CN116200381B

CN116200381B - 一种血浆游离dna提取试剂盒及提取方法和应用

Info

Publication number: CN116200381B
Application number: CN202310093787.XA
Authority: CN
Inventors: 胡立夫; 南熠郎
Original assignee: Shenzhen Zeyi Cell Therapy Group Co ltd; Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Zeyi Cell Therapy Group Co ltd
Priority date: 2023-02-10
Filing date: 2023-02-10
Publication date: 2026-01-30
Anticipated expiration: 2043-02-10
Also published as: CN116200381A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用。试剂盒包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液、清洗液和洗脱液。提取方法：将血浆样品、裂解液、蛋白酶K、结合液和磁珠混合，裂解后的血浆游离DNA(cfDNA)与磁珠孵育形成磁珠‑cfDNA复合物；在磁场作用下经洗涤去除磁珠‑cfDNA复合物中的多种杂质，洗脱后获得血浆cfDNA。本发明的方法操作简单且快速，样本裂解时间短且质量稳定，裂解过程中将异丙醇替换为无水乙醇，使得核酸提取回收率高，适用于血浆cfDNA提取；纯度适用于后续测序和PCR/Q‑PCR；磁珠法有利于规模化使用，在研究和临床方面具有重要意义。

Description

一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用。

背景技术

核酸是生物大分子的一种，其作为遗传信息的携带者，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸对生物的生长和遗传等起决定性作用，与肿瘤的发生也有重要关系。因此，对核酸的研究是现代医学研究中的重要课题之一。

核酸在人体内通常和蛋白质结合，得到高质量的核酸是后续研究的基础，因此在提取过程中要尽量保证提取充分，并保证核酸的一级结构完整，防止蛋白质等生物大分子的污染。目前核酸的分离技术主要有：

苯酚/氯仿提取法：该方法是目前使用最广泛、最经典的核酸分离纯化技术。先将样本材料裂解，之后与酚氯仿充分混匀，利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性；十二烷基磺酸钠(SDS)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，使核蛋白变性降解，DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。通过离心后由上而下形成三层，上层为含核酸的水相层，中间为主要含蛋白质的乳化层，下层为酚氯仿有机溶剂，吸取上层水相就能将蛋白质和核酸有效地分开。但其缺点是所用试剂为有毒试剂。

盐析法：通过将组织、细胞在裂解液中裂解后，加入高盐(NaCl、NH₄Cl、KCl)促使蛋白质变性形成不溶性物质而除去，从而将杂质和核酸得以分离。该法的缺点在于杂质去除不彻底。

玻璃珠法：利用玻璃珠在高离液盐(盐酸胍、NaCl、异硫氰酸胍)条件下与核酸发生吸附反应，在低离液盐条件下核酸会被洗脱下来，从而实现核酸和蛋白质、糖、脂质等杂质分离的目的。其缺点是会有玻璃珠的残留。

硅胶柱法：该方法采用特殊硅基质材料，在一定的高盐、低pH值条件下高效、专一地吸附DNA、RNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA、RNA。离心柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能，从而实现核酸与蛋白质等杂质的分离。其缺点是需要较多的样本，耗材多，珍稀样本不适合通过本法提取核酸。

磁珠法：目前广泛应用于DNA的提取纯化实验。磁珠的基本结构一般分为3层，内层是聚苯乙烯，第二层包裹磁性物质四氧化三铁(Fe₃O₄)，最外层是官能团基团修饰的高分子材料。利用表面标记了官能团的纳米级磁珠微珠，官能团与核酸吸附，蛋白质等杂质不会与磁珠吸附，磁珠可以在磁场下聚集和分散，从而实现将核酸与杂质分离的目的。该法用到的磁珠一般为羟基磁珠，该磁珠体系包含：磁珠、聚乙二醇(PEG)和盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子(如Na⁺)环境中，DNA分子的水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性被破坏，构象也随之改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面，通过Na⁺与羟基形成“电桥”，使得DNA可吸附到羟基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体)，形成了“核酸-磁珠复合物”，同时磁珠具有超顺磁性，可以通过外磁场进行吸附操作，该过程是可逆的，在适当条件下，DNA分子可以被洗脱回收。

人体血液循环系统中不断流动着血液细胞，体细胞和血细胞破裂降解后，释放胞浆中的内含物，包括蛋白质、外泌体、RNA及携带有各种遗传信息的DNA片段即cfDNA(cellfree DNA)。该类DNA片段含有例如突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等异常情况，特别是来自基因组的ctDNA(circulating tumor DNA，循环肿瘤细胞DNA)片段。这种被成为液体活检，侵犯性低，可多次获得样品，以观察动态变化。在外周血中，基因异常的ctDNA只占全部DNA的极小部分，大约0.1～1％，且高度碎片化(通常为几十到一百多碱基对)，提取难度高，降低了临床检测的敏感性和特异性。目前的DNA提取方法所提取的ctDNA含量低。

目前市场上存在的试剂盒操作方便，但所提取的ctDNA含量低，提取率一般且价格昂贵。因此，需要提供一种提取效率高，性价比好的试剂盒，在提高提取效率的同时还可以减少提取成本，为研究和临床的后续应用带来方便。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血浆游离DNA提取试剂盒，该试剂盒的提取效率高，简单快速，成本低。

本发明还提出一种血浆游离DNA的提取方法。

本发明还提出所述血浆游离DNA提取试剂盒或所述血浆游离DNA提取方法在制备血浆甲基化标志物中的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液；所述裂解液包括Tris-HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚山梨醇酯-20(Tween20)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triron X-100)。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30～40％的无水乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液的总体积为50mL。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠用于吸附DNA，以悬浮液状态参与反应。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠包括羟基磁珠、氨基磁珠、硅胶质膜磁珠中的任一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述磁珠选自所述羟基磁珠。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠以磁珠悬浮液的方式加入，体积为50～100μL。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K用于降解蛋白质，灭活核酸酶(DNase和RNase)。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K的浓度为20～21mg/mL。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K的体积为50～100μL。

在本发明的一些实施方式中，所述结合液包括：5～7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍，以及质量浓度为30～45％的无水乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述血浆游离DNA提取试剂盒还包括清洗液和洗脱液。

在本发明的一些实施方式中，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液。

在本发明的一些实施方式中，所述第一清洗液包括：0.1～10M的异硫氰酸胍，0.1～1M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，10～500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，7～9M的高氯酸钠，质量浓度为20～40％的无水乙醇或异丙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述第二清洗液包括：1～5000mM的Tris-HCl，质量浓度为70～80％的无水乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液用于将血浆样品中的DNA从磁珠上洗脱下来。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液包括：1～15mM的Tris-HCl，1～15mM的TE缓冲液。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液的pH为8.0～9.0。

在本发明的一些实施方式中，所述TE缓冲液是由Tris和EDTA配制而成的缓冲液。

根据本发明的第二个方面，提出了一种血浆游离DNA的提取方法，使用所述血浆游离DNA提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：

S1：将血浆样品与裂解液、蛋白酶K混合，得第一混合液；

S2：向所述第一混合液中加入磁珠和结合液，得第二混合液；

S3：对所述第二混合液进行磁力吸附，以提取所述血浆游离DNA。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中将所述血浆样品与所述裂解液、所述蛋白酶K混合后，于45～60℃下孵育20～30min，得所述第一混合液。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2所述磁珠以磁珠悬浮液的形式加入，所述磁珠悬浮液的体积为50～100μL。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2除加入所述磁珠和所述结合液外，还加入载体RNA或Poly A，以及无水乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述第二混合液中包括磁珠-DNA复合物。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3对所述第二混合液进行磁力吸附后，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第一沉淀；清洗所述第一沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第二沉淀；清洗所述第二沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第三沉淀。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3还包括清洗所述第三沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第四沉淀；清洗所述第四沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第五沉淀；对所述第五沉淀进行磁力吸附，收集磁珠-DNA复合物，对所述磁珠-DNA复合物进行干燥。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3还包括加入洗脱液，与所述磁珠-DNA复合物进行孵育，磁力吸附，收集洗脱液，即得所述血浆游离DNA。

在本发明的一些实施方式中，使用第一清洗液清洗所述第一沉淀和所述第二沉淀；所述第一清洗液包括：0.1～1M的异硫氰酸胍，0.1～1M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，10～500mM的乙二胺四乙酸，7～9M的高氯酸钠，质量浓度为20～40％的无水乙醇或异丙醇。

在本发明的一些实施方式中，使用第二清洗液清洗所述第三沉淀和所述第四沉淀；所述第二清洗液包括：1～5000mM的Tris-HCl，质量浓度为70～80％的无水乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液的pH为8.0～9.0。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液与所述磁珠-DNA复合物于50～65℃下孵育5～10mim。

根据本发明的第三个方面，提出了所述血浆游离DNA提取试剂盒或所述血浆游离DNA的提取方法在制备血浆甲基化标志物中的应用。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明使用血浆游离DNA提取试剂盒，首先加入血浆样品、裂解液和蛋白酶K，充分混合均匀后在45～60℃下裂解，裂解液处理后，血浆样品中的cfDNA与磁珠悬浮液混合形成磁珠-cfDNA复合物，然后通过洗涤和洗脱过程，去除磁珠-cfDNA复合物中的多种杂质，获得cfDNA：1.本发明方法简单快速，时间短，质量稳定；2.无水乙醇替换异丙醇，方便实验室操作，改善工作环境，降低成本；3.由于磁珠对核酸的吸附率高，回收率也高，有利于血浆中微量ctDNA(循环肿瘤DNA)提取；4.所提取获得的DNA纯度高，可适应于后续测序和PCR/Q-PCR应用；5.整个方法建立在磁场下操作，因此磁珠法提取cfDNA有利于大规模使用。此方法在研究和临床方面都有重要意义。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例提供一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括：

用于对血浆样品进行预处理的裂解液：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30～40％的无水乙醇；加水补充总体积为50mL；

用于降解蛋白质，灭活核酸酶的蛋白酶K：浓度为20mg/mL；

磁珠：为羟基磁珠，以磁珠悬浮液的形式加入，加入量为50～100μL；

用于对血浆样品中DNA进行吸附的结合液：5～7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍，以及质量浓度为30～45％的无水乙醇；

用于洗涤的第一清洗液：0.1～10M的异硫氰酸胍，0.1～1M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，10～500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，7～9M的高氯酸钠，质量浓度为20～40％的无水乙醇或异丙醇；

用于洗涤的第二清洗液：1～5000mM的Tris-HCl，质量浓度为70～80％的无水乙醇；

用于洗脱的洗脱液：1～15mM的Tris-HCl，1～15mM的TE缓冲液，pH为8.0～9.0。

本发明还提供一种血浆游离DNA的提取方法，应用上述试剂盒进行DNA提取，包括以下步骤：

(1)在无核酸酶的离心管中，依次加入3mL血浆样本、50～100μL蛋白酶K、1～2mL裂解液，涡旋30s后短暂离心获得第一混合液。

(2)将第一混合液在45～60℃下孵育20～30min后，加入2～4mL结合液、5～10μL的Poly A、4～6mL无水乙醇、50～100μL磁珠悬浮液，得含有磁珠-DNA复合物的第二混合液。

(3)将第二混合液进行短暂离心后，置于磁力架上进行磁力吸附2min，吸弃离心管中的液体，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第一沉淀；将第一沉淀转移至新的离心管中，加入1mL第一清洗液，涡旋10s后简短离心获得第三混合液，将装有第三混合液的离心管置于磁力架上进行磁力吸附2min，吸弃离心管中的液体，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第二沉淀；在第二沉淀中加入1mL第一清洗液，涡旋10s后简短离心获得第四混合液，将装有第四混合液的离心管置于磁力架上进行磁力吸附2min，吸弃离心管中的液体，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第三沉淀；

在第三沉淀中加入500～750μL第二清洗液，涡旋10s后简短离心获得第五混合液，将装有第五混合液的离心管置于磁力架上进行磁力吸附2min，吸弃离心管中的液体，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第四沉淀；在第四沉淀中加入500～750μL第二清洗液，涡旋10s后简短离心获得第六混合液，将装有第六混合液的离心管置于磁力架上进行磁力吸附2min，吸弃离心管中的液体，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第五沉淀；将第五沉淀涡旋后简短离心置于磁力架上进行磁力吸附1min，吸弃离心管中的残留液体，收集获得磁珠-DNA复合物，并在45～55℃条件下对磁珠-DNA复合物干燥10～15min；

在干燥后的磁珠-DNA复合物中加入25～50μL洗脱液，涡旋30s混合均匀后得到第七混合液，将第七混合液在50～65℃下孵育5～10min；将孵育后的第七混合液涡旋后短暂离心，置于磁力架上进行磁力吸附2min，收集洗脱液，转移到新的无核酸酶的离心管中，即得到血浆游离DNA。

上述血浆游离DNA提取试剂盒及血浆游离DNA提取的方法可用于制备并检测肿瘤基因的甲基化标志物。

实施例1

本实施例比较裂解液中有无添加无水乙醇或异丙醇的DNA提取效率。

在本实施例中，模拟血浆操作，60ng超声DNA与3mL血浆混合后模拟血浆提取操作，同时，裂解液中分别不添加或添加无水乙醇/异丙醇，对得到的结果计算提取效率，并对提取效率进行比较。

本实施例中，裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，不添加或添加无水乙醇或异丙醇；加水补充总体积为50mL；

结合液包括：5～7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍溶于1L水中，以及质量浓度为30～45％的无水乙醇；

第一清洗液包括：0.1～10M的异硫氰酸胍，0.1～1M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，10～500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，7～9M的高氯酸钠，质量浓度为20～40％的无水乙醇或异丙醇；

第二清洗液包括：1～5000mM的Tris-HCl，质量浓度为70～80％的无水乙醇；

洗脱液包括：1～15mM的Tris-HCl，1～15mM的TE缓冲液，pH为8.0～9.0。

血浆游离DNA的提取方法包括如下步骤：

(1)取3个15mL离心管，分别加入3mL待处理的血浆，其中，3个离心管分别编号1(不添加无水乙醇或异丙醇)、2(添加异丙醇)、3(添加无水乙醇)；

(2)向上述离心管中分别加入50～100μL蛋白酶K、1～3mL裂解液，将混合物置于45～60℃水浴锅中孵育20～30min后，加入2～4mL结合液、5～10μL的Poly A、0或4.5mL无水乙醇/异丙醇和50～100μL磁珠悬浮液，涡旋30s；

(3)将15mL离心管置于磁力架上，磁力吸附5min，弃去上清液；将离心管从磁力架上取下，加入1000μL第一清洗液，涡旋10s后简短离心，再将离心管中的所有液体转移至1.5mL离心管中；

(4)将离心管置于磁力架上2min，将所有的上清液转移至上述15mL离心管中，尽可能地将15mL离心管管壁上的磁珠洗脱下来。将15mL离心管涡旋10s后简短离心，再将离心管中的液体转移至1.5mL离心管中；

(5)将1.5mL离心管置于磁力架上2min，弃去上清液；将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入500～750μL第二清洗液，涡旋10s后简短离心，将离心管置于磁力架上2min，弃去上清液；重复加一次第二清洗液；将离心管简短离心后置于磁力架上1min，尽可能吸弃残留的上清液，将离心管置于45～55℃条件下烘干10～15min；

(6)在离心管中加入25μL洗脱液，涡旋30s混合均匀后在50～65℃下孵育5～10min；将孵育后的混合液涡旋后短暂离心，置于磁力架上进行磁力吸附2min，收集洗脱液并转移到新的无核酸酶的离心管中，得到血浆游离DNA。

使用ThermoFisher Qubit 4及HS dsDNA定量检测试剂盒，对上述方法提取得到的DNA进行浓度测定，计算并对回收率进行比较，结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，本方法中，裂解液中添加异丙醇或无水乙醇后DNA的提取效率与不添加异丙醇或无水乙醇作比较分别为2.86倍和3.64倍，可见，裂解液中添加异丙醇或无水乙醇的提取效率均优于不添加异丙醇或无水乙醇的提取效率，且添加无水乙醇的提取效率更高。

实施例2

本实施例比较裂解液中添加不同量的无水乙醇后DNA的提取效率。

在本实施例中，模拟血浆操作，60ng超声DNA与3mL血浆混合后模拟血浆提取操作，同时，裂解液中分别添加不同体积量的无水乙醇，对得到的结果计算提取效率，并对提取效率进行比较。

本实施例中，裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，添加不同体积量的无水乙醇；加水补充总体积为50mL。其余试剂与实施例1的相同。

本实施例的血浆游离DNA的提取方法同实施例1。

使用ThermoFisher Qubit 4及HS dsDNA定量检测试剂盒，对上述方法提取得到的DNA进行浓度测定，计算并对回收率进行比较，结果如表2所示。

表2

从表2可以看出，本方法中裂解液中添加不同体积量的无水乙醇，以4.5mL为参照，5.0mL、5.5mL、6.0mL、6.5mL的提取效率分别为4.5mL的4.05倍、2.58倍、2.31倍、3.17倍。可见，裂解液中添加无水乙醇的量为5.0mL时提取效率最优。

实施例3

本实施例比较裂解液中添加异丙醇和无水乙醇后DNA的提取效率。

在本实施例中，模拟血浆操作，15ng或60ng超声DNA与3mL的PBS或3mL血浆混合后模拟血浆提取操作，同时，裂解液中分别添加异丙醇或无水乙醇，对得到的结果计算提取效率，并对提取效率进行比较。

本实施例中，裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，添加异丙醇或无水乙醇；加水补充总体积为50mL。其余试剂与实施例1的相同。

本实施例的血浆游离DNA的提取方法同实施例1。

使用ThermoFisher Qubit 4及HS dsDNA定量检测试剂盒，对上述方法提取得到的DNA进行浓度测定，计算并对回收率进行比较，结果如表3所示。

表3

从表3可以看出，以添加异丙醇的DNA提取效率为参照，添加无水乙醇的提取效率分别为添加异丙醇的提取效率的1.125倍、1.098倍、1.081倍和1.062倍。可见，裂解液中添加无水乙醇的提取效率优于添加异丙醇的提取效率。

实施例4

本实施例与不同公司磁珠法提取DNA的提取效率进行比较。

在本实施例中，模拟血浆操作，15ng超声DNA分别与3mL的PBS或3mL血浆混合后模拟血浆提取操作，同时，以A公司和B公司磁珠法的试剂盒提取血浆DNA得到的结果作为对照来对提取效率进行比较。其中，A公司磁珠法的试剂盒为：货号为DP710-01，天根生化科技公司，北京，磁珠法大体积血浆游离DNA提取法；B公司磁珠法的试剂盒为：BSC95S1，博日科技公司，杭州，血浆游离DNA提取法。

本实施例中，裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris-HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30～40％的无水乙醇；加水补充总体积为50mL。其余试剂与实施例1的相同。

本实施例的血浆游离DNA的提取方法同实施例1。

使用ThermoFisher Qubit 4及HS dsDNA定量检测试剂盒，对上述方法提取得到的DNA进行浓度测定，计算并对回收率进行比较，其中提取率的计算公式为：(b-b₀)/a，b为采用本方法或A公司或B公司的试剂盒提取后DNA总量，b₀为空白对照中提取后DNA总量，a为提取前DNA总量。如：编号1中的提取率的计算：(13.4-1.3)/15＝80.7％。结果如表4所示。

表4

从表4可以看出，利用本方法的DNA提取效率分别为80.7％和78.7％，而采用目前市场有销售的A公司和B公司的磁珠法提取试剂盒，提取效率分别为42.7％和40％，52.7％和52％。可见，本方法的提取效率优于用市面上在售的其他磁珠法提取试剂盒提取的提取效率。

实施例5

本实施例与不同公司柱子法提取DNA的提取效率进行比较。

在本实施例中，采用不同病人来源的血浆样本进行操作，提取3mL病人血浆样本中的cfDNA。同时，以C公司柱子法的试剂盒(D3182-03S，美基科技公司，广州)提取的结果作为对照来对提取效率进行比较。

本实施例的血浆游离DNA的提取方法同实施例1。

使用ThermoFisher Qubit 4及HS dsDNA定量检测试剂盒，对上述方法提取得到的DNA进行浓度测定，计算并对回收率进行比较，结果如表5所示。

表5

从表5可以看出，以C公司柱子法试剂盒的提取效率作为参照，本方法的提取效率分别为C公司柱子法提取效率的2.91倍、2.34倍、2.85倍、2.54倍。可见，本方法的提取效率优于市面上在售的其他柱子试剂盒提取法的提取效率。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液；所述裂解液包括：1~2M、pH为8.0~9.0的Tris-HCl，0.5~1M、pH为8.0~9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1~30%的聚山梨醇酯-20，质量浓度为0.1~3%的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30~40%的无水乙醇。

2.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20~21mg/mL。

3.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠选自羟基磁珠，所述磁珠以磁珠悬浮液的方式加入，体积为50~100μL。

4.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述结合液包括：5~7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍，以及质量浓度为30~45%的无水乙醇。

5.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述血浆游离DNA提取试剂盒还包括清洗液和洗脱液；

所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；所述第一清洗液包括：0.1~10M的异硫氰酸胍，0.1~1M、pH为8.0~9.0的Tris-HCl，10~500mM的乙二胺四乙酸，7~9M的高氯酸钠，质量浓度为20~40%的无水乙醇或异丙醇；

所述第二清洗液包括：1~5000mM的Tris-HCl，质量浓度为70~80%的无水乙醇；

所述洗脱液包括：1~15mM的Tris-HCl，1~15mM的TE缓冲液。

6.根据权利要求5所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液的pH为8.0~9.0。

7.一种血浆游离DNA的提取方法，其特征在于，使用权利要求1~6任一项所述血浆游离DNA提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：

S1：将血浆样品与裂解液、蛋白酶K混合，得第一混合液；

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤S1中将所述血浆样品与所述裂解液、所述蛋白酶K混合后，于45~60℃下孵育20~30min，得所述第一混合液。

9. 根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤S2除加入所述磁珠和所述结合液外，还加入载体RNA或Poly A，以及无水乙醇。

10.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤S3对所述第二混合液进行磁力吸附后，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第一沉淀；清洗所述第一沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第二沉淀；清洗所述第二沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第三沉淀。

11.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，步骤S3还包括清洗所述第三沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第四沉淀；清洗所述第四沉淀，磁力吸附，收集获得含有磁珠-DNA复合物的第五沉淀；对所述第五沉淀进行磁力吸附，收集磁珠-DNA复合物，对所述磁珠-DNA复合物进行干燥。

12.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤S3还包括加入洗脱液，与所述磁珠-DNA复合物进行孵育，磁力吸附，收集洗脱液，即得所述血浆游离DNA。

13.根据权利要求12所述的提取方法，其特征在于，所述洗脱液与所述磁珠-DNA复合物于50~65℃下孵育5~10min。

14.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，使用第一清洗液清洗所述第一沉淀和所述第二沉淀。

15.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，使用第二清洗液清洗所述第三沉淀和所述第四沉淀。

16.权利要求1~6任一项所述血浆游离DNA提取试剂盒或权利要求7~15任一项所述血浆游离DNA的提取方法在制备血浆甲基化标志物中的应用。