CN111269284B - 同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和rna的试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速高效分离动物细胞蛋白质和RNA的提取试剂和方法。利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法，通过优化提取条件，实现从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的目的。该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学蛋白提取技术领域，涉及一种利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法，从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的提取试剂和方法，该方法适用于少量细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
背景技术
随着精准医学和肿瘤生物学的快速发展，从大量临床样本中获取更多的疾病遗传信息受到越来越多的关注。整合蛋白质组学、转录组学以及代谢组学信息，可以全面的了解疾病发生发展的规律，为临床治疗寻找药物作用靶点。然而，由于试验样本有限，有时候不能同步提取DNA、RNA、蛋白质或代谢物，结果造成样本信息不对等，引起试验结果偏差较大等实际问题。因此，为了充分利用试验样本，从相同样本中同时获取蛋白、核酸或代谢物等信息，获取更多有价值的遗传背景信息，很多试剂公司或研究人员都致力于开发一些可以同步提取蛋白、核酸或代谢物的试剂或方法。
近些年蛋白质的提取方法主要包括水溶液提取法和有机溶剂提取法。前者适合提取大部分可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液的蛋白质，后者用来提取少数与脂类结合的蛋白质，常用有机溶剂包括乙醇、丙酮或丁醇等。提取出来的蛋白质可通过盐析、等电点沉淀、离子交换层析或亲和层析等方法进行分离。目前分离动物细胞蛋白质的试剂主要包括RIPA试剂，根据表面活性剂种类和比例不同，又分为强、中、弱细胞裂解液，适用于提取胞浆、胞核或细胞膜蛋白，满足后续WB或IP等实验要求。常用的表面活性剂有SDS、Triton X-100和NP-40等。
现阶段RNA提取试剂主要包括Trizol、RNAiso等试剂，其内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定。当加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。该法所提RNA纯度高，完整性好，可用于定量PCR、Northern Blot、体外翻译和分子克隆等实验。
尽管有关蛋白质或RNA的提取试剂很多，提取方法比较成熟，但是可以同步分离蛋白质和RNA或DNA的试剂却很少，提取方法不够成熟，不能满足少量或珍贵细胞样本的实验要求，亟待解决。
发明内容
本发明的目的：一是提供一种高效快速地从动物细胞质或细胞核中提取总蛋白和RNA的提取试剂；二是利用上述提取试剂建立一种同步提取蛋白质和RNA的实验方法，可从少量或珍贵实验样本中同时分离细胞总蛋白和RNA，用于同步研究细胞蛋白组和转录组，节约细胞样本、获取很多有效数据。
本发明的技术方案如下：
一种快速高效提取动物细胞总蛋白和RNA的提取试剂，包括以下三种组分：
试剂A：包括20mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1％NP40、1mM EDTA(pH8.0)和10％Glycerol，使用前添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和RNA分解酶抑制剂(现用现配)。
试剂B:100mM Tris-HCl(pH7.4)、2mM Na3VO4、100mM NaCl、1％TritonX-100、1mMEDTA、10％Glycerol、1mM EGTA、0.1％SDS、1mM NaF、0.5％deoxycholate和2mM Na4P2O7。
试剂C：包含质量浓度为0.1％异硫氰酸胍盐和0.2％β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液；
一种利用上述提取试剂同步提取细胞质或细胞核蛋白和RNA的方法，包括以下步骤：
1、配制提取试剂A、B和C。使用前在试剂A和C中分别添加1％的磷酸酶抑制剂、1％蛋白酶抑制剂和1U//μl RNase分解酶抑制剂(现用现配)；
2、准备实验样品。按照常规方法收集细胞(1×106～5×106)。使用预冷PBS清洗细胞两次。离心1000rpm×5min×4℃，收集细胞沉淀；
3、添加500μl提取试剂A，冰上静置60min，每10分钟混匀一次，充分裂解细胞；
4、离心3000rpm×10min×4℃，上清液中含有细胞质蛋白及RNA，而沉淀中含有细胞核蛋白及RNA；
5、添加PBS清洗沉淀两遍，可用移液枪轻缓吹打。离心3000rpm×10min×4℃，收集沉淀；
6、向沉淀中添加25μl试剂B，放置在冰上裂解30min，每10分钟涡悬震荡30s，重复三次；
7、离心14000rpm×20min×4℃，上清液中含有细胞核蛋白和RNA提取物；
同步提取细胞质或细胞核中的RNA，具体步骤如下：
8、吸取上述步骤4的细胞质裂解液200μl、步骤7的细胞核裂解液50μl，分别添加600μl、150μl试剂C(3倍体积)，混合均匀，室温静置5min；
9、加入总体积20％的氯仿，涡悬震荡混匀，室温静置10min；
10、离心12000rpm×10min×4℃，将上清液转移到新的无RNA分解酶的无菌离心管中；
11、加入与上清液等体积的异丙醇后，混合均匀，室温静置10min；
12、离心12000rpm×10min×4℃，保留沉淀，添加500μl 75％乙醇清洗沉淀；
13、离心8000rpm×5min×4℃，保留沉淀；
14、室温干燥沉淀。添加DEPC处理水溶解RNA。
该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
一、现有的蛋白质提取试剂和RNA提取试剂通常是分开使用的，不能同时提取蛋白质和RNA，操作步骤繁琐，需要较多实验样本，不适合少量或珍贵细胞样本的检测分析。本发明通过优化提取液配方、改进实验流程，将细胞蛋白质和RNA提取方法融合在一起，可以同时分离细胞蛋白质和RNA，简化了实验步骤，节约实验样本，提高工作效率。
二、与Trizol试剂相比，本方法通过优化细胞裂解液配方、调整细胞破碎时间，优先分离出细胞质蛋白和RNA，然后再分离出细胞核蛋白和RNA，保证了蛋白质活性和RNA完整性，可用于后续的蛋白组功能研究及转录组分析检测。
附图说明
图1利用本发明试剂同步分离提取细胞质/细胞核蛋白和RNA的实验流程图；
图2利用本发明方法提取的细胞质和细胞核蛋白，免疫印迹检测结果(WesternBlotting)。利用凯基生物商品化细胞质/细胞核蛋白提取试剂和本发明提取试剂，分别提取肝癌细胞SMMC7721细胞质和细胞核蛋白，并进行Western blotting检测。结果表明，商品化试剂盒和本发明试剂都可以很好的分离出细胞质蛋白，纯度很好(核蛋白Lambin B没有出现在细胞质蛋白中)；但是商品化试剂盒分离的细胞核蛋白有少量胞质蛋白残留(如箭头所示，胞质蛋白Tubulin出现在胞核蛋白中)，而利用本发明提取试剂分离的胞核蛋白中没有出现胞质蛋白Tubulin残留，说明本发明试剂在去除细胞核蛋白残留方面效果更好。
图3利用本发明试剂和提取方法获取的细胞质和细胞核RNA，进行qRT-PCR检测结果。
利用本发明方法提取的细胞质和细胞核RNA，进行qRT-PCR检测。结果表明，RNA纯度很好，qPCR产物特异性很好，可用于后续RNA检测分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
利用本发明的细胞质/细胞核蛋白和RNA同步提取试剂与凯基生物公司商品化细胞核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒，分别提取人肝癌细胞SMMC7721胞质和胞核蛋白，并进行Western Blotting检测，评价本试剂盒胞质和胞核蛋白的提取效果[见图2]。
实验步骤如下：
一.配制提取试剂组分：
(1)配制100ml细胞裂解液A：
按照如下方法称量试剂粉末，并依次溶于双蒸水中，混匀后用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
| 组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
| Tris-HCl | 科密欧 | 0.2423g | 20mM(pH7.4) |
| NaCl | 科密欧 | 0.0585g | 10mM |
| MgCl2 | 科密欧 | 0.06099g | 3mM |
| NP40 | Sigma | 0.1ml | 0.1％ |
| EDTA | 科密欧 | 0.037224g | 1mM(pH8.0) |
| Glycerol(甘油) | Sigma | 10ml | 10％ |
(2)配制100ml细胞裂解液B：
按照如下方法称量试剂粉末，并依次溶于双蒸水中，混匀后用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
| 组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
| Tris-HCl | 科密欧 | 1.211g | 100mM(pH7.4) |
| Na3VO4 | Sigma | 0.036782g | 2mM |
| NaCl | 科密欧 | 0.585g | 100mM |
| TritonX-100 | Sigma | 1ml | 1％ |
| EDTA | 科密欧 | 0.037224g | 1mM |
| Glycerol(甘油) | Sigma | 10ml | 10％ |
| EGTA | Sigma | 0.038035g | 1mM |
| SDS | 科密欧 | 0.1g | 0.1％ |
| NaF | Sigma | 0.0041199g | 1mM |
| Deoxycholate | Sigma | 0.5g | 0.5％ |
| Na4P2O7 | Sigma | 0.89212g | 2mM |
(3)配制100ml细胞裂解液C：
| 组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
| 重蒸酚 | 贝斯特 | 250ml | 100ml(PH4.7) |
| β-巯基乙醇 | Sigma | 200μl | 0.2％ |
| 异硫氰酸胍 | Sigma | 0.1g | 0.1％ |
具体方法如下：
①取出重蒸酚(贝斯特)，室温放置，至室温后68℃度水浴融化；分取250ml重蒸酚，添加750ml双蒸水(重蒸酚与水的体积比1:3)，放置在通风橱中，搅拌4小时；然后室温静置过夜。
②次日，可见溶液分层：上层为水相，下层为水饱和酚相。从下层取出100ml水饱和酚，添加200μl的β-巯基乙醇和0.1g的异硫氰酸胍，搅拌均匀，4℃保存备用。
二、同步提取细胞质和细胞核蛋白质和RNA实验方法如下：
1、使用前在试剂A和C中分别添加1％的磷酸酶抑制剂、1％蛋白酶抑制剂和1U//μlRNase分解酶抑制剂(现用现配)；
2.取出新鲜培养的SMMC7721肝癌细胞(1×106～5×106)，使用预冷PBS清洗细胞两次，离心1000rpm×5min×4℃，收集细胞沉淀；
3、添加500μl提取试剂A，冰上静置60min，每10分钟震荡混匀一次，充分裂解细胞；
4、离心3000rpm×10min×4℃，将上清液转移到新的1.5ml离心管中保存(含有胞质蛋白及RNA)，而沉淀中含有细胞核蛋白及RNA；
5、添加500μl PBS清洗沉淀两遍，可用移液枪轻缓吹打。离心3000rpm×10min×4℃，弃上清，保留沉淀，近量吸干残留的液体；
6、加入100μl试剂B于细胞沉淀，放置在冰上裂解30min，每10分钟涡悬震荡30s，重复三次；
7、离心14000rpm×20min×4℃，上清液中含有细胞核蛋白和RNA提取物；在上述蛋白提取过程中，可以同时提取细胞质或细胞核中的RNA，具体步骤如下：
8、吸取上述步骤4的细胞质裂解液200μl、步骤7的细胞核裂解液50μl，分别添加600μl、150μl试剂C(3倍体积)，混合均匀，室温静置5min；
9、加入总体积20％的氯仿，涡悬震荡混匀，室温静置10min；
10、离心12000rpm×10min×4℃，将上清液转移到新的无菌离心管中；
11、加入与上清液等体积的异丙醇后，混合均匀，室温静置10min；
12、离心12000rpm×10min×4℃，保留RNA沉淀，添加500μl 75％乙醇溶液清洗沉淀；
13、离心12000rpm×5min×4℃，保留沉淀；
14、室温自然干燥，添加50～100μl的DEPC处理水溶解RNA。待检测。
三、选取凯基生物的核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒作为对照，分离肝癌细胞SMMC7721胞质和胞核蛋白，提取方法详见产品说明书(略)。
四、实验结果
利用蛋白免疫印迹方法(Western Blotting)，检测人肝癌细胞质和细胞核蛋白分离效果。结果显示，利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核蛋白分离得很彻底，在细胞质和细胞核蛋白之间没有残留或干扰，可以很好的定位目标蛋白的分布。而对照商品化的试剂盒，细胞质蛋白分离效果很好，而胞核蛋白中可见少量胞质蛋白(Tubulin)残留，表明对胞质和胞核蛋白分离得不够彻底。可见，本发明的细胞质和细胞核蛋白提取试剂分离性能更为优越(附图2)。
实施例2
利用本发明试剂分离人肝癌细胞SMMC7721细胞质和细胞核RNA，并进行qRT-PCR检测。评价本试剂盒胞质和胞核RNA的提取效果。
一、实验步骤：
1、利用本发明试剂提取细胞质和细胞核RNA的方法，具体操作步骤详见实施例1。
2、采用Nanodrop仪器，对提取的RNA进行浓度测定(见表1)。
3、对提取的RNA进行反转录合成cDNA。
cDNA合成试剂：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)；
具体步骤如下：
cDNA合成反应：
4、对合成的cDNA，进行qRT-PCR检测。
定量PCR试剂：TaKaRa TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)
定量PCR反应体系：
qPCR反应条件
二、实验结果：
1、利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核RNA，浓度测定结果如表1所示。RNA纯度在1.8～2.0之间，满足qPCR实验检测要求。
表1利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核RNA浓度测定结果
2、采用qRT-PCR方法，检测人肝癌细胞质和细胞核RNA的扩增性能。
定量PCR检测结果显示，利用本试剂提取的RNA纯度很好，可以进行反转录合成cDNA和定量PCR检测，条带特异性很好(附图3)。
注意事项：
RNA分离的最关键的因素是尽量减少RNA的污染，RNA酶，尤其是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase，故在提取RNA时，应尽量减少RNA酶对RNA的降解作用，做好灭菌工作。
Claims (2)
1.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的方法，其特征在于：包括使用试剂A、试剂B和试剂C：
试剂A的组分为：pH7.4的20mM~100mM Tris-HCl、10mM~100mM NaCl、1mM~10mM MgCl2、体积浓度0.1%~1% NP40、pH8.0的1mM~10mM EDTA和体积浓度1%~10% Glycerol；
试剂B的组分为pH7.4的10mM~100mM Tris-HCl、1mM~5mM Na3VO4、10mM~100mM NaCl、0.1%~1% TritonX-100、1mM~10mM EDTA、体积浓度1%~10% Glycerol、1mM~10mM EGTA、质量浓度0.1%~10% SDS、1mM~10mM NaF、质量浓度0.1%~0.5% Deoxycholate和1mM~10mMNa4P2O7；
试剂C的组分为：质量浓度为0.1~1%异硫氰酸胍盐和0.1~0.5% β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液；
所述方法是：
（1）在提取细胞蛋白质和RNA前，在试剂A和C中均添加终体积浓度1%的磷酸酶抑制剂、终体积浓度1%的蛋白酶抑制剂和终浓度1U/μl的RNase分解酶抑制剂；
（2）准备新鲜细胞样品，离心收集1×106~5×106个细胞，添加1~2ml PBS缓冲液清洗两遍；
（3）添加0.1~1ml提取试剂A，-4℃~4℃裂解细胞60min，释放出细胞质蛋白和RNA；
（4）离心3000rpm×10min×4℃，上清液中含有细胞质蛋白及RNA，沉淀中含有细胞核蛋白及RNA，将上清液转移到新离心管中，同时保留沉淀；
（5）添加1~2ml PBS缓冲液清洗步骤（4）得到的沉淀两遍；离心3000rpm×10min×4℃，收集沉淀；
（6）向步骤（5）收集的沉淀中添加试剂B，试剂B的添加体积为试剂A添加体积的0.01~1倍，放置在-4℃~4℃裂解30min，每间隔10min涡旋震荡一次；
（7）离心14000rpm×15min×4℃，上清液中含有细胞核蛋白和RNA；
（8）提取细胞质或细胞核中的RNA的步骤如下：
a、分别取步骤（4）或步骤（7）的上清液，然后添加上清液3倍体积的试剂C，震荡混合，室温放置5~10min；
b、向步骤a得到的溶液中加入终体积20%的氯仿，涡悬震荡混匀，室温静置10min；
c、离心12000rpm×10min×4℃，将含有RNA的上清液转移到无RNase分解酶的离心管中，沉淀物中含有蛋白；
d、向步骤c得到的上清液中添加0.5~1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温静置10min；
e、离心12000rpm×10min×4℃，保留沉淀；添加与试剂C等体积的体积浓度75%乙醇清洗沉淀；
f、离心8000rpm×5min×4℃，保留沉淀；
g、室温干燥沉淀；DEPC处理水溶解RNA；
所述细胞样品为所有人或动物来源的细胞株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中试剂B的添加体积为试剂A添加体积的1/20。
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