CN111212899A - 灌注生物反应器及相关使用方法 - Google Patents

Abstract

一种控制生物反应器系统的方法包括：提供生物反应器中的细胞培养物，其中反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(POI)，以拉曼(RAMAN)测量反应器内培养的工艺参数(PPs)，其中该工艺参数选自由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群组，测量含细胞培养物的生物反应器预定重量，使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基，使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞，及使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中。

Description

灌注生物反应器及相关使用方法

【技术领域】

相关申请案之交互参照

本专利申请案是于35 U.S.C.§119之下要求2017年10月16日申请的美国临时专利申请案号62/572,918U.S之利益，其全文以引用的方式并入本文中。

本公开涉及灌注生物反应器及相关使用方法。

【先前技术】

生物反应器可就制造生物性产物，例如蛋白之目的，用于维持细胞培养。在一馈料批式反应器中，在培养期间将一或多种营养素给料至生物反应中，而生物产物留在生物反应器直到该批次结束。灌注生物反应器应付某些与馈料批式相关的效能挑战，并在1990年后期开始普及。然而，最新技术的灌注生物反应器遭逢可用的控制策略数目有限、数据空缺和费用高之苦。

例如，当在应付泵漂移和程序变异性时，灌注反应器的控制解决方案试图校正输入和输出给料泵的体积流量。然而，由于任二个特定泵间的固有差别(例如制造差异)和不能达到紧密控制，失败的生产运作可能导致填料过满或生物器排空。现有的控制解决方案亦缺乏测量其他参数，例如氨、葡萄糖和蛋白属性之能力。本公开之实施例解决一或多个现有灌注生物反应器之限制和缺点。

【发明内容】

本公开之实施例，除了其他事项外，是关于一种控制生物反应器和生物反应器系统之方法，其可用于控制蛋白生产之细胞培养程序。文中所揭示的各实施例可包括一或多个与任何其他实施例有关之文中所述的特点。

本公开是关于一种控制生物反应器系统之方法，其包括提供一生物反应器中的细胞培养物；藉由拉曼探针(RAMAN probe)测量细胞反应器内之细胞培养物的一或多项工艺参数；使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基；使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞；使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中；及以拉曼探针测量为基准，改变一或多项第一特定比率、第二特定比率或第三特定比率。

本公开一实施例是关于一种控制生物反应器系统之方法，其包括：提供一生物反应器中的细胞培养物，其中生物反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(POI)，以拉曼测量生物反应器内细胞培养物的工艺参数(PP)，其中该工艺参数是由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群中选出，测量含细胞培养内容物的生物反应器重量，使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基，使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞，及使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中，且其中该输入和输出导管以拉曼探针测量值及生物反应器的重量测量值为基准加以调整用以维持(i)一或多项工艺参数在预定的范围内，(ii)含细胞培养物之生物反应器重量在预定的范围内，及(iii)输入导管的第三特定比率以及各输出导管的第一和第二特定比率在各自的预定范围内。

在某些实施例中，以拉曼测量生物反应器内培养的一或多项工艺参数以规律的间隔进行，例如至少每小时一次。在其他的实施例中，该方法配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(mL)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时至少约30天。在一实施例中，此生物反应器具有至少2L，至少3L，至少10L，至少35L，或至少50L，或更高的容积，且该方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的生物反应器重量之0.1百分比。例如此生物反应器具有至少约10L之容积，而该方法配置为将生物反应器和细胞培养物之重量维持在以最初的生物反应器和细胞培养物内容物重量为基准所测定的重量范围内，例如在约20±2g范围内。在某些实施例中，当工艺参数偏离各自所欲范围内的设定值时，则控制一或多项移出无细胞培养物基，移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者及然后调整生物反应器，用以降低偏差。每天经由第一输出导管移出至少二个生物反应器体积的用过培养基。每天经由第一输出导管移出至高三个生物反应器体积的用过培养基。工艺参数包括细胞培养物的温度和细胞培养物的pH，且温度维持在约30至40℃，约32至约38℃或34至约38℃，而pH维持从在6.50至约7.50，从约6.60至约7.40，从约6.70至约7.40，从约6.80至约7.30，从约6.90至约7.20，从约7.00至约7.10，约6.50，约6.55，约6.60，约6.65，约6.70，约6.75，约6.80，约6.85，约6.90，约6.95，约7.00，约7.05，约7.10，约7.15，约7.20，约7.25，约7.30，约7.35，约7.40，约7.45，或约7.50。工艺参数包括细胞单位生产率，且该方法配置为将细胞培养物内的细胞维持在至少约15-60pg/细胞/天，约15-25pg/细胞/天，至少约17-23pg/细胞/天，或至少约19-21pg/细胞/天的细胞单位生产率历时至少25-37天。工艺参数包括葡萄糖浓度，且该方法配置为将葡萄糖浓度维持在从约5mM至约85mM，或从约0.5g/L至约15.5g/L，从约1g/L至约15.5g/L，从约0.5g/L至约8g/L，从约2g/L至约6g/L，或从约3g/L至约5g/L。工艺参数包括乳酸浓度，且该方法配置为将乳酸浓度维持在低于约60mM，或低于约6g/L，低于约5g/L，低于约4g/L，低于约3g/L，低于约2g/L，或低于约1g/L。工艺参数包括氨浓度，且该方法配置为将氨浓度维持在低于约15mM，低于约12mM，低于约10mM，低于约9mM，低于约8mM，低于约7mM，低于约6mM。各移出无细胞用过的培养基、移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者藉由各自的泵来控制。此生物反应器包括一配置用来保留细胞及让液体通过的过滤器。

在另外的实施例中，本公开是关于控制生物反应器系统之方法，其包括提供一生物反应器中的细胞培养物；以拉曼探针测量一或多个生物反应器内细胞培养物的工艺参数(PP)；及以拉曼探针的测量值为基准，调整一或多项生物反应器的输入和输出。

根据本公开之方法以包括下列步骤加以说明：提供一生物反应器中的细胞培养物(302)，其中生物反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(POI)，以拉曼测量生物反应器内培养的工艺参数(304)，其中该工艺参数是由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群中选出，测量含细胞培养物的生物反应器预定重量(306)，使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞用过的培养基(308)，使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞(310)，及使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中，且其中该输入和输出导管以拉曼探针测量值及生物反应器的重量测量值为基准加以调整以维持(i)一或多项工艺参数在预定的范围内，(ii)含细胞培养物之生物反应器重量在预定的范围内，及(iii)输入导管的第三特定比率以及各输出导管的第一和第二特定比率在其各自的预定范围内(312)。

又在另外方面，本公开关于一生物反应器系统，其包括具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；联接此罐之过滤器；连接罐之拉曼探针；与至少一泵和拉曼探针连接之控制器，此控制器配置为以拉曼探针的输入值为基准，控制该至少一泵。

至少一输出导管包括用来连接第二泵之第一输出导管，而该第二泵配置用来控制从罐移出液体，以及用于连接第三泵的第二输出导管，而该第三泵配置用来控制从罐移出细胞。过滤器配置用来将细胞保留在罐内并让液体通过过滤器。拉曼探针配置在罐内。控制器与第一泵、第二泵和第三泵连接。生物反应器包括配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；其中控制器配置来接收秤的重量数据。此控制器配置来比较重量设定点之罐重量，及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出。控制器配置用来接收来自拉曼探针之光谱数据；以接收的光谱数据为基准，测定细胞培养物的参数；将测定出的参数与设定点的参数相比较；及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出。调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出降低测出的参数和设定点参数之间的偏差，或接收的重量和设定点重量之间的偏差。此方法配置用来将细胞培养物以稳定状态维持在至少每毫升3千万个细胞之平均活细胞浓度历时30天。此罐具有至少10L的体积，且此方法配置为将含细胞培养物的罐之重量维持在20g范围内。此罐具有至少10L的体积，且此方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比。控制器配置用来以接收的光谱数据为基准，测定多个生物反应器培养的参数；将各多个参数与各多个参数的各自设定点比较；及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出，用以降低测定参数和各自设定值之间的偏差。多个参数包括温度、pH、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。过滤器配置用来保留细胞并让液体通过。生物反应器包括秤，其中该罐和过滤器置于秤上。生物反应器包括秤，其中该罐置于秤上。生物反应器包括秤，其中该罐与该秤实体接触。

一生物反应器培养系统，其包括：具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；与罐接触之过滤器；连接罐之拉曼探针；与罐接触之秤；及联接至少一泵、秤和RAMAN探针之控制器。在某些实施例中，过滤器和罐与秤接触。在另外的实施例中，过滤器包括网类物质。在某些实施例中，过滤器包括具有范围从0.2μM至30μM之孔洞大小的网子。

又在另外的实施例中，本公开关于一生物反应器系统，其包括：具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；联接罐之过滤器；和罐接触之秤；联接罐之拉曼探针；及联接该至少一泵、秤和拉曼探针之控制器，而该控制器配置为以拉曼探针之输入和秤的输入为基准，控制该至少一泵。

在另外的实施例中，揭示一生物反应器培养系统。此生物反应器培养系统包括：具有供连接第一泵之输入导管、供连接第二泵之第一输出导管，以及供连接第三泵之第二输出导管的罐，而该第一泵配置用来控制液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；联接罐之过滤器，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过过滤器；配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；配置在罐内的拉曼探针。此实施例包括联接第一泵、第二泵、第三泵、秤和拉曼探针之控制器，其中控制器配置用来接收秤的重量数据，将罐的重量与设定点的重量相比较，接收来自拉曼探针的光谱数据，以接收的光谱为基准测定细胞培养物的参数，将测定地参数与设定点的参数相比，并以该比较为基准，调整一或多项第一泵、第二泵和第三泵的流通量。

调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量降低所测之参数和设定点参数之间的偏差，或接收重量和设定点重量之间的偏差。此控制配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(mL)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时约30天。此罐具有至少3L的体积，且此控制器配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在20g范围内。此罐具有至少3L的体积，且此控制器配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比。此控制器配置用来以接收的光谱数据为基准，测定多个生物反应器培养的参数；将各多个参数与各多个参数的各自设定点比较，及以该比较为基准，调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量，用以降低测定参数和各自设定值之间的偏差。多个参数包括温度、pH、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。此生物反应器系统包括一过滤器配置用来保留细胞并让液体通过。罐和过滤器置于秤上。该罐置于秤上。

在特定的实施例中，根据本公开之生物反应器培养系统是以包括下列组件来说明：具有一供连接第一泵(30)之输入导管、一供连接第二泵(40)之第一输出导管，以及一供连接第三泵之第三输出导管的罐(10)，而该第一泵配置用来控制液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；一联接、连接罐或与罐液体连通之过滤器(100)，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过过滤器；一配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤(110)；一配置在罐内的拉曼探针(18)；及一联接第一泵(30)、第二泵(40)、第三泵(50)、秤(110)和拉曼探针(18)之控制器(200)。

在此生物反应器培养系统中，控制器(200)配置为：接收秤(110)的重量数据；比较罐(10)重量与设定点的重量；接收拉曼探针(18)的光谱数据；以所接收的光谱数据为基准，测定细胞培养物参数；比较所测定的参数和设定点的参数；及以该比较为基准，调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量。

【附图简单说明】

并入及构成本说明书之一部份的附图、说明的各种实例和描述共同用于解释所揭示的实例和实施例之原理。

本公开之各方面可结合附图所说明之实施例来施行。这些图显示本公开之不同的方面且，在适当情况下，说明如结构、组份、物质及/或组件之标号经同样标示。请了解，结构、组份及/或组件的各种组合，特别指出的除外，涵盖及在本公开之范围内。

再者，文中有许多描述和说明的实施例。本公开并非限制于任何单一方面及其实施例，亦非限制于此等方面及/或实施例的任何组合及/或排列。再者，本公开的各方面及/或其实施例，可单独或与一或多个本公开之其他方面及/或其实施例组合应用。为了简洁起见，文中并未各自论述及/或说明特定的排列和组合。请注意，描述为“例示的”之文中所述的实施例或施行不应理解为较佳的或优于，例如，其他实施例或施行，而是希望反应或指出该(等)实施例为“例示的”实施例。

图1为根据本公开之实例，生物反应器系统之示意图。

图2为图1之生物反应器系统的例示控制器示意图，及其各自输入和输出。

图3为一根据本公开之例示方法的流程图。

图4为比较一批第37天时灌注生物反应器中所测的活细胞浓度与一批第6天时馈料批式生物反应器中活细胞浓度之图示。

图5为显示有关图4所描述之灌注生物反应器和馈料批式生物反应器间随时间变化的正常化单位细胞生产率之图。

图6为显示未控制活细胞浓度和葡萄糖之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

图7为显示图6中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

图8为显示图6中所述之灌注生物反应器中随时间变化的细胞存活率之图。

图9为显示控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

图10为显示图9中所述之灌注生物反应器中稳定状态的细胞存活率之图。

图11为显示图9中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

图12为显示图9中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

图13为比较灌注生物反应器和馈料批式生物反应器之活细胞浓度之图。

图14为比较图13中所述之生物反应器中达到的正常化蛋白生产(效价)之图。

图15为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器随时间变化的活细胞浓度之图。

图16为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的细胞存活率之图。

图17为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

图18为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

图19为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

图20为显示图19中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

图21为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

再次，文中有许多描述和说明的实施例。本公开并非限制于任何单一方面及其实施例，亦非限制于此等方面及/或实施例的任何组合及/或排列。本公开的各方面及/或其实施例，可单独或与一或多个本公开之其他方面及/或其实施例组合应用。为了简洁起见，文中并未各自论述许多的该等排列和组合。

请注意，为了简单和清楚说明，特定的附图方面描绘各种实施例之一般结构及/或建构方式。熟知的特征及技术之说明和详情可能省略以避免不必要掩盖其他特征。附图中的组件并不一定按照比例；某些特征之尺寸相对于其他组件可能夸大，用以增进对示例实施例的了解。例如，本项技术之一般技术者应了解，剖视图并非按照比例且不应视为代表不同组件间的比例关系。剖视图提供用来帮助说明所述组合体之各种组件，及显示彼此的相对位置。

【具体实施方式】

现在可详细参照本公开之实例，其以伴随的附图加以说明。当可能时，相同的附图标记将可用于全部的附图，用来指出相同或类似的部件。在下列论述中，相关术语，例如“约”、“实质上”、“大约”等是用来指所述数值之可能的±10％变化。再者，在权利要求中，数值、限制及/或范围是指数值、限制及/或范围±10％。

术语“导管”指渠道、管道、接头、通道，经由该管可让液体通过。在一实例中，导管可包括Watson-Marlow公司的Bioprene热塑管。

“批式培养”或“批次模式”是指一充满细胞之单位(例如培养容器)及从未换过的最初细胞培养基之工作容积。在此一批式培养中，用于细胞培养的所有组份是在培养程序开始时供应至培养容器中。此培养可进行直到营养素耗尽或废料产物达到有毒之程度，触发细胞凋亡。

“馈料批式细胞培养”或“馈料批式培养”指一批细胞培养，其中动物细胞和培养基是在最初供应至培养容器中，并在培养终了前有或无周期性细胞及/或产物收获下，于培养期间以连续或离散单次添加供给另外的培养营养素至培养中。馈料批式细胞培养包括“半连续馈料批式细胞培养”，其中周期性移出整个细胞培养物(可包括细胞和培养基)并置换新鲜的培养基。馈料批式培养与简单“批式培养”之差别为在培养期间添加(或移出)组份至容器中。馈料批式培养与灌注培养之进一步区别为培养基在馈料批件作业期间并未交换，而在灌注培养中，所有或某些细胞藉由使用过滤器或细胞滞留装置保留在培养中，且培养基连续或间歇性供给，而抑制生长的副产物被持续地或周期性从培养容器中移出。在一馈料批式作业中，其有别于灌注作业，该培养持续直到决定最大或另外决定的工作容积及/或达到蛋白生产，然后收取馈料批式培养产物。

亦考虑将灌注培养作为一种生产感兴趣蛋白之方法用于本公开之方法中。用于生产感兴趣蛋白或抗体之灌注细胞培养法已为本项技术之一般技术者所知。

术语“细胞”包括适合表现重组核酸序列之任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物之细胞。真核细胞包括(但不限于)酵母菌和所有哺乳动物细胞(人类和非人类)，以及细胞融合，例如杂交瘤和四源杂交瘤。在特定的实施例中，此细胞为人类、猴子、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他的实施例中，此细胞由下列细胞中选出：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、淋巴细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞和衍生自前述细胞之细胞株。在某些实施例中，此细胞包括一或多个病毒基因，例如表现病毒基因的视网膜细胞(例如PER.

细胞)。在某些实施例中，此细胞为CHO细胞。在其他的实施例中，此细胞为CHOK1细胞。

“细胞株”指衍生自特定是经由细胞之连续继代培养或次培养的细胞。术语“细胞”可与“细胞群族”交换使用。

有鉴于目前新进技术给料策略，CHO细胞已达到例如大于10×10⁶个细胞/mL的细胞数(大约1周后)及例如>2g/L人类IgG的效价(在大约2周后收取)，CHO细胞馈料批式培养之典型的工业价值数目。参见Kim,B J,et al.,Biotechnol Bioeng.2012January；109(1):137-45。甚至已有报告提出从已完整确立为重要工业哺乳动细胞株之CHO细胞制造大于10g/L的抗体。参见Omasa等人,Current Pharmaceutical Biotechnology,2010,11:233-240。

术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长哺乳动物细胞之营养素溶液，其典型地被提供必须营养素用以增进细胞生长，例如碳水化合物能量来源、必须胺基酸、微量元素、维生素等。细胞培养基可含有萃取物，例如血清或蛋白胨(水解物)，其供应支持细胞生长的原料。培养基可含有酵母菌-衍生性或大豆萃取物取代动物衍生性萃取物。化学性界定培养基指其中已知晓所有化学组份之细胞培养基。化学性界定培养基整体整体并无动物衍生性组份，例如血清或动物衍生性蛋白胨。培养基亦可为无蛋白质的。“新鲜培养基”为尚未导入到细胞培养中及/或尚未被细胞培养之细胞所利用之培养基。新鲜培养基一般可能包括高营养素含量和极少至无废弃产物。“用过的培养基”可指已被细胞培养中的细胞所使用之培养基，且一般可能包括比新鲜培养基中存在的量更低的营养素含量(因营养素已被细胞培养中的细胞所利用)及更高的废弃物含量。

在一灌注生物培养器中，培养基可连续从细胞培养物中移出并以新鲜的培养基置换。在消除废弃产物时固定的添加新鲜培养可提供细胞培养中的细胞所需要的营养素，达到高细胞浓度。不同于批式或馈料批式培养期间持续改变条件，此灌注法提供了达到及维持稳态的培养之工具。典型地，大约每天交换1个培养容积且在灌注法中所达到细胞浓度典型地为批式或馈料批式培养高峰时所达到的二至十倍以上。置换营养素及/或移出凋亡细胞能让细胞存活率长期维持在稳定状态。在一稳态的生产中，此批次早期所生产的蛋白(或其他感兴趣组份)质量属性可能实质上与此批次晚期所生产的蛋白(或其他感兴趣组份)质量属性相同。可以各种后转译修饰，例如糖型、带电异质性、聚集作用和各种纯度测量值为基准来评估蛋白。在馈料批式反应器中无法达到实质相同的蛋白质量，因为在该等反应器中细胞培养条件不断地改变。

生物反应器中的培养条件能使细胞培养在提供一致性蛋白物质的目标下产生感兴趣蛋白(POI)。在某些细胞培养的培养条件下，可从至少下列组成之群中选择一或多个工艺参数：营养素浓度，例如葡萄糖浓度、谷氨酸浓度和谷氨酰胺浓度；氨浓度；乳酸浓度；总细胞密度；活细胞密度；和蛋白属性。

生物反应器法得以设定对各种组成份之流量的控制，例如进出生物反应器之培养基(包括，例如营养素)、蛋白和细胞。生物反应器法包括使用第一输出导管以第一特定流量从细胞培养移出无细胞之用过的培养基。此方法包括使用第二输出导管以第二特定流量从细胞培养物移出细胞。此方法包括使用输入导管以第三特定流量将新鲜的培养基或营养素或二者导入细胞培养物中。一或多个第一、第二和第三特定流量以生物反应器的拉曼探针测量值为基准来调整。一或多个第一、第二和第三特定流量以生物反应器的拉曼探针测量值为基准来调整，用以将一或多项工艺参数维持在预定的范围内。第一、第二和第三特定流量以生物反应器的RAMAN探针测量值为基准来调整，用以将输入导管的第三特定流量和各输出导管的第一及第二特定流量维持在各自的预定范围内。

各移出的无细胞之用过培养基、移出的细胞和导入的新鲜培养基或营养素或二者，通过各自的泵来控制。生物反应器包括配置用来保留细胞并让液体通过的过滤器。

本公开之方法和系统，除了其他理由外，包括控制生物反应器的重量及其内容物之方法，应用一致的生产程序。此方法包括测量包含细胞培养内容物之生物反应器的重量。在另一实施例中，此方法是应用结合控制如上述连接上文导管之流量，控制生物反应器的重量。此方法包括测量含细胞培养内容物之生物反应器重量，其中一或多个第一、第二和第三特定流量以所测量的重量为基准来调整。第一、第二和第三特定流量以所测量的重量为基准来调整，用以将输入导管的第三特定流量和各输出导管的第一及第二特定流量维持在各自的预定范围内。第一、第二和第三特定流量进行调整，用以将细胞培养和生物反应器的重量维持在预定范围内。藉由拉曼探针测量生物反应器内的细胞培养之工艺参数(PP)每小时至少进行一次。此方法配置用来将细胞培养以稳定状态维持在每毫升(mL)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时至少约30天。此生物反应器具有至少10L的体积，且此方法配置为将生物反应器和细胞培养物的重量维持在20g范围内。此生物反应器具有至少10L的体积，且此方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的生物反应器重量之0.1百分比。当工艺参数偏离各自所欲范围内的设定值时，调整一或多个移出的无细胞之用过培养基、移出的细胞和导入的新鲜培养基或营养素或二者，以降低此偏离。例如，每天至少经由第一输出导管移出二个生物反应器容积的用过培养基，或每天至高经由第一输出导管移出三个生物反应器容积的用过培养基。

一或多项工艺参数亦包括细胞培养物的温度和细胞培养物的pH，而温度维持在35至36℃之间，pH维持在6.85至7.15之间。在其他的实施例中，pH维持在约6.50至约7.50之间，从约6.60至约7.40，从约6.70至约7.40，从约6.80至约7.30，从约6.90至约7.20，从约7.00至约7.10，约6.50，约6.55，约6.60，约6.65，约6.70，约6.75，约6.80，约6.85，约6.90，约6.95，约7.00，约7.05，约7.10，约7.15，约7.20，约7.25，约7.30，约7.35，约7.40，约7.45或约7.50。

一或多项工艺参数包括细胞单位生产率，且该方法配置为将细胞培养物内的细胞维持在至少15-25pg/细胞/天之细胞单位生产率历时至少25-37天。

一或多项工艺参数包括葡萄糖浓度，且该方法配置用来将葡萄糖浓度维持在约5mM至约85mM之间，或1g/L至约15.5g/L。

一或多项工艺参数包括乳酸浓度，且该方法配置用来将乳酸浓度维持在低于约60mM，或低于约6g/L。

一或多项工艺参数包括氨浓度，且该方法配置用来将氨浓度维持在低于约15mM。

术语“稳定状态”是指将细胞培养物中的营养素浓度、工艺参数或质量属性维持在不变、恒定或稳定程度。请了解，不变、恒定或稳定程度是指在预定设定点或预定设定范围内之程度。因此，设定点及稳定状态程度在操作者操作之生产细胞培养期间内可能会改变。设定点或稳定状态程度亦可包括数值的设定范围或阀值。

术语“预定”可指量或设定点，其数值为固定的或由使用者或控制者根据一或多个算法手动计算。

在整个制造特定治疗蛋白产品之制程中，须控制的产品属性或蛋白质量属性可以其潜在的质量影响，特别是临床影响为基础来鉴别。相关的蛋白质量属性可能影响纯度、安全性及/或效用。质量属性是指所生产的药物产品之物理、化学、生物或微生物性质或特征，其应在适当的限制、范围或分布内，以确保所欲的产品(蛋白)质量。参见，例如International Council for Harmonization(ICH)Q8(R2)Pharmaceutical Development(ICH,August 2009)。蛋白产品的质量属性可包括(但不限于)高分子量种类、聚集物、带电变体、外观、颜色、pH、效力、后转译修饰(多糖含量和分布)、导电性、等电点、电荷异质性、双硫键重组、游离半胱胺酸、宿主细胞蛋白，且可视为对产品质量具有高影响之属性。就制造作业期间操作可靠度和一致性，在生产培养期间特定的工艺参数可控制在适当的限制、范围或分布内。工艺参数可包括最初的细胞密度、最初的细胞存活率、最终的细胞存活率、总蛋白(效价)、活细胞数(VCC)、营养素浓度(葡萄糖、磷酸盐、胺基酸等)、氨、pH、乳酸和更多。在制造作业期间对特定工艺参数敏感的药物产品可能造成蛋白属性改变超过或低于该特定属性之阀值，且因此需要适当的控制。因此，工艺参数亦包括其变异性可能对任何上列之质量属性具有大于或等于定义阀值之影响的工艺参数，且因此应加以监测或控制以确保该制程生产出所欲质量之物质。

术语“细胞单位生产率(cell specific productivity)”、“细胞单位比率(cellspecific rate)”及其类似词语是指单位，例如每个细胞或每个计量单位之细胞质量或体积之产物表现率。细胞单位生产率以，例如每个细胞每天所生产的蛋白克数来测量。

生物反应器系统1可包括生物反应槽10、馈料储槽28、给料泵、排出泵和收获泵。生物反应器系统1亦可包括一ATF泵70、排放槽80和收获槽90。泵30、40、50和70可操作上联接一控制器200。在某些实施例中，然而，ATF泵70可联接和由分开的控制器102控制。

生物反应槽10可为大小符合许多操作规模的缸盆、桶、器皿、烧瓶或其他适合的容器。例如，生物反应槽10的容积可从约1L至约20,000L，从约5L至约10,000L，从约10L至约1,000L，从约20L至约100L，约50L，至少约1L，至少约10L，至少约50L，至少约100L，至少约200L，至少约500L，至少约1,000L，至少约10,000L，低于约20,000L，低于约10,000L，低于约1,000L，低于约500L，低于约200L，或低于约100L。在其他的实施例中，生物反应槽10具有至少2L，至少3L，至少10L，至少35L，或至少50L或更大的容积。生物反应槽10可为金属(例如钢或不锈钢)、金属合金、玻璃及/或聚合物(例如抛弃式、单次使用生物反应器)所制造。

泵30、40和50可包括任何适合的泵，例如蠕动泵、隔膜泵、活塞泵、机动泵或类似泵。在一实例中，泵30、40和50彼此实质上可为相同的。在另外的实例中，一或多个泵30、40和50相互可为不同的。又在另外的实例中，泵70可与任一泵30、40和50为相同。馈料储槽28可包括任何适合用于生物反应槽10之营养素馈料来源，且营养素馈料可经由给料泵30经由适合的导管导向生物反应槽10。营养素馈料(生长培养基)可包括碳源(例如葡萄糖)、水、盐、胺基酸来源及/或其他营养素。

罩盖12可覆盖生物反应槽10的顶端，及各种组件和仪器可通过罩盖12延伸至生物反应槽10的内部。例如，充气器14、搅拌器16、RAMAN探针18、导管20和导管22可延伸通过罩盖12。然而，希望任何或所有的充气器14、搅拌器16、RAMAN探针18、导管20和导管22可以任何其他适合的方式操作上联接生物反应槽10，例如经由生物反应槽10的侧面。

充气器14可为喷洒器，配置用来提供氧气及/或其他气体给生物反应罐10内的细胞培养物。充气器14可与氧气或其他气体来源联接，且可将气体导入细胞培养物中，使得气体通入细胞培养物中，藉此使细胞培养物充气。在某些实例中，微型充气器可与钻孔管式充气器组合使用。

搅拌器16可为配置用来混合生物反应槽10内的细胞培养物之任何适合的搅拌器。搅拌器16可为藉由机器及/或磁力机制之顶部驱动或底部驱动。在某些情况下底部驱动的搅拌器为所希望的，因为其可空出罩盖12的上方空间放置感测仪器，例如温度、pH、溶氧、泡沫、二氧化碳和其他传感器，以及用于酸、碱、新鲜培养基入口和出口。搅拌器16可包括辐射式搅拌器、轴流式搅拌器、拉西顿式搅拌器、折叶式搅拌器、螺桨搅拌器或其类似物。

拉曼探针18可为，例如，不锈钢箱中的光纤拉曼探针，并具有一透明，例如蓝宝石或玻璃窗口。拉曼探针18可配置用于进行细胞培养物2之拉曼取样。拉曼探针18可配置用来放射单色光源(例如至少于785nm或另外适合的波长)于细胞培养物2上并从细胞培养物2侦测发散光。

拉曼光谱为一种振动光谱形式，其提供有关分子振动的信息，可藉由插入一原位拉曼探针供样本辨识及定量来使用。在某些实施例中，监测程序变量是使用原位拉曼光谱来进行。原位拉曼分析为一种在其原来的位置分析样本的方法，在拉曼光谱仪中不需要提取一部分的样本来进行分析。原位拉曼分析为有利的，其中拉曼光谱分析仪为非侵入性，其降低了污染的风险，且为非破坏性对细胞培养物活性或蛋白质量无影响。原位拉曼分析可提供细胞培养物中一或多项程序变量之实时评估。拉曼探针的制造商包括，但不限于tech5usa、Anton Paar、InPhotonics、Kaiser Optical Systems,Inc.及FiberTechOptica。

生物反应槽10可联接在其中具有中空纤维过滤器之过滤系统100。中空过滤膜(例如聚砜)可包括一或多个具有从约0.3mm至约6.0mm，从约0.5mm至约3.0mm，从约0.5mm至约2.0mm，大于约0.3mm，大于约0.5mm，低于约6.0mm，低于约3.0mm，或低于约2.0mm之内径的管状膜。膜中的网状物质可经选择使得网中的孔洞大小接近细胞培养物2中的细胞径长，帮助确实保留高量细胞同时让细胞碎片和用过的培养基通过该过滤器。在一实例中，虽然亦可涵盖其他适合的范围和数值，但网孔大小从约0.2μm至约30μm。蛋白或其他感兴趣的生物产物，以过滤器的孔径大小(例如0.2μm或50kD)为基础，可经灌注或保留。

来自生物反应槽10之液流可经由导管20和泵70递送到过滤系统100。泵70可为双向的能让液流从过滤系统100流回生物反应槽10。过滤系统100可在交替切向流之下操作。在一实例中，交替切向流可指与(例如正切的)中空纤维的膜表面方向相同的液流，其向后或向前流，且有另一液流方向实质上与该过滤器表面垂直。交替切向流可使用一泵(例如泵70)来进行，使细胞培养物流通到包括中空纤维和另一泵(例如泵50)之过滤器模块中，用以在过滤器分离之前移出具有较低细胞密度的液体。交替切向流可帮助防止其他细胞滞留机制中典型的结垢和切断问题。

另一种选择，可利用其他过滤机制(包括膜过滤机制)，例如超过滤、微过滤和切向流过滤。

排出泵40可配置为从生物反应槽10经由导管22移出细胞。导管22可为一液浸管，其经挑选用以避免细胞聚集及堵塞(其，例如若导管22相对于培养物2的黏度为太狭窄时，可能会产生)。导管22可包括热塑弹性管(例如bioprene)。排出泵40可经由，例如处理器200来控制。经由排出泵40排出细胞可从生物反应槽10内的细胞培养物2移出细胞。细胞排出率(藉由排出泵40和控制器200的输出来控制)可以细胞培养物2中的细胞生长率来决定。为了维持细胞培养物2中稳定的细胞密度，可能希望具有大约或实质上彼此相等的排出率和细胞生长率。在某些实例中，若有显著的细胞量从含有价值产物之细胞排出移出，则可收集排出物并处理以回收产物。

生物反应槽10可置于配置用来测量生物反应槽10和细胞培养物2之重量的秤110上。秤110可与控制器200相联接，且可连续将生物反应槽10和细胞培养物2的重量传送到控制器200。在某些实施例中，至少一部份的过滤系统100，包括过滤器外罩和其内的中空膜过滤器，亦可置于秤110上。秤110可为配置用来测量置于秤上之组份重量之任何适合的秤或测力器(load cell)。

有关图1和2，控制器200可配置用来接收来自拉曼探针10、秤110和其他传感器之数据，且可配置用来以该数据为基准，控制液体流经一或多个给料泵30、排出泵40和收获泵50之比率。

控制器200可配置用来接收来自拉曼探针18之原始光谱数据，用以测定工艺参数，例如葡萄糖浓度、谷氨酸浓度、谷氨酰胺浓度、氨浓度、乳酸浓度、总细胞密度、效价和活细胞密度。控制器200可使用这些测定的工艺参数来建立回馈回路，用以调整一或多个流经给料泵30、排出泵40和收获泵50之液流。亦即，控制器200可建立一或多个葡萄糖浓度(例如，从约5mM至约85mM，或从约0.5g/L至约15.5g/L，从约1g/L至约15.5g/L，从约0.5g/L至约8g/L，从约2g/L至约6g/L，或从约3g/L至约5g/L)、谷氨酸浓度(例如，低于约8mM，低于约7mM，低于约6mM，低于约5mM，或低于约4mM)、谷氨酰胺浓度(例如，低于约5mM，低于约4mM，低于约3mM，低于约2mM，或低于约1mM)、胺浓度(例如，低于约15mM，低于约12mM，低于约10mM，低于约9mM，低于约8mM，低于约7mM，低于约6mM)、乳酸浓度(例如，低于约6g/L，低于约5g/L，低于约4g/L，低于约3g/L，低于约2g/L，或低于约1g/L)、总细胞密度(例如，大于约30MM，大于约35MM，大于约40MM，大于约45MM，大于约50MM，大于约55MM，大于约60MM，或大于约65MM)和活细胞密度(例如，每毫升至少3千万个细胞，每毫升至少3千5百万个细胞，每毫升至少5千万个细胞，或每毫升至少7千5百万个细胞)之设定点，并将所测定的值(以来自拉曼探针18之拉曼光谱为基准)与其各自的设定点相比较。

控制器200可利用一负回馈回路来校正任何设定值(或一设定范围内的值)和测定值之间的差异。例如，当一测定的葡萄糖浓度大于设定的葡萄糖浓度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，降低给排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助降低葡萄糖浓度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。例如，当一测定的谷氨酰胺浓度大于设定的谷氨酰胺浓度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，降低给排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助降低谷氨酰胺浓度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。例如，当一测定的谷氨酸浓度大于设定的谷氨酸浓度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，降低给排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助降低谷氨酸浓度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。例如，当一测定的氨浓度大于设定的氨浓度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，增加排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助降低氨浓度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当一测定的乳酸浓度大于设定的乳酸浓度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，降低排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助降低乳酸浓度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。例如，当一测定的总细胞密度大于设定的总细胞密度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，增加排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助降低总细胞密度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。例如，当一测定的活细胞密度大于设定的活细胞密度，控制器200可，例如降低给料泵30的输出，增加排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助降低活细胞密度；或控制器200可降低给料泵30之输出和降低收获泵50之输出。

例如，当测定的葡萄糖浓度低于设定的葡萄糖浓度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，增加给排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助增加葡萄糖浓度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当测定的谷氨酰胺浓度低于设定的谷氨酰胺浓度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，增加给排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助增加谷氨酰胺浓度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当测定的谷氨酸浓度低于设定的谷氨酸浓度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，增加给排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助增加谷氨酸浓度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当测定的乳酸浓度低于设定的乳酸浓度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，增加排出泵40的输出，及/或降低收获泵50之输出，以便于帮助增加乳酸浓度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当测定的总细胞密度低于设定的总细胞密度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，降低排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助增加总细胞密度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。例如，当测定的活细胞密度低于设定的活细胞密度，控制器200可，例如增加给料泵30的输出，降低排出泵40的输出，及/或增加收获泵50之输出，以便于帮助增加活细胞密度；或控制器200可增加给料泵30之输出和增加收获泵50之输出。

然而，通过系统的总灌注维持在一特定的设定量(灌注率将以反应器内的浓度为基准而不同)。控制器200可同样地使用负回馈回路控制生物反应器重量(和细胞培养物2的重量)。

应注意，添加或减少各种输入反应器内的营养素可结合对应其他输入的改变，以确保输入反应器中的物质总质量及/或体积仍为相同的。亦即，因为灌注率维持恒定，营养素的增加，例如葡萄糖溶液、谷氨酰胺、谷氨酸等，可能伴随最初营养素给料流之对应质量或体积下降。

在一实施例中，此系统可包括至少二个回馈回路-一个用于重量控制而另一个用于控制工艺参数(例如VCC、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、氨、乳酸等)。在一实施例中，各种输入和输出泵并非由竞争回路来控制。例如，灌注率可经设定(例如20L/天)，之后拉曼探针18测量一或多个培养值，及以来自拉曼探针18的测量值为基准，进行控制器200评估步骤。若控制器200测定出，例如VCC太高，则控制器200可开始经由排出泵40移出细胞，而收获泵50的流速可同时降低，使得通过系统的总体积仍为恒定的。当感测到其他的工艺参数太高或太低时(例如葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、氨、乳酸和总细胞密度)，控制器200会如上述采取额外的步骤。

可加入第二给料泵用以添加葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、谷氨酸等。在一替代的实施例中或另外的，可调整排出量，同样藉由移出细胞来回应，增加氨。

控制器200可配置在无头计算机系统中(例如无监测器、键盘和鼠标之系统)。因此，控制器200可位于服务器内，其经由网络连接或其某些连接，例如序列连接来控制。控制器200可复制在一或多个多余的服务器上，以防止一或多个服务器失效。

控制器200可配置用来应用卡尔曼滤波(Kalman filtering)，例如来自拉曼探针18之拉曼光谱数据的线性二次估算(LQE)。卡尔曼滤波可包括将一演算应用于光谱数据，其于一段时间内使用一连串的测定，产生未知变量之估算，希望该估算比该等以单独的单一测量为基础之估算更精确。因此，所测定的工艺参数可以过滤模型为基准。预期其他类型的滤波亦可为控制器200所用，用以处理来自拉曼探针18之光谱数据。

控制器200可包括或可另外与PI(过程信息)储库结合。PI储库(PI historian)可为带有时间序列数据库之应用，其可记录来自过程控制系统的数据。PI储库能让用户记录、分析和监测实时的信息。控制器200可将，例如来自秤110之重量数值、来自拉曼探针18之光谱数据和给料泵30、排出泵40和收获泵50之泵比率储存在PI储库中。

图3说明本公开之方法300。方法300之一或多个步骤可不按顺序来进行，同时与其他步骤一起进行，或一起省略。方法300可由步骤302开始，其中可组装生物反应器系统1，并在生物反应槽10内提供细胞培养物2及以细胞株培养。然后方法300可进行到步骤304，其中细胞培养物2的工艺参数在生物反应器内藉由拉曼探针18及/或藉由另外或其他的传感器来测量。工艺参数可包括由拉曼探针18得来的光谱数据所测定之任何前述参数。方法300可进行到步骤306，其中生物反应槽10的重量(包括细胞培养物2在内)藉由秤110所测并提供给处理器200。

从步骤306，方法300可进行到步骤308，其中藉由启动泵70以第一特定比率从生物反应槽10经由导管20抽取细胞培养物(培养基加上细胞)，以及亦藉由启动收获泵50从过滤系统100抽取溶液，将细胞培养物2之无细胞用过的培养基移出。从步骤308，方法300可进行到步骤310，其中可使用输出导管22藉由排出泵40以第二特定比率从细胞培养物中移出细胞。从步骤310，方法300可进行到步骤312，其中新鲜的培养基或营养素或二者可使用输入导管和给料泵30以第三特定比率，以使得总输入的培养基和营养素等于排出泵40和收获泵50之组合输出量的方式，导入到细胞培养物中。特定的比率可为一设定比率或比率范围，在该比率时泵被启动及/或保持原状。特定比率可藉由控制器200来测定。

预期各步骤302至312可以任何顺序进行，且在某些情况下，可实时经由多个由控制200所操纵的回馈回路同时进行。

步骤308、310和312可以步骤304中从拉曼探针18和步骤304从秤110所接收的数据为基准，藉由控制器200来控制。生物反应槽10的重量(加上包含在其内的细胞培养物2)可经由PID(比例-积分-微分)回路控制。另外，控制器200可配置用来分析从拉曼探针18所得到的拉曼光谱，用以测定一或多个工艺参数，包括葡萄糖浓度、麸酰胺浓度酸、谷氨酸浓度、乳酸浓度、总细胞密度和活细胞密度。各个这些变量亦可藉由负回馈回路来控制。

本公开之实例可就现有的控制解决方案提供优雅、弹性和低廉的解决方案，且可能仅有极少的数据空缺。本公开之控制策略可展现一致的生物反应器量级控制。例如，使用本公开之控制系统，量级变动从+/-0.5L/天降至+/-0.01L/天。亦达到重量变动改善，例如从使用其他系统，例如容积校正之5-10％的重量变动降至使用文中所揭示的控制系统之0.1-0.5％误差。此项改善可能至少是由于将系统从泵的容积校正变更到以重量和其他参数为基准的软件控制版本。再者，本公开之控制系统可充份整合程序信息(PI)警告(例如，电子邮件提醒)，并可远程评估和关闭。再者，本公开之系统和方法可提供比先前系统和方法更可复验的及更可靠的结果。

实例1(图4和5)

实例1中所述的实验是比较灌注生物反应器与馈料批式生物反应器，并显示在灌注生物反应器中比馈料批式生物反应器得到较高的活细胞浓度和细胞单位生产率。

在一实验中，使用细胞株和培养基以15L容量的生物反应器培养。生物反应器的设定点包括温度(35.5℃)，搅拌(250RPM)，pH(使用CO₂和碳酸氢钠控制)(从6.85至7.15)以及工作容积(11L)。将配置有0.2μm中空纤维过滤器之ATF4细胞滞留装置与生物反应器相联接。中空纤维过滤器保留细胞但让蛋白和营养素通过。每24小时让二个反应器容积(或22L的培养基)通过过滤器。

将生物反应器和ATF二者放置在秤上。经由以太网络(Ethernet)连接一计算机运作控制软件，传送生物反应器、细胞培养物和ATF的重量。将此重量与设定点相比(11.0kg，例如生物反应器的工作容积)，及以PID控制器(以MATLAB设计，但经由控制软件SynTQ执行)测定是否与给料泵接合。收获泵设定在与所欲灌注率相等之固定比率(每天二个反应器容积)。给料泵和灌注泵使用传送OPC讯号至Kepware服务器之SynTQ软件被自动控制。Kepware服务器将此讯号通过以太网络连接传送到MODBUS模拟输出模块(Analog Output Module)，其将此数字值转变为介于4至20mA间的实质(physical)毫安输出。

使用此系统，生物反应器重量可控制在最初11kg重的10g内(0.09％)。在此系统施行之前，在生物反应器中，不可能将生物反应器重量控制在超过0.5kg(4.54％)之内一整夜。在相同的系统内，使用Kaiser光学拉曼探针从细胞培养物捕捉拉曼光谱。此控制器利用先前批次中所发展的模型来预测细胞数、葡萄糖、乳酸、氨和其他营养素浓度。拉曼探针捕捉数千个不同的光谱，然后将其以计算机程序，例如SIMCA分析。使用多个组成份分析，及特定参数的脱机数据，此程序创造出一跨越所有探针读数的模型。然后将此SIMCA模型上传至SynTQ并实时评估，每次该探针采用一个读数(例如每15min至45min)。

以拉曼探针控制各种营养素能得到较高的细胞株生产率，在长期的细胞培养物中增加存活率，及增进蛋白多方面之质量。

图4说明根据本公开之灌注生物反应器在一批次的第37天的最大活细胞浓度(显示为“Ex.”1)，其约略为同样大小的馈料批式生物反应器在一批件的第7天之最大活细胞浓度的2倍(Ex.2)。在第37天达到最大活细胞浓度之事实(而不是在灌注生物反应器的第6天)，显示灌注生物反应器制程之稳键性和长寿性。

图5显示灌注批式制程(Ex.1)之第12-25天的细胞单位生产率(cSP)与馈料批式制程(Ex.2)之第1-12天的cSP。灌注批式法在第25-37天达到类似的生产率。

每天需要三个反应器容积的灌注率使灌注批件中VCC增加超过50x10⁶个细胞/mL，其可能在商业上于许多情况下为禁止的。

使用“推低(push-to-low)”策略之培养基优化应能降低所需的灌注率。例如，细胞可生长至20x10⁶个细胞/mL，并保持在稳定状态。灌注率可设定在2个反应器容积/天持续5天。在第5天。灌注率可降至1.5个反应器容积/天。若细胞持续生存，则5天后灌注率可降至1个反应器容积/天。一旦细胞开始死亡，可使用胺基酸分析和其他分析来测定如何强化培养基，例如在培养基中补充营养素或调整营养素浓度。在一非限定实例中，此策略描述于Bayer等人之“The Push to Low Approach for Optimization of High DensityPerfusion Cultures of Animal Cells”,Adv.BioChem.Engin./Biotechnol.2006,101:75-98中。

可得到NOVA Flex数据，其中分析样本是采脱机读数。使用先前的NOVA数据，可建立一拉曼模型及，在此点，可将探针置入反应器中且该模型可每15至45分钟，每秒、每分钟、每2分钟，每3分钟，每4分钟，每5分钟，每10分钟，每15分钟，每20分钟，每25分钟，每30分钟，每35分钟，每40分钟，每45分钟，每50分钟，每55分钟，每小时，每2小时，每3小时，每4小时，每5小时，或每6小时提供VCC数据，取代每天一次需要像以NOVA人工取样。图5显示特定一回操作的第20天。使用该回操作的前20天收集NOVA数据，其用来产生一拉曼模型供用于该回操作的后面部分。

在下列实例中，下列为特定工艺参数之一般范围：pH：6.85-7.40，溶氧：30-60％、35-55％、40-50％或45％，温度：34-37.5℃，及搅拌：在台上150-300RPM、175-275RPM、200-250RPM或225RPM。

实例2(图6-8)

实例2中所述的实验显示对VCC生长或葡萄糖不进行控制之灌注生物反应器的数据。观察到VCC在第7天达到高峰因细胞快速生长到大量细胞密度，然后快速衰减到第11天因为其耗尽了培养基内的营养素(图6)。仅控制重量不足以达到稳态的VCC。

在灌注操作期间亦未控制葡萄糖。因为在灌注操作期间培养是依赖培养基中的葡萄糖供给细胞，此项后续导致了细胞在培养期间死亡。虽然持续的供给培养基，但因为生长，葡萄糖稳定地递减(图7)。当监测细胞存活率时可看到，如图8中所示，在第10天后检测到大量的葡萄糖是由于细胞完全死亡而因此无葡萄糖消耗。

在此实验中，以15L台式生物培养器培养制造mAb1之特定浓度的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。将此细胞以特定的溶氧、温度、搅拌和pH培养，其在操作期间保持恒定。亦以灌注给料的形式，以每天2倍的反应器容积之比率，提供细胞新鲜的培养基和营养素。藉由于反应器中添加与使用Repligen XCell ATF4系统移出的灌注液相同量的馈料，保持反应器容积恒定。此项藉由监测生物反应器系统的重量和使用计算机辅助回馈回路控制系统使重量保持在特定目标重量的0.05kg之内来达成。在此灌注生产操作期间并未提供拉曼控制和排出控制来控制VCC或任何其他生物反应器参数。

在一类似的实验中(未描绘于图中)，其中流量亦设定为每天二个生物反应器的培养基给料，并未监测重量，所以无法适当地控制泵变异。

在此类似的灌注实验中，给料泵和灌注液泵设定为相同流量(以泵的容积校正来测定)。此方法无法提供彼此相配之足够精确的流量，且隔夜(例如，一段时间未积极监测生物反应)，给料泵添加了多于灌注泵能移出的培养基到反应器中。此举造成的反应器溢满及后续流失培养物。

实例3(图9-12)

实例3中所述的实验显示具有VCC控制之灌注生物反应器。VCC控制(图9)使得存活率(图10)、蛋白生产(图11)和营养素(图12)持续稳定。

在此实验中，以15L台式生物培养器培养制造mAb2之特定浓度的CHO细胞。将此细胞以在操作期间保持恒定的特定溶氧、温度、搅拌和pH培养。亦以灌注给料的形式，以每天2倍的反应器容积之比率，提供细胞新鲜的培养基和营养素。藉由于反应器中添加与使用ATF4系统移出的灌注液相同量的馈料，保持反应器容积恒定。此项通过监测系统的重量和使用计算机控制系统使重量保持在特定目标重量的±0.05kg之内来达成。在此操作期间并未使用拉曼控制，且泵的排出比率是在VCC取样后以人工设定。此制程需要多个样本且一天必须调整排出比率多次。

在灌注生产培养期间，以42.5x10⁶个细胞/mL(40-45x10⁶个细胞/mL)之目标控制VCC。因此，若VCC升高到目标以上，则增加排出比率，而若VCC落在目标以下，则降低排出比率。

实例4(图13和14)

本实例之实验是比较灌注培养法(图14)与馈料批式培养法(图13)。相较于馈料批式培养法，就相同的蛋白于类似的条件下，灌注培养法能达到大约4倍细胞数(图13)。馈料批式培养法在试验性规模(pilot scale)下进行，而灌注实验则以实验室规模(benchscale)(15L)进行。搅拌和充气策略被缩小规模至实验室规模，搅拌是使用每单位体积能量法及充气是以体积对体积匹配法。

相较于馈料批式反应器内所产生的蛋白量，在相同的时间下，灌注培养法能产生3.5倍的蛋白量(图14)。

灌注培养法是藉由提供一15L台式生物反应器培养生产mAb2之特定浓度的CHO细胞来进行(Ex.5和7)。此细胞以在操作期间保持恒定的特定溶氧、温度、搅拌和pH培养。亦以灌注给料的形式，以每天2倍的反应器容积之比率，提供细胞新鲜的培养基和营养素。相较于先前的实验，在此回操作中培养基被补充递增浓度的重要营养素，使得细胞能在灌注运作期间推高细胞密度。藉由使用重量控制系统将反应器体积保持恒定，将重量维持在特定目标的0.05kg内。在此灌注生产操作期间并未提供拉曼控制和排出控制。

馈料批式细胞培养法(Ex.6和8)于类似的条件(溶氧、温度、搅拌和pH)下进行。

实例5(图15-18)

图15-18中所述的实验显示有关此灌注系统之活性、葡萄糖和效价以及VCC维持在稳定状态长达30天以上的有利结果(参见，例如图15-18)。

具有拉曼、排出和重量控制之灌注培养法藉由提供一15L台式生物反应器培养生产mAb2之特定浓度的CHO细胞来进行。此细胞以在操作期间保持恒定的特定溶氧、温度、搅拌和pH范围培养。亦以灌注给料的形式，以每天2倍的反应器容积之比率，提供细胞新鲜的培养基和营养素。亦以灌注给料的形式，以每天2倍的反应器容积之比率，提供细胞新鲜的培养基和营养素。在此回操作中培养基被补充递增浓度的重要营养素(相较于实例2和3)，使得细胞能推高细胞密度。藉由使用重量控制系统添加与使用ATF4系统移出的灌注液相同量的馈料，保持反应器容积恒定，藉由监测系统重量和使用计算机回馈控制系统将重量维持在特定目标值的±0.05kg。

在此次操作中使用以拉曼回馈为基准的拉曼控制和自动排出控制来控制VCC(图15)。在一第一实验中(Ex.9)，拉曼排出策略被设定以维持40x10⁶个细胞/mL之VCC。VCC的范围为35-45x10⁶个细胞/mL，这稍微比先前实验中手动排出的目标值更广(实例3)。然而，此系统一天仅采样一次且在此次灌注作业中并不需要调整(相较于实例3中所述的一天多次调整以手动排出)。

在一第二实验中(Ex.10)，条件类似第一实验，但VCC设定在10x10⁶个细胞/mL，每天1个反应器容积的灌注率。

实例6(图19和20)

在一实验中，使用细胞株和培养基培养三个不同生物反应器。生物反应器的容量为：3L(Ex.11)，15L(Ex.12)及50L(Ex.13)(单次使用的生物反应器)。生物反应器设定点包括温度(35.5℃)，搅拌(250RPM)，pH(使用CO₂和碳酸氢钠控制)(从6.85至7.15)以及工作容积(分别为2L、10L、35L)。所有的这些参数在操作期间皆保持恒定。各生物反应器与一配置有0.2微米过滤器之细胞滞留装置的ATF(分别为ATF2、ATF4、ATF6)联接。24小时之后，中空纤维过滤器留住细胞但让蛋白通过。

灌注培养是在各系统中使用拉曼、排出和重量控制以全部三种规模来进行。如同实例5，此实验中的培养基被补充额外的营养素。各系统内的重量控制在：ATF4和ATF6中+/-0.05kg，及特定目标值+/-1kg(由于规模本身的设备限制)。

在此次操作中是使用以拉曼回馈为基准的拉曼控制和自动排出控制将VCC(图19)设定为40x10^6个细胞/mL。在50L ATF6系统中观察到拉曼探针的变异性，其为预期的，因为拉曼控制模型尚未针对较大规模进行最适化。

在全部这三个操作中，灌注率设定在1.8至2RV/天之间，且所有放大规模的参数使用传统方法来设定。

此实验的结果为：在全部三个系统中历时5天的期间，达到相当的蛋白生产率(图20)。

实例7(图21)

在一实验中，使用细胞株和培养基培养一单一生物反应器。生物反应器的容量为15L(Ex.14)。生物反应器设定点包括温度(35.5℃)，搅拌(250RPM)，pH(使用CO₂和碳酸氢钠控制)(从6.85至7.15)。所有的这些参数在操作期间皆保持恒定。生物反应器与配置有0.2微米过滤器之细胞滞留装置的ATF4联接。24小时之后，中空纤维过滤器留住细胞但让蛋白通过。

灌注培养在此系统中使用拉曼、排出和重量控制来进行。如同实例5，此实验中的培养基补充额外的营养素。各系统内的重量控制在：在ATF4中特定目标值之+/-0.05kg。

在此操作中使用以拉曼回馈为基准的拉曼控制和自动排出控制将VCC(参见图21)设定为70x10^6个细胞/mL。

在此操作中灌注率设定在2.5RV/天，用以补充培养中的额外细胞，并确保不会发生培养基耗尽。

此反应器能在设备失效而造成该批次结束之前，将VCC维持在70x10^6个细胞/mL以上历时7天。在此期间，存活率维持在90％以上，其显示了健康的培养。在执行本公开之控制系统之前，此等高密度的持久性生产应是不可能的。

请注意，有关文中“一实施例”是指与该实施例有关的所述特别内容、结构或特征可包括、应用及/或并入一、一些或所有的本发明之实施例。在本说明书中使用或出现词语“在一实施例中”或“在另外的实施例中”并非指相同的实施例，亦非各自或替代的实施例必须相互排除一或多个其他实施例，亦非限制在单一排除的实施例中。同样适用于术语“施行”和“实例”。本公开不限于任何单一此等方面及其实施例，亦不限于此等方面及/或实施例之任何组合及/或排列。再者，本公开之各方面，及/或其实施例可单独或与一或多个本公开之其他方面及/或其实施例组合应用。为了简洁起见，文中并未各自论述及/或说明特定的排列和组合。

另外，如上所示，文中描述为“例示的”之实施例或施行不应理解为较佳的或优于，例如，其他实施例或施行，而是希望反应或指出该(等)实施例为“例示的”实施例。

Claims (50)

1.一种控制生物反应器系统的方法，包括：

提供生物反应器中的细胞培养物，其中生物反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(POI)，

以拉曼(RAMAN)探针测量生物反应器内细胞培养物的一或多个工艺参数(PP)，其中该工艺参数选自由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群组，

测量含细胞培养物的生物反应器重量，

使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基，

使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞，使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中，且

其中该输入和输出导管以拉曼探针测量值及生物反应器的重量测量值为基准加以调整，以维持(i)一或多项工艺参数在预定的范围内，(ii)含细胞培养物之生物反应器重量在预定的范围内，及(iii)输入导管的第三特定比率以及各输出导管的第一和第二特定比率在其各自的预定范围内。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过拉曼测量生物反应器内细胞培养物的一或多项工艺参数至少每小时进行一次。

3.如前述权利要求任一项中所述的方法，其中该方法配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(mL)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时30天。

4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该生物反应器具有至少约10L之容积，而该方法配置为将生物反应器和细胞培养物之重量维持在20g的范围内。

5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该生物反应器具有至少10L的容积，且该方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的生物反应器重量之0.1百分比内。

6.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，当工艺参数偏离各自期望范围内的设定值时，则调整以下一项或多项：移出无细胞之培养基、移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者，以降低偏差。

7.如前述权利要求任一项所述的方法，其中每天经由第一输出导管移出至少二个生物反应器体积的用过的培养基。

8.如前述权利要求任一项所述的方法，其中每天经由第一输出导管移出至高三个生物反应器体积的用过的培养基。

9.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该工艺参数包括细胞培养物的温度和细胞培养物的pH，且温度维持在约35至36℃之间，而pH维持在6.85至7.15之间。

10.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该工艺参数包括细胞单位生产率，且该方法配置为将细胞培养物内的细胞维持在至少约15-25pg/细胞/天的细胞单位生产率历时至少25-37天。

11.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该工艺参数包括葡萄糖浓度，且该方法配置为将葡萄糖浓度维持在约5mM至约85mM，或约1g/L至约15.5g/L。

12.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该工艺参数包括乳酸浓度，且该方法配置为将乳酸浓度维持在低于约60mM，或低于约6g/L。

13.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该工艺参数包括氨浓度，且该方法配置为将氨浓度维持在低于约15mM。

14.如前述权利要求任一项所述的方法，其中移出无细胞之用过的培养基、移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者中的每一项通过各自的泵来控制。

15.如前述权利要求任一项所述的方法，其中该生物反应器包括配置用来保留细胞及让液体通过的过滤器。

16.一种控制生物反应器系统的方法，包括

提供生物反应器中的细胞培养物；

以拉曼探针测量生物反应器内细胞培养物的一或多个工艺参数；

使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基；

使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞；

使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中；及

以拉曼探针的测量值为基准改变第一特定比率、第二特定比率和第三特定比率中的一或多项。

17.一种生物反应器系统，包括：

具有输入导管和至少一输出导管之罐；

至少一泵；

联接罐之过滤器；

连接罐之拉曼探针；及

连接至少一泵和拉曼探针之控制器，该控制器配置为以拉曼探针的输入值为基准，控制该至少一泵。

18.如权利要求17所述的生物反应器培养系统，其中该至少一输出导管包括用来连接第二泵之第一输出导管，而该第二泵配置用来控制从罐移出液体，以及用于连接第三泵的第二输出导管，而该第三泵配置用来控制从罐移出细胞。

19.如权利要求17或18所述的生物反应器培养系统，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐内并让液体通过该过滤器。

20.如权利要求17-19任一项所述的生物反应器培养系统，其中拉曼探针配置在罐内。

21.如权利要求17-20任一项所述的生物反应器培养系统，其中该控制器与第一泵、第二泵和第三泵相联接。

22.如权利要求17-21任一项所述的生物反应器培养系统，进一步包括秤，其配置用来测量在罐内含细胞培养物之罐的重量；其中该控制器配置用来接收秤的重量数据。

23.如权利要求22所述的生物反应器培养系统，其中该控制器配置用来比较罐的重量和设定点的重量，及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的输出。

24.如权利要求17-23任一项所述的生物反应器培养系统，其中该控制器配置用来接收来自拉曼探针之光谱数据；以接收的光谱数据为基准，测定细胞培养物的参数；将测定出的参数与设定点的参数相比较；及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的输出。

25.如权利要求24所述的生物反应器培养系统，其中调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的输出降低测出的参数和设定点参数之间的偏差，或接收的重量和设定点重量之间的偏差。

26.如权利要求17-25任一项所述的生物反应器培养系统，其中该方法配置用来将细胞培养物以稳定状态维持在至少每毫升3千万个细胞之平均活细胞浓度历时30天。

27.如权利要求17-26任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐具有至少10L之容积，且该方法配置为将含细胞培养物的罐之重量维持在20g范围内。

28.如权利要求17-27任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐具有至少10L之容积，且该方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比。

29.如权利要求28所述的生物反应器培养系统，其中该控制器配置用来：以接收的光谱数据为基准，测定生物反应器培养的多个参数；

将多个参数的每一个与多个参数的每一个的各自设定点比较；及

以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的输出，用以降低测出的参数和各自设定值之间的偏差。

30.如权利要求29所述的生物反应器培养系统，其中该多个参数包括温度、pH、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。

31.如权利要求17-30任一项所述的生物反应器培养系统，其中该过滤器配置用来保留细胞并让液体通过。

32.如权利要求17-31任一项所述的生物反应器培养系统，进一步包括秤，其中该罐和过滤器置于秤上。

33.如权利要求17-31任一项所述的生物反应器培养系统，进一步包括秤，其中该罐置于秤上。

34.如权利要求17-31任一项所述的生物反应器培养系统，进一步包括秤，其中该罐与该秤实体接触。

35.一种生物反应器培养系统，包括：

具有输入导管和至少一输出导管之罐；

至少一泵；

联接罐之过滤器；

接触罐之秤；

联接罐之拉曼探针；及

与至少一泵、秤和拉曼探针联接之控制器，

该控制器配置为以拉曼探针之输入和秤的输入为基准，控制该至少一泵。

36.一种生物反应器培养系统，其包括：

具有供连接第一泵之输入导管、供连接第二泵之第一输出导管，以及供连接第三泵之第三输出导管的罐，而该第一泵配置用来控制将液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；

联接罐之过滤器，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过该过滤器；

配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；

配置在罐内的拉探针；及

联接第一泵、第二泵、第三泵、秤和拉曼探针之控制器，其中控制器配置用来：

接收秤的重量数据；

将罐的重量与设定点的重量相比较；

接收来自拉曼探针的光谱数据；

以接收的光谱为基准测定细胞培养物的参数；

将测定的参数与设定点的参数相比；及

以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的流通量。

37.如权利要求36所述的生物反应器培养系统，其中调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的流通量降低所测之参数和设定点参数之间的偏差，或接收重量和设定点重量之间的偏差。

38.如权利要求36和37任一项所述的生物反应器培养系统，其中该方法配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(mL)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时30天。

39.如权利要求36-38任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐具有至少10L的容积，且该方法配置为将含细胞培养物的罐重量维持在20g范围内。

40.如权利要求36-39任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐具有至少10L的体积，且该方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比内。

41.如权利要求36-40任一项所述的生物反应器培养系统，其中该控制器配置为：

以接收的光谱数据为基准，测定多个生物反应器培养的参数；

将多个参数的每一个与多个参数的每一个的各自设定点比较；及

以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多个的流通量，用以降低测定参数和各自设定值之间的偏差。

42.如权利要求41所述的生物反应器培养系统，其中该多个参数包括温度、pH、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。

43.如权利要求36-42任一项所述的生物反应器培养系统，进一步包括配置用来保留细胞并让液体通过的过滤器。

44.如权利要求43所述的生物反应器培养系统，其中该罐和过滤器置于秤上。

45.如权利要求36-44任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐置于秤上。

46.如权利要求36-45任一项所述的生物反应器培养系统，其中该罐实体与该秤接触。

47.一种生物反应器培养系统，包括：

具有输入导管和至少一输出导管之罐；

至少一泵；

联接罐之过滤器；

联接罐之拉曼探针；及

与至少一泵和拉曼探针联接之控制器，该控制器配置为以拉曼探针之输入为基准，控制该至少一泵。

48.一种生物反应器培养系统，包括：

具有供连接第一泵之输入导管、供连接第二泵之第一输出导管，以及供连接第三泵之第二输出导管的罐，而该第一泵配置用来控制液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；

联接罐之过滤器，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过过滤器；

配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；

配置在罐内的拉曼探针；及

联接第一泵、第二泵、第三泵、秤之控制器。

49.一种如本公开之图1和2中所示之生物反应器系统。

50.一种如本公开之图3中所示之控制生物反应器系统的方法。

Images