CN1112855C

CN1112855C - 用高酯果胶在酸性环境中稳定蛋白质的方法

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Publication number: CN1112855C
Application number: CN96196968A
Authority: CN
Inventors: T·M·I·E·克里斯滕森; J·D·克雷堡; H·托尔所; H·C·布霍尔特; P·拉斯慕森; J·尼尔森
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 2003-07-02
Anticipated expiration: 2016-07-12
Also published as: DE69615199T3; AU6614496A; CN1195970A; EP0839006B2; JP2006262905A; EP1101412A3; EP1625796A1; US20020009790A1; ES2163644T5; EP1101412B1; DE69615199T2; ES2163644T3; CZ11798A3; NZ313625A; DK0839006T3; AU714570B2; MX9800422A; DK0839006T4; EP1101412A2; US7166312B2

Abstract

本发明描述了一种向含至少一种蛋白质的酸性环境中加入以嵌段式方式酶促去酯化的果胶的方法，其中该果胶是高酯果胶。本发明还描述了一种重组果胶甲基酯酶。

Description

用高酯果胶在酸性环境中稳定蛋白质的方法

本发明涉及一种方法和用于该方法的酶。

具体地说，本发明涉及用于制备和使用酶修饰的果胶的方法。

在今天的工业中，果胶是一种重要的商品。例如，在食品工业中它可用作增稠或胶化剂，如在果酱的制备中。

果胶是一种在植物细胞壁中常见的原果胶形式的结构多糖。果胶的骨架包括α-1-4连接的半乳糖醛酸残基，它被少量1，2连接的α-L-鼠李糖单位打断。另外，果胶包括高度分枝的区域，具有一个几乎交错的鼠李糖-聚半乳糖醛酸链。这些高度分枝的区域还含有以糖苷键连接到鼠李糖单位的C3和C4原子或半乳糖醛酸单位的C2或C3原子上的其它糖单位(如D-半乳糖，L-阿拉伯糖和木糖)。α-1-4连接的半乳糖醛酸残基的长链通常称为“光滑区”，而高度分枝的区域常称为“多毛区”。

半乳糖醛酸残基的一些羧基被酯化(例如，羧基被甲基化)。一般，羧基的酯化在半乳糖醛酸残基聚合后出现。然而，所有的羧基被酯化(例如，甲基化)的极其少见。通常，酯化程度在0-90％间变化。如果50％或更多的羧基被酯化，那么所得的果胶称为“高酯果胶”(缩写为“HE果胶”)或“高甲氧基果胶”。如果不超过50％的羧基被酯化，那么所得的果胶称为“低酯果胶”(缩写为“LE果胶”)或“低甲氧基果胶”。如果果胶不含任何(或仅有少量)酯化基团，那么通常称为果胶酸。

果胶的结构，特别是酯化的程度(例如，甲基化)决定着果胶的许多物理和/或化学特性。例如，果胶凝胶化取决于果胶的化学特性，特别是酯化程度。然而，果胶的凝胶化也取决于可溶性固体的含量，pH和钙离子浓度。对于后者，据信钙离子与游离羧基形成复合物，特别是在LE果胶的游离羧基上。

果胶酶根据其攻击果胶分子的聚半乳糖醛酸部分的方式进行分类。Pilnik和Voragen已描述了一些果胶酶的综述(食品酶学，P.F.Fox；编辑；Elsevier(1991)；pp：303-337)。具体地说，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)，或称为PME将HE果胶去酯化形成LE果胶或果胶酸。相反，举例来说，果胶解聚酶断裂半乳糖醛酸苷甲基酯残基间的糖苷键。

更详细地说，PME活性产生游离羧基和游离甲醇。以自动滴定很容易监测自由羧基的增加。在这一方面，早期的研究已显示一些PME以随机方式使果胶去酯化，这就是说它们使超过一种果胶链的任一酯化(例如，甲基化的)的半乳糖醛酸残基去酯化。对果胶随机去酯化的PME的例子可从棘孢曲霉(见WO94/25575)和日本曲霉(Ishii等，食品科学杂志， 44：pp611-14)等真菌来源获得。Baron等(Lebensm，Wiss.M-Technol.13，pp330-333)很明显已从黑曲霉中分离出一种真菌PME。据报道这种真菌PME具有39000D的分子量，等电点为3.9，最适pH为4.5，Km值(mg/ml)为3。

相反，已知一些PME以嵌段式方式使果胶去酯化，这就是说据信它们在非还原端或靠近自由羧基处攻击果胶，然后以单链机制沿果胶分子前进，从而产生极具钙敏感性的未酯化的半乳糖醛酸单位。以嵌段式酶促方式使果胶去酯化的这类酶的例子是植物PME。已表明在柑桔中存在多达12种PME的同工型(Pilnik W.和Voragen A.G.J.(食品酶学(Ed：P.F.Fox)；Elsevier；(1991)；pp：303-337)。这些同工型具有不同的特征。

Versteeg等(食品科学杂志，45 pp：969-971)明显已从橙子中分离了一种PME。据报道该植物PME存在不同特征的多种同工型。同工型I分子量为36000D，等电点为10.0，最适pH为7.6，Km值(mg/ml)为0.083。同工型II分子量为36200D，等电点为11.0，最适pH为8.8，Km值(mg/ml)为0.0046。同工型III(HMW-PE)分子量为54000D，等电点为10.2，最适pH为8，Km值(mg/ml)为0.041。然而，迄今为止该PME的序列资料还非常有限。

根据Pilnik和Voragen(出处同上)，PME可在许多其它高等植物中发现。如苹果、杏、鳄梨、香蕉、浆果、酸橙、葡萄柚、中国柑橘、樱桃、茶藨子属、葡萄、芒果、番木瓜、西番莲、桃子、梨子、李、蚕豆、胡萝卜、花椰菜、黄瓜、韭葱、洋葱、豌豆、马铃薯、小萝卜和西红柿。然而，同样，适合对这些PME的序列资料非常有限。

以高效离子交换色谱可区分游离羧基的随机或嵌段式分布(Schols等，食品水胶体，1989，6，pp：115-121)。这些试验常用于检测巴氏消毒后在柑桔汁中的不需要的残留PME活性，因为残留的PME活性除了在橙汁中积累甲醇外，还引起所谓的“雾状消失”。

PME在工业上具有重要的用途。例如，它们可用于或作为钙离子的分离剂。在这方面，根据Pilnik和Voragen(出处同上)，经过向汁液提取后的柑桔果皮中加入氢氧化钙悬液可制备家畜饲料。加入后，高pH和钙离子激活果皮中的天然PME，引起果胶的迅速脱脂化和出现果胶酸钙凝固。束缚的液相被释放且易于压出，所以只有部分原始水份需要经过昂贵的热干燥来去掉。然后压榨的溶液用作动物饲料。

Pilnik和Voragen(出处同上)列出了内源性PME的用途，包括如果果汁中含过多来自水果的果胶时，将其加入果汁以减少果汁的粘度，将它们作为果胶酶溶液加入已加热到果心温度为20至40℃的柑桔果实的白色层气泡中以利于去掉果皮和从完整的果汁部分中去掉其它膜(US-A-4284651)，及其用于保护和改进诸如苹果(Wiley &Lee 1970，食品技术， 24，1168-70)，罐装西红柿(Hsu等，1965，食品科学杂志 30，pp.583-588)和马铃薯(Bartolome & Hoff1972，农业食品化学杂志， 20，pp.262-266)的一些加工的水果和蔬菜的质地和硬度。

Glahn和Rolin(1994，Food Ingredients Europe，CoutProceedings pp.252-256)报道了关于工业“GENU果胶型YM-100”与酸奶饮料相互作用的假定的用途。但根本没有提供关于如何制备GENU果胶型YM-100的细节。

EP-A-0664300公开了制备钙敏感性果胶的化学分离方法。据说该钙敏感性果胶对食品工业具有优势。

因此，除PME外，果胶和去酯化果胶具有工业重要性。然而，仍然需要改进稳定酸性环境中的蛋白质而不对该环境的粘度产生有害影响的已知方法。在这方面，对环境粘度的有害影响可损害所得产品的总体外观和/或质地和/或适口性和/或口感。

根据本发明的第1个方面，提供的方法包括向含至少一种蛋白质的酸性环境中加入一种嵌段式酶促去酯化的果胶，其中该果胶是高酯果胶。

根据本发明的第2个方面，提供的嵌段式酶促去酯化果胶的方法包括用包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的任一个的重组酶或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合来处理果胶。

根据本发明的第3个方面，提供了包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的氨基酸序列中任意一个的重组酶，其变异体，衍生物或同源物，包括其组合。

根据本发明的第4个方面，提供了编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列，其中的核苷酸序列包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的序列的任意一个或其变异体，衍生物或同源物。

根据本发明的第5个方面，提供了编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列，其中核苷酸序列可从NCIMB 40749或NCIMB 40750，或其变异体，衍生物或同源物中获得。

根据本发明的第6个方面，提供了表达或包含根据本发明的重组酶或根据本发明的核苷酸序列的构建体。

根据本发明的第7个方面，提供了表达或包含根据本发明的构建体或根据本发明的重组酶或根据本发明的核苷酸序列的载体。

根据本发明的第8个方面，提供了一种构建体的组合，包括至少一个表达或包含根据本发明的重组酶或根据本发明的核苷酸序列的第一构建体，和一个包含感兴趣的基因(GOI)和启动子的第二构建体。

根据本发明的第9个方面，提供了表达或包含根据本发明的载体或根据本发明的构建体或根据本发明的重组酶或根据本发明的核苷酸序列或根据本发明的构建体的组合的细胞，组织或器官。

根据本发明的第10个方面，提供了表达或包含本发明的任一上述方面的转基因生物。

根据本发明的第11个方面，提供了NCIMB 40749或NCIMB40750。

根据本发明的第12个方面，提供了一种重组PME酶，它与针对根据本发明的第3个方面的纯化重组酶而不是西红柿PME酶产生的抗体具有免疫反应性。

根据本发明的第13个方面，提供了根据本发明的重组酶对减少果胶的酯基数目的应用。

根据本发明的第14个方面，提供了根据本发明的重组酶对果胶以嵌段式方式去酯化的应用。

根据本发明的第15个方面，提供了根据本发明的重组酶影响果胶的钙敏感性的应用。

根据本发明的第16个方面，提供了根据本发明的重组酶酯化含游离羧基的果胶的应用。

根据本发明的第17个方面，提供了使用根据本发明的重组酶，如经过根据本发明的方法获得的果胶。

根据本发明的第18个方面，提供了包含根据本发明的重组酶及一种真菌PME和/或其它果胶降解酶(例如，果胶裂解酶)的酶组合。

本发明的其它方面包括根据本发明的果胶用于制备食品；根据本发明的果胶用于稳定酸性环境中的蛋白质而不对环境的粘度产生有害影响；以及编码根据本发明的酶的重组核苷酸序列。

因此，本发明涉及去酯化的果胶的新用途。本发明还涉及制备该果胶的新的重组PME。

本发明的一些主要的优势在于本发明的去酯化果胶赋予蛋白质在酸性环境中的稳定性而不对环境的粘度产生有害影响。

本发明的第一个方面优选的实施方案是包括向含至少一种蛋白质的酸性环境中加入使用重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化的果胶的方法，其中该果胶是一种高酯果胶。

术语“使用重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶”指含嵌段式去酯化基团的果胶，其中经过使用重组DNA技术制备的酶处理(例如，接触)含酯化基团的果胶来制备该果胶。

本发明的该优选方面的一些主要优势在于可较容易且以相当的一致程度制备去酯化的果胶。在这方面，可相当简单和容易地制备重组PME本身且也能达到高度的匀质性。不象背景技术PME制品，这意味着所得的PME活性更一致和匀质，使得总的去酯化过程更易控制。

嵌段式酶促去酯化的果胶(优选使用重组DNA技术制备)在本发明的方法中用于稳定酸性环境中的至少一种蛋白质具有益处，因为它使乳清和乳蛋白(如酪蛋白)等蛋白质在酸性溶液中稳定。这对诸如脱脂奶粉，果汁和乳清蛋白饮料的饮料市场具有重要性，其中如果存在高含量的稳定剂，只有在相当高的酸性条件(如，pH4.2)下才有可能达到关键蛋白的风味。

现在我们已发现，对于某些应用，可使用根据本发明的少量脱酯化的果胶。以这些较低的水平，根据本发明的去酯化果胶不仅充当稳定剂，而且对最终产物无副作用。

如果需要，本发明的去酯化果胶的使用能使食品制造者增加饮料等食品的pH。在这一方面，在有些情况下饮料的酸性较低可使它们对人们，特别是婴儿更适口。因此，与背景技术方法相反，经过使用嵌段式酶促去酯化果胶，特别是使用重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶，现在可在高于4.2的pH条件下，如高达pH5.5(如pH5.2)时保留这些蛋白质的风味。

另外，据信甚至在较低的pH条件，如pH4.2或更低时，嵌段式酶促去酯化果胶(特别是用重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶)比用于这些pH条件的背景技术的稳定剂可稳定更多的蛋白质。

另一个优势在于重组PME能产生基本上均一的嵌段式去酯化果胶。我们以此指基本上所有的果胶链包含至少2个相邻的去酯化羧基。然而，对于某些应用，制备或使用这些基本上均一的嵌段式去酯化果胶是不必要的。

尽管不希望受理论的束缚，但据信嵌段式酶促去酯化果胶(特别是使用重组DNA技术制备的)经过以负电荷屏蔽包围蛋白质，从而形成稳定的乳胶来稳定蛋白质。

当果胶与重组酶在基本上含水的介质中接触时，本发明的重组PME酶对果胶进行嵌段式去酯化是有用的。在有些情况下，去酯化果胶可增加果胶的钙离子敏感性，而这可能具有优势。

另外，当果胶与重组酶在基本上无水的介质中接触时，本发明的重组PME酶对于使果胶酯化是有用的，如在甲醇存在的条件下或在高浓度的硫酸铵存在的条件下。如果，例如，需要减小果胶的钙敏感性时，这一方面具有优势。

这种酯化果胶的方法具有优势，因为它不需要与背景技术方法相关的高温和甲醇酯化条件。因此，本发明还包括在食品制品及果胶本身中使用该酯化的果胶。

根据本发明，本发明的去酯化果胶对食品的制备具有优势。

典型的食品包括乳制品，肉制品，家禽制品，鱼制品和面包制品。优选该食品是饮料。

本发明的去酯化果胶对于在药品制备，药品应用，化妆品和化妆品应用中用作稳定剂和/或粘度修饰剂也是有优势的。

优选的酸性环境是水溶液。

优选的水溶液是饮料。

优选的饮料是饮用酸牛奶，果汁或包含乳清蛋白的饮料。

优选蛋白质来自或可从诸如牛奶或奶酪的乳制品中获得。

优选该蛋白质是酪蛋白或乳清蛋白。

优选酸性环境具有从大约3.5到大约5.5的pH。

优选的酸性环境具有从4到大约5.5的pH。

优选其中酸性环境pH为大约4。

优选的嵌段式酶促去酯化果胶(特别是以重组DNA技术制备的)是含大约80％酯基或较少(即，酯化程度(DE)为80％或较少)的高酯果胶，优选大约75％酯基或较少(即DE为大约75％或更少)。在这方面，果胶中游离羧基与酯化羧基的比率从1∶1到1∶4，优选从1∶2到1∶3。

优选嵌段式酶促去酯化果胶含约76％酯基。

在有些情况下，优选的嵌段式酶促去酯化果胶对Ca²⁺离子具有敏感性。以下面实施例所述的方法可测定钙敏感性。

然而，更优选的是，嵌段式酶促去酯化果胶，特别是以重组DNA技术制备的果胶对Ca²⁺离子不敏感。以下面实施例所述的方法可测定钙不敏感性。

优选嵌段式酶促去酯化果胶具有高分子量。

典型的是，分子量在大约50kD到大约150kD之间。

优选的是，经过用在至少基本上全部的果胶链上使果胶上的2个或多个相邻半乳糖醛酸残基去酯化的重组果胶甲基酯酶处理果胶来制备嵌段式酶促去酯化果胶。

优选重组果胶甲基酯酶来自可从植物获得的PME。

术语“来自可从植物获得的PME”指重组PME具有类似于可从植物获得的PME的序列，只要重组PME能以嵌段式方式使果胶去酯化。

优选的植物是水果。

优选的水果是柑桔水果。

优选的柑桔水果是橙子。

优选重组果胶甲基酯酶来自可从橙子的瓣膜或白色层中获得的PME。作为参考，图1显示了典型的柑桔水果的横切面，其中显示了瓣膜和白色层。术语“来自可从橙子的瓣膜或白色层中获得的PME”指重组PME具有类似于可从橙子的瓣膜或白色层获得的PME的序列，前提是重组PME可以嵌段式方式使果胶去酯化。

优选的是，嵌段式酶促去酯化果胶用包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重组酶，或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合处理果胶来制备。

优选的是，经过用表达包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列可获得的重组酶或其变异体，衍生物或同源物或其组合处理果胶制备嵌段式酶促去酯化果胶。

优选的是，用表达包含于NCIMB 40749或NCIMB 40750中的PME编码序列可获得的重组酶或其变异体，衍生物或同源物或其组合处理果胶制备嵌段式酶促去酯化果胶。

优选的是，在钠离子存在的条件下用重组果胶甲基酯酶处理果胶制备嵌段式酶促去酯化果胶。

优选的是，在NaCl、NaNO₃或Na₂SO₄存在的条件下，用重组果胶甲基酯酶处理果胶来制备以重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶。

优选的是，重组酶包括SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的所有序列。

优选的是，以包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的所有序列的核苷酸序列表达重组酶。

本发明还包括与上述序列互补的序列。

术语“果胶”包括常规意义上的果胶，以及其片段和衍生物，以及修饰的果胶(例如，化学修饰的果胶和酶促修饰的果胶)。

优选的是，果胶不是预先已用多聚半乳糖醛酸酶处理过、基本上减小了果胶主链长度的果胶。

与本发明的重组酶相关的术语“变异体”、“同源物”或“片段”包括从或对序列进行任意取代、变异、修饰、替代、缺失或添加一个(或多个)氨基酸，只要所得的氨基酸序列具有PME活性，优选具有至少等同于包含SEQ.I.D.No.1和2所示的任意一个或多个序列的重组酶的活性。特别是，术语“同源”包括关于结构和/或功能的同源性，只要所得的重组酶具有PME活性。至于序列同源性(即，相似性)，优选与所附序列表所示序列有至少75％，更优选至少85％，更加优选至少90％的同源性。更优选的是，与所附序列表所示的序列具有至少95％，更加优选至少98％的同源性。

与编码本发明的重组酶的核苷酸序列相关的术语“变异体”，“同源物”或“片段”包括从或对该序列进行任意取代、变异、修饰、替代、缺失或增加一个(或多个)核酸，只要是所得的核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶，优选具有至少等同于包含SEQ.I.D.Nos.1和2所示的任意一个或多个序列的重组酶的活性。具体地说，术语“同源”包括结构和/或功能的同源性，只要所得的核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶。至于序列同源性(即，相似性)，优选具有至少75％，更优选至少85％，更加优选至少90％的同源性。更优选的是，具有至少95％，更加优选至少98％的同源性。

上面的术语与该序列的等位变异体同义。

术语“互补”指本发明还包括能与编码序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

与本发明相关的术语“核苷酸”包括基因组DNA，cDNA，合成DNA和RNA。优选的是，它指DNA，更优选的是指本发明的编码序列的cDNA。

术语“柑桔水果”指柑桔属的种类，包括酸橙、柠檬、橙子、葡萄柚、金橘、柚，和中国柑橘。优选的是，它指橙子。

术语“构建体”与诸如“连接物”，“序列盒”和“杂合体”的术语同义，包括根据本发明的核苷酸序列，或构建体的组合情况，直接或间接附着于启动子上的GOI。间接附着的例子是提供诸如内含子序列的合适的间隔区，如Sh1-内含子或ADH内含子，间隔启动子与本发明的核苷酸序列或GOI。对于与本发明有关的术语“融合的”也是相同的，它包括直接或间接附着。在各种情况下，该术语不包括通常与野生型基因启动子相连的编码该酶的基因的自然组合，且此时它们均存在于其自然环境中。

该构建体甚至含有或表达一个标记，它允许在其所转化进的，例如，丝状真菌，优选曲霉属，如黑曲霉或植物，如马铃薯、甜菜等中选择该遗传构建体。可使用的各种标记有，例如，编码甘露糖-6-磷酸异构酶(特别是对于植物)的标记或提供抗生素抗性的那些标记，例如，对G418、潮霉素、博莱霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。

术语“载体”包括表达载体和转化载体。

术语“表达载体”指能在体内或体外表达的构建体。

术语“转化载体”指能从一个物种转移到另一物种的构建体，如从大肠杆菌质粒到丝状真菌，优选曲霉属。甚至可以是能从大肠杆菌质粒转移到土壤杆菌并转移到植物的构建体。

术语“组织”包括组织本身和器官。

与本发明有关的术语“生物”包括可包含编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列和/或可从其获得的产物的任意生物，其中当存在于生物中时，启动子允许表达根据本发明的核苷酸序列。

优选的生物是丝状真菌，优选曲霉属，更优选黑曲霉。

与本发明相关的术语“转基因生物”包括包含编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列和/或从其获得的产物的任意生物，其中该启动子允许在生物中表达根据本发明的核苷酸序列。优选核苷酸序列整合到生物的基因组中。

优选的转基因生物是丝状真菌，优选曲霉属，更优选黑曲霉。

因此，本发明的转基因生物包括包含启动子，编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列，根据本发明的构建体(包括其组合)，根据本发明的载体，根据本发明的质粒，根据本发明的细胞，根据本发明的组织或其产物的任意一种或其组合的一种生物体。

术语“转基因生物”不包括在其天然环境中的其天然启动子控制下的其天然环境中的根据本发明的天然核苷酸编码序列。另外，本发明不包括处于其天然启动子控制之下的其天然核苷酸序列表达的根据本发明的天然酶，其中上述启动子，核苷酸和酶均处于其天然环境之中。

转化的细胞或生物可制备易于从细胞或生物体中回收的可接受量的所需化合物。

优选本发明的构建体包括本发明的核苷酸序列和启动子。

术语“启动子”以本领域中的正常意义使用，例如，基因表达的Jacob-Monod理论中的RNA聚合酶结合位点。

在一个方面，根据本发明的核苷酸序列在可能是细胞或组织特异性启动子的启动子控制之下。例如，如果生物体是植物，那么，启动子可以是在块茎、茎、芽、根和叶组织的一处或多处影响核苷酸序列表达的启动子。

以举例的方式，本发明的核苷酸序列的启动子可以是在我们1994年10月21日申请的共同未决的英国专利申请号9421292.5中描述的α-Amy1启动子(或者称为Amy1启动子，Amy637启动子或α-Amy637启动子)。另外，本发明的核苷酸序列的启动子可以是在我们1994年10月21日申请的共同未决的英国专利申请号9421286.7中所述的α-Amy3启动子(或者称为Amy3启动子。Amy351启动子或α-Amy351启动子)。

另外，启动子包括保证或增加在合适的宿主中表达的特征。例如，该特征可以是诸如Pribnow Box或TATA box的保守区。该启动子甚至可含有对本发明的核苷酸序列或在构建体，GOI的组合情况下影响(如维持、增强、减小)表达水平的其它序列。例如，合适的其它序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导的元件，如温度，化学品，光照或压力可诱导的元件。另外，可存在增强转录或翻译的合适元件。后一类元件的例子有TMV5′信号序列(见Sleat基因217〔1987〕217-225；和Dawson植物分子生物学：23〔1993〕97)。

另外，本发明还包括启动子和/或编码蛋白质或重组酶的核苷酸序列和/或元件的组合。

本发明还包括使用启动子表达编码根据本发明的重组酶的核苷酸序列或GOI，其中启动子部分被灭活，但其中该启动子仍能发挥启动子功能。在某些情况下启动子的部分失活是有优势的。具体地说，对于以前提及的Amy351启动子，可使其部分失活，以便部分失活的启动子以更特异性的方式，如只在一种特异性组织类型或器官中表达本发明的核苷酸或GOI。

术语“失活的”指部分失活，意思是启动子的表达方式被修饰，但其中部分失活的启动子仍发挥启动子的功能。然而，如上所述，修饰的启动子能在至少一种(但不是全部)原始启动子的特异性组织中表达本发明的核苷酸或GOI。一个这类启动子是上述的Amy351启动子。部分失活的例子包括改变启动子序列的折叠方式，或部分核苷酸序列的结合种类，使部分核苷酸序列不被，例如，RNA聚合酶识别。部分失活的启动子的另一个且是优选的方式是将其截短以形成其片段。另一方式可诱变至少部分序列，使RNA聚合酶不能结合到该部分或另一部分上。另一类修饰是诱变调节蛋白(例如从丝状真菌了解的Cre A蛋白)的结合位点以产生碳降解产物阻遏，从而废除天然启动子的降解产物阻遏。

与根据本发明的构建体组合有关的术语“GOI”指任何目的基因。GOI可以是对所讨论的生物体(例如，丝状真菌，优选曲霉属或植物)是外来的或天然的任意核苷酸。典型的GOI的例子包括编码修饰代谢性和分解性过程的蛋白质和酶的基因。GOI可编码用于导入或增加病原体抗性的因素。GOI甚至可以是修饰存在于相关组织的天然转录子表达的反义构建体。GOI甚至可编码丝状真菌，优选曲霉属的非天然蛋白质或对动物或人类有益的化合物。

GOI的例子包括其它果胶酶，果胶解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，半纤维素酶，内-β-葡聚糖酶，阿聚糖酶或乙酰酯酶或其组合及其反义序列。

GOI可以是对食品或作物提供营养价值的蛋白质。典型的例子包括能抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和有更需要的氨基酸组成(例如，比非转基因植物更高的赖氨酸含量)的植物蛋白质。GOI甚至可编码能用于食品加工的酶，如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是编码任一害虫毒素和反义转录子的基因，如编码patatin或α-淀粉酶，ADP-葡萄糖焦磷酸酶(例如，见EP-A-0455316)，蛋白酶反义物，葡聚糖酶或基因组PME的基因。

GOI甚至可编码特定酶的内含子，但其中内含子可以是有义或反义方向。在后一种情况下，具体的酶可以是基因组PME。基因组外显子或内含子序列作为GOI的反义表达指天然PME表达减少或消除，但其中重组PME表达不受影响。对反义内含子或有义内含子的表达尤其如此。

GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，它是我们1994年7月4日申请的共同未决的英国专利申请9413439.2的主题。GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，它是我们1994年10月21日申请的共同未决的英国专利申请9421290.9的主题。GOI可以是编码ADP-葡萄糖焦磷酸酶的任意核苷酸序列，它是我们1994年4月7日申请的共同未决的PCT专利申请PCT/EP94/01082的主题。GOI可以是任一编码α-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，它在我们1994年10月15日申请的共同未决的PCT专利申请PCT/EP94/03397中描述。

宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草杆菌。关于原核宿主转化的指导在本领域中有充分的记载，例如，见Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第二版，1989，冷泉港实验室出版)。如果使用原核宿主，那么基因在转化前需适当修饰，如经过去掉内含子。

如上所述，优选的宿主生物是曲霉属，如黑曲霉。

根据本发明的转基因曲霉可按下面的指导来制备：Rambose k.J.和Leach.J.1987(丝状真菌中的重组DNA：进展和前景，CRC Crit.Rev.Biotechnol.6：357-393)，Davis R.W.1994(曲霉中的异源基因表达和蛋白质分泌，在Martinelli S.D.Kinghorn J.R.(编辑)，曲霉：工业微生物学进展50年，vol.29，Elsevier Amsterdam1994，pp.525-560)，Ballance.D.J.1991(丝状真菌的转化系统及真菌基因结构综述。见：Leong，S.A.，Berka R.M.(编辑)，分子工业真菌学。丝状真菌的系统和应用。Marcel Dekker Inc.NewYork，1991，pp.1-29)和Turner G.1994(遗传操作的载体，在：Martinelli S.D.Kinghorn J.R.(编辑)曲霉：50年工业微生物学进展，vol.29，Elsevier Amsterdam.1994，pp.641-666)。尽管如此，下面的描述提供了用于产生根据本发明的转基因曲霉的指导的小结。

几乎在一个世纪的时间里，丝状真菌被广泛用于许多类生产有机化合物和酶的工业中。例如，传统的日本酒曲和酱油发酵已使用曲霉属种类。另外，在本世纪，黑曲霉已用于生产有机酸，特别是柠檬酸及用于生产各种酶以便在工业上使用。

丝状真菌被广泛用于工业上有两个主要的原因。首先丝状真菌可产生高含量的细胞外产物，例如，酶和诸如抗生素或有机酸的有机化合物。其次，丝状真菌可在诸如谷物、糠、甜菜果肉等的廉价底物上生长。相同的原因使丝状真菌成为用于根据本发明的异源表达宿主的有吸引力的生物。

为了制备转基因曲霉，将根据本发明的核苷酸序列(或甚至GOI)插入设计成在丝状真菌中表达的构建体中可制备表达构建体。

已形成了用于异源性表达的一些类型的构建体。这些构建体优选含在真菌中有活性的启动子。启动子的例子包括用于高表达细胞外酶的真菌启动子，如葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)可与信号序列融合，该信号序列指导由根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)编码的蛋白质的分泌。通常使用真菌来源的信号序列。真菌中有活性的终止子终止表达系统。

在真菌中已形成另一类表达系统，其中根据本发明的核苷酸(或甚至是GOI)与编码稳定蛋白质的较小的或较大的部分真菌基因融合。这可稳定由根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)编码的蛋白质。在这一系统中，由特异性蛋白酶识别的裂解位点可导入真菌蛋白和由根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)编码的蛋白质之间，如此产生的融合蛋白质可由特异性蛋白酶在该位置裂解，从而释放由根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)编码的蛋白质。以举例的方式说明，可导入由至少在一些曲霉中发现的KEX-2样肽酶识别的位点。这种融合导致在体内裂解产生对表达产物而不是较大的融合蛋白的保护。

已报道了在曲霉中异源表达编码细胞，真菌、脊椎动物和植物蛋白的一些基因。如果根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)不与信号序列融合，该蛋白质可沉积在细胞内。该蛋白质可在细胞质中积累，且通常不被糖基化，对于某些细菌蛋白质来说，这可能是一种优势。如果根据本发明的核苷酸序列(或甚至是GOI)带有信号序列，该蛋白质将在细胞外积累。

至于产品稳定性和宿主菌株的修饰，一些异源性蛋白质当它们分泌进真菌培养液中时不是太稳定。大多数真菌产生一些降解异源性蛋白质的细胞外蛋白酶。为了避免该问题，将具有减小蛋白酶产量的特定真菌菌株用作异源性生产的宿主。

为了转化丝状真菌，建立了一些转化方案，用于许多丝状真菌(Ballance 1991，出处同上)。其中的一些以原生质的制备为基础且使用PEG和Ca²⁺离子将DNA导入原生质体中。转化的原生质体然后再生且使用各种选择性标记选择转化的真菌。用于转化的标记中有许多营养缺陷型标记，如arg B、trp C、nia D和pyr G，抗生素抗性标记，如苯菌灵抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的转化标记是构巢曲霉的amds基因，其高拷贝数允许真菌以丙烯酰胺作为唯一氮源进行生长。

在另一实施方案中，转基因生物是酵母。在这方面，酵母还广泛用作异源基因表达的载体。啤酒糖酵母种类具有较长的工业应用历史，包括其用于异源基因的表达。异源基因在啤酒糖酵母中的表达由Goodey等(1987，酵母生物技术，D.R.Berry等，编辑，pp.401-429，Allen和Unwin，伦敦)和由King等(1989，酵母分子和细胞生物学，E.F.Walton和G.T.Yarronton编辑，pp.107-133，Blackie，Glasgow)进行了综述。

由于一些原因，啤酒糖酵母非常适用于异源基因的表达。首先，它对人类是非致病性的，它不能产生某些内毒素。其次，在几个世纪的为各种目的进行的商用开发后，它具有较长的安全使用历史。这导致被公众广泛接受。第三，对该生物进行的广泛商业应用和研究导致对啤酒糖酵母的遗传学和生理学及大规模发酵特征具有充分的了解。

对在啤酒糖酵母中表达异源基因和分泌基因产物的综述由E.Hinchcliffe E.Kenny(1993，“酵母作为表达异源基因的载体”，酵母，vol.5，Anthony H.Rose和J.Stuart Harrison编辑，第二版，学术出版有限公司)给出。

可得到一些类型的酵母载体，包括整合载体(它需要与宿主基因组进行重组以便于其维持)和自主复制质粒载体。

为了制备转基因糖酵母，经过将本发明的核苷酸序列插入设计成在酵母中表达的构建体中来制备表达构建体。已形成了用于异源性表达的一些类型的构建体。构建体含有在酵母中有活性的，且融合到本发明的核苷酸序列上的启动子，通常使用酵母来源的启动子，如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子终止表达系统。

为转化酵母，已形成了一些转化方法。例如，可按Hinnen等(1978，美国科学院学报，75，1929)；Beggs，J.D.(1978，自然，伦敦，275，104)和Ito.H.等(1983，细菌学杂志，153，163-168)的指导制备根据本发明的转基因糖酵母。

使用各种选择性标记可选择转化的酵母细胞。用于转化的标记中有许多营养缺陷型标记，如LEU2，HIS4和TRP1，和显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷类抗生素标记，例如G418。

另一宿主生物是植物。

尽管在EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公开该酶及编码它们的核苷酸序列，但这两篇文献提供了关于可用来制备根据本发明的转基因植物的技术类型的一些有用的背景描述。一些这类背景技术现在包括在下面的描述中。

构建遗传修饰的植物的基本原理是将遗传信息插入植物基因组以便获得所插入的遗传物质的稳定维持。

对插入遗传信息有一些技术，两个主要的原则是直接导入遗传信息及经过使用载体系统导入遗传信息。一般技术的综述可见于Potrkus(植物生理学和植物分子生物学年鉴〔1991〕，42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。

因此，在一个方面，本发明涉及一种载体系统，它携带根据本发明的核苷酸序列或构建体，且它能将核苷酸序列或构建体导入生物体，如植物的基因组中。

载体系统可包括一个载体，但它可包含两个载体。在两个载体的情况下，载体系统一般称为二元载体系统。二元载体系统在Gynheung An等(1980)，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19中进行了更详细的描述。

一个具有给定启动子或核苷酸序列或构建体，广泛用于转化植物细胞的系统以使用来自根癌土壤杆菌的Ti质粒或来自发根土壤杆菌的Ri质粒为基础，An等(1986)，植物生理学，81，301-305及ButcherD.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养方法，编辑；D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203 208。

已构建了一些不同的Ti和Ri质粒，它们适用于构建上面所述的植物或植物细胞构建体。这类Ti质粒的一个非限制性的例子是pGV3850。

本发明的核苷酸序列或构建体应优选插入Ti质粒的T-DNA末端序列之间或相邻于T-DNA序列，以避免破坏刚好在T-DNA边界周围的序列，因为至少一个这类区域似乎对将修饰的T-DNA插入植物基因组是必需的。

从上面的解释可了解到，如果生物体是植物，那么本发明的载体系统优选含感染植物所必需的序列(例如，vir区)和至少一个T-DNA序列的边界部分，该边界部分位于作为遗传构建体的相同载体上。优选的是，该载体系统是根癌土壤杆菌Ti-质粒或发根土壤杆菌的Ri-质粒或其衍生物，因为这些质粒是熟知的，且广泛用于转基因植物的构建，存在许多以这些质粒或其衍生物为基础的载体系统。

在构建转基因植物时，可首先在微生物中构建本发明的核苷酸序列或构建体，其中该载体可复制且在插入植物前易于操作。一个有用的微生物的例子是大肠杆菌，但可使用具有上面特征的其它微生物。当按上面限定的载体系统的载体在大肠杆菌中构建时，如果需要的话，将它转移进合适的土壤杆菌菌株，例如，根癌土壤杆菌中。因此，含本发明的核苷酸序列或构建体的Ti质粒优选转移进合适的土壤杆菌菌株，例如根癌土壤杆菌中，以获得含本发明的核苷酸序列或构建体的土壤杆菌细胞，随后将DNA转移进待修饰的植物细胞中。

如在CA-A-2006454中所报道的，可获得大量克隆载体，它含有大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化细胞的标记。该载体包括，例如，pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。

以这种方式，可将本发明的核苷酸或构建体导入载体的合适限制性位置上。所包含的质粒用于转化进大肠杆菌。在合适的营养培养基中培养大肠杆菌细胞，然后收获并裂解。然后回收该质粒。至于分析方法，一般使用的有序列分析，限制性分析，电泳和其它生物化学-分子生物学方法。在每种操作后，可限制性消化所用的DNA序列并与下一DNA序列相联。各序列可克隆在相同或不同的质粒中。

在根据本发明的所需启动子或构建体或核苷酸序列的每种导入方法后，在植物中存在和/或插入其它DNA序列是必需的。例如，对于转化，如果使用植物细胞的Ti-或Ri-质粒，可连接至少右侧边界且通常是Ti-或Ri-质粒T-DNA的右侧和左侧边界，作为导入基因的侧翼区。已深入研究了用于转化植物细胞的T-DNA的使用且在EP-A-120516；Hoekema，在：二元植物载体系统，Offset-drukkerijKanters B.B.，Alblasserdam，1985，Chapter V；Fraley等，Crit，Rev.Plant Sci.4：1-46；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284中进行了描述。

用土壤杆菌直接感染植物组织是一种简单的技术，它已被广泛地采用且在Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养方法，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中进行了描述。关于该主题的进一步的指导，参见Potrykus(植物生理学和植物分子生物学年鉴〔1991〕42：205-225和Christou(Agro-Food-IndustryHi-Tech March/April 1994 17-27)。使用该技术，可在植物的某部分或组织对植物进行感染，即在叶、根、茎的一个部分或植物的另一部分。

一般用携带启动子和/或GOI的土壤杆菌直接感染植物组织时，使待感染的植物受伤，例如，用刀片切断植物或用针刺穿植物或用研磨物擦破植物而使植物感染。然后用土壤杆菌接种伤口。然后使接种的植物或植物部分在合适的培养基上生长且使其发育成成熟植物。

当构建植物细胞时，可按熟知的组织培养方法培养和维持这些细胞，如在加有必需的生长因子，如氨基酸，植物激素，维生素等的合适培养基中培养细胞。转化的细胞再生成遗传修饰的植物可使用从细胞或组织培养物再生植物的已知方法来实现，例如，使用抗生素选择转化苗或在含合适的营养成分，植物激素等的培养基上传代培养幼苗来实现。

关于植物转化的进一步的指导参见EP-A-0449375。

总之，本发明提供了在酸性环境中稳定至少一种蛋白质的方法，包括将蛋白质与嵌段式酶促去酯化果胶，特别是以重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶接触。

另外，本发明提供了在该方法中有用的重组酶。

本发明优选的实施方案涉及在酸性环境中稳定至少一种蛋白质的方法，包含将蛋白质与经重组DNA技术制备的嵌段式酶促去酯化果胶接触，其中嵌段式酶促去酯化果胶使用重组酶来制备，且其中重组酶包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合，且具有下列特征：1.分子量从大约36kD到大约64kD；2.当用0.5％的酸橙果胶在0.15M NaCl中测量时最适pH为pH7-8；3.最适温度为至少50℃；4.在从10℃到至少40℃的范围内具有温度稳定性；5.Km值为0.07％；6.在大约0.25M NaCl水平时具有最大活性；7.在大约0.2M Na₂SO₄水平时具有最大活性；和8.在大约0.3M NaNO₃水平时具有最大活性。

本发明的另一优选的实施方案涉及以嵌段式使果胶酶促去酯化的方法，包括用包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重组酶或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合处理果胶，其中重组酶具有下列特征：1.分子量从大约36kD到大约64kD；2.当用0.5％的酸橙果胶在0.15M NaCl中测量时最适pH为pH7-8；3.最适温度为至少50℃；4.在从10℃到至少40℃的范围内具有温度稳定性；5.Km值为0.07％；6.在大约0.25M NaCl水平时具有最大活性；7.在大约0.2M Na₂SO₄水平时具有最大活性；和8.在大约0.3M NaNO₃水平时具有最大活性。

本发明的另一优选的实施方案涉及包含SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列的重组酶，或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合，其中该重组酶具有下列特征：1.分子量从大约36kD到大约64kD；2.当用0.5％的酸橙果胶在0.15M NaCl中测量时最适pH为pH7-8；3.最适温度为至少50℃；4.在从10℃到至少40℃的范围内具有温度稳定性；5.Km值为0.07％；6.在大约0.25M NaCl水平时具有最大活性；7.在大约0.2M Na₂SO₄水平时具有最大活性；及8.在大约0.3M NaNO₃水平时具有最大活性。

本发明更优选的实施方案涉及上述优选的过程，方法和重组酶，其中，以包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示序列的核苷酸序列或其变异体，衍生物或同源物表达重组酶。

下列样品按照布达佩斯条约于1995年7月6日保存在认可的保藏单位；国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)23 St.MacharDrive，Aberdeen，苏格兰，AB2 1RY，英国：NCIMB 40749(它相应于质粒pO34)。

下列样品按照布达佩斯条约于7月12日保存于认可的保藏单位国立工业和海洋微生物有限公司(NCIMB)23 St.Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，AB2 1RY，英国：NCIMB 40750(它相应于质粒pO17)。

因此，本发明更优选的实施方案涉及上述过程，方法和重组酶，其中重组酶能由NCIMB 40749或NCIMB 40750表达。

本发明还提供了包含SEQ.I.D.No.5所示序列的氨基酸序列或其变异体，衍生物或同源物，它适用于赋予蛋白质热稳定性或增加其热稳定性。

另外，本发明提供了包含SEQ.I.D.No.6所示序列的核苷酸序列或其变异体，衍生物或同源物，它适用于表达赋予蛋白质热稳定性或增加其热稳定性的氨基酸序列。

至于最后一个方面，同样可应用上面关于变异体，衍生物，同源物，构建体，载体，宿主生物的转化的描述，尽管在这种情况下氨基酸序列和核苷酸序列肯定会影响该蛋白质的热稳定性。

在该方面，据信SEQ.I.D.No.5所示氨基酸序列能赋予一种蛋白质热稳定性或增加其热稳定性，如对本发明的重组PME，该氨基酸序列也可向其它蛋白质，包括其它来源的PME增加或赋予热稳定性。

现在将以实施例的方式描述本发明，其中下列附图作为参考：

图1.柑桔水果如橙子的示意图；图2.本发明的重组酶的SDS PAGE凝胶；图3.测定最适pH的曲线图；图4.测定最适温度的曲线图；图5.测定温度稳定性的曲线图；图6.测定Km值的曲线图；图7.在NaCl存在或不存在时测定活性的曲线图；图8.在Na₂SO₄存在或不存在时测定活性的曲线图；图9.在NaNO₃存在或不存在时测定活性的曲线图；图10.pO17的质粒图谱；图11.pO34的质粒图谱；图12.两个基因的示意图；图13.pJK10的质粒图谱；图14.pJK11的质粒图谱；图15.pJK12的质粒图谱；图16.pJK20的质粒图谱；图17.pJK21的质粒图谱；和图18.pJK22的质粒图谱。图1在上面的描述中提及，其它附图在下面的描述中讨论。

实验部分用于生物化学法的材料和方法：

植物材料：无种子的Nanelina品种I型的未成熟的西班牙橙子用于分离PME。将橙子手工剥皮并将果皮贮存于-80℃。从橙皮中提取PME：

根据下列方法纯化PME。所有操作在4℃进行。融化600g冷冻的橙皮并切成小块。然后将它们在Warring捣碎器中用1200ml缓冲液(100mM琥珀酸钠pH6.2，1mM DTT)匀浆2分钟。向匀浆物中加入36g固体NaCl达到3％(w/v)的终浓度以便分离膜结合蛋白(Versteeg等，(1978)，Lebensmittel，-Wiss.U.技术， 11：267-274)。在4℃轻轻搅拌保温2小时后将悬液通过尼龙网过滤，滤液以10,000rpm离心20分钟以去掉不溶性残渣。

然后使用(NH₄)₂SO₄沉淀分离上清。首先用30％(NH₄)₂SO₄且缓慢搅拌30分钟沉淀上清。以20,000rpm离心10分钟后，用60％(NH₄)₂SO₄进一步沉淀上清30分钟。如前所述离心悬液且沉淀重悬于50ml 50mMMES，1mM DTT pH6.8中并用相同的缓冲液透析过夜。色谱：

经阳离子交换色谱进一步分离透析样品。对40-50ml样品过两轮CM-Sepharose^TM CL-6B(1.5×15cm)柱，在两轮间用缓冲液A：50mM MES，1mM DTT pH6.8洗涤30分钟。用缓冲液A洗下未结合的蛋白质后，用总共500ml 0-0.4M NaCl的NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。流速为25ml/h，收集8.33ml的馏分。在280nm下测量蛋白质的吸光情况。

分析所有馏分的PME活性和蛋白质。用BioRad方法以分光光度术测蛋白质的含量。

合并含PME活性的馏分并使用Amicon滤器系统经加压透析浓缩。在相同的系统中将缓冲液交换成50mM Tris，1mM DTT，0.1MNaCl pH7。

然后将9ml浓缩的PME样品过Sephacryl^TM S-200(2.6×70cm)凝胶过滤柱。用50mM Tris，1mM DTT，0.1M NaCl pH7平衡柱。流速为40ml/h，收集5.33ml的馏分。合并含PME活性的馏分并浓缩。酶活性：

PME催化从果胶上裂解甲基酯基。在纯化步骤过程中使用甲基红指示剂试验以快速方法检测PME。由于从果胶链的半乳糖醛酸残基上裂解甲基基团，因此在试验中形成羧基且pH下降。pH指示剂(甲基红)在pH下降时颜色从黄色(pH6.2)到变为桃红(pH4.2)。该试验含1ml在0.15M NaCl pH7中溶解的0.5％Grindsted^TM果胶1450(DE 70％)(由Daniseo Ingredients，Danisco A/S提供)和125μl样品。在30℃保温10分钟后甲基红试验阳性的样品然后以滴定方法(Versteeg等(1978)Lebensmittel.-Wiss.U.技术， 11：267-274)进一步测定。

至于滴定方法，该试验含10ml溶于0.15M NaCl pH6.8中的0.5％酸橙果胶(Grindsted^TM果胶1450(由Danisco Ingredients，DaniscoA/S提供)和10-100μl样品。用0.02M NaOH进行滴定并在室温下测量反应。使用自动滴定仪(Versteeg等(1978)Lebensmittel.-Wiss.U.技术， 11：267-274)。SDS-PAGE/Western印迹：

使用具有10-15％SDS-梯度凝胶的Pharmacia PhastSystem^TM经SDS-PAGE检查PME馏分的纯度。按Pharmacia的手册所述进行蛋白质的电泳和银染。为了测定pI，使用IEF3-9 PhastSystem^TM凝胶。

免疫凝胶电泳用于鉴定抗橙皮PME的多克隆抗体。在SDS-PAGE上分离酶馏分并以PhastSystem^TM的半干转移单位的半干印迹技术转移到NC-纸上。用1∶50稀释的第一抗体温育NC-纸并用偶联到碱性磷酸酶(Dako A/S Glsotrup，Denmark)上的以1∶1000稀释的第二抗体染色。肽图谱：

用胰蛋白酶或来自产酶溶杆菌的内切蛋白酶Lys-C消化PME(两种酶制品均是测序级，购自Boerhinger Mannheim，德国)。

用碘乙酰胺对100μg纯化的PME进行羧甲基化以保护还原的SH-基团。然后用胰蛋白酶(4μg/20-100μl)裂解该蛋白质。在40℃下水解2×3小时。加入20μl TFA终止反应。在15,000rpm下离心5分钟后，在反相HPLC柱(Vydac 10 C₁₈柱)上纯化该肽。对2×500μl样品进行处理。60分钟内用在0.1％TFA中0.05-0.35％递增的乙腈梯度洗脱并分离肽。在Eppendorf管中手工收集该肽。

为了用内切蛋白酶Lys-C消化，冷冻干燥的PME(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH₄HCO₃，pH8.4中。用N₂覆盖并加入5μl 45mM DTT后，变性蛋白质并在N₂中50℃下还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺使半胱氨酸在N₂中暗处及室温下衍化15分钟。随后，加入90μl水和溶于50μl 50mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和10mM EDTA，pH8.0的5μg内切蛋白酶Lys-C且在N₂中37℃下消化24小时。

按对胰蛋白酶消化的肽所述分离所得的肽。

选择的肽在Devosil 3 C₁₈ RP-HPLC柱0.46×10cm(NovoNordisk，丹麦)上进一步纯化。然后将纯化的肽上氨基酸测序仪，应用生物系统476A，使用脉冲液相快速循环。研究1：

在PME纯化期间，将600g冷冻的橙皮匀浆，用30-60％(NH₄)₂SO₄沉淀并透析后，将样品上阳离子交换柱(CM-Sepharose^TM CL-6B)。在pH6.8时PME强烈地结合阳离子交换柱材料，而大多数蛋白质不结合柱，因此在洗涤溶液中洗脱。随着NaCl梯度的递增，PME洗脱成2个峰。在0.25M的NaCl浓度下的PME I(馏分49-53)具有主要活性。在较低NaCl浓度下洗脱出次级PME峰(馏分25-32)。只对PME I进行进一步的纯化，它含有最高活性。

浓缩后，使用凝胶过滤色谱(Sephacryl^TM S-200柱)进一步纯化PME馏分。合并含最高PM E活性的馏分并在amicon滤膜透析中浓缩。

从600g橙皮获得总共大约4mg PME，相当于蛋白产率为12％。

在纯化的PME馏分中SDS-PAGE仅显示出一条蛋白质带，MW为36,000D(图2)。PME的等电聚焦显示pI为＞9。鉴定及动力学数据：

PME的鉴定和最适值的测定均按材料和方法所述的滴定方法进行。

用0.5％酸橙果胶(Grindsted^TM果胶1450-由DaniscoIngredients，Danisco A/S提供)在0.15M NaCl中测定PME活性的pH最适值。数据在图3中表示。发现最适值为大约pH7-8。

发现最适温度为50℃，见图4所示的数据。

经过将酶样品在Eppendorf管中在不同的温度下保温15分钟测定PME的热(温度)稳定性。保温后，以传统试验经滴定方法测定酶活性。酶活性的稳定性在10°-40℃之间，参见图5所示的数据。

以不同果胶浓度对活性的Lineweaver Burk曲线图测定对酸橙果胶(Grindsted^TM果胶1450-由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)的亲和力。数据在图6中显示。从曲线计算Km为0.07％。

我们还发现PME也能对甜菜果胶去酯化。甜菜果胶含60％半乳糖醛酸残基，其中一些羧基被甲基化(大约DE为60％)，另外，一些半乳糖醛酸基团在C-2和/或C-3被乙酰基化。按材料和方法中所述测定PME活性，但在该试验中使用溶于0.15M NaCl中的1％甜菜果胶，因为甜菜果胶含大约60％的果胶。结果表明PME能对甜菜果胶去酯化，即使半乳糖醛酸残基在C-2/C-3位被乙酰基化。

	酶活性(μmol/分/ml)
	酶活性(μmol/分/ml)	0.5％酸橙果胶(Grindsted^TM果胶1450-由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)	387
1.0％甜菜果胶	80		387

进一步的实验表明，本发明的PME活性优选需要NaCl-见图7中的数据。活性随NaCl浓度的递增而增加，最适值为0.25M NaCl。与最大活性相比，更高的浓度减小活性。

进一步的实验显示，对于PME活性，其它盐，例如Na₂SO₄或NaNO₃可代替NaCl。该数据在图8和9中显示，在0.2M Na₂SO₄和0.3MNaNO₃时分别出现最适活性。N-末端分析：

研究显示，天然PME的N末端序列被封闭。经过用无水TFA在试管中45℃下处理印迹到PVDF膜上的PME 4分钟可实现去封闭。蒸发掉大部分TFA后，试管在65℃下放置4小时(Wellner，D等(1990)美国科学院学报，87：1947-1949)。获得的序列是SSSVTPNVVVAADSSGNFK，且N-乙酰丝氨酸是PME的N-端残基。免疫组织学定位：

为了制备免疫组织化学的组织样品，将成熟水果中间部分的薄切片在用0.05M磷酸盐缓冲液pH7缓冲的2％低聚甲醛，0.25％戊二醛和3％蔗糖中固定。25℃温育2小时及5℃温育63小时后，标本在0.05M磷酸盐缓冲液pH7中洗涤3×20分钟。使用系列乙醇洗涤(50％、70％、80％和96％)，接着以99％乙醇洗涤3次(每个乙醇浓度30分钟)，进行脱水。用石油(Shellsol^TM D70K，Q7712)再次处理2×2小时及在具有7％蜂蜡的石蜡中处理2×2小时后，将样品包埋于石蜡中。在Supercut 2050 Reichart Jung pyramitome中制备12.5μm的横切片。免疫学：

组织切片在TBS(0.5M Tris/HCl pH7.6，0.15M NaCl，0.1％Triton X-100)中用20％猪血清预温育30分钟后用在TBS中1∶50稀释的PM E抗体处理1小时。用TBS洗涤5×5分钟去掉多余的抗体。洗涤后切片用在TBS缓冲液中1∶20稀释的与碱性磷酸酶偶联的第二抗体保温30分钟。按上面所述用TBS洗涤去掉剩余的第二抗体。染色前，切片用佛罗那乙酸缓冲液pH9.2处理5分钟，然后用坚牢红和Naphtol AS-BI磷酸(Sigma no N 4875)染色20分钟。用水洗涤去掉多余的试剂。对照平行地进行且用免疫前血清处理。结果：

用抗果皮PME的抗体进行免疫学定位表明PME大量位于果瓣之间瓣膜外部细胞层上，果核及在果汁囊的外部细胞层上，也存在于白色层的内部细胞层上(见图1)。这些结果证实，抗果皮PME的抗体与果肉(果肉由果瓣组成，见图1)的PME交叉反应，表明分别位于果皮和果肉中的PME之间具有高度同源性。研究2：

从橙子果皮大量纯化PME。在该方面，从5kg橙子果皮分离大约70mg PME。然后将纯化的PME用于使用牛奶蛋白质-即饮用酸牛奶的应用试验中。在该试验中，嵌段式酶促去酯化果胶与非去酯化果胶相比增加了蛋白质的稳定特征，很可能是因为形成了封闭的结构。最终产物也具有较好的粘度。同工酶：

尽管不希望受理论的约束，据信本发明的PME可存在至少两种同工酶。同工酶S分子量为大约36kD，可称作“短PME”。同工酶L分子量为大约64kD，可称作“长PME”。

据信同工酶L比同工酶S具有更高的热稳定性。另外，据信同工酶S以嵌段式方式开始起始的去酯化步骤，然后由同工酶L代替。

换句话说，据信同工酶L比同工酶S对部分去酯化果胶具有更大的亲和力。

据信同工酶L的热稳定性可能是由于SEQ.I.D.No.5所表示的氨基酸序列。

进一步的研究表明，同工酶L的基因具有信号序列的N端延伸上游区。这在图12中以图表示。分离和鉴定可从橙子中获得的编码果胶甲基酯酶的cDNA分子生物学的材料和方法：1.材料：

使用产自摩洛哥的橙子(甜橙)品种Navel。2.DNA：

按Dellaporta S.L.等(1983)植物分子生物学报道1(4)：19-21所述分离基因组DNA。按EP-B-0470145所述分离质粒DNA。3.RNA：

从成熟的橙子中分离总RNA。按Logemann J.，Schell.J.和Willmitzer L.(1987)。分析生物化学，163：16-20“从植物组织分离RNA的改进方法”所述的方法将Navel橙子果实的果肉外部和白色层的内部(见图1)用于RNA分离。4.PCR：

用rTth反向PCR试剂盒(Perkin Elmer)根据供应商的说明以下面的温度循环将橙子总RNA用于进行反向PCR：

逆转录：

70℃ 2分钟

60℃ 2分钟

50℃ 2分钟

45℃ 5分钟

40℃ 5分钟

30℃ 10分钟

42℃ 10分钟

70℃ 2.5分钟

5℃ 浸泡

扩增(PCR)：

94℃ 2分钟

92℃ 1分钟

45℃ 2分钟

72℃ 2分钟，循环40次

72℃ 5分钟

5℃ 浸泡5.PCR片段的克隆：

按供应商的说明将PCR片段克隆进载体pT7Blue(Novagen)的EcoRV位点。6.DNA测序：

基本上按Sanger等(1979)的双脱氧方法使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪(参见：Sanger，F.，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1979)。用链决定抑制剂进行DNA测序，美国科学院学报：74：5463-5467)对双链DNA测序。用于测序的引物在下面列出(按5′至3′提供)：

UNI(M13-20引物)-17 Mer

GTAAACGACGGCCAGT

REV-19 MER

GGAAACAGCTATGACCATG

01-20 MER

GACAACGGCAACGAGCCTCA

02-22 MER

GCACTTGTAATAACCCTAAAT

03-20 MER

CAGGGTAGTTTCCCGACGTA

04-20 MER

TACGTCGGGAAACTACCCTG

05-21 MER

CTCCTGGAAGCTTCATTGCTG

06-20 MER

GAAGCTTCTTGAAGAGAACG

07-20 MER

CGTTCTCTTCAAGAAGAAGCTTC

08-22MER

GAGGATAGCATGATGAGGCTCG

09-22 MER

GCAGTTCACAAAGAACTGGCGG

010-22 MER

CCTCATGATCATCATGTCAGTG

011-21 MER

GCTCCTCAGGGAGGCACTAAG

012-21 MER

CAGCAATGAAGCTTCCAGGAG

013-21 MER

CTTAGTGCCTCCCTGAGGAGC

014-18 MER

GCCACCGCCTGGTGCTTT

015-18 MER

AAAGCACCAGGCGGTGGC

016-20 MER

GCGGGATGCGTTGTCAGACG

017-20 MER

GAGGCACTAAGCGGTATATT

018-18 MER

GCAACTGTAGCAGACTTG

019-20 MER

CACTGACATGATGATCATGA

020-20 MER

CAATTAAGCAGTTCACAAAG

021-20 MER

AATATACCGCTTAGTGCCTC

测序的核苷酸序列以SEQ.I.D.No.3(来自pO17)和SEQ.I.D.No.4(来自pO34)表示。N-端序列以SEQ.I.D.No.6表示。7.文库的筛选：

用合适的放射性标记的PCR探针筛选从橙子果实果肉和白色层分离的mRNA所制备的λZap II(Stratagene)中的cDNA文库。根据供应商的说明进行筛选，但预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt’s和100μg/ml变性鲑精DNA中进行。在67℃杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次，在1×SSC，0.1％SDS中洗涤2次，在0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤2次。8.探针：

经过用合适的限制性酶消化以pT7blue载体中分离克隆的PCR片段。以琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段，纯化片段，并使用Ready toGO^TM DNA标记试剂盒(Pharmacia)进行放射性标记。9.Southern分析

用合适的限制性酶消化基因组橙子DNA或质粒DNA，转移到HybondN^+TM膜上并按供应商(Amersham)的说明进行杂交。10.原位杂交实验：

原位杂交技术以反义核糖核苷酸序列与mRNA的杂交原理为基础。该技术用于观察存在所说mRNA的显微切片区域。在该具体情况下，该技术用于定位甜橙切片中的编码果胶甲基酯酶的mRNA。用于原位杂交的组织样品的制备

用FAA固定液(45％乙醇，5％福尔马林(40％多聚甲醛)和5％乙酸)对成熟橙子水果的中部的薄切片进行固定并在25℃保温2小时，在5℃保温63小时。将这些样品在0.05M磷酸缓冲液pH7中洗涤3×20分钟。使用系列乙醇洗涤(50％，70％，80％，96％)及最后在99％乙醇中洗涤3次进行脱水。每次洗涤30分钟。然后将样品用石油(Shellsol^TM D 70K，Q 7712)处理2×2小时，在含7％蜂蜡的石蜡中再处理2×2小时。然后将样品包埋于石蜡中。使用Supercut2050 Reichart Jung pyramitome制备12.5μm的横切片。用于原位杂交的³⁵S标记探针的制备：

将来自第二次PCR扩增的501bp PCR片段以两个方向克隆进pT7blue载体(Novagen)中。pT7载体含T7启动子。用BamHI消化质粒后以SP7启动子启动反义RNA和有义RNA的转录。按下面的改进使用Maxiscript.Kit^TM(Ambion)。转录子走6％测序凝胶以去掉掺入的核苷酸并用与T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒(Ambion)一起提供的洗脱缓冲液洗脱。转录子在一端含55个非编码核苷酸，在另一端也含9个非编码核苷酸。为进行杂交，使用10⁷cpm/ml的³⁵S标记探针。

基本上按Langedale J.A.(1994)在the Maize Handbook.M.Freeling和V.Walbot编辑，pp.165-180 Springer-Verlag，NewYork，Inc所述进行原位杂交。发现杂交温度在57℃为最适。在57℃洗涤后，用Kodak K-5照相乳胶覆盖切片并在黑暗中5℃放置3天。11.结果：

下列序列信息用于产生用于下面提及的PCR反应的引物及检查由各核苷酸序列(见所附的SEQ.I.D.No.s 7-19)产生的氨基酸序列。用于产生引物的果胶甲基酯酶的肽序列：

Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr(PE492B)

Val ILe Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser

Ser Trp Leu Gly Ser Thr Gly Phe(PE701)

用于产生引物A的氨基酸序列(PE492B，4-7)(Met Leu Ala Tyr Gln Asn Thr)引物A：

ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256mix

用于产生引物B(Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro)的氨基酸序列 (PE 701，7-13)引物B：

GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128mix

(该序列相应于互补链)

产生部分编码果胶甲基酯酶的PCR DNA片段

两个非重叠肽的氨基酸序列(上述)用于产生混合的寡核苷酸。它们用作反转录及随后的总RNA扩增(PCR)的引物。测序所得的PCR克隆发现其具有501bp的插入片段。从核苷酸序列推断的氨基酸序列几乎完全相应于SEQ.I.D.No.s 7-19给出的肽序列。原位杂交分析：

用针对果胶甲基酯酶mRNA的核糖探针(从合适的PCR克隆产生)进行的原位杂交实验(见材料和方法)显示出在果瓣向瓣膜的外部细胞层中(见图1)的强烈杂交。从果汁囊的外部细胞层，白色层的内部细胞层和果核也获得了强烈的信号。这些结果与用按前面所述抗果皮PME的抗体所见的免疫学定位结果非常吻合。Southern分析：

Southern分析表明在甜橙基因组中存在分离的PME基因的其它拷贝(由cDNA克隆代表)。这些其它的PME基因与在pO17和pO34中代表的基因相当同源。

在这一方面，我们在每条泳道中观察到一条强杂交信号带，2条中等杂交信号带及至少超过2条的与其余相比更弱的信号带。这一带型表明甜橙在基因组中具有至少5到7个拷贝的PME基因。新PME cDNA的分离和鉴定

用来自PCR克隆的放射性标记的501bp插入片段筛选按材料和方法中所述制备的λZapII(Stratagene)中的cDNA文库。鉴定了一些杂交克隆，根据供应商的说明体内切除质粒DNA。经过用EcoRV和Sma I消化并接着进行琼脂糖凝胶电泳测定克隆中的cDNA插入片段的大小。一个克隆pO34具有大约2kb的插入片段，而另一克隆pO17具有大约1.4kb的插入片段。选择这些克隆用于进一步的分析。测定核苷酸序列并且pO17和pO34的核苷酸序列分别如SEQ.I.D.No.3和SEQ.I.D.No.4所示。

起始于核苷酸29且终止于核苷酸1780的O34中的开放阅读框编码包括推断的信号肽的584个氨基酸的PME。在位置46的甘氨酸和位置47的异亮氨酸之间的可能的裂解位点可根据Von Heijne，G.(1986)核酸研究14，4683-4690“推测信号序列裂解位点的新方法”的规则推测，从而产生具有计算的分子量为58386道尔顿的538个氨基酸长的成熟PME酶。包括信号序列的长PME的分子量可计算为63502道乐顿。pO34核苷酸序列包括29个核苷酸的非翻译5′区和186个核苷酸的非翻译3′区，末端为poly A尾。

O17中的开放阅读框以核苷酸18开始且以核苷酸1103终止。它编码包括44个氨基酸的信号肽的362个氨基酸的短PME。可预测推断的裂解位点在44位的谷氨酰胺和45位的丝氨酸之间，剩下的成熟短PME以氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Pro开始。这一N端氨基酸序列与生化部分所述的PME的纯化短类型的N-端氨基酸序列相同。将从纯化酶获得的氨基酸序列与推断的pO17成熟氨基酸序列进行了序列对比。发现肽片段完全相同。

所有测序的肽和推断的pO17氨基酸序列及推断的pO34(长PME)氨基酸序列具有几乎完全相同。在这一方面，pO17在一个氨基酸位置有区别(编码成熟多肽的序列中第24号)。成熟短PME蛋白质具有计算的33954道尔顿的分子量。包含信号肽的短PME形式计算的分子量是39088道尔顿。O17包括17个核苷酸的5′非翻译区和180个核苷酸的3′非翻译区，以polyA尾结尾。

长的和短的PME酶的主要区别是来自O34、SEQ.I.D.No.5所示的成熟酶中存在的220个氨基酸的N-端延伸。编码长PME酶该区域的相应核苷酸序列如SEQ.I.D.No.6所示。PME在微生物中的表达：

将编码长或短形式的橙子PME的DNA序列导入微生物中以产生大量具有高比活的重组酶，以便用于酶促处理果胶。在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 pJK10，pJK11和pJK12的构建(见图13-15)

pO34质粒DNA模板DNA，使用下面引物对进行PCR反应：

5′-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3′，在一端具有EcoRI位点，和5′-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3′，在近末端具有BamHI位点。

在下面的缓冲液中混合Ampli Taq^R DNA聚合酶(PerkinElmer)、模板DNA，dATP，dGTP，dCTP和dTTP以及两种引物：

60mM Tris-HCl(pH8.5)，15mM(NH₄)₂SO₄和1.5mMMgCl₂，使用下列温度循环：

94℃ 2分钟

94℃ 1分钟

55℃ 2分钟

72℃ 2分钟，循环35次

72℃ 7分钟

5℃ 浸泡

产生1690bp的预期的PCR产物，将它纯化并按供应商的说明亚克隆进载体pT7 Blue(来自Novagen)。

含预期大小的EcoRI-BamHI片段的所得克隆(称为pT7-O34)经DNA测序进一步证实(见分子生物学的材料和方法)。含正确序列的pT7-O34亚克隆用EcoRI和BamHI消化，纯化1685bp的片段并亚克隆进用相同酶消化的巴斯德毕赤氏酵母载体pHIL-S1(来自Invitrogen)；

编码PME成熟长形式的序列以这种方式克隆在载体的具有PHO1分泌信号(S)的读框中。所得的质粒是所谓的pJK10且在图13中示出。

为了产生pJK11(见图14)，将pT7-O34克隆的EcoRI-BamHI片段进一步亚克隆进用相同酶消化的pBSK-载体(来自Stratagene)中。然后，来自一个所得克隆(经DNA测序证实)的EcoRI-NotI片段亚克隆进用相同酶消化的巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPIC9(来自Invitrogen)中。这样在pPIC9中。插入了编码PME长形式成熟蛋白的阅读框，它在α-因子分泌信号(S)的下游且符合读框地与其相连，见图14。

另外，来自pT7-O34的EcoRI-NotI片段也亚克隆进pPIC9K(Invitrogen)载体中产生图15所示的pJK12质粒。pJK11和pJK12间的唯一区别是编码卡那霉素抗性的基因，该基因位于pJK12中。

pJK10中的PHO1分泌信号和pJK11和pJK12中的α分泌信号均能指导编码PME长形式的成熟多肽的分泌。pJK20，pJK21和pJK22的构建

pO17质粒DNA在使用下列引物的PCR反应中用作模板DNA：

5′-GAATTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3′，在一端具有EcoRI位点，和5′-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3′在近末端具有BamHI位点。

将模板DNA，AmpliTaq^R聚合酶，dATP，dGTP，dCTP和dTTP与缓冲液(60mM Tris-HCl，pH8.5；15mM(NH₄)₂SO₄和1.5mM MgCl₂)混合且放入具有下列温度循环的thermoblok中：

94℃ 2分钟

94℃ 1分钟

55℃ 2分钟

72℃ 2分钟，循环35次

72℃ 7分钟

5℃ 浸泡

由此产生1008bp的预期的PCR带，将它纯化并亚克隆进pT7Blue(Novagen)中。所得的克隆经上面所述的DNA测序证实。用EcoRI和BamHI消化具有正确序列的质粒且将所得的片段进一步亚克隆进pHIL-S1载体(Invitrogen)，所得的质粒称为pJK20(在图16中显示)，且其中具有位于阅读框内的编码PME短形式的成熟多肽的区域且在PHO1分泌信号的下游。

与pJK11和pJK12所述相同的方式构建质粒pJK21和pJK22，但EcoRI-NotI片段从pBSK-O17克隆获得。图17和18显示了所得的质粒，其中编码成熟多肽的区域位于阅读框中分别在pPIC9和pPIC9K中的α分泌信号的下游。经原生质球形成和转化将长或短形式的PME导入巴斯德毕赤氏酵母中

在不同的实验中将质粒pJK10，pJK11，pJK12，pJK20，pJK21和pJK22导入巴斯德毕赤氏酵母GS115细胞中。

在这一方面，从在28-30℃生长于酵母提取物胨葡萄糖培养基(YPD)的GS115细胞制备原生质球。原生质球的制备和转化程序按在毕赤氏酵母表达试剂盒：说明书(Invitrogen)中所述进行。经过使用在生化材料和方法中所述的方法分析上清中的PME活性分析所得的巴斯德毕赤氏酵母Mut⁺或Mut^s转化子的重组PME基因表达。筛选高效表达PME的长或短形式的转化子

在基础培养基(如在Invitrogen毕赤氏酵母表达试剂盒说明书中说明的基础葡萄糖培养基或基础甘油培养基)中进一步培养推断的阳性转化子，分离基因组DNA并按说明书所述经PCR进行分析。

选择在初次筛选中发现的阳性克隆，它也产生预期大小的PCR带，按毕赤氏酵母说明书所述的方法在28-30℃的培养瓶中使其进一步生长。

筛选各构建体(pJK10，pJK11，pJK12，pJK20，pJK21和pJK21)的至少10个经证实的重组克隆用于分泌PME，每隔2到6小时取样在一段时间内测定其相对表达水平。沉淀样品中的细胞，按生化材料和方法中所述的方法试验上清的PME活性。

按Scorer C.A.等(1994)生物/技术，vol.12，pp.181-184和Laroche Y等(1994)生物/技术，vol.12，pp.1119-1124所述使用整合的卡那霉素抗性基因作为选择基因预选用pJK12或pJK22转化后获得的克隆。以这种方式获得多拷贝整合转化子并按上面所述进一步筛选。

选择代表长或短形式的PME并且显示出高水平表达重组蛋白的转化子并以Western印迹分析(见生化材料和方法)进一步分析。重组PME的纯化和鉴定

按需要使用生化材料和方法中所述的方法从培养物上清中纯化重组PME蛋白质。

经过按在鉴定和动力学数据部分中所述在不同温度下培养后试验酶活性来证实长形式PME推测的高温稳定性。按在鉴定和动力学数据部分所述进一步鉴定纯化的重组酶(长的及短的PME形式)。这些分析表明，两种类型的pH最适值为大约7-8，发现短重组PME在10到40℃之间具有温度稳定性，对于长的重组PME高达80℃仍稳定。在黑曲霉中的表达

在另一实施方案中，用合适的限制性酶消化pO34或pO17，将本发明的PME的长或短形式的编码序列克隆进曲霉表达载体pBAMTE1(含来自粗糙链孢霉的甲基色氨酸抗性启动子)用于在黑曲霉中表达(Pall等(1993)Fungal Genet Newslett，vol.40，pp.59-62)。

使用裂解酶Sigma L-2773和溶细胞酶Sigma L-8012根据Daboussi等(当代遗传学(1989)vol.15，pp.453-456)制备原生质球。原生质球的转化按Buxton等(基因(1985)vol.37，pp.207-214)所述的方法进行，但涂布转化的原生质球的方法按Punt等(酶学方法(1992)vol.216，pp.447-457)所列的方案进行，使用0.6％渗压稳定的顶级琼脂糖。

结果表明从黑曲霉培养物中可获得纯化的橙子PME活性。应用橙子PME处理的果胶对蛋白饮料的粘度和稳定性的影响方法：用来自橙子的PME酶促处理果胶

按如下方法制备一批酶促处理的果胶：

将125g果胶在高效搅拌的条件下溶入热水中。加入45.3g NaCl(试剂级)并用水将体积调为4.0l。搅拌该溶液直到盐溶解。将果胶溶液冷却到40℃且用1N NaOH(试剂级)将pH升高到pH7.0并高效搅拌。加入合适的橙子PME样品，继续酶促反应直至达到所需的酯化程度。在培养期间经1N NaOH(试剂级)的自动加样保持pH恒定于pH7，以NaOH消耗监视酶反应。

当果胶样品达到所需程度的去酯化时，终止NaOH加入，经过加入2％HCl将溶液的pH降低到大约3.0。然后将果胶溶液加热到70℃5分钟以完全灭活酶。用1体积的异丙醇沉淀处理的果胶，用60％异丙醇洗涤并加压到大约50％干燥状态。然后在40℃空气干燥酶处理的果胶产品，最后磨成干粉。

方案

果胶样品的钙敏感性指数(CF)的测定

钙敏感性以溶于具有57.6mg钙1g果胶的溶液中的果胶的粘度除以完全相同量的果胶但未加钙的溶液粘度来测量。非钙敏感性果胶的CF值为1。

将4.2g果胶样品以高效搅拌溶于550ml热水中。将该溶液冷却到大约20℃并用1N HCl将pH调到1.5。用水将果胶溶液调到700ml并搅拌。分别量取145g该溶液至4个粘度杯中。向两个杯中加入10ml水(双倍测量)，在搅拌条件下向其它2个杯中加入10ml 250mM CaCl₂溶液。

在高效磁力搅拌条件下将50ml乙酸缓冲液(0.5M，pH大约4.6)加入所有4个粘度杯中，从而使果胶溶液的pH上升到pH4.0以上。取出磁棒，将杯放于20℃过夜。用Brookfield粘度计在第二天测量粘度。钙敏感性指数计算如下：

果胶样品酯化程度的测定(％DE)

向50ml 60％异丙醇和5％HCl溶液中加入2.5g果胶样品并搅拌10分钟。将果胶溶液通过一个玻璃滤器过滤并用15ml 60％异丙醇/5％ HCl溶液洗涤6次，接着用60％异丙醇再洗涤直到滤液无氯。将滤液在80℃干燥过夜。

将20.0ml 0.5N NaOH和20.0ml 0.5N HCl在锥形瓶中混合并加入2滴酚酞。用0.1N NaOH滴定，直至获得永久的颜色变化。0.5NHCl应略强于0.5N NaOH。所加的0.1N NaOH的体积记录为V₀。

称取0.5g干燥的果胶样品(过滤物)放入锥形瓶中，用96％的乙醇湿润该样品。加入100ml刚煮沸并冷却的蒸馏水，搅拌所得的溶液直至果胶完全溶解。然后加入5滴酚酞并用0.1N NaOH滴定溶液(直至颜色改变且pH为8.5)。这里使用的0.1N NaOH的量记录为V₁。加入20.0ml 0.5N的NaOH并剧烈摇动瓶子，然后静置15分钟。加入20.0ml0.5N HCl并摇动瓶子直至桃红色消失。然后加入3滴酚酞，用0.1NNaOH滴定所得的溶液。使用的0.1N NaOH的体积记录为V₂。

酯化的程度(％DE：总羧基％)计算如下：

% DE = \frac{V_{2} - V_{0}}{V_{1} + (V_{2} - V_{0})}

酸牛奶的生产

标准化的脱脂牛奶(经过将奶粉与适当体积的水混合来制备)在90℃加热5分钟，然后在200kp/cm²匀浆并将牛奶冷却到31℃。加入酸牛奶培养物，将牛奶发酵至大约pH4.0。将酸牛奶冷却到大约20℃，以饱和的糖溶液(大约65％糖)加入果胶样品并搅拌15分钟。用乳酸将pH调至pH4.0。将酸牛奶在88℃以巴氏消毒法消毒15秒，并以150kp/cm²匀浆。然后冷却到20℃并装入无菌的250ml蓝盖瓶中(200ml/瓶)。

终产物的组成为：7.6％MSNF(牛奶固体含量)，9.15％糖和0.25％或0.35％果胶样品。使固体总量为17.0％或17.10％。酸牛奶饮料的粘度测定

使用具有剪切率18.5-46.0的Bohlin Rheometer^TM(由BohlinInstruments提供)或使用具有相同剪切率的Stress Tech^TM(Rheologica Instruments AB)测定酸牛奶样品的粘度(双重测定)。以离心试验测定蛋白质的稳定性

在10℃，2300×g下离心20g样品(例如，酸奶饮料)20分钟。弃去上清，将离心管倒置30分钟，称重离心管，沉降％计算如下：

其中，Wgt＝重量，centri＝离心以样品中的颗粒大小分布判断蛋白质的稳定性：

使用Malvern 2600 Easy^TM大小测定仪测定酸牛奶样品中的颗粒大小分布。以该方法用激光散射测定颗粒大小。向9ml脱气的缓冲液(30.7％ 0.1M柠檬酸，19.3％0.2M Na₂HPO₄和50.0％水)中加入1ml酸牛奶样品并混合。向测量杯中加入脱气的缓冲液，逐滴加入样品/缓冲液混合物直至获得最佳浓度。以测量值计算平均颗粒大小。

平均颗粒大小在大约3μm下的酸牛奶被认为相当稳定，而平均颗粒大小超过大约10μm和更高的酸牛奶据认为长期贮存不稳定。长期稳定性的测定：

将样品在4℃或环境温度下贮存且测量乳清的分离(在瓶中样品顶部的乳清mm数)。样品装入250ml蓝盖瓶中(双重测定)。每例中样品深度为大约70mm-它相应于每瓶200ml标记。

实施例1

酸奶饮料

向酸奶饮料(例如酸牛奶饮料)中加入果胶的目的是为了产生在饮料的细菌学和感官的货架寿命期间保持物理学上匀质的饮料。另外，为长期贮存而对酸奶饮料的处理使饮料中的蛋白质不稳定，如果不加入果胶，会产生具有沙状口感和显示出相当快脱水收缩的饮料。果胶的处理

选择可由商业途径获得的高酯果胶；Grindsted^TM Pectin URS(Ultra Rapid Set果胶型)作为亲代果胶，因为它具有高酯水平(％DE为82，见图19)。在方法部分描述了用橙子PME酶处理该亲代果胶。

终止酶促反应，用方法部分所述的方法研究所得的实验果胶(称为果胶号1944-96-2)的酯化程度。另外，为了比较两种果胶类型，在实验中包括了亲代果胶和处理的果胶以及一种已知较好的商业饮料酸奶果胶型，Grindsted^TM果胶AM 453。

按方法部分：果胶样品钙敏感性指数(CF)的测定中所述测定3种选择的果胶的相对钙敏感性，结果在下面表中显示。

果胶型	ΔCF	DE％
果胶型	ΔCF	DE％	Grindsted^TM果胶URS	1.1	82
果胶1944-96-2	1.4	76	Grindsted^TM果胶URS	1.1	82
果胶1944-96-2	1.4	76	Grindsted^TM果胶AM 453	＞20	72

Grindsted^TM果胶URS亲代果胶从82％DE下降到75％DE的去酯化对这两种果胶的钙敏感性方面几乎无变化(ΔCF为1，无敏感性)。经过用橙子PME酶进一步处理亲代果胶至70％DE可产生具有可测量的钙敏感性的果胶，因为该果胶ΔCF为14。酸牛奶/饮用酸牛奶分析的结果

按方法部分所述生产酸牛奶。三种果胶(Grindsted^TM果胶URS，果胶1944-96-2和Grindsted^TM果胶AM 453)分别用于下面配方：

在最终产物中含7.6％MSNF(牛奶固形物含量)，9.15％糖和0.25％或0.35％果胶样品，固形物总量为17.0％或17.10％。

按方法部分所述在离心试验中观察每一种酸牛奶的沉降％，测量酸牛奶中的颗粒大小，测量其粘度及检查长时间贮存期间可能的乳清分离来研究产生的各种酸奶的质量。

用3种果胶类型产生的酸牛奶的沉降在下表中列出。酸奶的沉降(以％)

果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％
果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％	Grindsted^TM果胶URS	29.40	21.02
果胶1944-96-2	1.53	2.95	Grindsted^TM果胶URS	29.40	21.02
果胶1944-96-2	1.53	2.95	Grindsted^TM果胶AM 453	2.20	1.85

结果是1到4个各产品的平均值

很明显亲代果胶(URS类型)具有较高的沉降％，且由此产生的酸牛奶经常显示出乳清分离且在所用的两种果胶浓度(0.25和0.35％)下不稳定。这并不奇怪，因为正常情况下URS果胶类型不能用于稳定为长期贮存而加热处理的酸牛奶类型。

由上面的结果可见用果胶1944-96-2生产的酸牛奶在所用的两种果胶剂量下显示出稳定性及较低的沉降，且在75天的贮存期后无乳清分离。相比之下，正常情况下用于酸牛奶生产的优良Grindsted^TM果胶AM 453与预期一样显示出较低的沉降且产生无乳清分离的稳定的酸牛奶(见上面结果)。

经过用橙子PME处理亲代URS果胶，将一种不适用的果胶变成在酸牛奶中适用于作为稳定剂，且这种处理果胶的作用与优良的商用稳定剂一样好。

经颗粒大小测定(见方法部分)对产生的酸牛奶进行进一步的检查，结果在下表中显示。酸牛奶的颗粒大小(以μm)

果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％
果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％	Grindsted^TM果胶URS	9.32	6.41
果胶1944-96-2	1.33	1.55	Grindsted^TM果胶URS	9.32	6.41
果胶1944-96-2	1.33	1.55	Grindsted^TM果胶AM 453	1.40	1.53

与预期一样，用亲代URS果胶产生的酸牛奶的平均颗粒大小(显示了相应于D(4.3)部分使用Malvern仪器的数值)较高。同样该结果是一到四个产品的平均值。

从果胶1944-96-2和Grindsted^TM果胶AM 453产生的酸牛奶的平均颗粒大小在所用的两种果胶剂量下都较小(见上面结果)。再次表明用这些果胶类型生产的酸牛奶适于生产稳定的酸牛奶。

最后且非常重要的是，对于长期贮存的饮用酸牛奶产品，测定了其粘度，结果在下面表中显示。酸牛奶的粘度(以MPa表示)

浓度/果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％
浓度/果胶类型	浓度-0.25％	浓度-0.35％	Grindsted^TM果胶URS	55	40
果胶1944-96-2	12	18	Grindsted^TM果胶URS	55	40
果胶1944-96-2	12	18	Grindsted^TM果胶AM 453	24	43

由于亲代URS果胶不能稳定酸牛奶，因此与预期一样，在两种果胶浓度下获得的粘度相当高。产生具有低沉降和低颗粒大小的稳定酸牛奶的优良Grindsted^TM果胶AM 453在0.25％果胶剂量下显示出的粘度大约为用Grindsted^TM果胶URS果胶所见粘度的一半且在0.35％果胶剂量下几乎与URS果胶相同-尽管事实上只有AM 453果胶产生稳定的酸牛奶。

在URS和AM 453的例子中所见的更高粘度可能部分是由于所加的果胶的量，特别是在AM 453果胶的例子中似乎是因为所加果胶量的增加(从0.25到0.35％)产生几乎粘稠2倍的酸牛奶。

在0.25％浓度时与亲代URS果胶相比，用橙子PME处理的果胶1944-96-2所获得的粘度显著下降。这部分是由于用1944-96-2果胶稳定了酸牛奶，但这不是唯一原因，因为在该果胶剂量下AM 453酸牛奶粘度高2倍。事实上，向酸牛奶中加入0.35％1944-96-2果胶仅增加了6个单位的粘度(与0.25％剂量相比)，而在AM 453的例子中从0.25％到0.35％时粘度增加了19个单位。

橙子PME处理的果胶1944-96-2可稳定具有极低粘度的酸牛奶，尽管果胶剂量是0.25％(或0.35％)，使用其它未处理的果胶(例如Grindsted^TM果胶AM 453)产生几乎高达两倍的粘度。

这对于酸奶饮料生产是一种新的且极重要的发展。

经过用橙子PME处理Grindsted^TM果胶URS产生了一种新果胶类型，与亲代果胶相反，它能稳定酸牛奶，且最重要的是比正常使用的果胶显示出低得多的粘度。经过用橙子PME处理也可改进其它高酯果胶。

实施例2

乳清果汁饮料

根据本发明修饰的果胶(制备如上)用于如下的乳清果汁饮料中：

甜或酸乳清 42.00％果汁 40.00％糖 8.00％柠檬酸钠 0.20％PME修饰的果胶 0.20％Grindsted调味品 +水 9.60％

混合干燥的PME修饰的果胶，柠檬酸钠和糖，然后溶于80℃的水中。将该果胶溶液冷却到5℃下，在5℃加入乳清。缓慢加入Grindsted调味品(由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)和果汁，用柠檬酸或乳酸将样品混合物的pH调到pH4.0。在搅拌条件下使样品混合物老化大约30分钟。以80℃/15秒进行巴氏消毒且在200bar(2900psi)下匀浆。样品冷却到20℃并无菌装入容器中。

室温下温育24小时，1个月和6个月后分析试验样品。研究分析包括粘度测量，稳定性指标颗粒大小和长期稳定性-其方案在上面已描述。

结果表明，与在对照试验中采用的对照果胶相比，用PME修饰的果胶处理的乳清果汁饮料稳定性及长期稳定性提高。另外，乳清果汁饮料具有低于对照饮料的有利粘度。

也分别用植物PME修饰的酸橙和柠檬果胶(即用本发明的PME修饰)处理了乳清果汁饮料。结果证实，与未修饰的果胶及对照果胶相比，PME修饰的果胶提高了蛋白质的稳定性。

实施例3

牛奶/果汁饮料

按对酸牛奶饮料所述，用PME修饰Grindsted^TM URS(以DaniscoIngredients，Danisco A/S获得)。修饰的果胶用于牛奶/果汁饮料，它含有：

脱脂牛奶 45.00％果汁 40.00％糖 5.00％PME修饰的果胶 0.25％Grindsted调味品 +水 9.75％

混合干燥的PME修饰的果胶和糖，然后溶于80℃的水中。果胶溶液冷却到5℃下，在5℃加入牛奶。缓慢加入Grindsted调味品和果汁，用柠檬酸或乳酸将样品混合物的pH调到pH4.0(如果需要的话)。按对乳清果汁饮料所述将样品混合物老化、灭菌和匀浆。样品冷却到20℃并无菌装入容器中。

结果表明，与在对照试验中所用的对照果胶相比，用PME修饰的果胶处理的牛奶/果汁饮料稳定性(包括长期稳定性)增加。另外，牛奶/果汁饮料具有低于对照饮料的有利的粘度。还观察到了功能性的改进。

还可用以本发明的PME修饰的酸橙和柠檬果胶处理牛奶/果汁饮料。

实施例4

乳清稳定性

在pH4.0试验了酶促修饰的果胶，用KOH/HCl将所得的果胶溶液的pH调到pH4.0。果胶浓度调到1.0％。以0.1％-0.25％的浓度试验了果胶。混合果胶，Jenness缓冲液(见下面)和乳清溶液(见下面)并在96℃加热25分钟。冷却到室温后，在500nm处测吸光率。干燥混合的Jenness缓冲液：

干粉Jenness(在Jenness，R和Koops，J.模拟牛奶超滤物的盐溶液的制备和特征，Nederlands Melk-en Zuiveltijdschrift.vol.16，nr.3，pp.153-164，1962)：

15.80g KH₂PO₄

5.08g K₃·柠檬酸

17.91g Na₃·柠檬酸·2·H₂O

1.80g K₂SO₄

13.20g CaCl₂·2·H₂O

5.02g Mg₃·柠檬酸·H₂O

3.00g K₂CO₃

10.78g KCl

缓冲溶液：

pH4.0的7.5900g/l干粉Jenness的水溶液。乳清溶液

冷冻干燥乳清蛋白浓缩物并研磨。在pH4.0的Jenness缓冲液中制备0.40％w/w乳清蛋白的溶液。果胶溶液

制备pH4.0的1％w/w果胶水溶液。混合物浓度：

按下表所示混合果胶，Jenness缓冲液和乳清溶液。混合物在96℃加热25分钟，冷却到室温后，在分光光度计上在500nm处测样品。

μl果胶溶液	μl Jenness缓冲液	μl 乳清溶液	μl 总体积
μl果胶溶液	μl Jenness缓冲液	μl 乳清溶液	μl 总体积	500	2000	2500	5000
750	1750	2500	5000	500	2000	2500	5000
750	1750	2500	5000	1000	1500	2500	5000
1250	1250	2500	5000	1000	1500	2500	5000

结果

结果在下表中显示。引用的500nm处的吸光值是取两次测量的平均值。为了比较不同类型的果胶及根据本发明的酶促修饰的果胶，将未修饰的果胶Grindsted^TM果胶3450(由Danisco Ingredients，Danisco A/S提供)的指数设定为100。

指数＞100表示比使用样品3450具有更差的蛋白稳定性。指数为100表示与样品3450具有相似的稳定性。指数＜100表示比使用样品3450具有更好的蛋白稳定性。指数为95或＜95表示具有极好的蛋白稳定性。

果胶类型	0.10％果胶	0.15％果胶	0.20％果胶	0.25％果胶
果胶类型	0.10％果胶	0.15％果胶	0.20％果胶	0.25％果胶	Grindsted^TM果胶3450	100	100	100	100
Grindsted^TM果胶URS	127	140	155	161	Grindsted^TM果胶3450	100	100	100	100
Grindsted^TM果胶URS	127	140	155	161	5分钟酶处理	100	108	115	113
10分钟酶处理	98	106	111	111	5分钟酶处理	100	108	115	113
10分钟酶处理	98	106	111	111	15分钟酶处理	92	94	100	100
20分钟酶处理	90	95	100	99	15分钟酶处理	92	94	100	100

从该结果可见，与对照Grindsted^TM果胶3450和未修饰的Grindsted^TM果胶URS果胶相比，根据本发明的修饰的Grindsted^TM果胶URS果胶表现出有利的特性且在有些情况中对于增加稳定性表现出极好的特性。

实施例5

具有长货架寿命，低pH的Laban饮料

Laban饮料是pH值低于4.2的酸化牛奶饮料。Laban饮料由与果胶溶液混合的laban基质组成。

Laban基质的配方为：

无水牛奶脂肪 2.8％脱脂牛奶 10.0％Grindsted调味品 +水 87.2％

标准化的全牛奶(无水牛奶脂肪和脱脂奶粉)在75-80℃及200bar(2900psi)压力下匀浆，接着在90-95℃巴氏消毒5-10分钟。培养至pH约4.0后，用柠檬酸或乳酸将pH调到3.8-4.2。然后加入果胶溶液。搅拌混合物直到形成匀质混合物。在90-95℃巴氏消毒10-15秒并进一步在150-200bar下匀浆。冷却到20-25℃后，将产物无菌装入容器。

几天后，不稳定的Laban饮料常表现出脱水收缩。

然而，加入根据本发明的酶促修饰的果胶防止了脱水收缩并改进了粘度。

另外，该产品具有显著的酸牛奶口味和长货架寿命。

实施例6

橙汁(富含蛋白质)

橙汁饮料是一种含2％DANPROLACT 40^TM(Central Soya，Aarhus A/S)，6％糖，10％橙子浓缩物，0.4％柠檬浓缩物，0.2％果胶和81.4％水的酸化饮料(pH大约为4)。该产品是富含大豆蛋白的橙汁饮料。将该产品巴氏消毒并匀浆。冷却到20-25℃后，将该产品无菌装入容器中，并可在室温下贮存大约6个月。在橙汁饮料(富含蛋白质)中加入根据本发明的酶促修饰的果胶显示出有利的特征(如长期稳定性)，且它具有较好的口感。

实施例7

抗体生产

根据N Harboe和A Ingild(“免疫，免疫球蛋白的分离，抗体滴度的估计”，在定量免疫电泳手册，方法和应用，NH Axelsen等(编辑)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)及T.G.Cooper(“生化工具”，John Wiley和Sons，New York，1977)所述的方法经过用纯化酶注射兔并从抗血清中分离免疫球蛋白来产生抗本发明的酶的抗体。

本发明的其它修饰对本领域的技术人员而言在不偏离本发明范围的条件下将是显而易见的。

在下面几页中提供了许多序列表，它们从SEQ.I.D.No.1到SEQ.I.D.No.19连续编号，表示核苷酸序列和氨基酸序列。

序列表SEQ.I.D.NO.1MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK LIEETSTVDG WPAWLSTGDR RLLQSSSVTP 50NVVVAADGSG NFKTVAAAVA AAPQGGTKRY IIRIKAGVYR ENVEVTKKHK 100NIMFIGDGRT RTIITGSRNV VDGSTTFKSA TVAVVGEGFL ARDITFQNTA 150GPSKHQAVAL RVGADLSAFY NCDMLAYQDT LYVHSNRQFF VNCLIAGTVD 200FIFGNAAAVL QNCDIHARKP NSGQKNMVTA QGRADPNQNT GIVIQKSRIG 250ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW KEYSRTVIMQ SSITDVIHPA GWHEWDGNFA 300LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG RVKWKGFRVI TSATEAQAFT PGSFIAGSSW 350LGSTGFPFSL GL 362SEQ.I.D.NO.2MTRIKEFFTK LSESSTNQNI SNIPKKKKKL FLALFATLLV VAAVIGIVAG 50VNSRKNSGDN GNEPHHAILK SSCSSTRYPD LCFSAIAAVP EASKKVTSQK 100DVIEMSLNIT TTAVEHNYFG IQKLLKRTNL TKREKVALHD CLETIDETLD 150ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HADDLKTLMS AAMTNQGTCL DGFSHDDANK 200HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN RKLIEETSTV 250DGWPAWLSTG DRRLLQSSSV TPNVVVAADG SGNFKTVAAS VAAAPQGGTK 300RYIIRIKAGV YRENVEVTKK HKNIMFIGDG RTRTIITGSR NVVDGSTTFK 350SATVAVVGEG FLARDITFQN TAGPSKHQAV ALRVGADLSA FYNCDMLAYQ 400DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT VDFIFGNAAA VLQNCDIHAR KPNSGQKNMV 450TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR IGATSDLKPV QGSFPTYLGR PWKEYSRTVI 500MQSSITDVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGE HQNAGAGAGT SGRVKWKGFR 550VITSATEAQA FTPGSFIAGS SWLGSTGFPF SLGL 584SEQ.I.D.NO.3GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC TGACATGATG 50ATCATGAGGA CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT 100TGATGGGTGG CCGGCGTGGC TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT 150CCTCGTCGGT GACACCGAAC GTGGTGGTGG CAGCAGATGG CAGCGGAAAC 200TTTAAGACGG TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG GAGGCACTAA 250GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG 300TGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TCGGTGACGG GAGGACTAGA 350ACTATCATCA CAGGAAGTAG AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTTTCAA 400GTCTGCTACA GTTGCTGTTG TTGGTGAAGG ATTCTTGGCC CGAGACATTA 450CATTCCAAAA CACAGCCGGC CCCTCAAAGC ACCAGGCGGT GGCACTACGA 500GTGGGAGCTG ACCTTTCAGC ATTTTACAAT TGCGATATGT TAGCTTACCA 550AGACACACTC TACGTCCACT CGAACCGCCA GTTCTTTGTG AACTGCTTAA 600TTGCTGGCAC GGTTGATTTT ATTTTTGGTA ACGCTGCAGC CGTGTTACAA 650AATTGTGACA TCCATGCACG AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA AAAATATGGT 700CACAGCCCAA GGCAGGGCTG ACCCTAACCA AAACACCGGC ATTGTCATTC 750AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TAAAACCGGT TCAGGGTAGT 800TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA GGACGGTGAT 850CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC 950GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG 1000GGTTATTACA AGTGCTACCG AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA 1050TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG GTTTCCCATT CTCCCTTGGT 1100TTGTAATATT CACTAGGAGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA TTAGTGGATC 1150CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA 1250TAGCATGGGA AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1300AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1323SEQ.I.D.NO.4CTTTTGTTCT CTCTTATCGA GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT 50TCACAAAACT TTCTGAATCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC 100AAGAAAAAAA AGAAACTATT CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT 150CGCTGCCGTA ATCGGCATTG TCGCCGGAGT GAACTCAAGA AAAAACTCCG 200GCGACAACGG CAACGAGCCT CATCATGCTA TCCTCAAATC ATCATGTAGC 250AGCACAAGGT ACCCGGACTT ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCCAGA 300GGCCTCCAAA AAGGTGACAA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA 350ACATCACAAC AACAGCCGTG GAACACAACT ACTTCGGGAT TCAGAAGCTC 400TTGAAGAGAA CGAATCTCAC CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG 450TCTTGAGACG ATCGATGAGA CTCTTGATGA GTTACACAAA GCCGTCGAGG 500ATCTTGAGGA GTACCCGAAC AAGAAATCTT TATCACAGCA TGCGGATGAT 550CTCAAAACCC TAATGAGTGC CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA 600TGGGTTCTCT CATGATGATG CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG 650ACGGCCAGGT TCATGTTGAG AAGATGTGTA GCAATGCGCT TGCTATGATC 700AAGAACATGA CTGACACTGA CATGATGATC ATGAGGACTT CAAACAACAG 750GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA TGGGTGGCCG GCGTGGCTGT 800CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT CGTCGGTGAC ACCGAACGTG 850GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT AAGACGGTGG CGGCATCGGT 900GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG GTATATTATT AGGATTAAAG 950CCGGTGTTTA TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA CAAAGAAGCA TAAAAATATA 1000ATGTTCATCG GTGACGGGAG GACTAGAACT ATCATCACAG GGAGTAGAAA 1050TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC TGCTACAGTT GCTGTTGTTG 1100GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT TCCAAAACAC AGCCGGCCCC 1150TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTACGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT 1200TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA 1250ACCGCCAGTT CTTTGTGAAC TGCTTAATTG CTGGCACGGT TGATTTTATT 1300TTTGGTAACG CTGCAGCCGT GTTACAAAAT TGTGACATCC ATGCACGAAA 1350GCCCAATTCC GGCCAAAAAA ATATGGTCAC AGCCCAAGGC AGGGCTGACC 1400CTAACCAAAA CACCGGCATT GTCATTCAAA AATCTAGGAT TGGTGCCACC 1450TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC 1500CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG 1550TGATCCACCC TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC 1600ACATTGTTTT ACGGAGAGCA TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC 1650AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT TATTACAAGT GCTACCGAGG 1700CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC 1750TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT 1800AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT 1850TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA 1900CTATTGTGTG ATTAACAAGA AATAAAATAG CATGGGAAGA ATAATAATTT 1950CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 1975SEQ.I.D.NO.5IVAGVNSRKN SGDNGNEPHH AILKSSCSST RYPDLCFSAI AAVPEASKKV 50TSQKDVIEMS LNITTTAVEH NYFGIQKLLK RTNLTKREKV ALHDCLETID 100ETLDELHKAV EDLEEYPNKK SLSQHADDLK TLMSAAMTNQ GTCLDGFSHD 150DANKHVRDAL SDGQVHVEKM CSNALAMIKN MTDTDMMIMR TSNNRKLIEE 200TSTVDGWPAW LSTGDRRLLQ 220SEQ.I.D.NO.6ATTGTCGCCG GAGTGAACTC AAGAAAAAAC TCCGGCGACA ACGGCAACGA 50GCCTCATCAT GCTATCCTCA AATCATCATG TAGCAGCACA AGGTACCCGG 100ACTTATGCTT TTCGGCTATT GCTGCCGTTC CAGAGGCCTC CAAAAAGGTG 150ACAAGCCAAA AGGACGTTAT TGAGATGTCC TTAAACATCA CAACAACAGC 200CGTGGAACAC AACTACTTCG GGATTCAGAA GCTCTTGAAG AGAACGAATC 250TCACCAAACG GGAAAAGGTT GCTCTCCATG ACTGTCTTGA GACGATCGAT 300GAGACTCTTG ATGAGTTACA CAAAGCCGTC GAGGATCTTG AGGAGTACCC 350GAACAAGAAA TCTTTATCAC AGCATGCGGA TGATCTCAAA ACCCTAATGA 400GTGCCGCGAT GACCAATCAG GGGACGTGTC TTGATGGGTT CTCTCATGAT 450GATGCTAATA AGCACGTGCG GGATGCGTTG TCAGACGGCC AGGTTCATGT 500TGAGAAGATG TGTAGCAATG CGCTTGCTAT GATCAAGAAC ATGACTGACA 550CTGACATGAT GATCATGAGG ACTTCAAACA ACAGGAAGCT GATAGAGGAG 600ACCAGTACGG TTGATGGGTG GCCGGCGTGG CTGTCCACCG GAGACAGGAG 650GCTGTTGCAG 660SEQ.I.D.NO.7PE511(14 aa) Ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe-leu-ala-

argSEQ.I.D.NO.8PE3252(4 aa) Tyr-ile-ile-argSEQ.I.D.NO.9PE8(8 aa) Asn-ile-met-phe-ile-gly-asp-glySEQ.I.D.NO.10PE21(21 aa) Ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-

phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-proSEQ.I.D.NO.11PE492D(15 aa) xxx-ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe-leu-

ala-argSEQ.I.D.NO.12PE492C(11 aa) xxx-ala-tyr-pro-gly-gln-ile-thr-ser-asn-metSEQ.I.D.NO.13PE492B(12 aa) Asn-cys-asp-met-leu-ala-tyr-gln-asp-thr-leu-tyrSEQ.I.D.NO.14PE492A(16 aa) Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe-thr-pro-

gly-ser-pheSEQ.I.D.NO.15PE701(28 aa) Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe-thr-pro-

gly-ser-phe-ile-ala-gly-ser-ser-trp-leu-gly-ser-thr-

gly-pheSEQ.I.D.NO.16PE594(13 aa) Ile-ala-gly-ser-ser-trp-leu-gly-ser-thr-gly-phe-proSEQ.I.D.NO.17PE7(19 aa) Asn-met-val-thr-ala-gln-gly-arg-ala-asp-pro-asn-gln-

asn-thr-gly-ile-val-ileSEQ.I.D.NO.18PE 251(38 aa) xxx-arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-

gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro-(trp)-lys-

glu-tyr-(ser)-arg-(thr)-val-ile-met-gln-ser-ser-ile-

thrSEQ.I.D.NO.19PE 201(27 aa) xxx-xxx-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-

gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro-xxx-lys-glu-

tyrSEQ.I.D.N0.20PE 22(21 aa) Ser-arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-

gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-glyaa 2(arg)可用val代替aa 3(ile)可用met代替aa 6(thr)可用val代替

Claims

1.一种方法，包括：

a)纯化一种能够使果胶嵌段式酶促去酯化的果胶甲基酯酶；

b)将所述能够使果胶嵌段式酶促去酯化的纯化果胶甲基酯酶加入果胶；

c)通过所述能够使果胶嵌段式酶促去酯化的纯化果胶甲基酯酶由所述果胶制备嵌段式酶促去酯化的果胶；其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶是含有70％到80％酯基的高酯果胶；

d)向含有至少一种蛋白质的酸性环境中加入嵌段式酶促去酯化的果胶；并且

e)通过所述嵌段式酶促去酯化的果胶稳定所述蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶含有76％的酯基。

3.权利要求1的方法，其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶是通过重组DNA技术制备的。

4.权利要求1的方法，其中酸性环境是水溶液。

5.权利要求4的方法，其中水溶液是一种饮料。

6.权利要求5的方法，其中饮料是饮用酸奶，果汁或含有乳清蛋白的饮料。

7.权利要求1的方法，其中蛋白质来自或可从日用品中产生或在一种日用品之中。

8.权利要求7的方法，其中日用品是牛奶或奶酪。

9.权利要求8的方法，其中蛋白质是酪蛋白或乳清蛋白。

10.权利要求1的方法，其中酸性环境的pH为3.5到5.5。

11.权利要求10的方法，其中酸性环境的pH为4到5.5。

12.权利要求1的方法，其中酸性环境的pH为4。

13.权利要求1的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶根据以下方案对Ca²⁺离子不敏感：

方案

果胶样品的钙敏感性指数测定

钙敏感性以溶于具有57.6mg钙/g果胶的溶液中的果胶的粘度除以完全相同量的果胶但未加钙的溶液粘度来测量。非钙敏感性果胶的CF值为1。

将4.2g果胶样品以高效搅拌溶于550ml热水中。将该溶液冷却到20℃并用1N HCl将pH调到1.5。用水将果胶溶液调到700ml并搅拌。分别量取145g该溶液至4个粘度杯中。向两个杯中加入10ml水(双倍测量)，在搅拌条件下向其它2个杯中加入10ml 250mM CaCl₂溶液。

在高效磁力搅拌条件下将50ml乙酸缓冲液(0.5M，pH4.6)加入所有4个粘度杯中，从而使果胶溶液的pH上升到pH4.0以上。取出磁棒，将杯放于20℃过夜。用Brookfield粘度计在第二天测量粘度。钙敏感性指数计算如下：

14.权利要求1的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶具有高分子量。

15.权利要求1的方法，其中果胶甲基酯酶在所有或基本上所有果胶链上使2个或更多个果胶的相邻半乳糖醛酸残基去酯化。

16.权利要求1的方法，其中果胶甲基酯酶来自可从植物获得的PME。

17.权利要求16的方法，其中植物是水果。

18.权利要求17的方法，其中水果是柑桔水果。

19.权利要求18的方法，其中柑桔水果是橙子。

20.权利要求18的方法，其中果胶甲基酯酶来自可从橙子瓣膜或白色层获得的PME。

21.权利要求1的方法，其中所述酶包括SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合。

22.权利要求1的方法，其中所述酶可通过表达NCIMB 40749或NCIMB 40750所含的PME编码序列或其变异体，衍生物或同源物，或其组合；或表达包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其变异体，衍生物或同源物，或其组合获得。

23.权利要求1的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶通过在钠离子存在下用重组果胶甲基酯酶处理果胶来制备。

24.一种方法，包括：

a)将编码能够使果胶嵌段式酶促去酯化的果胶甲基酯酶的DNA序列插入一种有机体；

b)表达编码能够使果胶嵌段式酶促去酯化的果胶甲基酯酶的DNA序列；

c)纯化该能够使果胶嵌段式酶促去酯化的果胶甲基酯酶；

d)将所述能够使果胶嵌段式酶促去酯化的纯化果胶甲基酯酶加入果胶；

e)通过所述能够使果胶嵌段式酶促去酯化的纯化果胶甲基酯酶由所述果胶制备嵌段式酶促去酯化的果胶；其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶是含有70％到80％酯基的高酯果胶；

f)向含有至少一种蛋白质的酸性环境中加入嵌段式酶促去酯化的果胶；并且

g)通过所述嵌段式酶促去酯化的果胶稳定所述蛋白质。

25.权利要求24的方法，其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶含有76％的酯基。

26.权利要求24的方法，其中所述嵌段式酶促去酯化的果胶是通过重组DNA技术制备的。

27.权利要求24的方法，其中酸性环境是水溶液。

28.权利要求27的方法，其中水溶液是一种饮料。

29.权利要求28的方法，其中饮料是饮用酸奶，果汁或含有乳清蛋白的饮料。

30.权利要求24的方法，其中蛋白质来自或可从日用品中产生或在一种日用品之中。

31.权利要求30的方法，其中日用品是牛奶或奶酪。

32.权利要求24的方法，其中蛋白质是酪蛋白或乳清蛋白。

33.权利要求24的方法，其中酸性环境的pH为3.5到5.5。

34.权利要求33的方法，其中酸性环境的pH为4到5.5。

35.权利要求33的方法，其中酸性环境的pH为4。

36.权利要求24的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶根据以下方案对Ca²⁺离子不敏感：

方案

果胶样品的钙敏感性指数测定

37.权利要求24的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶具有高分子量。

38.权利要求24的方法，其中果胶甲基酯酶在所有或基本上所有果胶链上使2个或更多个果胶的相邻半乳糖醛酸残基去酯化。

39.权利要求24的方法，其中果胶甲基酯酶来自可从植物获得的PME。

40.权利要求39的方法，其中植物是水果。

41.权利要求40的方法，其中水果是柑桔水果。

42.权利要求41的方法，其中柑桔水果是橙子。

43.权利要求31的方法，其中果胶甲基酯酶来自可从橙子瓣膜或白色层获得的PME。

44.权利要求39的方法，其中所述酶包括SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2所示的任一氨基酸序列或其变异体，衍生物或同源物，包括其组合。

45.权利要求24的方法，其中所述酶可通过表达NCIMB 40749或NCIMB 40750所含的PME编码序列或其变异体，衍生物或同源物，或其组合；或表达包含SEQ.I.D.No.3或SEQ.I.D.No.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其变异体，衍生物或同源物，或其组合获得。

46.权利要求24的方法，其中嵌段式酶促去酯化的果胶通过在钠离子存在下用重组果胶甲基酯酶处理果胶来制备。

47.一种在酸性环境下稳定的蛋白质，其中所述蛋白质是通过前述任一权利要求的方法稳定的。