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CN111172083A - 一种用于高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其发酵培养方法 - Google Patents

一种用于高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其发酵培养方法 Download PDF

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CN111172083A
CN111172083A CN202010156379.0A CN202010156379A CN111172083A CN 111172083 A CN111172083 A CN 111172083A CN 202010156379 A CN202010156379 A CN 202010156379A CN 111172083 A CN111172083 A CN 111172083A
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CN
China
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culture medium
culture
mass fraction
volume fraction
mycoplasma capricolum
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Application number
CN202010156379.0A
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English (en)
Inventor
宋青龙
薛新升
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Longkefangzhou Bio Engineering Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Longkefangzhou Bio Engineering Technology Co ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了一种用于高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其发酵培养方法。所述山羊支原体山羊肺炎亚种由临床诊断为患支原体性肺炎的山羊呼吸道分泌物中分离得到，已于2019年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18878。所述发酵培养方法为将经过复苏传代后的山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17 CGMCC No.18878在特定发酵培养基及特定条件下进行液体发酵培养。所述特定发酵培养基采用葡萄糖、水解酵母蛋白、水解酵母培养物、水解乳蛋白、酪蛋白的组合替代部分马血清，大大降低了菌株发酵成本。

Description

一种用于高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其 发酵培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其发酵培养方法。
背景技术
山羊传染性胸膜肺炎是山羊养殖中常见的急性或慢性高度接触性呼吸道传染病，以纤维素性胸膜炎为主要特征，被感染羊群无年龄和性别差异，发病率和死亡率都很高。现广泛流行于非洲和亚洲养羊国家，危害极大，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病之一，1873年首次发现于阿尔及利亚，迄今为止全球已有40多个国家和地区曾有该病发生的报道，我国于2010年首次向OIE通报此病，该病每年都会造成巨大的经济损失。山羊传染性胸膜肺炎是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumonia，Mccp)引起，由于临床上支原体的分离与培养十分困难，非专业实验室无法做到，且临床上又常可能被其它呼吸道疾病干扰而最终不能确认，致使羊场技术人员及基层兽医基本上只能凭经验用药，而无法针对病原支原体进行科学合理用药。
山羊传染性胸膜肺炎病原的分离与鉴定是一个难题，到目前为止，分离到病原是证实山羊传染性胸膜肺炎发生的唯一办法。然而分离山羊支原体肺炎亚种是一个漫长而艰难的过程，进行体外培养也较难，其对营养要求和培养条件比较苛刻，在很大程度上阻碍了对其的分离培养。除此之外，山羊支原体山羊肺炎亚种的基因组很小，其生物合成能力较低，生长需要外源性胆固醇、核酸前体、维生素等等，要想找到既便宜又能高密度培养该支原体的培养基组成需要很大的工作量去尝试、去筛选。因此，选择适宜的培养基及发酵条件是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种既便宜又能高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基及其发酵培养方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基。
本发明提供的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基为如下1)或2)或3)：
1)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％(质量分数)酵母浸液、10％(质量分数)醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠和葡萄糖；
2)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％(质量分数)酵母浸液、10％(质量分数)醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖和水解乳蛋白；
3)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％(质量分数)酵母浸液、10％(质量分数)醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、水解乳蛋白、水解酵母蛋白、水解酵母培养物和酪蛋白。
上述1)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-20％；进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-20％；更进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或20％。
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-12％；进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-12％；更进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或12％。
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1-0.2％；进一步的，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1％或0.2％。
所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-300μg/mL；进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-200μg/mL或200-300μg/mL；更进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100μg/mL或200μg/mL或300μg/mL。
所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.5％；进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.1％或2.1-2.5％；更进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5％或2.1％或2.5％。
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数可为0.1-10％；进一步的，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数可为0.1％或10％。
上述1)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基还包括消泡剂和溶剂。所述消泡剂在所述培养基中的质量分数可为0.1-0.2％。所述溶剂可为无菌水。在本发明的一个具体实施例中，所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基由灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、消泡剂和无菌水组成，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为10％，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为10％，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1％，所述青霉素在所述培养基中的浓度为200μg/mL，所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.4％，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为2.1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2％，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数为10％，所述消泡剂在所述培养基中的质量分数为0.2％。
上述2)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-20％；进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-20％；更进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或20％。
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-12％；进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-12％；更进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或12％。
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1-0.2％；进一步的，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1％或0.2％。
所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-300μg/mL；进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-200μg/mL或200-300μg/mL；更进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100μg/mL或200μg/mL或300μg/mL。
所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.5％；进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.1％或2.1-2.5％；更进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5％或2.1％或2.5％。
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数可为5-8％；进一步的，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数可为5-6％或6-8％；更进一步的，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数可为5％或6％或8％。
所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数可为4-10％；进一步的，所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数可为4％或10％。
上述2)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基还包括消泡剂和溶剂。所述消泡剂在所述培养基中的质量分数可为0.1-0.2％。所述溶剂可为无菌水。在本发明的一个具体实施例中，所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基由灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、水解乳蛋白、消泡剂和无菌水组成，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为10％，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为10％，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1％，所述青霉素在所述培养基中的浓度为200μg/mL，所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.4％，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为2.1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2％，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数为6％，所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数为4％，所述消泡剂在所述培养基中的质量分数为0.2％。在本发明的另一个具体实施例中，所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基由灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、水解乳蛋白、消泡剂和无菌水组成，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为10％，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为10％，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1％，所述青霉素在所述培养基中的浓度为200μg/mL，所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.4％，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为2.1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2％，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数为5％，所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数为10％，所述消泡剂在所述培养基中的质量分数为0.2％。
上述3)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-20％；进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-20％；更进一步的，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或20％。
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-12％；进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8-10％或10-12％；更进一步的，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数可为8％或10％或12％。
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1-0.2％；进一步的，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数可为0.1％或0.2％。
所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-300μg/mL；进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100-200μg/mL或200-300μg/mL；更进一步的，所述青霉素在所述培养基中的浓度可为100μg/mL或200μg/mL或300μg/mL。
所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述酚红在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.5％；进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5-2.1％或2.1-2.5％；更进一步的，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数可为1.5％或2.1％或2.5％。
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2-0.4％；进一步的，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数可为0.2％或0.4％。
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数可为6-8％；进一步的，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数可为6％或8％。
所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数可为2-4％；进一步的，所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数可为2％或4％。
所述水解酵母蛋白在所述培养基中的质量分数可为2-4％；进一步的，所述水解酵母蛋白在所述培养基中的质量分数可为2％或4％。
所述水解酵母培养物在所述培养基中的质量分数可为2-4％；进一步的，所述水解酵母培养物在所述培养基中的质量分数可为2％或4％。
所述酪蛋白在所述培养基中的质量分数可为0.5-2％；进一步的，所述酪蛋白在所述培养基中的质量分数可为0.5-1％或1-2％；更进一步的，所述酪蛋白在所述培养基中的质量分数可为0.5％或1％或2％。
上述3)中所述的用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基还包括消泡剂和溶剂。所述消泡剂在所述培养基中的质量分数可为0.1-0.2％。所述溶剂可为无菌水。在本发明的一个具体实施例中，所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基由灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、水解乳蛋白、水解酵母蛋白、水解酵母培养物、酪蛋白、消泡剂和无菌水组成，所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为10％，所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为10％，所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1％，所述青霉素在所述培养基中的浓度为200μg/mL，所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.4％，所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为2.1％，所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2％，所述葡萄糖在所述培养基中的质量分数为8％，所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数为2％，所述水解酵母蛋白在所述培养基中的质量分数为2％，所述水解酵母培养物在所述培养基中的质量分数为2％，所述酪蛋白在所述培养基中的质量分数为1％，所述消泡剂在所述培养基中的质量分数为0.2％。
上述任一所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基中，所述培养基的pH均为7.5。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述任一所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基的制备方法。
本发明提供的上述任一所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基的制备方法包括如下步骤：将上述1)或2)或3)所述培养基中的溶质与消泡剂和溶剂混匀，消毒，得到所述培养基。
进一步的，所述溶剂可为无菌水。
更进一步的，所述消毒的条件可为115-120℃灭菌15-25min。在本发明的一个具体实施例中，所述消毒的条件为115℃灭菌20min。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种的发酵培养方法。
本发明提供的山羊支原体山羊肺炎亚种的发酵培养方法包括将山羊支原体山羊肺炎亚种接种至上述任一所述用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基中进行发酵培养的步骤。
进一步的，所述山羊支原体山羊肺炎亚种在接种前还包括传代培养的步骤。所述传代培养方法具体如下：将山羊支原体山羊肺炎亚种接种至支原体培养基中进行培养，每6-7天传代一次，按培养基总量的5％进行接种传代，连续传代3-5代。所述支原体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：灭活马血清20％(体积分数)、25％酵母浸液10％(体积分数)、10％醋酸铊0.1％(体积分数)、青霉素200μg/mL、酚红0.4％(质量分数)、PPLO肉汤2.1％(质量分数)、丙酮酸钠0.2％(质量分数)、葡萄糖0.1％(质量分数)。
更进一步的，所述发酵培养的条件如下：厌氧、37℃、5％CO2、罐压0.03-0.04MPa、100-120rpm发酵培养50-70h。在本发明的一个具体实施例中，所述发酵培养的条件如下：厌氧、37℃、5％CO2、罐压0.03MPa、100rpm发酵培养50h或60h或70h。
上述任一所述培养基或方法中，所述山羊支原体山羊肺炎亚种可为山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.Capripneumonia)ZFY17，其保藏编号为CGMCCNo.18878。
本发明最后还提供了一株山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumonia)ZFY17。
本发明提供的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumonia)ZFY17的保藏编号为CGMCC No.18878。该山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17已于2019年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.18878。
本发明的有益效果：
1、采用本发明培养基发酵培养山羊支原体山羊肺炎亚种其生长滴度的增长幅度和变化规律与对照组基本是一致的，但本发明培养基的成本约为600元/L，而对照组培养基的成本约为1100元/L，生产成本大大降低。
2、采用本发明培养基在20L罐上发酵培养山羊支原体山羊肺炎亚种，不仅能够重现3L罐上的实验数据，而且比3L罐的生长滴度有所提高。
本发明采用葡萄糖、水解酵母蛋白、水解酵母培养物、水解乳蛋白和酪蛋白几种蛋白原料进行不同配比组合替代发酵培养基中的部分马血清，得到既便宜又能高密度培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基。通过实验证明：基于该培养基发酵培养山羊支原体山羊肺炎亚种使生长滴度最高达到了8次方的水平，且上升速度比较平稳，变化规律与对照组也比较一致，成本上比对照组有很大程度的降低。
保藏说明
菌种名称：山羊支原体山羊肺炎亚种
菌株编号：ZFY17
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年12月04日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18878
附图说明
图1为分离株ZFY17姬姆萨染色。
图2为分离株ZFY17和标准株固体培养基菌落形态。
图3为实验1组和对照组细菌生长曲线对比结果。
图4为实验2组和对照组细菌生长曲线对比结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所使用的试剂和溶液的来源如下：
灭活马血清是浙江联硕生物科技有限公司的产品，型号为26050088，品牌为GIBCO。
青霉素是北京索莱宝科技有限公司的产品，产品编号为YZ-130606。
酚红是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S19017-100G。
PPLO肉汤是青岛高科技工业园海博生物技术有限公司的产品，货号为HB8475。
丙酮酸钠是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S30226-500g。
葡萄糖是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S11022-500g。
果糖是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为TS0111-500g。
蔗糖是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S11055-500g。
水解乳蛋白是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S49770-250g。
酪蛋白是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S12002-500g。
消泡剂是上海源叶生物科技有限公司的产品，货号为S15026-250ml。
水解酵母蛋白是浙江湃肽生物有限公司的产品，CAS号为100684-36-4。
水解酵母培养物是达农威生物发酵工程技术(深圳)有限公司的产品，货号为IFN7-05-520。
25％(质量分数)酵母浸液的制备方法如下：称取250g酵母干粉，加入750mL无菌水，混匀，得到25％酵母浸液。酵母干粉是安琪酵母股份有限公司的产品，货号为81002166。
10％(质量分数)醋酸铊的制备方法如下：称取10g醋酸铊，加入无菌水定容至100mL，混匀，得到10％醋酸铊溶液。醋酸铊是北京永泽浩嘉生物技术发展中心的产品，CAS号为563-58-8。
下述实施例所使用的实验仪器与设备如下：LRH-150生化培养箱；HZC-280恒温振荡培养箱；DL-CJ-2DN洁净工作台；722型可见分光光度计；20L全自动发酵罐；高速冷冻离心机；倒置显微镜；精度0.01的电子秤；20μL-5000μL移液器；不锈钢安全酒精灯；二氧化碳储气瓶；氮气储气瓶；生物安全柜；水浴锅；离心管；酸度计；灭菌锅。
实施例1、菌株ZFY17的分离、鉴定与保藏
一、菌株ZFY17的分离培养
采集内蒙试验羊场中已临床诊断为患支原体性肺炎的山羊呼吸道分泌物，加少量生理盐水混合均匀，将组织液分装于1.5mL的EP管2000r/min离心2-3min，取上清0.3mL接种于支原体固体培养基(溶剂为无菌水，溶质及其浓度如下：灭活马血清20％、25％酵母浸液10％、10％醋酸铊0.1％、青霉素200μg/mL、酚红0.4％、PPLO肉汤2.1％、丙酮酸钠0.2％、葡萄糖0.1％、琼脂粉2％)中培养(37℃)，培养6-7天待培养基颜色变浅后用手术刀扣取单个菌落，接入支原体液体培养基(溶剂为无菌水，溶质及其浓度如下：灭活马血清20％、25％酵母浸液10％、10％醋酸铊0.1％、青霉素200μg/mL、酚红0.4％、PPLO肉汤2.1％、丙酮酸钠0.2％、葡萄糖0.1％)中进行传代和纯化。重复该步骤3-5次，最后将得到的单菌落培养物加10％的牛血清冻存备用，并将该菌株命名为ZFY17。
二、菌株ZFY17的鉴定
将纯化3代的菌株ZFY17进行姬姆萨染色，在光学显微镜的油镜下观察。同时，做标准对照，标准对照采用绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)标准株Y-98。
结果表明：在固体培养基中37℃培养6-7天后长出菌落，菌落大小不一，大的直径有0.8-1.0cm，小的直径只有0.2-0.3cm。姬姆萨染色油镜下观察，可见长杆状、球状、短杆状，多数菌体聚集排列，少数菌体单个存在，长短不一(图1)。进一步观察，分离的菌株4-5天开始增殖，菌落呈典型的煎蛋状(图2左)，与标准菌株(图2右)基本一致。
三、菌株ZFY17的保藏
经过上述鉴定表明：本发明分离得到的菌株ZFY17的分类命名为山羊支原体山羊肺炎亚种。山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17已于2019年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.18878。
实施例2、山羊支原体山羊肺炎亚种的培养
一、摇瓶条件下山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基优化实验
1、培养基设计
本发明以目前国内外公开发表的报道中一个比较典型的案例作为对照组培养基配方；采用葡萄糖、果糖、蔗糖、水解乳蛋白、酪蛋白分别替代部分马血清进行培养基优化，各实验组和对照组培养基配方具体见表1。
表1、各实验组和对照组培养基的溶质配方
名称 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5 实验组6 对照组
灭活马血清 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 20％
25％酵母浸液 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
10％醋酸铊 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
青霉素 200μg/mL 200μg/mL 200μg/mL 200μg/mL 200μg/mL 200μg/mL 200μg/mL
酚红 0.4％ 0.4％ 0.4％ 0.4％ 0.4％ 0.4％ 0.4％
PPLO肉汤 2.1％ 2.1％ 2.1％ 2.1％ 2.1％ 2.1％ 2.1％
丙酮酸钠 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％ 0.2％
葡萄糖 10％ 6％ - - 0.1％ 0.1％ 0.1％
果糖 - - 10％ - - - -
蔗糖 - - - 10％ - - -
水解乳蛋白 - 4％ - - 10％ - -
酪蛋白 - - - - - 10％ -
注：灭活马血清、25％酵母浸液和10％醋酸铊中的“％”表示在培养基中的体积分数；其他组分中的“％”表示在培养基中的质量分数。
2、实验室摇瓶条件下的菌株培养与验证实验
1)实验室摇瓶条件下的菌株培养
1-1)菌种的传代培养
将冻存的实施例1中分离得到的山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17稀释至对照组培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，每6-7天传代一次，按培养基总量的5％进行接种传代，连续传代3-5代，得到液体培养物，置4℃保存备用。
1-2)培养基的配制
按照表1所示配方配制各实验组和对照组的液体培养基。培养基消毒前pH调整为7.5，添加消泡剂(质量分数为0.2％)，用无菌水定容体积为12L，随后进行灭菌消毒，灭菌温度115℃，灭菌时间20min。备用。
1-3)菌种的发酵培养
取出4℃保存的液体培养物，按培养基总量的5％(体积分数)分别接种于6个实验组和对照组的液体培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，充入氮气，保持罐压0.03MPa，以恒速100rpm进行搅拌，发酵不同时间后进行生长滴度测定。生长滴度的具体测定步骤参照文献“高珊,逯忠新,许立华.山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定.动物医学进展,2012,33(2)；17-20.”中的方法。
结果如表2所示。由表2数据可以看出，实验组1和实验组2的培养效果比较好，生长滴度上升比较平稳，变化规律与对照组也比较一致，最高生长滴度达到了7次方的水平，成本上比对照组有很大程度的降低。
表2、实验室条件下菌株生长滴度比较(ccu/mL)
培养时间，h 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5 实验组6 对照组
0 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup>
10 1.6×10<sup>3</sup> 1.0×10<sup>3</sup> 4.5×10<sup>2</sup> 3.5×10<sup>2</sup> 1.0×10<sup>2</sup> 1.3×10<sup>3</sup> 7.2×10<sup>3</sup>
20 1.0×10<sup>4</sup> 9.7×10<sup>4</sup> 6.7×10<sup>3</sup> 9.3×10<sup>3</sup> 7.2×10<sup>2</sup> 1.7×10<sup>4</sup> 3.3×10<sup>4</sup>
30 1.4×10<sup>5</sup> 4.2×10<sup>5</sup> 4.0×10<sup>4</sup> 3.3×10<sup>4</sup> 4.2×10<sup>3</sup> 3.1×10<sup>5</sup> 5.9×10<sup>5</sup>
40 1.8×10<sup>6</sup> 9.7×10<sup>5</sup> 9.2×10<sup>4</sup> 5.4×10<sup>4</sup> 9.7×10<sup>4</sup> 7.1×10<sup>5</sup> 2.7×10<sup>7</sup>
50 2.2×10<sup>6</sup> 2.1×10<sup>6</sup> 3.6×10<sup>5</sup> 4.1×10<sup>4</sup> 2.1×10<sup>5</sup> 8.6×10<sup>6</sup> 5.9×10<sup>7</sup>
60 4.9×10<sup>7</sup> 3.3×10<sup>7</sup> 3.8×10<sup>5</sup> 3.3×10<sup>5</sup> 3.7×10<sup>5</sup> 7.9×10<sup>6</sup> 6.6×10<sup>8</sup>
70 2.7×10<sup>7</sup> 1.0×10<sup>7</sup> 1.5×10<sup>5</sup> 1.0×10<sup>5</sup> 1.3×10<sup>6</sup> 3.4×10<sup>6</sup> 1.4×10<sup>9</sup>
80 1.7×10<sup>4</sup> 1.2×10<sup>4</sup> 2.1×10<sup>4</sup> 1.2×10<sup>3</sup> 1.9×10<sup>5</sup> 1.2×10<sup>4</sup> 2.9×10<sup>5</sup>
90 3.3×10<sup>3</sup> 1.6×10<sup>3</sup> 1.1×10<sup>2</sup> 1.6×10<sup>2</sup> 2.7×10<sup>3</sup> 6.6×10<sup>2</sup> 9.0×10<sup>4</sup>
100 1.2×10<sup>2</sup> 2.2×10<sup>2</sup> 1.8×10<sup>1</sup> 1.1×10<sup>2</sup> 6.4×10<sup>2</sup> 2.2×10<sup>2</sup> 1.1×10<sup>3</sup>
2)实验室摇瓶条件下的验证试验
2-1)菌种的传代培养
同步骤1)的1-1)。
2-2)培养基的配制
同步骤1)的1-2)中的实验组1、实验组2和对照组。
2-3)菌种的发酵培养
取出4℃保存的液体培养物，按培养基总量的5％(体积分数)分别接种于实验组1、实验组2和对照组的液体培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，充入氮气，保持罐压0.03MPa，以恒速100rpm进行搅拌，发酵。
每个处理组平行做三个实验瓶，实验过程中，检测pH、活菌计数，记录三个样品的平均数据，并绘制生长曲线。
结果如表3、图3和图4所示。实验组1、实验组2和对照组不同培养时间的细菌生长滴度、细菌数和pH值的对比结果见表3；实验组1和对照组的生长曲线对比结果见图3，实验组2和对照组的生长曲线对比结果见图4。
由表3和图3可知，实验组1在生长过程中，其pH的变化与对照组的变化规律是一致的，其生长滴度的增长幅度比对照组略低一些，但其变化规律同对照组是一致的。从原料的成本来看，相对于对照组，实验组1培养基的生产成本大大降低(对照组培养基的成本约为1100元/L，实验组1培养基的成本约为600元/L)，说明用葡萄糖替代了50％的马血清是有效的，性价比显著提高。
由表3和图4可知，实验组2在生长过程中，其pH的变化与对照组的变化规律是很相似的，其生长滴度的增长幅度比对照组略低一些，但其变化规律同对照组是一致的。从原料的成本来看，实验组2中，用葡萄糖替代了30％的马血清，用水解乳蛋白替代了20％的马血清，生产成本的降低也很明显(对照组培养基的成本约为1100元/L，实验组2培养基的成本约为650元/L)，说明这样的替代也是有效的、可行的。
表3、不同实验组细菌生长滴度、细菌数与pH值对比结果
Figure BDA0002402320050000111
二、3L发酵罐实验
采用实验组1的配方，在3L发酵罐上做放大实验。具体步骤如下：
1、菌种的传代培养
将冻存的实施例1分离得到的山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17稀释至对照组培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，每6-7天传代一次，按培养基总量的5％进行接种传代，连续传代3-5代，得到液体培养物，置4℃保存备用。
2、培养基的配制
按照表4所示配方(与表1中的实验组1一致)配制液体培养基。培养基消毒前pH调整为7.5，添加消泡剂(质量分数为0.2％)，用无菌水定容体积为3L，随后进行灭菌消毒，灭菌温度115℃，灭菌时间20min。备用。
表4、3L发酵罐培养基的溶质配方
Figure BDA0002402320050000121
注：灭活马血清、25％酵母浸液和10％醋酸铊中的“％”表示在培养基中的体积分数；其他组分中的“％”表示在培养基中的质量分数。
3、菌种的发酵培养
取出4℃保存的液体培养物，按培养基总量的5％(体积分数)接种于表4中的液体培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，充入氮气，保持罐压0.03MPa，以恒速100rpm进行搅拌，发酵。接种后每4小时取样一次，检测pH、生长滴度、镜检。
结果如表5所示。从表5中数据可以看出，在3L罐培养条件下，采用厌氧培养，能够重现出摇瓶实验的数据，说明这个替代是可行的。
表5、3L发酵罐培养实验结果
培养时间，h pH 生长滴度，ccu/mL 镜检(无菌情况)
0 7.49 1.2×10<sup>2</sup> (-)
10 7.41 1.7×10<sup>3</sup> (-)
20 7.41 2.1×10<sup>4</sup> (-)
30 7.30 1.9×10<sup>5</sup> (-)
40 7.15 3.8×10<sup>6</sup> (-)
50 6.65 4.6×10<sup>6</sup> (-)
60 6.32 5.1×10<sup>7</sup> (-)
70 6.48 3.9×10<sup>7</sup> (-)
80 6.90 5.8×10<sup>4</sup> (-)
90 7.06 3.9×10<sup>3</sup> (-)
100 7.18 2.1×10<sup>2</sup> (-)
三、20L发酵罐实验
在3L罐研究的基础上，在20L罐进行工艺放大。继续寻找替代原料，优化培养基配比，降低生产成本。具体步骤如下：
1、培养基设计
采用葡糖糖、水解酵母蛋白、水解酵母培养物、水解乳蛋白、酪蛋白组合替代部分马血清，各实验组和对照组培养基配方具体见表6。
表6、20L发酵罐培养实验培养基的溶质配方
Figure BDA0002402320050000122
Figure BDA0002402320050000131
注：灭活马血清、25％酵母浸液和10％醋酸铊中的“％”表示在培养基中的体积分数；其他组分中的“％”表示在培养基中的质量分数。
2、20L发酵罐条件下的菌株培养与验证实验
1)20L发酵罐条件下的菌株培养
1-1)菌种的传代培养
将冻存的实施例1中分离得到的山羊支原体山羊肺炎亚种ZFY17稀释至对照组培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，每6-7天传代一次，按培养基总量的5％进行接种传代，连续传代3-5代，得到液体培养物，置4℃保存备用。
1-2)培养基的配制
按照表6所示配方配制各实验组和对照组的液体培养基。培养基消毒前pH调整为7.5，添加消泡剂(质量分数为0.2％)，用无菌水定容体积为20L，随后进行灭菌消毒，灭菌温度115℃，灭菌时间20min。备用。
1-3)菌种的发酵培养
取出4℃保存的液体培养物，按培养基总量的5％(体积分数)分别接种于6个实验组和对照组的液体培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，充入氮气，保持罐压0.03MPa，以恒速100rpm进行搅拌，发酵不同时间后进行生长滴度和pH测定。
结果如表7和表8所示。从表7和表8中的数据可以看出，实验组7和实验组8的培养效果较好，生长滴度上升比较平稳，变化规律与对照组也比较一致，最高生长滴度达到了8次方的水平，且其pH的变化与对照组的规律是很相似的，而成本上比对照组有很大程度的降低。在20L发酵罐上采用厌氧培养，不仅能够重现3L发酵罐实验的数据，而且比3L发酵罐的生长滴度有所提高。说明采用葡萄糖、水解酵母蛋白、水解酵母培养物、水解乳蛋白和酪蛋白几种蛋白原料进行不同配比组合替代部分马血清的方案是可行的。
表7、20L发酵罐培养实验各实验组生长滴度对比(ccu/mL)
Figure BDA0002402320050000132
Figure BDA0002402320050000141
表8、20L发酵罐培养实验各实验组发酵过程中pH值对比
培养时间，h 实验组7 实验组8 实验组9 实验组10 实验组11 实验组12 对照组
0 7.45 7.39 7.43 7.50 7.46 7.50 7.49
10 7.38 7.40 7.29 7.39 7.15 7.46 7.47
20 7.24 7.32 7.35 7.21 6.92 7.35 7.45
30 6.84 7.02 7.25 7.26 6.78 7.20 7.21
40 6.39 7.00 7.16 7.31 7.05 7.01 6.81
50 6.45 6.98 7.09 7.21 7.23 6.96 6.67
60 6.37 6.92 7.30 7.26 7.38 7.03 6.27
70 6.95 6.96 7.32 7.21 7.46 7.25 6.81
80 7.36 7.32 7.45 7.15 7.59 7.38 7.04
90 7.38 7.42 7.58 7.24 7.68 7.49 7.21
100 7.42 7.65 7.76 7.38 7.82 7.52 7.25
2)20L发酵罐条件下的验证实验
2-1)菌种的传代培养
同步骤1)的1-1)。
2-2)培养基的配制
同步骤1)的1-2)中的实验组7和对照组。
2-3)菌种的发酵培养
取出4℃保存的液体培养物，按培养基总量的5％(体积分数)分别接种于实验组7和对照组的液体培养基中，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，充入氮气，保持罐压0.03MPa，以恒速100rpm进行搅拌，发酵。实验过程中，检测生长滴度、pH、活菌计数。
结果如表9所示。从表9中的数据可以看出，实验组7在生长过程中，其pH的变化与对照组的规律是很相似的，其生长滴度的增长幅度比对照组略低一些，但其变化规律同对照组是一致的。采用其他原料替代部分马血清后生产成本的降低也很明显(对照组培养基的成本约为1100元/L，实验组7培养基的成本约为640元/L)，通过验证试验再次说明这样的替代也是有效的、可行的。
表9、20L发酵罐验证试验结果
Figure BDA0002402320050000151
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种的培养基，为如下1)或2)或3)：
1)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠和葡萄糖；
2)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖和水解乳蛋白；
3)所述培养基的溶质包括灭活马血清、25％酵母浸液、10％醋酸铊、青霉素、酚红、PPLO肉汤、丙酮酸钠、葡萄糖、水解乳蛋白、水解酵母蛋白、水解酵母培养物和酪蛋白。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述1)中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为8-20％；
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为8-12％；
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1-0.2％；
所述青霉素在所述培养基中的浓度为100-300μg/mL；
所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为1.5-2.5％；
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数为0.1-10％。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述2)中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为8-20％；
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为8-12％；
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1-0.2％；
所述青霉素在所述培养基中的浓度为100-300μg/mL；
所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为1.5-2.5％；
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数为5-8％；
所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数为4-10％。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述3)中，
所述灭活马血清在所述培养基中的体积分数为8-20％；
所述25％酵母浸液在所述培养基中的体积分数为8-12％；
所述10％醋酸铊在所述培养基中的体积分数为0.1-0.2％；
所述青霉素在所述培养基中的浓度为100-300μg/mL；
所述酚红在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述PPLO肉汤在所述培养基中的质量分数为1.5-2.5％；
所述丙酮酸钠在所述培养基中的质量分数为0.2-0.4％；
所述葡糖糖在所述培养基中的质量分数为6-8％；
所述水解乳蛋白在所述培养基中的质量分数为2-4％；
所述水解酵母蛋白在所述培养基中的质量分数为2-4％；
所述水解酵母培养物在所述培养基中的质量分数为2-4％；
所述酪蛋白在所述培养基中的质量分数为0.5-2％。
5.根据权利要求1-4任一所述的培养基，其特征在于：
所述培养基还包括消泡剂和溶剂；
或，所述消泡剂在所述培养基中的质量分数为0.1-0.2％；
或，所述溶剂为无菌水；
或，所述培养基的pH均为7.5。
6.权利要求1-5任一所述培养基的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-5中任一所述培养基中的溶质与消泡剂和溶剂混匀，消毒，得到所述培养基。
7.一种山羊支原体山羊肺炎亚种的发酵培养方法，包括将山羊支原体山羊肺炎亚种接种至权利要求1-5任一所述的培养基或按照权利要求6所述制备方法制备得到的培养基中进行发酵培养的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件如下：厌氧、37℃、5％CO2、罐压0.03-0.04MPa、100-120rpm发酵培养50-70h。
9.根据权利要求1-5任一所述的培养基或权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述山羊支原体山羊肺炎亚种为山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumonia)ZFY17。
10.山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.Capripneumonia)ZFY17，其保藏编号为CGMCC No.18878。
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