CN118956701B - 一种昏睡嗜血杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种昏睡嗜血杆菌菌株及其应用，昏睡嗜血杆菌菌株为昏睡嗜血杆菌H.S/NMG/2023，其保藏号为CGMCC No.31702。本发明提供了一株传代稳定，产菌数高，致病性强，免疫原性好的昏睡嗜血杆菌菌株，将其制备成灭活疫苗免疫小鼠后，能够针对流行的昏睡嗜血杆菌致病菌株，产生有效且稳定的免疫保护效果，且安全性良好，为牧区昏睡嗜血杆菌病的防控和治疗提供重要的医用价值，具有深远而重大的实际应用意义。

Description

一种昏睡嗜血杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种昏睡嗜血杆菌菌株及其应用。

背景技术

牛昏睡嗜血杆菌病是由昏睡嗜血杆菌(Haemophilus somnus)引起的多系统疾病，感染系统器官包括神经、呼吸、消化、肾脏、肌肉、骨骼和生殖等，因而有时称为昏睡嗜血杆菌综合征。首先H.somnus是牛上呼吸道中常见共生菌，也是导致牛呼吸道疾病（BRDC）的四种主要细菌之一，这种疾病在饲养场牛群中最为常见。H.somnus还能引起牛的其他形式的全身性疾病，包括败血症、心肌炎、关节炎和血栓闭塞性脑膜脑炎（ITME）。此外，它也是一种公认的导致牛流产和生殖疾病的病原体，包括不孕症和子宫内膜炎。昏睡嗜血杆菌单独感染或与其他病原体混合感染时可引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC),上呼吸道感染引起化脓性喉炎和气管炎，下呼吸道感染引起卡他性肺炎、化脓性肺炎、血栓栓塞性脑膜脑炎(TEME)、关节炎、纤维素性胸膜炎、心包炎及与败血性心血管坏死导猝死等。昏睡嗜血杆菌引起BRDC，病牛和隐性带菌牛是主要传染源，多发生于肉牛，泌乳牛、放牧牛也有发生,无明显季节性，但冬、春季潮湿阴冷聚变的气候多发。它是一种条件性致病菌,饲养应激、运输应激以及断乳应激等往往能导致牛群发病。目前,国内对牛呼吸道型昏睡嗜血杆菌病的相关报道非常少。国外病例中,在有呼吸道症状的牛群中有59.6%的反应阳性率，说明该病的呼吸道型感染率较高。国外研究资料显示，产犊后27周乳牛群，有55%的公、母、犊牛发生生殖道感染，母牛生殖道中本菌检出率为33-76%，该菌与流产和不孕有关，感染了昏睡嗜血杆菌的怀孕母牛在任何阶段都有发生流产的可能。

昏睡嗜血杆菌（Haemophilus somnus）在细菌分类学中属于变形杆菌纲、γ-变形菌纲、巴斯德氏菌目、巴斯德菌科、嗜血菌属。昏睡嗜血杆菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性多形性小型球杆菌,大小为1.0ｕm或者更短，呈短链或纤维状，没有运动性，没有芽孢且缺少鞭毛。在脑心浸液血液固体培养基上，37℃、5%~10%的CO₂环境中培养24~48h，形成黄色或灰白色奶油状圆形针尖状透明凸起小菌落，且湿润有光泽，直径1~2mm，菌株呈现β溶血性、α溶血性溶血性或非溶血性仅使培养基微变绿多种形态。其生长需要动物组织或细菌提取物中生长因子，但不依赖X和V因子。昏睡嗜血杆菌在体外存活时间很短。资料显示，其在23.5℃下在鼻粘液或血液中可存活70天以上，在阴道粘液中可存活5天以上，在排出的尿液中存活的时间下超过两小时（Frederick,W.等，1989）。

目前，对于发生牛昏睡嗜血杆菌疫病流行的地区，主要采取一些减少或降低对动物应激反应的预防措施，发生疫病后只能采取对症治疗，普遍采用的方法是大范围使用抗生素，虽有一定的防治效果，但抗生素的作用一旦消失，可再次发生重复感染，也极易导致具备多种药物抗性菌株变种的出现。对牛昏睡嗜血杆菌疫病防控的最有效策略是免疫预防，提前充分考虑免疫间隔期,通过免疫接种疫苗以减少牛群对昏睡嗜血杆菌的感染。目前国外已有使用菌苗间隔一定时间两次免疫降低发病率和死亡率的有关报道，但目前我国对昏睡嗜血杆菌病的研究报道较少,尤其是昏睡嗜血杆菌分离鉴定及疫苗研制方面更是少之又少，因此，成功分离鉴定出昏睡嗜血杆菌菌株并研制出有效的疫苗对于昏睡嗜血杆菌病的防治具有重大的意义。

发明内容

（一）解决的技术问题

本发明提供了一种昏睡嗜血杆菌菌株及其应用，该菌株经最适固体培养基多代次纯化分离培养，为当前昏睡嗜血杆菌病流行菌株，在培养基中均能稳定传代，且产菌数高，致病性强，免疫原性好。将其制备成灭活疫苗能够针对流行的昏睡嗜血杆菌致病菌株，产生有效且稳定的免疫保护效果，为有效的疫苗制备和昏睡嗜血杆菌病的防控提供了基础。

（二）技术方案

第一方面，本发明提供了一种昏睡嗜血杆菌菌株，该菌株已于2024年8月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101，分类命名：睡眠嗜血杆菌，拉丁文学名：Haemophilus somnus，保藏编号为CGMCC No.31702。

第二方面，本发明提供了上述昏睡嗜血杆菌菌株在药物或试剂制备中的应用，所述药物或试剂用于治疗、预防或诊断昏睡嗜血杆菌所致疾病。

第三方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗含有所述的昏睡嗜血杆菌或其培养物。

基于第三方面，进一步地，所述疫苗包括含有由所述昏睡嗜血杆菌或其培养物制备得到灭活的抗原以及佐剂。

较优地，所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂，其中所述佐剂和抗原的体积比为1:3～1:7。

较优地，疫苗中的所述抗原的有效含量不低于5×10⁹CFU/ml。

第五方面，本发明提供了一种疫苗的制备方法，制备方法包括：

步骤1、发酵培养所述的昏睡嗜血杆菌菌株菌液；

步骤2、将步骤1中的菌液进行浓缩、灭活，获得灭活的抗原菌液；

步骤3、将获得的灭活抗原菌液与佐剂混匀，制备得到灭活疫苗。

进一步地，所述步骤1具体包括：

1）一级种子繁殖：将昏睡嗜血杆菌菌株菌液接种于脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，置于37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，然后划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血平板，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，挑选典型菌落，分别接种脑心浸液酵母浸提膏血斜面若干支，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，作为一级种子，在2～8℃保存用于扩大培养，使用期不超过7日；

2)二级种子繁殖：取一支步骤1.1）中的一级种子，用脑心浸液酵母浸提膏液体培养基将脑心浸液酵母浸提膏血斜面上的菌苔冲下下来，接种于脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，置37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，经纯粹检验合格后，在2～8℃保存，作为二级种子；

3)发酵菌液制备：菌液培养采用摇瓶培养昏睡嗜血杆菌菌液，将脑心浸液酵母浸提膏液体培养基中按2％(v/v)的量加入二级种子液，混合均匀37℃，5%的CO₂环境中培养 8～12h获得昏睡嗜血杆菌菌株菌液。

进一步地，所述步骤2具体包括：

1)发酵菌液浓缩：采用离心的方法对发酵菌液进行浓缩，其中离心条件为：3500r/min，4℃，离心20min，随后收集菌体沉淀，并用pH 7 .2～7 .4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液；

2)发酵菌液灭活：按浓缩菌液量的0 .1％～0 .2％(v/v)加入甲醛溶液，37℃灭活8～10小时，期间摇匀数次，制备得到灭活抗原菌液；

进一步地，所述步骤3具体包括：在乳化罐中先加入步骤2获得的灭活抗原菌液，低速搅拌后再按1份佐剂和5份抗原菌液体积比例缓慢加入氢氧化铝胶佐剂，搅拌使其充分混合，制备得到灭活疫苗。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一株传代稳定，产菌数高，致病性强，免疫原性好的呼昏睡嗜血杆菌菌株，经实施例结果证明，利用该菌株作为抗原制备的牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗免疫小鼠后，能够针对流行的昏睡嗜血杆菌致病菌株，产生有效且稳定的免疫保护效果，且安全性良好。因此本发明提供的灭活疫苗预期可以对牧区昏睡嗜血杆菌病提供良好的预防效果，并且无潜在的安全性风险，为昏睡嗜血杆菌病的防控和治疗提供重要的医用价值，具有深远而重大的实际应用意义。

附图说明

图1为H.S/NMG/2023菌株划线接种培养菌落照片。

图2为H.S/ NMG/2023菌株革兰氏染色后的镜检照片。

图3为H.S/ NMG/2023菌株特异性PCR定量检测S形曲线图。

图4 为H.S/ NMG/2023菌株16SrDNA测序凝胶电泳图。

图5为现有国外公开H.S菌株信息图。

图6为H.S/ NMG/2023菌株16SrDNA测序同源性分析结果图。

图7为H.S/ NMG/2023菌株16SrDNA测序进化树分析结果图。

图8为的H.S/ NMG/2023菌株P7代生长曲线。

其中，所述提供牛昏睡嗜血杆菌菌株H.S/NMG/2023已于2024年8月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101，分类命名：睡眠嗜血杆菌，拉丁文学名：Haemophilussomnus；保藏编号为CGMCC No.31702。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1：牛昏睡嗜血杆菌菌株的分离和鉴定

1.1 培养基、病料

脑心浸液酵母浸提膏类培养基（脑心浸液厂家：广东环凯微生物科技有限公司，货号：028360；酵母浸提膏厂家：广东环凯微生物科技有限公司，货号：050070；马血清厂家：呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司）通过市售途径获得不同原料组份自行配制；病料为2023年采于内蒙古自治区昏睡嗜血杆菌阳性牛场的鼻拭子和病变肺组织。

需要说明的是，本发明中所提及的脑心浸液酵母浸提膏类培养基、脑心浸液酵母浸提膏血琼脂平板如无特殊说明，其成份及配比均一致。

1.2分离培养

将从内蒙古呼和浩特市各林格尔县采集病牛的鼻拭子和病变肺组织划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血琼脂平板中，5%CO₂恒温箱中37℃培养16～20h，其中只有1株阳性病料在血琼脂平板上出现可疑昏睡嗜血杆菌菌落，挑取其中可疑菌落(灰白色奶油状圆形针尖状透明凸起小菌落，湿润有光泽，微溶血性，菌株连续传代培养后，溶血性会减弱或消失，使培养基微变绿多种形态，如图1所示，左图为培养16h菌落，右图为培养72h老龄菌落)，无菌操作抹片，进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态及染色结果，结果如图２所示，可见革兰氏染色后，镜下观察到呈多形性、革兰氏阴性小球短杆菌，呈短链或纤维状排列。

1.3定量PCR特异性引物鉴定

1)蘸取上述经镜检的可疑昏睡嗜血杆菌多个单菌落，分别接种于适量脑心浸液酵母浸提膏培养基(编号1-8，含0.5%的酵母浸提膏及２％血清)中，5%CO₂恒温箱中37℃培养8～12h，获得细菌培养液；

2)取上述细菌培养液各200μL作为检测样品(对应脑心浸液酵母浸提膏培养基编号1-8)，分别提取基因组DNA，并以此作为模板，进行牛昏睡嗜血杆菌基因特异性PCR荧光定量检测 (徐丽媛等，牛昏睡嗜血杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针，中国发明专利，公开号：CN116219044A，公开日：2023.06.06 ，主分类号：C12Q1/689)，菌株特异性PCR定量检测S形曲线图如图3所示，可见除了3和5号样品未出现荧光定量特征性S形曲线外，其余6个样本均出现特征性S形曲线，鉴定为昏睡嗜血杆菌阳性。

1.4、16SrDNA测序鉴定

将上述PCR鉴定后的牛昏睡嗜血杆菌菌液(对应编号1-2、4、6-8)分别划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血琼脂平板上纯化，并接种于脑心浸液酵母浸提膏液体培养基（含0.5%的酵母浸提膏及２％血清），连续纯化，然后用16SrDNA基因序列(片段大小为1493bp)引物

(F:ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT，R:CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，取少量PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳(可见大小约为1493bp的目的条带，与预期大小相符，电泳结果如图4所示，1-6号分别对应编号1、2、4、6、7、8号菌株)。将扩增PCR产物送生工生物工程（北京）股份有限公司测序并将结果拼接，测序结果在NCBI进行BLAST在线比对分析，其中4个菌株(对应编号2、6、7、8)确定为昏睡嗜血杆菌阳性。

将4个菌株序列与GenBank数据库中下载参考序列进行同源性比对，并进行遗传进化分析。它们16SrDNA基因序列与6个昏睡嗜血杆菌参考基因核苷酸序列同源性比对结果在99.5％～99.8％，与本公司2024年分离生殖道菌株H.S/JS/2024核苷酸序列同源性为99.4％（图6），4个菌株同源性100%，与当前流行参考菌株同源性均非常接近，此分离菌株能够做为预防当前临床流行昏睡嗜血杆菌病的疫苗备选菌株。

1.5生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》中记载的巴氏杆菌科、嗜血菌属生化特性，将上述经定量PCR特异性引物鉴定和16SrDNA测序鉴定的昏睡嗜血杆菌菌液4株分别进行糖发酵试验（蕈糖、葡萄糖、果糖、肌醇、棉仔糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、木糖、乳糖）、VP试验、MR试验、硝酸盐还原试验。方法和结果判定参照所购生化鉴定管说明书。4株分离菌株生化鉴定结果一致，符合《伯杰细菌鉴定手册》及文献记载中该菌属的生化特性。

备注：“+”表示阳性；“—”表示阴性

1.6菌落计数及生长曲线测定

1）将昏睡嗜血杆菌菌液分别用脑心浸液酵母浸提膏液体培养基进行10倍梯度稀释。选3个适宜的连续稀释度（10^-6，10^-7，10^-8），用移液器吸取100µl滴脑心浸液酵母浸提膏血琼脂平板（商购不同组份自行配制，成份为脑心浸液及含有0.5%酵母浸提膏，1.5%琼脂，5%无菌的脱脂脱纤羊血，充分混匀铺于平板4℃保存备用），每个稀释度平行3板，倒置于5%CO₂恒温箱中37℃培养16～20h，观察每块培养平皿菌落生长情况，对每块培养平皿进行菌落计数。

2）取昏睡嗜血杆菌培养菌液做菌种生长曲线，每2h取一次培养菌液滴脑心浸液酵母浸提膏血琼脂平板，一直取到24h结束，每次取样后的平皿放入5%CO₂恒温箱中37℃培养16～20h使之形成菌落。汇总每个时间段的菌落计数结果（两块培养平皿菌落计数取平均值）绘制生长曲线，见图8。

1.7小鼠毒力筛选

1）菌株培养，将纯化后鉴定为昏睡嗜血杆菌阳性4株菌株分别按2％(v/v)的接种量接种于脑心浸液酵母浸提膏加2%血清液体培养基，置37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，获得培养菌液划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血平板，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，显微镜下挑选典型菌落，分别接种脑心浸液酵母浸提膏血斜面若干支，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h。用脑心浸液酵母浸提膏培养基将1支血斜面上的菌苔冲洗后，接种于200ml脑心浸液酵母浸提膏培养基，置5%CO₂恒温箱中37℃培养8～12h。

2）毒力试验，选取体重18～22g健康易感小鼠10只，分5组，每组2只分别腹腔注射4株新鲜培养菌液及液体培养基对照（0.2ml/只），观察3日，记录死亡情况。

备注：“G-”表示革兰氏染色阴性，“+”表示PCR鉴定为阳性。

由表2可见，编号为2和6的纯化菌株毒力较强，2只小鼠全部致死，结合前面菌株生长曲线测定中菌株生长情况，筛选出6号菌株做为研制疫苗候选菌株，命名为H.S/NMG/2023株。在菌株纯化分离培养过程，本发明筛选了大量牛昏睡嗜血杆菌病阳性病料的鼻拭子及肺组织进行平血划线传代培养，仅有1株阳性样本经连续挑菌划线纯化培养，获得典型菌落生长。在传代过程中对来源于1株阳性样本的单个典型菌落持续挑菌划线，获得多个纯化克隆株菌，经液体培养基放大培养及革兰氏染色镜检、特异性引物定量检测、16SrDNA测序、生长曲线测定、小鼠致病力测定等，发现一部分菌株纯化困难无法连续传代，还有些菌株生长菌数偏低，菌种毒力偏弱。经过大量筛选后，仅发现了两株既具有较好的传代稳定性又具有较高毒力的菌株，结合生长曲线测定中生长情况，挑选菌落数最高的一株，经免疫原性试验验证，获得了本发明致病性强，免疫原性好的保藏菌株H.S/NMG/2023。

实施例2：牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗的制备

在该实施例中，利用上述实施例1中分离获得的牛昏睡嗜血杆菌菌株H.S/NMG/2023株制备牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗，具体包括以下步骤。

2.1对牛昏睡嗜血杆菌H.S/NMG/2023株进行发酵培养，获得发酵菌液，具体为：

1)一级种子繁殖：将牛昏睡嗜血杆菌H.S/NMG/2023株菌种200μL接种于10mL脑心浸液酵母浸提膏液体培养基(含0.5%酵母浸提膏及2%马血清的脑心浸液，于4℃保存备用)，置37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，然后划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血平板（商购不同组份自行配制，成份为脑心浸萃液及含有0.5%酵母浸提膏，1.5%琼脂，5%无菌的脱脂脱纤羊血，充分混匀铺于平板4℃保存备用），37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，挑选典型菌落，分别接种脑心浸液酵母浸提膏血斜面若干支，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，作为一级种子，在2～8℃保存用于扩大培养，使用期不超过7日。

2)二级种子繁殖：取一支一级种子，用4mL脑心浸液酵母浸提膏液体培养基（同上）将脑心浸液酵母浸提膏血斜面上的菌苔冲下来，接种于200mL脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，置37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，经纯粹检验合格后，在2～8℃保存，作为二级种子；

3)发酵菌液制备：菌液培养采用摇瓶培养昏睡嗜血杆菌菌液。将脑心浸液酵母浸提膏液体培养基（同上）中按2％(v/v)的量加入二级种子液，混合均匀37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h。

菌液培养完成后，取样按2015版《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹；同时取样进行活菌计数。

2.2将步骤2.1获得的发酵菌液进行浓缩，灭活，获得灭活抗原菌液，具体为：

1)发酵菌液浓缩：采用离心的方法对发酵菌液进行浓缩，其中离心条件为：3500r/min，4℃，离心20min，随后收集菌体沉淀，并用pH7.2～7.4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液；

2)发酵菌液灭活：按浓缩菌液量的0.1％～0.2％(v/v)加入甲醛溶液，37℃灭活8～10小时，期间摇匀数次，制备得到灭活抗原菌液。灭活检验按2015版《中国兽药典》附录进行灭活检验，应无菌生长。

2.3将步骤2.2获得的灭活抗原菌液与氢氧化铝胶佐剂按照体积比3:1～7:1(优选5:1)混匀，制备得到灭活疫苗，具体为：

在乳化罐中先加入步骤2.2获得的灭活抗原菌液，低速搅拌5分钟，再按1份佐剂5份抗原菌液体积比例缓慢加入氢氧化铝胶佐剂，充分搅拌15～20分钟，使其充分混合。经验证，最终疫苗中含H.S/NMG/2023株抗原不低于5×10⁹CFU/ml。按2015版《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

2.4分装

经上述无菌检验合格后，定量分装，分装期间应随时搅拌，使其混合均匀，加塞密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。

按照以上方法步骤，该实施例利用H.S/NMG/2023株共制备了三批次牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗(疫苗批号为：S24001、S24002、S24003)。

2.5疫苗产品检测

1）性状：静置后上层为澄清液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2）装量检查：按现行《中国兽药典》三部附录进行检验，符合规定。

3）无菌检验：按现行《中国兽药典》三部附录进行检验，无菌生长。

4）安全检验：随机抽取各批次疫苗产品(疫苗批号为：S24001、S24002、S24003)中的疫苗进行检验，对每批次疫苗均进行安全检验。检验方法为：使用体重350～450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml；用体重18～22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.5ml，逐日观察7日。经过检测，各批次疫苗注射下的豚鼠及小鼠均不出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应。

2.6牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

1）小鼠最小致死量测定按照实施例2步骤制备1批新鲜菌液，批号为JY23001。选取体重18～22g小鼠20只，随机分为四组，每组5只。其中三组分别腹腔注射菌液0.2ml（含活菌2×10⁹CFU/只、4×10⁸CFU/只、8×10⁷CFU/只），剩余5只作为对照，注射相同体积的脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，观察5日。其中注射活菌2×10⁹CFU/只、4×10⁸CFU/只的小鼠于5日内全部死亡，注射活菌8×10⁷CFU/只的小鼠死亡2只，对照小鼠均健活，结果见表3，表明牛昏睡嗜血杆菌H.S/NMG/2023株采用腹腔注射的方式对18～22g小鼠的最小致死剂量为4×10⁸CFU/只。

2）免疫攻毒将15只健康小鼠随机分为3组，每组5只，将上述实施例2制备的三批次疫苗(S23001、S23002、S23003)分别以0.2ml剂量通过小鼠皮下接种，另设条件相同的5只对照小鼠，按照相同的方法接种灭菌PBS作为对照。接种后21日后,使用相同剂量相同接种方式进行二次免疫，二免后14日，对15只免疫小鼠和5只对照小鼠分别进行牛昏睡嗜血杆菌攻毒(H.S/NMG/2023株菌液，攻毒剂量为4×10⁸CFU)，随后连续观察10日，观察小鼠死亡情况，判定保护情况。试验结果见下表4。

由上表4结果可知：使用牛昏睡嗜血杆菌对免疫相应灭活疫苗二免14日后小鼠进行攻毒，三批疫苗中S23001和S23002批次均表现出5/5的免疫保护效果，S230032表现出4/5的免疫保护效果。而对对照小鼠攻毒后5只均死亡。表明本发明制备的牛昏睡嗜血杆菌灭活疫苗在接种小鼠后，可以使免疫小鼠获得对攻毒菌株较为稳定的有效保护。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种昏睡嗜血杆菌菌株，其特征在于，所述昏睡嗜血杆菌菌株（Haemophilus somnus）的保藏号为CGMCC No.31702。

2.一种如权利要求1所述的昏睡嗜血杆菌菌株在制备治疗或预防昏睡嗜血杆菌病的药物中的应用。

3.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1所述的昏睡嗜血杆菌，或其培养物。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括含有由所述昏睡嗜血杆菌或其培养物制备得到灭活的抗原以及佐剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂，其中所述佐剂和抗原的体积比为1:3～1:7。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，疫苗中的所述抗原的含量不低于5×10⁹CFU/ml。

7.一种如权利要求3至6中任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，制备方法包括：

步骤1、发酵培养权利要求1所述的昏睡嗜血杆菌菌株菌液；

步骤2、将步骤1中的菌液进行浓缩、灭活，获得灭活的抗原菌液；

步骤3、将获得的灭活抗原菌液与佐剂混匀，制备得到灭活疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：

1）一级种子繁殖：将昏睡嗜血杆菌菌株菌液接种于脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，置于37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，然后划线接种于脑心浸液酵母浸提膏血平板，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，挑选典型菌落，分别接种脑心浸液酵母浸提膏血斜面若干支，37℃，5%的CO₂环境中培养16～20h，作为一级种子，在2～8℃保存用于扩大培养；

2)二级种子繁殖：取一支步骤1）中的一级种子，用脑心浸液酵母浸提膏液体培养基将脑心浸液酵母浸提膏血斜面上的菌苔冲下来，接种于脑心浸液酵母浸提膏液体培养基，置37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h，经纯粹检验合格后，在2～8℃保存，作为二级种子；

3)发酵菌液制备：菌液培养采用摇瓶培养昏睡嗜血杆菌菌液，将脑心浸液酵母浸提膏液体培养基中按2％v/v的量加入二级种子液，混合均匀37℃，5%的CO₂环境中培养8～12h获得昏睡嗜血杆菌菌株菌液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：

1)发酵菌液浓缩：采用离心的方法对发酵菌液进行浓缩，其中离心条件为：3500r/min，4℃，离心20min，随后收集菌体沉淀，并用pH为7 .2～7 .4的无菌PBS重悬，制成10倍浓缩菌液；

2)发酵菌液灭活：按浓缩菌液量的0.1％～0.2％v/v加入甲醛溶液，37℃灭活8～10小时，摇匀后制备得到灭活抗原菌液。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：在乳化罐中先加入步骤2中获得的灭活抗原菌液，低速搅拌后再按1份佐剂和5份抗原菌液体积比例加入氢氧化铝胶佐剂，搅拌使其充分混合，制备得到灭活疫苗。