酸7.5mL，搅拌通氮，100℃反应24h。冷却到室温，将反应物倾入30mL冰水中，析出固体，抽滤。湿滤渣不用干燥，可直接用于下一步反应。用 4M NaOH的水溶液30mL溶解，搅拌30min。溶液用浓盐酸调pH＜5，大量固体析出，抽滤，水洗，过柱纯化，得到标题化合物(1.35g，81％)。1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.06(d，J＝7.6Hz，1H)，7.80 (t，J＝7.4Hz，1H)，7.73(t，J＝7.5Hz，1H)，7.25(d，J＝7.5Hz，1H)，6.77(d，J＝2.1Hz，2H)，6.69(d，J＝ 8.7Hz，2H)，6.62(dd，J＝8.7，2.1Hz，2H).13C NMR(101MHz，MeOD)δ169.80，153.42，134.86，129.79， 129.15，127.21，125.17，124.58，112.96，110.73，102.14.HRMS(ESI-TOF)m/z[M+H]+calcd for C20H12O5 333.0758，found 333.0751。
FTO-04的制备
Figure BSA0000176616070000071
合成方法如化合物FTO-02，2-氯-1，3-苯二酚1.59g，邻苯二甲酸酐741mg和甲基磺酸7.5mL，过柱纯化，得到标题化合物(1.70g，85％)。1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.03(d，J＝7.5Hz，1H)，7.80 (t，J＝7.4Hz，1H)，7.72(t，J＝7.5Hz，1H)，7.26(d，J＝7.6Hz，1H)，6.73(d，J＝8.8Hz，2H)，6.57(d，J＝ 8.8Hz，2H).13C NMR(126MHz，MeOD)δ169.68，148.19，135.36，130.01，126.54，125.96，124.64，124.00， 112.36，111.15，108.33.HRMS(ESI-TOF)m/z[M+H]+calcd for C20H10O5Cl2400.9978，found 400.9974。
FTO-06的制备
Figure BSA0000176616070000072
合成方法如化合物FTO-02，4-氟间苯二酚1.41g，邻苯二甲酸酐741mg和甲基磺酸7.5mL，过柱纯化，得到标题化合物(1.38g，75％)。1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.08(d，J＝7.7Hz，1H)，7.83(t， J＝7.0Hz，1H)，7.76(t，J＝7.2Hz，1H)，7.27(d，J＝7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝7.5Hz，2H)，6.42(d，J＝11.1 Hz，2H).13C NMR(101MHz，DMSO)δ168.75，152.15，149.51，148.11，147.98，147.82，136.17，130.83， 126.38，125.50，124.32，114.30，114.09，108.86，105.30.HRMS(ESI-TOF)m/z[M+H]+calcd for C20H10O5F2369.0569，found369.0568。
FTO-07的制备
Figure BSA0000176616070000081
合成方法如化合物FTO-02，4-氯间苯二酚1.59g，邻苯二甲酸酐741mg和甲基磺酸7.5mL，过柱纯化，得到标题化合物(1.83g，91％)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ11.10(s，2H)，8.02(d，J＝7.6Hz， 1H)，7.83(td，J＝7.5，1.1Hz，1H)，7.76(td，J＝7.5，0.9Hz，1H)，7.34(d，J＝7.6Hz，1H)，6.92(s，2H)，6.66 (s，2H).13C NMR(101MHz，DMSO)δ168.74，155.59，151.97，150.56，136.38，131.00，128.64，126.37， 125.55，124.41，116.72，110.94，104.18.
FTO-11的制备
Figure BSA0000176616070000082
合成方法如化合物FTO-02，4-甲氧基间苯二酚154mg，邻苯二甲酸酐74mg和甲基磺酸1mL，过柱纯化，得到标题化合物(155mg，79％)。1H NMR(500MHz，MeOD)δ8.22(d，J＝7.6Hz，1H)，7.81 (t，J＝7.5Hz，1H)，7.75(t，J＝7.4Hz，1H)，7.39(d，J＝7.3H2，1H)，6.81(s，2H)，6.33(s，2H)，3.62(s，6H). 13C NMR(101MHz，MeOD)δ168.57，149.16，147.79，145.40，132.57，131.75，129.67，129.58，129.04， 113.88，105.21，102.66，54.88.
FTO-15的制备
Figure BSA0000176616070000083
合成方法如化合物FTO-02，4-氟间苯二酚159mg，4，5-二氯苯二甲酸酐109mg和甲基磺酸1mL，过柱纯化，得到标题化合物(157mg，72％)。1H NMR(500MHz，MeOD)δ8.24(s，1H)，7.53(s，1H)，6.86 (d，J＝7.2Hz，2H)，6.60(d，J＝10.6Hz，2H).13C NMR(126MHz，DMSO)δ166.65，149.57，148.10，147.67，138.95，134.12，127.78，127.52，126.97，114.68，114.51，108.12，105.17.
FTO-16的制备
Figure BSA0000176616070000091
合成方法如化合物FTO-02，4-氟间苯二酚159mg，3，6-二氟苯二甲酸酐92mg和甲基磺酸1mL，过柱纯化，得到标题化合物(156mg，77％)。1H NMR(500MHz，MeOD)δ7.57-7.44(m，2H)，6.85(d， J＝7.3Hz，2H)，6.71(d，J＝11.0Hz，2H).13CNMR(101MHz，MeOD)δ164.28，156.42，156.39，153.82， 151.43，150.01，148.28，147.60，123.99，123.79，119.74，119.45，112.69，112.48，104.87，104.84.
实验实施例3：非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结构为通式I化合物对FTO的抑制作用。
pET-28a-FTO原核表达载体质粒转化至BL21(DE3)原核表达菌株，37℃ 200rpm摇菌至OD600为 0.2～0.6，然后加入IPTG 0.5mM 16℃ 16h。取菌体超声破碎之后，13000rpm30min取上清。经过NI-NTA 与Sephadex-200纯化后得到FTO纯度＞90％。合成含有m6A 49bp的ssDNA链，序列为 (‘5-TAGACATTGCCATTCTCGATAGG(m6A)-TCCGGTCAAACCTAGACGAATTCCA-3’)，在100μl反应体系含有50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH＝7.5)300μM α-酮戊二酸(2OG)， 280μM硫酸亚铁((NH4)2Fe(SO4)2)，2mM L-抗坏血酸，1μM ssDNA，1μMFTO和100μM化合物25℃反应2h，然后对单链进行退火，然后用DPNII酶切，切开后用20％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测条带强度，若能切开表示化合物对FTO无抑制作用，若切开的条带强度减少说明化合物对FTO有抑制作用，依此原理进行初筛。部分有抑制效果的图做浓度梯度抑制如附图2所示。根据初步筛选得到的化合物发现两者之间结构相似，其母核结构如通式I所示，据此我们进行了结构改造。
Figure BSA0000176616070000092
本文中所示“
Figure BSA0000176616070000101
”意为有n、m或t个R1、R2及R3在苯环上任意位置取代，X＝O或NH。
通式I所示结构的具体化合物如下所示，这类化合物对FTO表现出不同程度的活性抑制。
Figure BSA0000176616070000102
实验实施例4：高效液相色谱验证结构为通式I的化合物的选择性抑制FTO的去甲基化的活性。
然后将在实验实施例2中筛选的到有活性的化合物在100μl反应体系中加入10μMssRNA 1μM FTO，加入不同浓度的待测化合物25℃反应30min，95℃5min失活反应体系，加入P1酶和碱性磷酸酶酶切后用液相质谱联用仪检测m6A与G的比例。将酶活性抑制率达到50％时抑制剂的浓度定为IC50 (附图3)。其抑制率的计算方式为：抑制率％＝{(实验组m6A/实验组G/对照组G)/(对照组m6A)}*100％
表1为部分改造后化合物对FTO的活性抑制测试。
表1：部分通式I化合物对FTO去甲基化作用抑制活性。
Figure BSA0000176616070000103
实验实施例5：通式I的化合物及其衍生物通过非鳌合Fe(II)方式抑制FTO活性
因为FTO是依赖2OG/Fe(II)的加氧酶，所以加入EDTA可以与Fe(II)鳌合使反应无法发生。所以必须排除化合物是通过鳌合铁离子来干扰反应，所以设计以下实验，在保证FTO活性不被干扰的情况下，加入不同浓度相对化合物过量的Fe(II)，在每组中均加入100μM化合物FTO-03，结果表明化合物不依赖Fe(II)产生变化，说明化合物不是通过鳌合Fe(II)来实现抑制作用的结果示于附图4。
实验实施例6：通式I的化合物及其衍生物对肿瘤细胞杀伤作用
使用MTT检测化合物FTO-06分别对HL-60、NB4细胞的活性影响，分别用不同浓度的化合物处理细胞48h后加入MTT孵育4h，加入DMSO溶解甲瓒后490nm测OD值计算细胞活力。结果表明FTO-06对肿瘤细胞HL-60及NB4具有一定的杀伤作用(附图5)。
实验实施例7：通式I的化合物及其衍生物在细胞内对FTO的活性抑制
化合物FTO-01、FTO-02、FTO-09在人宫颈癌细胞Hela中对FTO的抑制作用。实验中分别用不同浓度的化合物处理Hela细胞，用液相质谱联用仪检测mRNA中m6A/A(‰)，结果表明经过化合物处理过后细胞的m6A水平显著升高(附图6)，表明9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物可在细胞内显著抑制 FTO活性。
实验实施例8：通式I的化合物及其衍生物对ALKBH5不具备抑制作用
pET-28a-ALKBH5原核表达载体质粒转化至BL21(DE3)原核表达菌株，37℃ 200rpm摇菌至OD600 为0.2～0.6，然后加入IPTG 0.5mM 16℃16h。取菌体超声破碎之后，13000rpm30min取上清。经过 NI-NTA与Sephadex-200纯化后得到FTO纯度＞90％。合成含有m6A 49bp的ssDNA链，序列为 (‘5-TAGACATTGCCATTCTCGATAGG(m6A)-TCCGGTCAAACCTAGACGAATTCCA-3’)，在100μl反应体系含有50mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH＝7.5)300μM α-酮戊二酸(2OG)， 280μM硫酸亚铁((NH4)2Fe(SO4)2)，2mM L-抗坏血酸，1μM ssDNA，1μMFTO和100μM化合物25℃反应2h，然后对单链进行退火，然后用DPNII酶切，切开后用20％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测条带强度，若能切开表示化合物对ALKBH5无抑制作用，若切开的条带强度减少说明化合物对 ALKBH5有抑制作用，依此原理进行检测化合物对ALKBH5的活性抑制作用。结构表示化合物对 ALKBH5无明显的活性抑制作用(附图7)。
实验实施例9：通式I的化合物及其衍生物对脂滴形成能力的影响
通过诱导3T3-L1前脂肪细胞分化进一步开展脂滴形成实验发现FTO-06可抑制3T3-L1前脂肪细胞的脂滴形成并显著下调脂肪形成相关转录因子CEBPα的表达(附图8)。以上结果提示FTO抑制剂 FTO-06具有良好的抗肿瘤活性及一定的减脂能力，具有良好的开发前景和应用价值。
附图说明
图1基于蛋白结构的化合物高通量虚拟筛选图及FTO-06与酶对接示意图；
图2非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示结构为通式I的化合物及其衍生物对FTO有选择性的活性抑制作用；
图3高效液相质谱联用实验结果显示结构为通式I的化合物及其衍生物对FTO有选择性抑制的作用；
图4结构为通式I的化合物及其衍生物通过非鳌合Fe(II)方式抑制FTO活性。
图5结构为通式I的化合物及其衍生物对不同肿瘤细胞的活力影响；
图6结构为通式I的化合物及其衍生物在细胞水平上对FTO有抑制活性的作用。
图7结构为通式I的化合物对ALKBH5无抑制作用。
图8结构为通式I的化合物对脂滴形成的抑制作用。
图9FTO抑制剂通式I。

Claims (9)

1.如下通式I所示9-(2-羧基苯基)呫吨类化合物及其盐，作为以FTO为靶点的疾病的药物中的用途：
Figure FSA0000176616060000011
其中：
X＝O或NH；
各个R1各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
各个R2各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
各个R3各自独立地选自卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基，取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代C1-C6烷氧基、取代或未取代羰基C1-C6烷基、取代或未取代C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的5-9元杂环基、取代或未取代的烯基，和取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、酯基、酰胺基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、C6-C12芳基，5-9元杂环基；
n、m及t均选自以下整数：0、1、2、3、4
以上化合物均用于选自下组的用途：(1)FTO蛋白抑制剂的组合物；(2)制备治疗FTO相关疾病的药物组合物；(3)及体外作为FTO抑制剂的作用。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
各个R1各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；
各个R2各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；
各个R3各自独立地选自下组：氟，氯，溴，碘，羟基、硝基、氰基、羧基、醛基、甲酯基、乙酯基、酰胺基，取代或未取代的甲基，取代或未取代的乙基，取代或未取代的丙基，取代或未取代的甲氧基，取代或未取代的乙氧基，取代或未取代的丙氧基，取代或未取代的乙酰基，取代或未取代的丙酰基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的萘基，取代或未取代的呋喃基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的吲哚基，或取代或未取代喹啉基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基；其中，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基取代：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基；
n是选自下组的整数：0、1、2、3、4；
和/或m是选自下组的整数：0、1、2、3、4、5；
和/或t是选自下组的整数：0、1、2、3、4、5。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
各个R1各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基；
各个R2各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基；
各个R3各自独立地选自下组：氟、氯、溴、碘、羟基、硝基、氰基、羧基、甲酯基、乙酯基、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、乙酰基、丙酰基、苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、酰胺基、醛基、烯基、炔基。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物为选自下列化合物中的一种化合物：
Figure FSA0000176616060000031
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂组合物用于体外非治疗性地抑制FTO蛋白的活性。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在所述抑制剂组合物中，式(I)化合物作为活性成分，且所述活性成分用于选择性抑制FTO蛋白活性。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的疾病选自下组：肥胖、细菌或病毒感染、癌症、代谢综合征(metabolic syndrome、MS)、2型糖尿病(Type 2 diabetes、T2D)、心血管疾病(CVD)、高血压、及中风等。
8.一种用于选择性抑制FTO蛋白的抑制剂组合物，其特征在于，所述的抑制剂含有(a)抑制有效量的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐，和(b)任选的药学上可接受的载体。
9.一种如式I化合物的用途，其特征在于，所述的式I化合物用于治疗与FTO蛋白表达量相关的疾病；所述的疾病为FTO蛋白表达过量或活性过高所导致的疾病。
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