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CN111264516B - 一种血管无冰晶冷冻保存液及血管保存方法 - Google Patents

一种血管无冰晶冷冻保存液及血管保存方法 Download PDF

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CN111264516B CN202010103528.7A CN202010103528A CN111264516B CN 111264516 B CN111264516 B CN 111264516B CN 202010103528 A CN202010103528 A CN 202010103528A CN 111264516 B CN111264516 B CN 111264516B
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Abstract

本发明公开一种血管无冰晶冷冻保存液及血管保存方法，所述血管无冰晶冷冻保存液，包括甘油1.0‑6.0mol/L、甲酰胺1.0‑7.0mol/L、聚乙烯吡咯烷酮0.1‑2.5mol/L和成分X；所述的成分X为A成分、B成分或C成分中的一种或多种；其中，A成分是NO供体，B成分是内皮素抑制剂或内皮素拮抗剂，C成分是抗凋亡剂。本发明所述保存液提高了对血管功能的保存效果，特别是对于最容易受冻存损伤的血管平滑肌细胞和内皮细胞，可以对血管平滑肌细胞和内皮细胞进行有效的保护，具有有效保护血管平滑肌细胞和内皮细胞的功能，此外还提高了血管移植后长期通畅率，极大的保证了血管临床移植的成功率。

Description

一种血管无冰晶冷冻保存液及血管保存方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种血管无冰晶冷冻保存液及血管保存方法。
背景技术
近20年来，临床上对血管替代物的需求逐年增加。应用同种异体血管移植，可以解决血管损伤、动脉瘤、动脉粥样硬化、糖尿病并发的血管病变、多种复杂性心脏病及建立血液透析通路等多种问题。此外，在器官移植领域当供体器官和宿主之间血管吻合不匹配，也需要移植入额外的血管替代物来完成移植器官的血管重建。过去恶性肿瘤组织侵占临近关键血管为手术绝对禁忌证，但随着技术发展，如在普外科中，将血管移植应用于胰腺癌手术联合血管的切除重建术，能将侵犯血管的恶性肿瘤得到了真正的根治性切除。在肾内科，将大隐静脉移植于尿毒症患者前臂、上臂作袢式移植，为其长期血液透析建立永久性的血管通路。
但据不完全统计，有超过20％的需进行动脉旁路手术的患者无法找到适合的血管、10％的患者更是无血管可用。解决同种异体血管组织的离体长期保存问题成为当前增加血管替代物供应的一项关键技术。利用传统的冷冻保存方法保存血管组织，虽能使得部分血管活性保存下来，但由于冷冻过程中细胞冰晶损伤等因素，使得血管的生物功能降低--内皮细胞功能受损、平滑肌细胞收缩能力明显下降，血管的长期通畅率低，血管保存结果不理想。因此对现有血管保存技术进行提升改进有重要意义。
细胞冻存时细胞内的水分会在降温过程中形成大量冰晶，冰晶的形成会导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤(细胞膜被冰晶刺破)、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等。加入冻存保护剂(如甘油或二甲基亚砜等)，可使细胞质中的水冰点降低，在缓慢降温的过程中，细胞质内的水分可以通过细胞膜透出细胞，减少细胞内冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存时出现的损伤种类及损伤程度。无冰晶冷冻通过增加温度传导的速度和冷冻保护剂的浓度，使细胞内外液由液态转化为类似玻璃状的非晶体化固体状态，形成透明的玻璃状固体，保留细胞内液体正常的分子和离子分布，减少冰晶形成，提高细胞存活。
但传统加入冷冻保护剂的方法及无冰晶冷冻方法(降温，复温方法)还存在不足。高浓度冷冻保护剂会产生极高的毒性，对血管细胞造成不可估量的损害。此外，血管结构从内往外依次为内皮细胞、平滑肌、外膜。内皮细胞可以阻止血液成分和内皮下组织接触，防止血管内凝血系统的激活和血栓的生成，防止炎症细胞浸润、调节平滑肌细胞迁移与增殖，而且内皮细胞的完整性对一氧化氮(NO)的合成具有重要作用，而NO能够有效促进血管舒张，因此内皮细胞的功能非常重要。但在加入、去除冷冻保护剂和冻存、复温的过程中，平滑肌细胞和内皮细胞同样的也可能受到不同程度的损伤。血管平滑肌细胞损伤会造成血管收缩舒张功能大大降低。血管内膜内皮细胞发生损伤、剥落后，会引发血管内膜增厚，平滑肌细胞增殖和迁移至血管内膜下发展为主要细胞，引起管腔狭窄影响远期通畅率等不良后果；同时内皮细胞的损伤会使NO等舒血管物质分泌减少，造成血管挛缩；另外血管内皮细胞受损使得肝素分泌减少，肝素生成较少易导致形成血栓从而影响远期通畅率。因此在血管加入、去除冷冻保护剂和冻存复苏过程中，如何尽可能的减少血管平滑肌细胞和内皮细胞凋亡也具有重要意义。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种用于血管保存的无冰晶冷冻保存液。
本发明的目的之二在于提供一种在冻存前步进式注入无冰晶冷冻保存液、在冻存过程中程序化控温的血管无冰晶冻存方法，用于保存新鲜血管组织。
为实现现有技术的上述目的，本申请采用以下技术方案：
一种血管无冰晶冷冻保存液，包括甘油1.0-6.0mol/L、甲酰胺1.0-7.0mol/L、聚乙烯吡咯烷酮0.1-2.5mol/L和成分X；所述的成分X为A成分、B成分或C成分中的一种或多种；其中，A成分是NO供体，B成分是内皮素抑制剂或内皮素拮抗剂，C成分是抗凋亡剂。
优选的，本发明所述的血管无冰晶冷冻保存液，包括甘油2.0-5.0mol/L、甲酰胺2.5-5.5mol/L、聚乙烯吡咯烷酮0.1-1.0mol/L和成分X；所述的成分X为A成分、B成分或C成分中的一种或多种；其中，A成分是NO供体，B成分是内皮素抑制剂或内皮素拮抗剂，C成分是抗凋亡剂。
在一些实施例中，本发明所述的成分X为A成分、B成分和C成分。
在一些实施例中，A成分优选为0.05-2mg/L的硝酸甘油、0.1-5mg/L的硝酸异山梨酯、0.5-10mg/L的吗多明或0.3-7mg/L的尼可地尔中的一种或多种；进一步优选为0.05-1mg/L的硝酸甘油。发明人发现加入B成分可以改善血管的保存质量。
在一些实施例中，B成分优选为5-50mg/ml的ET-1转化酶抑制剂CGS26303、10-100mg/ml的ETA受体拮抗剂PD155080、50-200mg/ml的ETA受体拮抗剂BQ-123、6-80mg/ml的ETA/ETBA受体拮抗剂RO46-2005的一种或多种；进一步优选为20-40mg/ml的ET-1转化酶抑制剂CGS26303。发明人发现加入B成分可以改善血管的保存效果。
在一些实施例中，C成分优选为5-100μmol/L的Caspase抑制剂Z-VAD,1-50μmol/L的Z-DEVD中的一种或多种；进一步优选为30-50μmol/L的Z-DEVD。发明人发现加入C成分可以改善血管的保存质量。
作为本发明的进一步改进，甘油含量为3.10mol/L。
作为本发明的进一步改进，甲酰胺含量为3.70mol/L。
作为本发明的进一步改进，聚乙烯吡咯烷酮含量为0.5mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述无冰晶冷冻保存液的其他成分为溶剂，进一步优选的，所述的溶剂为Euro-Collin溶液。
本发明还提供一种血管保存方法，利用步进式方式向血管组织中导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液。
在一些实施方式中，本发明导入无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向血管组织中增量加入本发明所述的无冰晶冷冻保存液。
在一些优选的实施方式中，本发明导入无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向血管组织中导入无冰晶冷冻保存液。
在一些实施方式中，本发明所述的血管保存方法，在采用步进式导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。
在一些优选的实施方式中，本发明第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；进一步优选的，为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃。
在一些优选的实施方式中，本发明第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃；进一步优选的，为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。
本发明还提供一种血管复苏方法，所述方法利用步进式方式从血管组织中洗脱本发明所述的无冰晶冷冻保存液。
在一些实施方式中，本发明洗脱无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以2～25min步进逐量，按6～25步将血管无冰晶冷冻保存液置换、洗脱。
在一些优选的实施方式中，本发明洗脱无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min。
在一些实施方式中，本发明所述的血管复苏方法，当复苏时，将冻存样本从储存环境中取出后，以10～50℃/分钟的速率第一次升温至-70℃～-120℃，然后以140～350℃/分钟的速度第二次升温至1～10℃，然后利用步进式方式从血管组织中洗脱本发明所述的无冰晶冷冻保存液。
在本发明的一些实施方式中，本发明第一次升温为以30±0.2℃/分钟的速率升温至-100℃。
在本发明的一些实施方式中，本发明第二次升温为以225±15℃/分钟的速度快速复温至4℃。
本发明还提供一种血管保存和复苏方法，为上述血管保存方法和复苏方法的结合。
本发明还提供本发明所述的无冰晶冷冻保存液的使用方法：保存血管组织时，利用步进式方式向血管组织中导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液；所述步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向血管组织中增量加入本发明所述的无冰晶冷冻保存液。
在一些优选的实施方式中，所述的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向血管组织中导入无冰晶冷冻保存液。
在一些实施方式中，本发明所述的使用方法，在采用步进式导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。
在一些优选的实施方式中，本发明第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；进一步优选的，为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃。
在一些优选的实施方式中，本发明第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃；进一步优选的，为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。
本发明相对于现有技术的优势：
(1)本发明的保存液提高了对血管功能的保存效果，特别是对于最容易受冻存损伤的血管平滑肌细胞和内皮细胞，现有血管冷冻保存技术缺少对其保护，本发明所述的保存液可以对血管平滑肌细胞和内皮细胞进行有效的保护，具有有效保护血管平滑肌细胞和内皮细胞的功能，有利于提升血管移植后长期通畅率。最终检验血管保存后的功效就是移植后的长期通畅率。不管在实验室检查的各项指标怎么样，血管真正展示自有功能的是移植后能不能通畅和能保持多长时间通畅。本发明的保存液提高了血管移植后长期通畅率，是一个其它实验效果所不能比拟的最高指标，极大的保证了血管临床移植的成功率。
(2)冷冻前步进式导入无冰晶冷冻保存液，使保存液均匀分布、充分浸润血管组织内外细胞、结构，降低冰晶对组织细胞结构的破坏；冷冻过程中优化了降温速率和复苏升温速率，可以大幅度减少血管组织在冻存和复苏过程中冰晶的形成，相比现有常规冷冻保存血管技术更有效的保护血管组织空间结构、提高移植成功率和移植后功能维持，进一步提高血管移植后长期通畅率，进一步提高了血管保存效果。
(3)复苏过程逐步降低血管无冰晶冷冻保存液含量，充分降低对血管的毒性作用。
附图说明
图1常规冷冻及无冰晶冷冻的兔颈动脉段冰晶大小，位置显微观察图；
图2新鲜的血管、常规冷冻方法保存血管和无冰晶冻存血管对一组兴奋剂药物(去甲肾上腺素，去氧肾上腺素)的收缩反应对比；
图3新鲜的血管，冷冻保存血管和无冰冻存血管对一组兴奋剂药物(去甲肾上腺素，去氧肾上腺素)的剂量/收缩反应曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。具体的实验方法在效果实验中说明。
实施例1：
1.取3.10mol甘油、3.70mol甲酰胺、0.5mol聚乙烯吡咯烷酮、0.5mg/l硝酸甘油、30mg/l CGS26303、40μmol/l Z-DEVD，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L。
2.取适量步骤1中的溶液，冷却到2-4℃。将冷却后的溶液在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的人血管组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min)。
3.将上一步骤导入冻存液的人血管组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至-135℃，并在此温度下保存至少24h；此后样本可长期保存在-135℃环境中。
4.将待复苏的血管样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃；
5.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min，在30min内置换、洗脱无冰冷冻保存液。
实施例2：
1.取3.10mol甘油、3.70mol甲酰胺、0.5mol聚乙烯吡咯烷酮、0.5mg/l硝酸甘油,混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L。
2.取适量步骤1中的溶液，冷却到2-4℃。将冷却后的溶液在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的人血管组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min)。
3.将上一步骤的人血管组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至-135℃，并在此温度下保存至少24h；此后样本可长期保存在-135℃环境中。
4.将待复苏的血管样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃。
5.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min，在30min内置换、洗脱无冰冷冻保存液。
实施例3：
1.取3.10mol甘油、3.70mol甲酰胺、0.5mol聚乙烯吡咯烷酮、30mg/l CGS26303混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L。
2.取适量步骤1中的溶液，冷却到2-4℃。将冷却后的溶液在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的人血管组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min)。
3.将上一步骤导入冻存液的人血管组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至-135℃，并在此温度下保存至少24h；此后样本可长期保存在-135℃环境中。
4.将待复苏的血管样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃。
5.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min，在30min内置换、洗脱无冰冷冻保存液。
实施例4：
1.取3.10mol甘油、3.70mol甲酰胺、0.5mol聚乙烯吡咯烷酮、40μmol/l Z-DEVD，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L。
2.取适量步骤1中的溶液，冷却到2-4℃。将冷却后的溶液在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的人血管组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min)。
3.将上一步骤导入冻存液的人血管组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至-135℃，并在此温度下保存至少24h；此后样本可长期保存在-135℃环境中。
4.将待复苏的血管样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃；在2-4℃下，在90min内置换、洗脱无冰冷冻保存液。
5.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min，在30min内置换、洗脱无冰冷冻保存液。
对照组1：提供了一种常规冷冻保护剂溶液，以体积百分比计，其中含有1.0MDMSO。
室温下，将此血管冷冻保护剂加入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有1.0MDMSO冷冻的血管平衡1分钟后放入程序降温仪，以-1℃/min的速度降至-90℃，然后再转移至-196℃液氮中长期保存。
对照组2：未经冷冻处理的新鲜血管，血管获取后放在Euro-Collin溶液中，在2-10℃环境中保存不超过12小时。
效果实验：
效果实验1血管功能和血管移植的效果实验
血管在进行了实施例和对照组处理后，开展了血管功能和血管移植的效果实验。血管收缩和舒张功能是检测了血管对不同剂量的收缩和舒张药物的反应，以及血管对这些药物的敏感性。血管功能恢复以血管收缩功能的恢复为主要指标，血管舒张和对药物的敏感性作参考，血管功能的恢复(％)是实施组血管收缩力与对照组2的新鲜血管收缩力的比值。血管移植是采取新西兰兔的颈动脉自体移植，一侧颈动脉经实施例和对照组处理后移植到另一侧相同部位。血管移植后存活率是指血管移植3月后血管通畅性作为指标。血管功能恢复及血管移植后存活率见表1.
表1血管功能恢复及血管移植后存活率
Figure BDA0002387662860000081
效果实验2常规冷冻及无冰晶冷冻在冷冻过程中有无冰晶形成的检测
举2个血管组的例子来说明：这二个组分别为对照组1(传统细胞冻存保护剂(1.0mol DMSO)冷冻保存)和实施例1无冰晶冷冻保存液组。
选体重2kg健康新西兰兔，待移植的异体血管取自健康新西兰兔的颈动脉，向颈动脉灌注实施例1中制备的无冰晶冷冻保存液或对照组1中传统细胞冻存保护剂。分别使用无冰晶冷冻保存液和传统细胞冻存保护剂(1.0mol DMSO)按照实施例1所述方法完成步进式冷冻剂导入后，进行程序降温，达到-90℃下选取无冰晶和常规冷冻的兔动动脉段样本进行切片显微观察，如图1所示，对照组1明显可见分布在血管壁细胞外基质上的大小不一的冰晶区域(B)，图中白色不规则大小的空隙(细箭头)是冰晶占据的时留下的，从最内层的内皮层，到中间的平滑肌层，以致最外面的血管外层都布满了冰晶(细箭头)，使得冷冻血管的结构明显发生了改变，由于外层较疏松冰晶较大较多，血管内皮和肌肉层较紧致冰晶较小较少。但冰晶在各层之间的间隙形成(粗箭头)破坏了血管的整体功能，特别是在内皮下形成(粗箭头)对血管移植后能否保持内皮层的完整性有重要意义，如果内皮不完整就会造成红细胞，血小板堆积，血管堵塞。而实施例1无冰晶冻存血管没有冰晶(A)。使用无冰晶冷冻保存液保存的血管组织完整性比使用传统细胞冻存保护剂保存的血管组织完整性高，使用无冰晶冷冻保存液保存的血管内各细胞、组织形态完好，破损程度低，由此可见，对照组1的血管明显可见分布在血管壁细胞外基质上的大小不一的冰晶区域，使得冷冻血管的结构明显发生了扭曲，而实施例1的无冰晶冻存血管没有冰晶，效果明显得到提高。
效果实验3兔颈动脉功能检测
举3个血管组的例子来说明：这三个组分别为复苏后的传统细胞冻存保护剂冷冻保存的血管(对照组1)、实施例1无冰晶冷冻保存血管(以下简称实施例1)与新鲜血管(对照组2)一同进行力学检测。
向实验用离体血管组织灌流系统内注入Krebs Henseleit Buffer(KHB)溶液1000ml。恒温灌流调整到37℃，张力传感器定标、调零。灌流槽内注入10ml的KHB溶液，不间断的充入5％的O2和CO2。将血管环轻柔的套入与传感相连的两探针之间，调整距离使初始张力为4g，平衡1h，不断的调整探针间的距离使初始张力保持为4g，每15分钟更换槽内KHB溶液一次。依次加入75ul的10％的KCL溶液至终浓度为10-90mmol/L，分别记录每次加药后的最大收缩力。更换KHB溶液两次，在依次加入10ul的去甲肾上腺素或去氧肾上腺素(浓度分别为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)，分别记录各次的最大收缩力。最后最大收缩力持续平稳后加入10ul的10-4mol/L的钙离子载体A23187或10-4mol/L的硝普钠，记录最大舒张后血管张力。
实验结果显示，对照组1(常规冷冻)血管经冷冻处理后，收缩力下降明显，下降至23-26％。实施例1(无冰晶)组血管保留了对照组2(新鲜的)的收缩力反应，具体如图2所示，对照组1(常规冷冻)血管经冷冻处理后，收缩力下降明显，下降至23-26％，而实施例1(无冰晶)血管保留了对照组2血管的收缩力反应；对照组1(常规冷冻)血管与对照组2(新鲜的)的血管比，p<0.0001；#：对照组1(常规冷冻)血管与实施例1(无冰晶)组血管相比，p<0.0001。去甲肾上腺素组：对照组2血管n＝16；实施例1(无冰晶)血管n＝43；对照组1(常规冷冻)血管n＝20；去氧肾上腺素组：对照组2(新鲜的)血管n＝12；实施例1(无冰晶)血管n＝31；对照组1(常规冷冻)血管n＝20。
此外，对照组1血管舒张力下降明显；实施例1组舒张力反应较对照2组弱，但优于对照组1，具体如表2所示，去甲肾上腺素作预收缩，硝普钠(非血管内皮细胞舒张因子，直接作用于血管平滑肌细胞)和钙离子载体A23187(血管内皮细胞舒张因子，通过血管内皮细胞发挥作用)舒张。每个药物分为三组，对照组2血管预收缩和舒张(新鲜预收缩/新鲜舒张)，实施例1血管预收缩和舒张(无冰预收缩/无冰舒张)，对照组1血管预收缩和舒张(冰冻预收缩/冰冻舒张)。硝普钠作用引起的舒张，对照组1血管舒张力显著下降(9％)，实施例1组舒张力反应(35％)大大优于对照组1，与对照组2(37％)相同。钙离子载体A23187刺激引起的舒张，实施例1(37％)和对照组1(28％)都比对照组2(68％)低。说明深低温对通过血管内皮细胞有影响。钙离子载体A23187组：对照组2血管n＝8；实施例1血管n＝33；对照组1血管n＝11；硝普钠组：对照组2血管n＝16；实施例1血管n＝33；对照组1血管n＝11。
表2对照组2，实施例1与对照组1这三组血管的预收缩和舒张力
Figure BDA0002387662860000101
一般从药理学的原理我们把达到最大收缩力一半的药物浓度用pD2来表示，即产生50％最大效应的摩尔浓度的负对数(-log)，pD2值越大说明受体对药物越敏感。对照组2，实施例1与对照组1这三组血管对去甲肾上腺素，去氧肾上腺素的敏感性来更精确地检测血管经过不同方式处理后受损的程度。
如表3所示，对照组2，实施例1与对照组1这三组血管的pD2值表明了这三组血管各自对药物的敏感性。对照组1血管经冷冻处理后，敏感性下降明显，而无冰晶冻存组血管保留了与对照组2血管相同的敏感性。@：对照组1血管与无冰晶的血管比，p<0.01；#：对照组1血管与实施例1血管相比，p<0.05。去甲肾上腺素组：对照组2血管n＝16；实施例1血管n＝39；对照组1血管n＝20.去氧肾上腺素组：对照组2血管n＝12；实施例1血管n＝27；对照组1血管n＝20。
表3对照组2，实施例1与对照组1这三组血管的pD2值
药物 对照组2 实施例1 对照组1
去甲肾上腺素 6.207±0.104 6.082±0.115 5.317±0.312@
去氧肾上腺素 5.720±0.131 5.617±0.130 5.079±0.257<sup>#</sup>
血管的最大收缩与舒张只代表了血管在经过不同的处理保存后能达到的最大极限，但对药物的敏感性反应不出来。比如，对一种药物，是在多少浓度的量上血管才达到了最大反应，换句话说，如果血管受到了损害，可能需要较高的药物浓度才能达到没受损害时，在较低的药物浓度就能达到的效果。对药物的反应敏感性可检验细胞受体功能，平滑肌收缩与舒张灵敏度以及血管整体机能的完好或受损程度。我们将每个药物每次用药的剂量所对应的收缩力除以最大收缩力得到一个百分比，形成一张药物剂量/收缩反应曲线结果如图3所示：对照组2(新鲜的)血管，对照组1血管和实施例1(无冰晶)血管对一组兴奋剂药物(去甲肾上腺素，去氧肾上腺素)的剂量收缩反应曲线。药物剂量从最小剂量10-10摩尔到最大剂量10-4摩尔，相应的收缩力比上最大收缩力得到百分比。从剂量收缩反应曲线可明显看到对照组1(常规冷冻)血管经处理后，曲线明显移向右侧，血管对药物的敏感性下降，需要使用更大的剂量才能达到对照组2(新鲜的)血管和实施例1(无冰晶)血管的收缩力。而实施例1(无冰晶)组血管与对照组2(新鲜的)血管的收缩力反应相近，说明对药物的敏感性没有收到影响。去甲肾上腺素组：对照组2(新鲜的)血管n＝16；实施例1(无冰晶)血管n＝43；对照组1(常规冷冻)血管n＝20.去氧肾上腺素组：对照组2(新鲜的)血管n＝12；实施例1(无冰晶)血管n＝27-39；对照组1(常规冷冻)血管n＝20。
将三组的血管标本使用10％福尔马林固定，制成石蜡切片，苏木素伊红(HE)染色观察血管的病理变化。结果显示：
(1)对照组2：内皮细胞连续连续性好，排列规则有序，可发现极个别的内皮细胞脱落，中层平滑肌细胞核清晰，胶原纤维、弹力纤维结构正常。
(2)对照组1：内皮细胞脱落较严重，内皮细胞排列顺序欠规则，中层平滑肌、胶原纤维、弹力纤维部分断裂。
(3)实施例1组：内皮细胞轻微脱落，内皮层与内皮下层可见少量空隙，内皮下层、内弹力膜及平滑肌细胞结构尚好。
效果实验4自体血管移植兔模型检测血管移植后血管通畅性
举血管移植3个组的例子来说明：这三个组分别为对照组2、对照组1(传统细胞冻存保护剂(1.0mol DMSO)冷冻保存)、实施例1的无冰晶冷冻保存液组，每组用兔颈总动动脉中段作为自体动脉的吻合部位各完成9-12例手术。血管通畅率(表3)在术后2周、4周用超声多普勒探仪探测三组移植血管血流通畅情况。在术后12周，标本10％福尔马林固定移植血管。固定的血管标本制成石蜡切片，苏木素伊红(HE)染色观察移植血管的病理变化，观察3月后移植动脉内膜、中层和外膜的改变及单核/淋巴细胞在血管壁浸润情况。
表4移植对照组2血管、对照组1血管和实施例1血管移植2周至3月后血管通畅性对比表
Figure BDA0002387662860000121
结果如表4所示，血管移植模型显示使用无冰冷冻保存液冷冻保存的血管组织移植后通畅性接近新鲜血管组织，说明本发明通过添加A、B、C成分可以增加无冰冻存血管的通畅性。
术后3月各组移植血管观察，各治疗组均有不同程度的管腔增生、炎性反应。内膜增生的主要组织成分是增殖的血管平滑肌细胞和基质。
对照组2：动脉管壁同移植前比略微增厚，管腔平整几何形状基本规则，管腔狭窄、管壁增生程度最轻，血管平滑肌增殖及基质沉积少。血管组织移植后通畅性90％。
对照组1：血管管壁增厚显著，血管内膜增生明显，平滑肌细胞大量增殖，基质沉积，管腔不规则狭窄，可见不同程度内皮细胞坏死。血管组织移植后通畅性33％。
实施例1：动脉管壁同移植前比略增厚，管腔平整几何形状规则，管腔狭窄、管壁增生程度与前两组相比较轻，血管平滑肌增殖及基质沉积较少。内皮下层、内弹力膜及平滑肌细胞结构完好。血管组织移植后通畅性达到了84％，接近对照组2的90％血管通畅。

Claims (17)

1.一种血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，包括甘油1.0-6.0mol/L、甲酰胺1.0-7.0mol/L、聚乙烯吡咯烷酮0.1-2.5mol/L和成分X；所述的成分X为A成分、B成分或C成分中的一种或多种；其中，A成分是NO供体，B成分是内皮素抑制剂或内皮素拮抗剂，C成分是抗凋亡剂；A成分为0.05-2mg/L的硝酸甘油、0.1-5mg/L的硝酸异山梨酯、0.5-10mg/L的吗多明或0.3-7mg/L的尼可地尔中的一种或多种；B成分为5-50mg/ml的ET-1转化酶抑制剂CGS26303、10-100mg/ml的ETA受体拮抗剂PD155080、50-200mg/ml的ETA受体拮抗剂BQ-123、6-80mg/ml的ETA/ETBA受体拮抗剂RO46-2005的一种或多种；C成分为5-100μmol/L的Caspase抑制剂Z-VAD,1-50μmol/L的Z-DEVD中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，包括甘油2.0-5.0mol/L、甲酰胺2.5-5.5mol/L、聚乙烯吡咯烷酮0.1-1.0mol/L和成分X；所述的成分X为A成分、B成分或C成分中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，成分X为A成分、B成分和C成分。
4.根据权利要求1所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，A成分为0.05-1mg/L的硝酸甘油；B成分为20-40mg/ml的ET-1转化酶抑制剂CGS26303；C成分为30-50μmol/L的Z-DEVD。
5.根据权利要求1所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，甘油含量为3.10mol/L；甲酰胺含量为3.70mol/L；聚乙烯吡咯烷酮含量为0.5mol/L。
6.根据权利要求5所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，无冰晶冷冻保存液的其他成分为溶剂。
7.根据权利要求6所述的血管无冰晶冷冻保存液，其特征在于，所述的溶剂为Euro-Collin溶液。
8.一种血管保存方法，其特征在于，利用步进式方式向血管组织中导入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液；步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向血管组织中增量加入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液；在采用步进式导入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。
9.根据权利要求8所述的血管保存方法，其特征在于，步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向血管组织中导入无冰晶冷冻保存液。
10.根据权利要求8所述的血管保存方法，其特征在于，第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃。
11.根据权利要求10所述的血管保存方法，其特征在于，第一次降温为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃；第二次降温速率为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。
12.一种血管复苏方法，其特征在于，所述方法利用步进式方式从血管组织中洗脱权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液；步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以2～25min步进逐量，按6～25步将血管无冰晶冷冻保存液置换、洗脱；当复苏时，将冻存样本从储存环境中取出后，以10～50℃/分钟的速率第一次升温至-70℃～-120℃，然后以140～350℃/分钟的速度第二次升温至1～10℃，然后利用步进式方式从血管组织中洗脱权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液。
13.根据权利要求12所述的血管复苏方法，其特征在于，进式方式具体为在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向血管组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min。
14.根据权利要求12所述的血管复苏方法，其特征在于，第一次升温为以30±0.2℃/分钟的速率升温至-100℃；第二次升温为以225±15℃/分钟的速度快速复温至4℃。
15.一种血管保存和复苏方法，为权利要求8所述的血管保存方法和权利要求12所述的复苏方法的结合。
16.权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液的使用方法，其特征在于，保存血管组织时，利用步进式方式向血管组织中导入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液；所述步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向血管组织中增量加入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液；在采用步进式导入权利要求1所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。
17.根据权利要求16所述的无冰晶冷冻保存液的使用方法，其特征在于，所述的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向血管组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向血管组织中导入无冰晶冷冻保存液。
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