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CN111303281A - 制备胰石蛋白抗体及建立检测psp方法 - Google Patents

制备胰石蛋白抗体及建立检测psp方法 Download PDF

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CN111303281A
CN111303281A CN201910396634.6A CN201910396634A CN111303281A CN 111303281 A CN111303281 A CN 111303281A CN 201910396634 A CN201910396634 A CN 201910396634A CN 111303281 A CN111303281 A CN 111303281A
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CN
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psp
antibody
protein
recombinant protein
pancreatic stone
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CN201910396634.6A
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刘雨哲
李宝民
关恒
刘斌
王珺楠
张蕾
黄景林
张金玲
赵青
刘戈
仇淑园
史永丰
王贺
朱道林
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Changchun Hengxiao Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Changchun Hengxiao Biotechnology Co ltd
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Abstract

一种制备胰石蛋白抗体及建立检测PSP方法，属于生物工程的基因重组技术领域。本发明的目的是制备出特异性PSP免疫原，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体，用于建立检测PSP方法和PSP体外诊断试剂盒的制备胰石蛋白抗体及建立检测PSP方法。本发明用基因重组技术构建标签‑PSP重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签‑PSP重组蛋白，纯化标签‑PSP重组蛋白作为PSP重组蛋白免疫原。本发明用于检测血液中PSP水平升高，能提供更早、更快、更准确诊断细菌性败血症的发生，指导败血症治疗，监测败血症进展，建立免疫学方法快速检测PSP试剂盒。

Description

制备胰石蛋白抗体及建立检测PSP方法
技术领域
本发明属于生物工程的基因重组技术领域。
背景技术
败血症（Sepsis）是一种潜在危及生命的状态, 主要由细菌，病毒及真菌感染而引发机体系统性反应，败血症进一步发展到败血症性休克, 血压大幅下降，可迅速导致重要器官衰竭和死亡。
早期诊断败血症是挽救生命的关键，每延迟治疗败血症一小时,死亡率上升8%，需要提供更早、更快、更准确诊断败血症方案，以大幅度减少败血症死亡。
细菌感染诱导产生宿主蛋白, 如IL-6、PCT和CRP, 检测这些宿主蛋白用于支持细菌感染引发败血症的诊断。CRP诊断败血症不特异, 因为，在非传染性病因的炎症状态下，CRP水平也会升高。PCT是诊断败血症较为特异性指标，但部分手术后无感染病人，创伤病人PCT水平增高；而细菌感染早期，一些病人PCT 水平不增高，表明PCT不能作为判定细菌感染性败血症发生的唯一指标，需要寻找新的细菌诱导宿主蛋白指标, 以提高早期诊断细菌感染性败血症准确性。
胰石蛋白 (Pancreatic stone protein, PSP)是血循环中诊断细菌感染性败血症新生物标志物。
PSP是在慢性钙化性胰腺炎病人胰腺结石和胰液中提取出一种蛋白，由再生基因(Regenerating gene)编码16KDa蛋白,该蛋白属于C-类凝集素家族。PSP主要由胰腺的腺泡细胞产生和分泌，在胃、肠道等处细胞也分泌少量PSP。
发明内容
本发明的目的是制备出特异性PSP免疫原，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体，用于建立检测PSP方法和PSP体外诊断试剂盒的制备胰石蛋白抗体及建立检测PSP方法。
本发明用基因重组技术构建标签-PSP重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-PSP重组蛋白，纯化标签-PSP重组蛋白作为PSP重组蛋白免疫原；PSP蛋白氨基酸序列：
QEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA 60
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTS 120
STGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
本发明合成PSP抗原表位肽-N, 氨基酸序列
SEQ ID NO.1：CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF；
合成PSP抗原表位肽-C，氨基酸序列
SEQ ID NO.2：LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC。
本发明PSP抗原表位肽-N或C偶联载体蛋白, 包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白(OVA)、蓝载体蛋白(BCP)等，制备成PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原。
本发明PSP重组蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明PSP重组蛋白，进行蛋白复性，作为检测PSP方法的校准品。
本发明PSP单克隆抗体或多克隆抗体，及PSP校准品，建立检测PSP方法，包括ELISA，化学发光法，免疫荧光法，免疫比浊法，免疫层析法，免疫凝集法等。
本发明PSP单克隆抗体或多克隆抗体,及PSP校准品，建立检测PSP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测PSP免疫层析试纸条，其中试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。
本发明结合垫吸附PSP抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定PSP抗体形成的检测线（T线）和抗IgG抗体构成的质控线（C线）。
本发明PSP重组蛋白制备过程，步骤如下：
（1）合成PSPDNA；（2）构建pQE-1-PSP载体；（3）表达His-PSP蛋白；(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化His-PSP蛋白；（5）进行His-PSP蛋白复性和浓缩过程；（6）测定His-PSP蛋白浓度，-80℃ 冻存；
His-PSP重组蛋白氨基酸序列：
MKHHHHHHQLHAGAHQEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTSSTGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
本发明研究发现，PSP能抑制炎症反应、促进细胞增殖、抗细胞凋亡、调节细胞黏附、促细菌聚集等作用。PSP还能作为一种抗菌蛋白, 控制肠道菌群的扩散和防止病原菌感染肠道。PSP被认为是一种急性期反应蛋白，受到IL-6、 TNF-α等炎症因子及感染期间释放的细胞因子的调节。PSP也属于炎性因子，可诱导中性粒细胞中L-选择素的脱落和下调β2整合素表达，激活中性粒细胞，因此，PSP是一种炎症发生的标记物。PSP水平增高与中性粒细胞上CD11b、CD62L的表达密切相关，表明PSP结合并激活中性粒细胞，血循环中PSP水平升高代表早期细菌感染发生。
在急性、慢性胰腺炎发生时，上调PSP表达；在缺乏任何胰腺炎症情况下，全身性应激反应，也促进胰腺PSP表达和分泌增多，表明PSP也是全身性应激反应标记物。
临床研究发现，无胰腺损伤患者，住院过程中发生脓毒症患者血清中PSP水平（146ng/ml）高于局部细菌感染患者(111ng/ml)，而局部细菌感染患者PSP水平高于无感染患者(22ng/ml)，可见，检测血液中PSP水平能早期判断细菌感染及败血症的发生。
检测PSP指标的灵敏度和特异性优于目前使用PCT，CRP和白细胞计数等指标，PSP在区分细菌感染败血症和非传染性疾病方面优于PCT; 在患者入ICU后24小时内测量PSP水平，预测患者死亡风险比PCT和CRP都要准确。检测血液中PSP水平升高，能提供更早、更快、更准确诊断细菌性败血症的发生，指导败血症治疗，监测败血症进展，建立免疫学方法快速检测PSP试剂盒。
附图说明
图1是免疫层析试纸条侧面图；图中1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7、吸水纸；
图2是免疫层析纸质卡正面图；图中5、检测线；6、质控线；8、加样孔；9、检测窗口；10、外壳；11、手持柄；12、防滑面；
图3是银染法测定His-PSP纯度；
图4是PSP浓度标准曲线；
图5是PSP校准品浓度与荧光强度单位相关曲线。
具体实施方式
本发明用基因重组技术构建标签-PSP重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-PSP重组蛋白，纯化标签-PSP重组蛋白作为PSP重组蛋白免疫原；PSP蛋白氨基酸序列：
QEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA 60
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTS 120
STGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
本发明合成PSP抗原表位肽-N, 氨基酸序列
SEQ ID NO.1：CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF；
合成PSP抗原表位肽-C，氨基酸序列
SEQ ID NO.2：LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC。
本发明PSP抗原表位肽-N或C偶联载体蛋白, 包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白(OVA)、蓝载体蛋白(BCP)等，制备成PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原。
本发明PSP重组蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明PSP重组蛋白，进行蛋白复性，作为检测PSP方法的校准品。
本发明PSP单克隆抗体或多克隆抗体，及PSP校准品，建立检测PSP方法，包括ELISA，化学发光法，免疫荧光法，免疫比浊法，免疫层析法，免疫凝集法等。
本发明PSP单克隆抗体或多克隆抗体,及PSP校准品，建立检测PSP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测PSP免疫层析试纸条，其中试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。
本发明结合垫吸附PSP抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定PSP抗体形成的检测线（T线）和抗IgG抗体构成的质控线（C线）。
本发明PSP重组蛋白制备过程，步骤如下：
（1）合成PSPDNA；（2）构建pQE-1-PSP载体；（3）表达His-PSP蛋白；(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化His-PSP蛋白；（5）进行His-PSP蛋白复性和浓缩过程；（6）测定His-PSP蛋白浓度，-80℃ 冻存；
His-PSP重组蛋白氨基酸序列：
MKHHHHHHQLHAGAHQEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTSSTGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
以下对本发明做进一步详细描述：
为了建立检测PSP方法，本发明提供了人PSP重组蛋白免疫原和PSP抗原表位肽免疫原，用于产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体，用此抗体建立检测PSP方法及PSP体外诊断试剂盒。
具体而言，本发明公开了一种PSP重组蛋白制备过程，步骤如下：
（1）合成PSPDNA；（2）构建pQE-1-PSP载体；（3）表达His-PSP蛋白；(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化His-PSP蛋白；（5）进行His-PSP蛋白复性和浓缩过程；（6）测定His-PSP蛋白浓度，-80℃ 冻存。
His-PSP重组蛋白氨基酸序列：MKHHHHHHQLHAGAHQEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTSSTGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN
本发明His-PSP重组蛋白，经过蛋白复性，接近自然结构PSP蛋白，His-PSP重组蛋白分子量为16KDa，适合作为蛋白免疫原，有高度免疫原性和特异性，用于免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等)，产生特异性PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明公开了一种PSP抗体制备过程，步骤如下：
（1）His-PSP重组蛋白作为免疫原；（2）免疫动物产生PSP抗血清；（3）测定PSP抗血清滴度和特异性；（4）His-PSP偶联树脂；（5）His-PSP-树脂层析柱分离和纯化出PSP抗体；（6）测定PSP抗体效价和特异性。
His-PSP蛋白免疫动物产生抗血清中可能包括His抗体，用His peptide（MKHHHHHHQLHAGAHQE) 与His-PSP抗血清中His 抗体结合，形成His-peptide-Hisantibody复合物，排出His 抗体结合 His-PSP蛋白。
本发明公开了一种PSP 抗原表位肽-载体蛋白免疫原制备过程，步骤如下：
合成PSP抗原表位肽-N（SEQ ID NO.1），氨基酸序列为64-96位：
CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF;
合成PSP抗原表位肽-C（SEQ ID NO.2），氨基酸序列为102-137位：
LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC。
本发明PSP 抗原表位肽-N 或C具有亲水性、抗原性强，与载体蛋白偶联而制备成PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原。此免疫原具有高度免疫原性和特异性，用于免疫动物，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。在本发明中，可用的载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白（OVA）、蓝载体蛋白(BCP)等。活化的BCP能有效与PSP 抗原表位肽末端-SH基结合， 并且BCP免疫原性强，免疫效果好，与免疫动物亲缘关系较远，用BCP作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此，优选BCP载体蛋白。
本发明公开了一种用PSP 抗原表位肽-载体蛋白免疫原制备PSP单克隆抗体过程，步骤如下：
1.免疫接种
本发明用PSP抗原表位肽-N或C偶联BCP蛋白载体，纯化PSP-N/C-BCP后，获得PSP抗原表位肽免疫原，免疫接种鼠，用ELISA检测出高PSP抗体滴度鼠，用于细胞融合。
2. 细胞融合
用聚乙二醇(PEG)为融合剂，融合鼠脾细胞与Sp2/0细胞，用HAT培养液，筛选出杂交瘤细胞，用ELISA检测出分泌PSP单克隆抗体杂交瘤细胞孔。
3. 筛选出分泌PSP单克隆抗体杂交瘤细胞
用有限稀释法对阳性检出孔的细胞进行亚克隆筛选,获得分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量扩增，长期传代培养后，获得了稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株。
4. 用ELISA鉴定PSP单克隆抗体特征
用ELISA鉴定出IgG 类PSP单克隆抗体；用ELISA测定PSP单克隆抗体亲合力。
5. 制备大量PSP单克隆抗体
扩大培养分泌PSP单克隆抗体杂交瘤细胞株，收集细胞上清液，用(NH4)2SO4沉淀上清液中单克隆抗体，获得单克隆抗体浓缩液；ProteinA-Agarose分离和纯化出PSP 单克隆抗体，测定单克隆抗体浓度，分装后，-20°C 保存；用ELISA测定纯化PSP单克隆抗体与PSP结合力及特异性。
本发明公开了一种PSP校准品制备过程，步骤如下：
（1）合成PSPDNA；（2）构建pQE-1-PSP载体；（3）表达和纯化His-PSP蛋白；（4）进行 His-PSP蛋白复性；（5）浓缩His-PSP蛋白；（6）检测His-PSP蛋白浓度，-80℃,冻存。
本发明用 PSP单克隆抗体或多克隆抗体，及PSP校准品进一步建立检测 PSP方法，包括酶联免疫吸附法（ELISA），化学发光法（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA），免疫荧光法（FluorescenceImmunoassay, FIA），免疫比浊法（Turbidimetric Immunoassay），免疫层析法（Immunochromatography），免疫凝集法（Immune Agglutination）等。
本发明公开了一种建立检测PSP体外诊断试剂盒的过程，具体为快速定量检测PSP免疫层析试纸条，步骤如下：
PSP抗体-荧光微球制备过程：
（1）碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；（2）加入PSP抗体进行偶联反应；（3）终止偶联反应；（4）用Tris缓冲液悬浮PSP抗体-荧光微球，4℃，保存备用。
本发明公开了一种结合垫吸附有PSP抗体-荧光微球的制备过程：
用Tris缓冲液稀释PSP抗体-荧光微球浓度到需要浓度，用4-10ul/cm速度，将上述荧光微球喷涂到结合垫上，30-37°C，干燥2-8小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种硝酸纤维素膜上T线和C线的制备过程：
用Tris缓冲液稀释PSP抗体（T线液）和抗IgG抗体（C线液）到需要浓度，用0.4-1.0ul/cm速度，将T线液和C线液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T线和C线，间隔为4-6mm，30-37℃，干燥2-6小时，干燥密封，备用。
本发明公开了一种试纸条组装过程：
在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方；另一端粘贴结合垫，位于硝酸纤维素膜上方；在结合垫另一端粘贴样品垫，位于结合垫上方，形成试纸板，切割成宽3-5mm试纸条（图1）。
本发明公开了一种试纸卡组装过程：
本发明含有外壳，由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上，合上壳面，形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口，壳面上对应于样品垫位置设加样孔，见图2。
本发明用双抗体夹心免疫层析原理：样品中PSP通过层析作用向前移动，与结合垫吸附PSP抗体-荧光微球结合，形成PSP-PSP抗体-荧光微球复合物，在毛细动力作用下，进入硝酸纤维素膜，PSP-PSP抗体-荧光微球与硝酸纤维素膜T线固定PSP抗体结合，而形成荧光微球-PSP抗体-PSP-PSP抗体复合物，聚集在T线，游离PSP抗体-荧光微球在T线处不结合，继续向前移动，并与C线固定抗IgG抗体结合，未结合成分继续移动到吸水纸位置。T线捕获的荧光微球量与样品中PSP浓度呈正相关，而C线捕获的荧光微球,表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对T线、C线信号进行扫描，根据T线信号强度与样品中PSP浓度呈正相关，获得样品中PSP浓度。
本发明提供一种PSP免疫层析试纸卡操作过程：
将PSP校准品加到PSP免疫层析试纸卡加样孔中，反应5-10分钟，用免疫荧光分析仪，测定试纸卡上T线和C线荧光强度，制备PSP浓度与荧光强度单位相关曲线，进一步设置免疫荧光分析仪PSP浓度与荧光强度单位相关参数后，设立免疫荧光分析仪自动检测PSP浓度系统，再进一步检测样品中PSP浓度。
结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤实验过程。
一、制备PSP重组蛋白
（一）合成PSPDNA(核酸序列67-501)
67caagaggccca
78gacagagttg ccccaggccc ggatcagctg cccagaaggc accaatgcct atcgctccta
138ctgctactac tttaatgaag accgtgagac ctgggttgat gcagatctct attgccagaa
198catgaattcg ggcaacctgg tgtctgtgct cacccaggcc gagggtgcct ttgtggcctc
258actgattaag gagagtggca ctgatgactt caatgtctgg attggcctcc atgaccccaa
318aaagaaccgc cgctggcact ggagcagtgg gtccctggtc tcctacaagt cctggggcat
378tggagcccca agcagtgtta atcctggcta ctgtgtgagc ctgacctcaa gcacaggatt
438ccagaaatgg aaggatgtgc cttgtgaaga caagttctcc tttgtctgca agttcaaaaa
498ctag
合成PSPDNA表达 PSP蛋白氨基酸序列：
QEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA 60
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTS 120
STGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN
catcaagaggcc ……………… aaa aactagg
tcgagtagttctccgg……………… ttt ttgatccagct
SacI SalI。
（二）构建pQE-1-PSP载体
1.pQE-1载体DNA 3ul（3ug）
Cutsmart buffer 6ul
SacI 3ul
SalI 3ul
H20 45ul
混均，37℃，反应2小时
2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳，EB进行DNA染色，紫外线下观察3.5kb载体DNA条带，切割下DNA条带,放到微量离心管中
3.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)提取Agarose 条带中DNA，
4.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度
5.用T4 DNA ligase (New England Biolabs.)，连接PSP DNA 到pQE-1载体中，
在微量离心管中加入以下物质
PSPDNA 50ng
载体 DNA（SacI/SalI） 50ng
10X T4 DNA LigaseBuffer 1.0 ul
T4 DNA Ligase 0.5ul
H2O 到10ul
混均，25℃ 反应4小时，
6.连接DNA转入感受态细菌中
7.用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (Life Technologies Inc.)提取细菌质粒DNA
8.鉴定出pQE-1-PSP载体，用于表达His-PSP重组蛋白。
（三) 表达His-PSP重组蛋白
1.pQE-1-PSP载体转入感受态细菌（M15细菌株）中
2.涂种50ul上述细菌液在25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，37℃，培养过夜
3.挑选单个菌落，接种到5ml 25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃, 摇动，过夜
4.稀释细菌液到100ml，37℃，摇动2-3 小时，OD600值0.2-0.5时，
5.加200ulIPTG（1.0M）到细菌液中,25℃,摇动3-5小时
6.离心，收集细菌，用PBS洗涤一次
7.加PBS，pH7.5, 含0.1%NP-40,1.0mM DTT,1.0mM PMSF,10ug/mlLeupeptin, 10ug/mlAprotinin到离心管中，悬浮细菌
8.用超声法破碎细菌后，4℃，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新离心管中 。
（四）纯化His-PSP重组蛋白
1.制备SP-Sepharose 层析柱，用Buffer A(20mM NaPO4,pH8.0，100mM NaCl,0.1%CTAB)平衡SP-Sepharose 层析柱
2.上述细菌上清液（含His-PSP，pI=6.5），加到SP-Sepharose 层析柱中，通过SP-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到SP-Sepharose 层析柱中，反复5次后，收集滤过液（含His-PSP蛋白）
3.Tris缓冲液洗涤Ni-NTAAgarose（QIAGEN）
4.加Ni-NTA Agarose到上述滤过液中，在4℃，反应1小时
5.在4℃条件下，离心，3000rpm, 2分钟，去除上清液
6.加50mM Tris缓冲液,300mM NaCl,10mMImidazole,0.05%NP-40到Ni-NTA Agarose离心管中，洗涤4次
7.加洗脱液（50mM Tris, pH8.0，200mM NaCl, 500mMImidazole）到Ni-NTA Agarose离心管中, 洗脱结合蛋白，2次
8.混合洗脱液转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(50mM Tris, pH7.6,150mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT, 1.0mM EDTA，1.0mMPMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜
9.收集透析袋中蛋白液体移到离心管中
10.制备Q-Sepharose 层析柱，用Buffer B(50mM K2PO4, pH8.0,100mM NaCl, 0.2%CTAB)平衡Q-Sepharose 层析柱
11.加上述透析液到Q-Sepharose 层析柱中，通过Q-Sepharose 层析柱，收集滤过液，
再加到Q-Sepharose 层析柱中，反复5次（His-PSP蛋白结合到Q-Sepharose层析柱）
12.加Buffer B到Q-Sepharose层析柱中，缓慢通过Q-Sepharose层析柱
13.洗脱液（0.5M K2PO4, pH4.5, 300mM NaCl,0.1%CTAB）到Q-Sepharose层析柱中,洗脱液缓慢通过Q-Sepharose层析柱，收集洗脱液（含His-PSP蛋白）
14.洗脱液转入到透析袋中 (Spectra/Pro) ，再放入透析液 (20mM NaPO4, pH7.5,100mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT,1.0mM EDTA，1.0mM PMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过液
15.将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟
16.加上述透析蛋白液到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-3KDa CentrifugalFilter），浓缩和净化离心柱中透析蛋白液
17.测定蛋白液浓度，-80℃，冻存。
（五）银染法测定His-PSP蛋白纯度（图3）
1.冻存蛋白液离心管放到37 ℃水浴中，快速溶化，放到冰块中
2.1.0ul蛋白液,加5ul PBS, 4ul 4X蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,10%Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100℃3分钟
3.加10ul蛋白样本液到10% SDS-PAGE 凝胶孔中，进行电泳
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：
i.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，
去除Methanol液体
ⅱ.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅲ.加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅳ.加100ml 0.1% AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除AgNO3液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次
ⅴ.加100ml 3% Na2CO3& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
ⅵ.加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
ⅶ.用水清洗SDS-PAGE胶后，干燥SDS-PAGE凝胶,判断His-PSP纯度达99%以上。
（六)Bradford法测定纯化His-PSP浓度（图4）
1.取1ml浓缩染料试剂（Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate）与4mlH2O
混合均匀，获得稀释染料试剂
2.制备BSA标准液, 浓度分别为0， 0.25, 0.5, 1.0, 2.0，4.0mg/ml
3.加79ul PBS 到微量滴定板孔中，加1.0ul不同浓度BSA标准液，1.0ul纯化His-PSP蛋白
液，每个样本加3个孔
4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，室温，放置5分钟
5.放微量滴定板到生化分析仪中，选用波长495nm,测定OD值
6.制备BSA浓度标准曲线，计算出纯化His-PSP蛋白浓度
纯化PSP平均OD值为 1.903
His-PSP蛋白浓度=1.4476X1.903–0.6203=2.13mg/ml
Figure 770076DEST_PATH_IMAGE001
。
二．制备PSP抗体
（一）产生PSP抗血清
1. (Day 0) 采集5ml山羊血液
2. (Day 1)0.5mlPSP(1.0mg/ml)与0.5ml福氏完全佐剂(CFA)混合,20点注射到山羊皮下（50ul/每点）
3. (Day 14)0.25ml PSP (1.0mg/ml)与0.25ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
4.(Day 28)0.25ml PSP (1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
5. (Day 42) 采集山羊血5ml，测定PSP抗血清滴度和特异性
6. (Day 45) 0.25ml PSP (1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
7. (Day 59) 采集200ml山羊血液
8. (Day 60) 0.25ml PSP (1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
9.(Day 74) 采集200ml山羊血液
10．重复8-9步骤2-3次，终止试验。
（三）测定PSP抗血清滴度和特异性
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备His-PSP(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.PSP抗血清(1.0mg/ml His-peptide)稀释到不同浓度（1:10, 1:50, 1:200，1:1000），加100ul到孔中 , 在室温下， 缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板5次，每次5分钟
5. 加1:4000稀释100ul抗羊IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
Figure 494318DEST_PATH_IMAGE002
。
（四）His-PSP偶联琼脂糖
1.6.0mgHis-PSP蛋白，200mg NHS活化琼脂糖（NHS-Activated Agarose）购于ThermoFisherScientific， 溶解2ml在PBSpH7.5中,摇动2小时
2．上述反应液转入离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
3.加5mlPBSpH7.5到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复步骤3一次
4.加5ml终止液（1M Ethanolamine）到离心管中，摇动30分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体
6.加5ml PBS pH7.5 到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复步骤6三次
7.加5ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
8.加2ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，4℃放置，备用。
（五）PSP-琼脂糖层析柱分离PSP抗体
1.5ml PSP抗血清(含1.0mg/mlHis-peptide)与5mlPBS pH7.5混合，并通过0.22um 滤膜
2. 加10ml上述PSP抗血清稀释液到PSP-琼脂糖离心管中，摇动1小时
3. 3000g, 离心2分钟，去除液体
4. 加10ml 洗涤液(20mM Tris，pH7.5，0.5M NaCl，0.02%NP-40)到PSP-琼脂糖离心管中，
摇动15分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体，重复4-5步骤三次
6. 加1ml 洗脱液(100mM Glycine, pH2.8)到离心管中，4000g, 离心1分钟，收集上清液，
加到50ul 2.0M Tris（pH9.0）微量离心管中，混均，重复步骤6五次。
7. 混合洗脱液转入透析袋中，用透析液（20mM NaPO4(pH7.5),150mM NaCl,1.0mM EDTA,
1.0mM DTT, 1.0mM PMSF, 10% Glycerol）, 4℃，过夜。
8. 加上述PSP抗体液到蛋白浓缩和净化离心柱（Microcon-10kDa CentrifugalFilter）中，
浓缩 PSP抗体
9. 测定PSP抗体浓度,放 -20℃，保存，备用。
（六）测定PSP抗体效价和特异性
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备His-PSP(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包
被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul不同浓度PSP抗体（0, 1, 5, 20, 100ng/ml）到孔中, 在室温下，
缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板5次，每次5分钟
5. 加1:2500稀释100ul抗羊IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
Figure 836438DEST_PATH_IMAGE003
。
三．制备PSP-N单克隆抗体
（一）制备PSP抗原表位肽-N-载体蛋白免疫原
PSP抗原表位肽-N（SEQ ID NO.1)CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF，是人PSP蛋白第64至96位一段肽，含33个氨基酸的肽段。这肽段具有亲水性、抗原性强，与载体蛋白连接后成为PSP-N-载体蛋白免疫原，接种动物产生特异性PSP抗体。
（二）PSP肽-N偶联蓝载体蛋白
1. 载体蛋白液： Maleimide活化蓝载体蛋白(Blue carrier protein, BCP), 购于Thermo Scientific公司，5mgBCP溶解在0.5mlddH2O(10mg/ml)
2. PSP-N肽液: 4mg合成PSP肽-N（>95%），溶解在0.5ml PBS，pH7.2 (8mg/ml)
3. 0.5mlBCP载体蛋白液与0.5ml PSP-N肽液混合，室温条件下，反应2 小时
4. 加上述反应液到Microcon-10KDa Centrifugal Filter
5. 离心，14000g 2-8分钟, 减少反应液到50-100ul
3. 去除收集管中液体, 加400ul PBS（pH7.5）到蛋白浓缩和净化离心柱中
4. 离心，14000g 2-8分钟, 减少离心柱中液体积到50-100ul
5. 重复3-4步骤，5次以上
6. 吸出蛋白浓缩和净化离心柱中约50-100ul PSP-N-BCP液
7.测定PSP-N-BCP浓度，-80℃冻存。
（三）制备PSP-N单克隆抗体
免疫接种
1.PSP-N-BCP与福氏完全佐剂乳化(0.1mg/ml), 对8周左右BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及腹膜内（Intraperitoneal,IP)初次免疫接种;2-3周后，PSP-N-BCP/福氏不完全佐剂乳化(0.1mg/ml)，对BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及IP第二次增强免疫接种。
2.6-8周后，使用眼眶后放血，获得BALB/c鼠血液（0.1-0.4ml），用PSP-N包被反应板进行ELISA检测，选出高抗PSP-N抗体滴度BALB/c鼠用于细胞融合。
3.8-9周后，PSP-N-BCP/PBS混合(0.1mg/ml)，对选出BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及IP 第三次增强免疫接种。
4.在进行细胞融合前2-3天，用0.1mgPSP-N-BCP/PBS混合，体积为 0.1ml，注入选出BALB/c鼠尾静脉内，进行加强免疫。
细胞融合
1.在融合细胞2周前，用含8-azaguanine DMEM液培养鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)，达到最好生长状态。
2.快速摘除BALB/c鼠脾脏，分离出脾细胞，用5：1比例与Sp2/0细胞混合，聚乙二醇(PEG4000)为融合剂，融合脾细胞与Sp2/0细胞。
3.融合细胞悬于含FBS的HAT培养液中，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板（200ul/孔），置于5%C02中在37℃ 培养，5天后，半保留换液, 10天后，用ELISA检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清液。
筛选阳性杂交瘤细胞
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备PSP肽-N(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul
包被液到酶联反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul杂交瘤细胞培养上清液到孔中, 在室温下， 缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板5次，每次5分钟
5. 加1:5000稀释100ul抗鼠IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
10.观察结果,确定产生IgG类PSP-N单克隆抗体细胞。
筛选出分泌PSP-N单克隆抗体杂交瘤细胞
1.用有限稀释法进行亚克隆筛选,对IgG 类PSP-N单克隆抗体阳性检出孔的细胞，用HTDMEM培养基稀释至每孔1个细胞，在 96孔细胞培养板培养，5小时内，显微镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆，用ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量扩增并冻存。
2.长期传代培养单克隆抗体杂交瘤细胞株后，用有限稀释法再进行亚克隆鉴定，从而获得了稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株。
3.对稳定单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，产生一定量抗体，用于鉴定单克隆抗体特征。
生产和纯化PSP-N单克隆抗体
1.用转瓶扩大培养分泌PSP-N单克隆抗体杂交瘤细胞株，收集细胞上清液，上清液通过0.45um滤膜过滤。
2.用(NH4)2SO4沉淀上清液中单克隆抗体，透析后除(NH4)2SO4，获得单克隆抗体浓缩液。
3.ProteinA-Agarose与单克隆抗体浓缩液反应，缓冲液洗涤后，用0.1Mcitricacid(pH3.0)洗脱结合PSP-N单克隆抗体，透析单克隆抗体，浓缩和净化单克隆抗体，测定单克隆抗体浓度，分装后，-20℃ 保存。
测定纯化单克隆抗体与PSP结合力及特异性
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备His-PSP(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul
包被液到酶联反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul不同浓度PSP-N单克隆抗体（0，1，5，20，100ng/ml）到孔中, 在室温下，
缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板5次，每次5分钟
5. 加1:2500稀释100ul抗鼠IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
Figure 13341DEST_PATH_IMAGE004
。
测定PSP-N单克隆抗体亲合力常数
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备His-PSP(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul
包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.10-8MHis-PSP(a)与20ng/mlPSP-N单克隆抗体混合（A），20ng/mlPSP-N单克隆抗体液
（A0），100ul加入每孔中，室温，反应l小时，PBST洗涤5min，共5次
4.加100ul 1:2500稀释抗鼠IgG抗体-HRP到每孔中，室温，反应l小时，PBST洗涤5min，共5次
5.每孔加入100ul底物显色液，室温，避光反应1O-15min, 加入50ul终止液, 测定OD值
Figure 528636DEST_PATH_IMAGE005
计算PSP-N单克隆抗体亲和力常数(K)公式：
A0/(A0–A)=1+K/a
1.586/（1.586-0.275）=1+K/10-8M
K=2.0 X 10-9M。
四．制备PSP-C单克隆抗体
（一）制备PSP抗原表位肽-N-载体蛋白免疫原
PSP抗原表位肽-N（SEQ ID NO.2)LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC，是人PSP蛋白第102至137位一段含36个氨基酸的肽段。这肽段具有亲水性、抗原性强，与载体蛋白连接后作为PSP-C-载体蛋白免疫原，接种动物产生特异性PSP抗体。
用制备PSP-N单克隆抗体相同步骤，制备PSP-C单克隆抗体。
用ELISA测定纯化PSP-C单克隆抗体与PSP结合力及特异性
Figure 982752DEST_PATH_IMAGE006
。
ELISA测定PSP-C单克隆抗体亲合力常数（K）
Figure 620406DEST_PATH_IMAGE007
计算PSP-C单克隆抗体亲和力常数(K)公式：
A0/(A0–A)=1+K/a
1.408/（1.408-0.291）=1+K/10-8M
K=2.6 X 10-9M。
五．制备PSP校准品
制备PSP重组蛋白相同步骤，制备PSP校准品，将Q-Sepharose洗脱液（含His-PSP蛋白）转入到透析袋中 (Spectra/Pro) ，再放入透析液 (20mM Tris, pH7.5, 100mM NaCl,10mM KCl,2.0mM MgCl2, 5% Glycerol, 1.0mM DTT, 1.0mM EDTA，1.0mM PMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过液。
将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟，收集上清液，加到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-3 KDa Centrifugal Filter），浓缩和净化离心柱中His-PSP蛋白液，测定His-PSP蛋白浓度，-80℃，冻存。
六.制备免疫层析检测PSP试纸条
（一）PSP抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒（Europium Chelate PS-COOH），购于Bangs Laboratories Inc.可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把PSP-N或C单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球（直径200nm）上, 步骤如下：
1. 取0.4ml Europium Chelate PS-COOH (10mg/ml), 直径200nm，加入1.5ml离心管中，离
心，13000rpm，6分钟，去除上清液
2. 再加入1.0ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)到离心管中，悬浮微球
3. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，重复2-3步骤二次
4. 再加0.5ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)含5mM EDC和10mM Sulfo-NHS到离心管中,混均，
25℃， 反应30分钟
5. 离心，13000rpm，6分钟，去除反应液
6. 加入1.0ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中
7. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，重复6-7步骤一次
8. 加入0.4ml PSP-N或C单克隆抗体（0.4mg/ml）到上述离心管中，25°C， 反应2小时
9. 加入50ul of 0.2M Tris(pH7.5) 到离心管中，25°C， 反应30分钟
10. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，
11. 加入1.0ml 0.2% BSA，0.01% Tween-20 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中
12. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，重复11-12步骤二次
13. 用缓冲液（10mM Tris，pH8.0，0.2% BSA，10% Sucrose, 0.1% PVP，0.2% Tween20,0.01% NaN3）悬浮PSP-N或C单克隆抗体-荧光微球至需要浓度，4°C储存，备用。
（二）处理样品垫和结合垫
本发明选用玻璃纤维MF1样品垫（GE Healthcare），浸泡在样品垫处理液（20 mM Tris,pH7.5, 2% Sucrose, 0.5% BSA，0.5% Tween-20，0.01%NaN3)，室温下，1 小时，再30℃，干燥8小时，密封，备用。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫（EMD Millipore），浸泡在结合垫处理液（10 mMTris, pH8.0，0.2% PVP, 15% Sucrose,0.5%BSA，0.5% Tween-20，0.01% NaN3)，室温下，1小时，再30°C，烘干8小时，密封，备用。
（三）喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1. 用缓冲液1（10mM Tris，pH8.0，5.0%Sucrose, 0.2%PVP，0.2% Tween20, 0.01%NaN3）将PSP-N或C抗体-铕螯合物荧光微球液稀释到0.2mg/ml，用Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，6ul/cm 速度，将PSP-N或C抗体-荧光微球喷到结合垫（GFDX）上，30°C，烘干6小时，加入干燥剂封存，备用。
2. 用缓冲液2（5mM Tris，pH8.0，2.0%Trehalose, 0.1%PVP，0.01% Tween20, 0.01%NaN3）稀释PSP抗体到2.0mg/ml，稀释抗鼠IgG 抗体浓度到2.0mg/ml，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，0.8ul/cm 速度，将上述PSP抗体液和抗鼠IgG抗体液喷到硝酸纤维素膜上，两线间距5mm, 30℃，烘干3小时，加入干燥剂封存备用。
（四）组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30%，30-37℃房间进行。免疫层析试纸条, 看图1，包括PVC底板及粘附于PVC底板上的样品垫（25mm）、结合垫（8mm）、硝酸纤维素膜（25mm）、吸水纸（30mm）;其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔PSP抗体涂层形成T线和由抗鼠IgG抗体涂层形成C线; 结合垫喷涂有PSP-N或C单克隆抗体-铕螯合物荧光微球。
本发明实施例中，T线与C线平行设置，T线与C线之间的距离为5mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm; 样品垫重叠在结合垫上方。将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm 试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡（图2），壳面上设置有加样孔（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样孔开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开位于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部T线（5）和C线（6）。
七．免疫荧光分析仪检测PSP浓度过程
（一）免疫层析试纸卡操作过程
用PSP免疫层析试纸卡进行定量检测样品中PSP时，在样品孔上加入PSP校准液(5ul),血清/浆（5ul）和全血（10ul）, 再加100层析液(PBS，pH7.5,0.5% BSA，0.5% Tween-20)到样品孔中，反应5-10分钟，T线和C线都应产生相应的荧光信号，用免疫荧光分析仪进行检测。
（二）建立免疫荧光分析仪检测PSP浓度程序
1.建立PSP浓度相关曲线
用His-PSP重组蛋白作为校准品，PBS（pH7.5）含0.5%BSA制备PSP校准品，浓度为 0,10，20，50，100，200，400ng/ml。 加5ulPSP校准品到PSP免疫层析试纸卡样品孔中，再加100ul层析液到样品孔中, 进行膜层析反应，5-10分钟后，用免疫荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长610nm，测定试纸条卡T线及C线荧光强度。以PSP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，制备PSP校准品浓度与荧光强度单位相关曲线，得到方程式，y=26.267x–24.27，R2=0.9885，看图5，通过此相关曲线得到PSP浓度标准卡，作为对样品中所含PSP浓度进行定量分析依据
Figure 912213DEST_PATH_IMAGE009
。
输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立自动运行系统，免疫荧光分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中PSP浓度。
用PSP免疫层析试纸卡检测样品中PSP浓度
加5ul血清到PSP层析试纸卡加样孔部位，再加100层析液到样品孔中，进行膜层析反应，5-10分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测系统，测定PSP浓度，结果如下：
Figure 861715DEST_PATH_IMAGE010
。
<110> 长春恒晓生物科技有限责任公司
<120> 制备胰石蛋白抗体及建立检测PSP方法
<160> 4
<210> 1
<211> 144
<213> PSP
<400> 1
QEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA 60
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTS 120
STGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN
<210> 1
<211> 33
<213> PSP
<400> 1
CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF
<210> 1
<211> 36
<213> PSP
<400> 1
LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC
<210> 1
<211> 137
<213> PSP
<400> 1
MKHHHHHHQLHAGAHQEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTSSTGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN

Claims (10)

1.一种制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：用基因重组技术构建标签-PSP重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-PSP重组蛋白，纯化标签-PSP重组蛋白作为PSP重组蛋白免疫原；PSP蛋白氨基酸序列：
QEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA 60
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTS 120
STGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
2.权利要求1所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：
合成PSP抗原表位肽-N, 氨基酸序列
SEQ ID NO.1：CQNMNSGNLVSVLTQAEGAFVASLIKESGTDDF；
合成PSP抗原表位肽-C，氨基酸序列
SEQ ID NO.2：LHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYC。
3.权利要求2所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP抗原表位肽-N或C偶联载体蛋白, 包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白(OVA)、蓝载体蛋白(BCP)等，制备成PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原。
4.根据权利要求1所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP重组蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP抗原表位肽-载体蛋白免疫原，免疫动物包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生PSP单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP重组蛋白，进行蛋白复性，作为检测PSP方法的校准品。
7.根据权利要求4，5和6所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP单克隆抗体或多克隆抗体，及PSP校准品，建立检测PSP方法，包括ELISA，化学发光法，免疫荧光法，免疫比浊法，免疫层析法，免疫凝集法等。
8.根据权利要求4，5和6所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP单克隆抗体或多克隆抗体,及PSP校准品，建立检测PSP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测PSP免疫层析试纸条，其中试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成。
9.根据权利要求1所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：结合垫吸附PSP抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定PSP抗体形成的检测线（T线）和抗IgG抗体构成的质控线（C线）。
10.根据权利要求1所述的制备胰石蛋白抗体 ，其特征在于：PSP重组蛋白制备过程，步骤如下：
（1）合成PSPDNA；（2）构建pQE-1-PSP载体；（3）表达His-PSP蛋白；(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化His-PSP蛋白；（5）进行His-PSP蛋白复性和浓缩过程；（6）测定His-PSP蛋白浓度，-80℃ 冻存；
His-PSP重组蛋白氨基酸序列：
MKHHHHHHQLHAGAHQEAQTELPQARISCPEGTNAYRSYCYYFNEDRETWVDADLYCQNMNSGNLVSVLTQAEGA
FVASLIKESGTDDFNVWIGLHDPKKNRRWHWSSGSLVSYKSWGIGAPSSVNPGYCVSLTSSTGFQKWKDVPCEDKFSFVCKFKN。
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