CN114875047A - 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和生物工程技术领域，具体而言本发明利用生物信息学手段确定了猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4主要结构功能区的基因序列信息并对该序列进行了优化，提供了一种重组猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法，该制备方法借助优化后的重组质粒在大肠杆菌表达系统中进行表达，其方法简便易操作，表达效率和生物活性均得到显著提升，且抗生素抗性水平低，为猪轮状病毒口服疫苗的研制提供重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的，本发明涉及一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4、其重组表达及其应用。
背景技术
猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属、双链RNA病毒，是引起幼儿及其他多种动物脱水性胃肠炎的主要病原之一，在我国广泛存在，易引起猪场的大规模感染且不分年龄阶段。此病毒会使仔猪患严重的胃肠炎，同时也会使仔猪发生脱水性腹泻，破坏机体酸碱平衡，4周龄以内的仔猪发病率可达80％，死亡率可达20％，严重制约了我国养猪业的健康发展，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。
现已知的猪轮状病毒血凝素抗原由第4节段编码的外衣壳蛋白VP4所决定，该蛋白具有血凝作用，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。感染后，病毒的VP4蛋白与宿主细胞相互作用，参与受体结合和细胞渗透，VP4可被蛋白水解酶和胰蛋白酶水解，裂解后可增强病毒的感染能力，改变上皮细胞的分子结构和功能，对上皮细胞造成破坏，导致小肠绒毛长度变短，密度降低，来自肠隐窝的未成熟细胞代替成熟细胞，从而引起吸收障碍、消化不良及渗透性腹泻。
目前在猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法中，主要存在以下问题：一、关于猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的研究报道较少且蛋白表达量不高；二、用于重组表达时抗生素使用量往往较大，存在耐药性基因扩散隐患等。因此，迫切需要开发一种能够高效表达生物活性高且安全的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法，该方法通过对VP4蛋白的基因序列进行优化，利用重组质粒在大肠杆菌表达系统中进行表达，有效提高VP4蛋白的表达效率，且获得的VP4蛋白抗生素抗性水平低，生物活性高。为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4，所述VP4的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第二个方面，提供一种用于表达上述优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的重组表达载体。
在一种实施方式中，上述重组表达载体包含强启动子、标签蛋白、多克隆位点、限制性内切酶位点以及氨苄抗性序列。
本发明的第三个方面，提供一种上述重组载体的构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)对优化的VP4序列的基因片段和pET32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带；
(2)用T4连接酶连接，转化至DH5α感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得重组质粒pET32a-VP4。
本发明的第四个方面，提供一种重组猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法，其中，所述方法为将上述构建的重组载体在大肠杆菌中表达获得重组的VP4。
在一种实施方式中，作为一种优选方式，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将上述构建的重组载体通过化学转化法转至大肠杆菌感受态细胞中，转化结束后将带有重组质粒的大肠杆菌涂布含有0.5ug/ml氨苄抗性的LB平板，37℃恒温培养；
(2)挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行测序鉴定，得到重组菌；
(3)将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜；
(4)取振荡培养过夜的菌液接种到LB培养基中使其OD600初始浓度为0.2，37℃恒温振荡培养约2h，待OD600至0.6左右时加入IPTG诱导剂，加入IPTG的终浓度为1mM；
(5)诱导4h后终止发酵，离心收集菌体获得所述重组猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4。
优选的，所述化学转化方法包括如下步骤：
(1)50ul感受态中加入重组载体500ng～1ug，轻轻混匀，置冰上30分钟；
(2)42℃水浴热激45s，迅速放回冰中静置5分钟；
(3)加入600ul不含抗生素的无菌LB液体培养基，混合均匀，37℃震荡培养1小时。
本发明的第五个方面，提供一种根据上述方法制备获得的重组VP4蛋白。
本发明的第六个方面，提供一种上述重组VP4蛋白在制备禽畜饲料中的应用。
本发明相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：
1.本发明对猪轮状病毒VP4蛋白的主要抗原结构功能区的核苷酸序列进行优化，将优化后的VP4核苷酸序列在大肠杆菌中重组表达，可显著提升VP4蛋白的表达效率，优化后蛋白表达效率是未优化的1.4倍，且生物活性更强；
2.本发明填补了猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4研究及应用方面的技术空白。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：基因使用频率及序列对比：加粗的序列表示其使用频率高，更适合宿主，从而导致更高的表达。
图2：密码子相对频率雷达图：显示了每个密码子的相对频率，更好的曲线匹配意味着更适用于宿主。
图3：密码子百分比分布：密码子的百分比越大，说明使用频率越高。
图4：pET32a-VP4质粒双酶切鉴定。
图5：SDS-PAGE凝胶电泳检测结果：1道为未诱导表达大肠杆菌BL21(DE3)；2道为诱导表达2h大肠杆菌BL21(DE3)；3道为诱导表达4h大肠杆菌BL21(DE3)。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：确定猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4基因序列及其优化方法
1.在NCBI中查到该核苷酸序列及所编码蛋白的氨基酸序列，筛选得到用于合成、构建的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，通过查阅文献确定猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4基因全长序列、开放阅读框及抗原结构功能区；
2.调整密码子使用偏好，以符合目标宿主的最高表达谱，将密码子适应指数(CAI)从0.4提高到0.98(CAI值0.8-1.0被认为是良好的高表达)；
3.将平均GC含量由35.4％调整到54.7％，去除掉不良峰；
4.去除原始序列中的重复区域，避免mRNA中的茎环结构；
5.对用于亚克隆的限制性酶切位点和负的顺式作用位点进行修饰；
6.继续对整个序列进行微调，提高翻译效率，延长mRNA的半衰期，获得优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4基因序列，该序列如SEQ ID NO.2所示，将该序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
实施例2：重组载体的构建和目标蛋白的表达
1、对人工合成的优化的VP4基因序列(SEQ ID NO.2)和pET32a质粒(序列如SEQ IDNO.3)进行BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至BL21(DE3)感受态细胞中，利用0.5ug/ml氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pET32a-VP4；
2、挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行双酶切鉴定并将鉴定正确的质粒送上海生工进行测序鉴定，得到重组菌；
3、将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜；
4、取振荡培养过夜的菌液接种到LB培养基中使其OD600初始浓度为0.2，37℃恒温振荡培养约2h，待OD600至0.6左右时加入IPTG诱导剂，加入IPTG的终浓度为1mM；
5、诱导4h后终止发酵，分别取诱导前、诱导2h和诱导4h菌液，定量后将菌液浓缩并加入4×SDS上样缓冲液，使缓冲液终浓度为1×SDS，放入沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达情况，优化后蛋白表达率更高，诱导2h的表达率是未诱导的1.1倍， 诱导4h的表达率是未诱导的1.4倍。
实施例3：重组蛋白的生物活性验证
猪场发现有60头仔猪出现精神萎靡、厌食、呕吐、腹泻等症状，经病理检查和实验室检测确定是轮状病毒感染所致，将上述实施例2中表达重组优化的VP4的重组菌(实验组)以及表达重组原始VP4蛋白的重组菌(对照组)制备成菌粉进行饲喂实验。由于重组菌的佐剂效应、黏附特性以及无致病性却保留了抗原特异性等特点，其可作为递呈VP4抗原蛋白的载体，因此将其制备成菌粉进行动物实验。
将上述60头仔猪随机分成实验组、对照组和日常饲料组(无VP4菌粉添加)三组，实验组和对照组分别在日常饲料中添加优化的VP4菌粉和原始的VP4菌粉，日常饲料组仅饲喂日常饲料，饮水及其他饲养条件相同(见下表)。
实验分组如下：
结果统计数据见下表：
从表格中可以看出，VP4对仔猪腹泻有一定的治疗作用。使用优化VP4菌粉的实验组平均日增重相对于未优化菌粉组多出0.15kg，比日常饲料组多出0.23kg，平均日采食量比未优化菌粉组多出0.35kg，比日常饲料组每头猪多出0.53kg。并且，实验组与对照组相比，优化后的VP4蛋白更能够有效改善仔猪厌食、呕吐、腹泻等症状，具有更佳的益生活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏三仪生物工程有限公司
大连三仪动物药品有限公司
<120> 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的重组表达及应用
<130> 4
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggcttcgc tcatttatag acaattgctc acgaattctt atacagtaga tttatccgat 60
gagatacaag agattggatc aactaaatca caaaatgtca caattaatcc tggaccattt 120
gcgcaaacag gttatgctcc agttaactgg ggacctggag aaattaatga ttctacgaca 180
gttgaaccat tgctggatgg gccttatcaa ccaacgacat tcaatccacc agtcgattat 240
tggatgttac tggctccaac gacacctggc gtaattgttg aaggtacaaa taatacagat 300
agatggttag ccacaatttt aatcgagcca aatgttcagt ctgaaaatag aacttacact 360
atatttggta ttcaagaaca attaacggta tccaatactt cacaagacca gtggaaattt 420
attgatgtcg taaaaacaac tgcaaatgga agtataggac aatatggacc attactatcc 480
agtccgaaat tatatgcagt tatgaagcat aatgaaaaat tatatacata tgaaggacag 540
acacctaacg ctaggacagc acattattca acaacgaatt atgattctgt taatatgact 600
gctttttgtg acttttatat aattcctaga tctgaagagt ctaaatgtac ggaatacatt 660
aataatggat taccaccaat acaaaatact agaaatgttg taccattatc gttgactgct 720
agagatgtaa tacactatag agctcaagct aatgaagata ttgtgatatc c 771
<210> 2
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggcgagcc tgatctaccg tcagctgctg accaactctt acaccgttga cctgagcgat 60
gaaatccagg aaatcggcag caccaaaagc cagaacgtta ccatcaaccc aggtccgttc 120
gctcagaccg gctacgcgcc ggttaactgg ggtccgggtg aaattaacga tagcaccacc 180
gttgaaccgc tgctggatgg tccgtaccag ccgaccacct tcaacccgcc ggttgattac 240
tggatgctgc tggcgccgac cactccgggc gttatcgttg aaggtaccaa caacaccgat 300
cgttggctgg cgaccatcct gatcgaaccg aacgttcaga gcgaaaaccg tacctacacc 360
atcttcggca tccaggaaca gctgaccgtt tctaacacct ctcaggatca gtggaaattc 420
atcgatgttg tgaaaaccac cgcgaacggt tctatcggcc agtatggtcc gctgctgtcc 480
agcccgaaac tgtacgcggt tatgaaacac aacgaaaaac tgtacaccta cgaaggtcag 540
accccgaacg cgcgtaccgc gcactacagc accaccaact acgattccgt taacatgacc 600
gcgttctgcg atttctacat catcccgcgt agcgaagaaa gcaaatgcac cgaatacatc 660
aacaacggcc tgccgccgat ccagaacacc cgtaacgttg ttccgctgag cctgaccgcg 720
cgtgatgtta tccactaccg tgcgcaggcg aacgaagata tcgttatcag c 771
<210> 3
<211> 5900
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
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tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgatatca gccatggcct tgtcgtcgtc gtcggtaccc 240
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gaaccgcgtg gcaccagacc agaagaatga tgatgatgat ggtgcatatg gccagaacca 360
gaaccggcca ggttagcgtc gaggaactct ttcaactgac ctttagacag tgcacccact 420
ttggttgccg ccacttcacc gtttttgaac agcagcagag tcgggatacc acggatgcca 480
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tctgcccaga aatcgacgag gatcgccccg tccgctttga gtacatccgt gtcaaaactg 660
tcgtcagtca ggtgaataat tttatcgctc atatgtatat ctccttctta aagttaaaca 720
aaattatttc tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta 780
atttcgcggg atcgagatcg atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca 840
ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc 900
gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg 960
tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc 1020
tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 1080
gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc 1140
ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca 1200
gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt 1260
tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac 1320
cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt 1380
ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg 1440
ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg 1500
gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac 1560
caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc 1620
tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc 1680
gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt 1740
tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt 1800
cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg 1860
caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg 1920
ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga catctcggta 1980
gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa 2040
caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 2100
caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 2160
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 2220
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagct 2280
cactcattag gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc 2340
cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat 2400
gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg 2460
ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc 2520
tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc 2580
cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg 2640
ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag 2700
cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg 2760
tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg 2820
catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg 2880
gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc 2940
ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct 3000
ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc 3060
agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt 3120
aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc 3180
gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3240
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 3300
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 3360
catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 3420
cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 3480
gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3540
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3600
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3660
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3720
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3780
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3840
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3900
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3960
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 4020
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4080
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 4140
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4200
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4260
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4320
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4380
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4440
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4500
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4560
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4620
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4680
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4740
acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4800
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4860
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4920
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4980
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 5040
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 5100
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5160
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5220
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5280
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5340
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5400
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa 5460
aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 5520
aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 5580
acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 5640
agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 5700
gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 5760
cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 5820
caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 5880
agggcgcgtc ccattcgcca 5900
Claims (9)
1.一种重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4，其特征在于，所述VP4的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种用于表达如权利要求1所述的优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的重组表达载体。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含强启动子、标签蛋白、多克隆位点、限制性内切酶位点以及氨苄抗性序列。
4.如权利要求2或3所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对如权利要求1所述的优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的基因片段和pET32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带；
(2)用T4连接酶连接，转化至BL21(DE3)感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得重组表达载体。
5.一种重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4的制备方法，其特征在于，所述方法为将如权利要求2或3所述的重组表达载体或如权利要求4所述方法构建的重组表达载体在大肠杆菌中表达，获得重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将按照权利要求4所述方法构建的重组表达载体通过化学转化法转化至大肠杆菌感受态细胞中，转化结束后，将带有重组质粒的大肠杆菌涂布含有0.5ug/ml氨苄抗性的LB平板，37℃恒温培养；
(2)挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行测序鉴定，得到重组菌；
(3)将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜；
(4)取振荡培养过夜的菌液接种到LB培养基中使其OD600初始浓度为0.2，37℃恒温振荡培养约2h，待OD600至0.6左右时加入IPTG诱导剂，加入IPTG的终浓度为1mM；
(5)诱导4h后终止发酵，离心收集菌体获得所述重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化学转化法包括如下步骤：
(1)50ul感受态中加入重组表达载体500ng～1ug，轻轻混匀，置冰上30分钟；
(2)42℃水浴热激45s，迅速放回冰中静置5分钟；
(3)加入600ul不含抗生素的无菌LB液体培养基，混合均匀，37℃震荡培养1小时。
9.如权利要求1所述的重组优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白VP4在制备禽畜饲料中的应用。
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